Μοριακή κλωνοποίηση και βιοχημικός χαρακτηρισμός μιας νέας κουμαρινικής γλυκοσυλτρανσφεράσης CtUGT1 από το Cistanche Tubulosa

για περισσότερες πληροφορίες:ali.ma@wecistanche.com

Xiping Xu, et al

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

Οι UDP-γλυκοζυλοτρανσφεράσες (UGTs) είναι μια σημαντική και λειτουργικά ποικιλόμορφη οικογένεια ενζύμων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση του δευτερογενούς μεταβολίτη. Η κουμαρίνη είναι ένας από τους πιο συνηθισμένους σκελετούς φυσικών προϊόντων με υποψήφια φαρμακολογική δράση. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, πολλοί ανέφεραν GT από φυτά αναγνώρισαν κυρίως τα φλαβονοειδή ως δέκτες ζάχαρης. Μόνο περιορισμένοι GT θα μπορούσαν να καταλύσουν τη γλυκοζυλίωση των κουμαρινών. Σε αυτή τη μελέτη, ένα νέο UGT κλωνοποιήθηκε απόCistanche tubulosa, ένα πολύτιμο παραδοσιακό τονωτικό κινέζικο βότανο, το οποίο είναι άφθονο με ποικίλους γλυκοσίτες όπως φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, λιγνάνες γλυκοσίδες και ιριδοειδή γλυκοσίδες. Η ευθυγράμμιση αλληλουχίας και η φυλογενετική ανάλυση έδειξαν ότιCtUGT1είναι φυλογενετικά μακριά από τα περισσότερα από τα αναφερόμενα UGT φλαβονοειδών και γειτονικά με τα φαινυλοπροπανοειδή UGT. Εκτεταμένες in vitro ενζυμικές δοκιμασίες διαπίστωσαν ότι αν καιCtUGT1δεν συμμετείχαν στη βιοσύνθεση βιοδραστικών γλυκοσιδών σεCistanche tubulosa, θα μπορούσε να καταλύσει τη γλυκοζυλίωση των κουμαρινών ουμπελιφερόνη 1, εσκουλετίνης 2 και υμεκρομόνης 3 σε σημαντική απόδοση. Τα γλυκοσυλιωμένα προϊόντα ταυτοποιήθηκαν με σύγκριση με τα πρότυπα αναφοράς ή τη φασματοσκοπία NMR και τα αποτελέσματα έδειξαν ότιCtUGT1μπορεί να καταλύει τοπικά τη γλυκοζυλίωση των υδροξυλοκουμαρινών στη θέση C7- ΟΗ. Τα βασικά υπολείμματα που καθόρισανCtUGT1Η δραστηριότητα του 's συζητήθηκε περαιτέρω με βάση τη μοντελοποίηση ομολογίας και τις αναλύσεις μοριακής σύνδεσης. Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα μεταλλαξογένεσης κατευθυνόμενης θέσης, διαπιστώθηκε ότι το H19 έπαιξε έναν αναντικατάστατο ρόλο ως κρίσιμη βάση κατάλυσης.CtUGT1θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην ενζυματική παρασκευή βιοδραστικών γλυκοσιδών κουμαρίνης.

Λέξεις-κλειδιά:Φυτικές γλυκοζυλοτρανσφεράσες, γλυκοσίδες κουμαρίνης,Cistanche tubulosa, Μοντελοποίηση ομολογίας, Τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιογένεση

Κάντε κλικ για να ωφελήσει προϊόντα από εκχύλισμα κιστάνσε

Εισαγωγή

Η γλυκοζυλίωση είναι ένας από τους πιο συνηθισμένους τύπους τροποποίησης της δομής των δευτερογενών φυσικών προϊόντων. Η γλυκοζυλίωση θα μπορούσε να αλλάξει τη σταθερότητα ή/και τη διαλυτότητα του αγλυκόνης και να συμβάλει πολύ στην ποικιλία των φυσικών/αφύσικων προϊόντων λόγω των πολλαπλών τύπων σύζευξης. Στα φυτά, αυτές οι αντιδράσεις πραγματοποιούνταν συνήθως από γλυκοζυλοτρανσφεράσες (UGT) εξαρτώμενες από διφωσφορική ουριδίνη (UDP), ένα είδος ενζύμων που καταλύουν τη μεταφορά τμημάτων μονοσακχαρίτη από ενεργοποιημένο νουκλεοτιδικό σάκχαρο σε ένα μόριο δέκτη γλυκοζυλίου που μπορεί να είναι ένας υδατάνθρακας, γλυκοζαχαρίτης, ή ένας πολυσακχαρίτης [1,2]

Μέχρι σήμερα, πολλά γονίδια που κωδικοποιούν UGTs έχουν απομονωθεί από πολλά φυτά [3]. Η γλυκοζυλίωση συνέβη κυρίως σε ομάδες υδροξυλίου ή καρβοξυλικές ομάδες ενός ευρέος φάσματος δευτερογενών προϊόντων, όπως τα φλαβονοειδή [4], τα φαινυλοπροπανοειδή [5], τα τερπενοειδή [6], τα στεροειδή [7], τα αλκαλοειδή [8] ​​και ούτω καθεξής. Οι κουμαρίνες είναι μεταβολίτες φαινυλοπροπανοειδών που διανέμονται ευρέως σε πολλά είδη φυτών. Οι κουμαρίνες που απαντώνται στη φύση υπάρχουν συχνά ως γλυκοσυζεύγματα και αυτά τα παράγωγα εμφάνισαν ένα ευρύ φάσμα φαρμακολογικών δράσεων, συμπεριλαμβανομένων αντιοξειδωτικών [9], αντιικών [10,11], ηπατοπροστατευτικών [12], αντιφλεγμονωδών [13], αντικαρκινικών [14 ], αντιμεταλλαξιογόνες [15] και ανασταλτικές δραστηριότητες της χολινεστεράσης (ChE) και της μονοαμινοξειδάσης (ΜΑΟ) [14,15], κ.λπ. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, σε σύγκριση με τα πιο συχνά αναφερόμενα και εκτενώς διερευνημένα φλαβονοειδή UGTs, μόνο περιορισμένες UGT ήταν αναφέρθηκε ικανή να μεταφέρει το τμήμα σακχάρου σε κουμαρίνες [16-18].

Φυτά πλούσια σε διαφορετικούς γλυκοσίδες θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως ιδανική γονιδιακή δεξαμενή των UGTs με νέες δραστηριότητες κατάλυσης. Επιπλέον, πολλά UGTs έχουν αναφερθεί ότι διαθέτουν σημαντική αδυναμία δέκτη για να καταλύουν τη γλυκοζυλίωση πολλαπλών υποστρωμάτων, μερικά από τα οποία ακόμη δεν διαχωρίστηκαν στα φυτά [19]. Σε αυτό το άρθρο, μια νέα γλυκοζυλοτρανσφεράσηCtUGT1ταυτοποιήθηκε απόCistanche tubulosa, ένα παραδοσιακό φαρμακευτικό βότανο που είναι άφθονο με διάφορους γλυκοσίδες όπως οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhGs), οι λιγνάνες γλυκοσίδες και οι ιριδοειδής γλυκοσίδες. Η ετερόλογη έκφραση και ο χαρακτηρισμός λειτουργίας απέδειξε ότι αν και ανασυνδυασμένοCtUGT1δεν συμμετείχε στη βιοσύνθεση αυτών των γλυκοσιδών σεCistanche tubulosa, μπορεί να καταλύσει τη γλυκοζυλίωση των υδροξυλοκουμαρινών και η αντίδραση τοπικά συνέβη στη θέση 7- ΟΗ των κουμαρινών ουμπελιφερόνη 1, κλιμακούμενη 2 και υμεκρομόνη 3 για να παραχθούν τρεις φαρμακολογικά δραστικές ενώσεις που ξεφλουδίζουν (1a), κιχοριίνη (2α) και 4-μεθυλουμπελλιφερυλ γλυκοζίτη (3α) με σημαντική απόδοση, αντίστοιχα. Επιπλέον, το υπόστρωμα βενζοφαινόνης 4,4'-διυδροξυ βενζοφαινόνη (4), το υπόστρωμα ισοφλαβόνης γενιστεΐνη (5) και το υπόστρωμα ανθρακινόνης αλόη-εμοδίνη (6) θα μπορούσαν επίσης να γίνουν δεκτά απόCtUGT1. Οι καταλυτικές ιδιότητες και τα βασικά υπολείμματα υπογραμμίζουν την καταλυτική ικανότητα τουCtUGT1αξιολογήθηκαν επίσης με βάση τη μοντελοποίηση ομολογίας, την ανάλυση AutoDock και την κατευθυνόμενη μεταλλαξιογένεση.

2. πειραματικός

2.1. Φυτικά υλικά και χημικά

Cistanche tubulosaπου χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη συλλέχτηκε από περιοχές της ερήμου στις αυτόνομες περιοχές Hetian, Xinjiang. Η βοτανική τους ταυτότητα επιβεβαιώθηκε από τον καθηγητή Pengfei Tu στο Πανεπιστήμιο του Πεκίνου. Οι ελεγμένες κουμαρίνες και άλλα υποστρώματα σε αυτή τη μελέτη αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΗΠΑ), την Chengdu Push Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Κίνα) και την Chengdu Biopurify Phytochemicals Co., Ltd. (Chengdu, Κίνα ) εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά. Τα πρότυπα αναφοράς skimming (1a) και cichoriin (2a) αγοράστηκαν από την Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, Κίνα).

2.2. Μοριακή κλωνοποίηση CtUGT1 από Cistanche tubulosa

Το συνολικό RNA τουCistanche tubulosaεξήχθη από το σαρκώδες στέλεχος χρησιμοποιώντας ένα κιτ φυτικού RNA OMEGA (GA, ΗΠΑ) και μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA με το κιτ αντιδραστηρίων PrimeScript™ RT (TaKaRa, Ιαπωνία) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένας εκφυλισμένος εκκινητής σχεδιάστηκε για το 3'RACE με βάση τις αλληλουχίες αμινοξέων στο διατηρημένο κουτί φυτικών γλυκοζυλοτρανσφερασών PSPG (Plant Secondary Product Glycosyltransferases). Οι ενισχύσεις 3' και 5' άκρου τουCtUGT1διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Smart RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας εκκινητές (Πίνακας S1). Το πλήρους μήκους cDNA τουCtUGT1ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας πολυμεράση KOD-Plus Neo DNA (TOYOBO, Ιαπωνία) με ειδικά γονιδιακά ζεύγη εκκινητών (Πίνακας S1) υπό τις ακόλουθες συνθήκες: ένα αρχικό στάδιο μετουσίωσης στους 94 ◦C για 2 λεπτά, ακολουθούμενο από 35 κύκλους μετουσίωσης σε 98 ◦C για 15 s, ανόπτηση στους 55 ◦C για 30 s, και επέκταση στους 68 ◦C για 55 s, με τελικό βήμα επέκτασης στους 68 ◦C για 7 λεπτά. Όλα τα θραύσματα DNA που ελήφθησαν κλωνοποιήθηκαν σε φορέα pEASY-Blunt (TransGen Biotech, China) και αναλύθηκαν η αλληλουχία τους.

2.3. Ευθυγράμμιση αλληλουχίας και φυλογενετική ανάλυση

Στοίχιση ακολουθίας τουCtUGT1με αναφερόμενες γλυκοζυλοτρανσφεράσες (Πίνακας S2) πραγματοποιήθηκε με χρήση πακέτου λογισμικού DNAMAN 4.0 (Lynnon Biosoft, Καναδάς). Τα μοτίβα και οι τομείς αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα εργαλείο συντηρημένου τομέα (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi). Το φυλογενετικό δέντρο κατασκευάστηκε με εκκίνηση λογισμικού MEGA 7.0.14 χρησιμοποιώντας τη μέθοδο γειτονικής ένωσης με 1000 επαναλήψεις εκκίνησης [20]. Η μεταφρασμένη αλληλουχία πρωτεΐνης τουCtUGT1ευθυγραμμίστηκε με τις γνωστές φυτικές γλυκοζυλοτρανσφεράσες που κατατέθηκαν στη βάση δεδομένων NCBI GenBank (Πίνακας S3) με το ClustalW.

2.4. Ετερόλογη έκφραση και καθαρισμός πρωτεΐνης του CtUGT1 σε Escherichia coli

Η περιοχή κωδικοποίησης τουCtUGT1ενισχύθηκε με BamH I και Not I ως θέσεις περιορισμού χρησιμοποιώντας εκκινητές που φαίνονται στον Πίνακα S1. Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας πολυμεράση KOD-Plus-Neo DNA (TOYOBO, Osaka, Ιαπωνία). Οι ληφθείσες αλληλουχίες επαληθεύτηκαν με κλωνοποίηση στον φορέα pEASY-Blunt (TransGen Biotech, China). Το επιβεβαιωμένο προϊόν ενίσχυσης τουCtUGT1στη συνέχεια χωνεύτηκε και υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα έκφρασης ρΕΤ-28a(συν) (Novagen, ΗΠΑ). Το επαληθευμένο κατασκεύασμα στη συνέχεια μετασχηματίστηκε σε Ε. coli Transetta (DE3) για να ληφθεί το ανασυνδυασμένο στέλεχος. Ολονύκτια καλλιέργεια ανασυνδυασμένου στελέχους εμβολιάστηκε σε μέσο Luria-Bertani (LB) που περιέχει 50 ug⋅mL− 1 καναμυκίνη και 40 ug⋅mL− 1 χλωρομυκετίνη σε αναλογία 1:1{{{ 19}}0. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν στους 37 ◦C, 200 rpm έως ότου η τιμή OD600 έφτασε στο 0,4–0,6. Στη συνέχεια προστέθηκε ισοπροπυλ- -D-θειογαλακτοπυρανοσίδη (IPTG) σε τελική συγκέντρωση 0,5 mM και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 16 ώρες στους 18 °C, 180 rpm. Κατόπιν τα σφαιρίδια κυττάρων συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (7600 xg, 10 λεπτά, 4 ◦C) και επαναιωρήθηκαν σε 3 mL/g παγωμένο ρυθμιστικό λύσης (Σημείωση Συμπληρωματικών Δεδομένων 1) και διακόπηκαν με υπερήχους σε πάγο. Τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση στα 7600 χ g, 4°C για περίπου 30 λεπτά. Μια προ-ισορροπημένη στήλη Histrap (GE Healthcare, Uppsala, Σουηδία) χρησιμοποιήθηκε για χρωματογραφία συγγένειας σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εκλούστηκε με 10 όγκους στήλης ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (Σημείωση Συμπληρωματικών Δεδομένων 1) που περιείχε 250 mM ιμιδαζόλης. Η καθαρότητα της πρωτεΐνης αναλύθηκε με 10 τοις εκατό SDS-PAGE. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη συμπυκνώθηκε με σωλήνα υπερδιήθησης 30 kDa (Sigma-Aldrich, ΗΠΑ) και αφαλατώθηκε χρησιμοποιώντας στήλη PD-10 (GE Healthcare, Ουψάλα, Σουηδία) με ρυθμιστικό διάλυμα αφαλάτωσης (Σημείωση Συμπληρωματικών Δεδομένων 1). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford χρησιμοποιώντας BSA ως πρότυπο.

2.5. Δοκιμασίες ενζυμικής δραστηριότητας και ειδικότητα υποστρώματος του CtUGT1

Για τη διερεύνηση της δραστηριότητας γλυκοζυλίωσης τουCtUGT1, οι ενζυμικές δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν σε ένα μείγμα αντίδρασης (150 μL) που αποτελείται από 0,4 mM αγλυκόνη, 0,8 mM UDP-γλυκόζη (UDPG) και 50 ug καθαρούCtUGT1πρωτεΐνη στο ρυθμιστικό διάλυμα αφαλάτωσης. Όλες οι αντιδράσεις επωάστηκαν στους 30 ◦C για 12 ώρες και τερματίστηκαν με την προσθήκη 300 μL ψυχρής μεθανόλης. Τα μίγματα φυγοκεντρήθηκαν στους 15,000 ×g για 30 λεπτά για να συλλεχθεί το υπερκείμενο για αναλύσεις HPLC-UV/ESI-MS. Τρεις παράλληλες δοκιμασίες διεξήχθησαν συνήθως για κάθε αντίδραση. Το HPLC (Agilent 1260, ΗΠΑ) ήταν εξοπλισμένο με έναν ανιχνευτή συστοιχίας διόδων και μια στήλη CAPCELL PAK C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm· Shiseido, Ιαπωνία) με ρυθμό ροής 1 mL⋅min− 1, και τη θερμοκρασία της στήλης διατηρήθηκε στους 30 ◦C. Η κινητή φάση αποτελούνταν από Α (δηλ. υδατικό διάλυμα μυρμηκικού οξέος 0,1 τοις εκατό) και Β (δηλαδή ακετονιτρίλιο). Τα προγράμματα βαθμίδωσης παρατίθενται στον Πίνακα S4. Τα δεδομένα HRESI-MS καταγράφηκαν σε ένα σύστημα LCMS-IT-TOF, εξοπλισμένο με διεπαφή ESI (Shimadzu, Kyoto, Ιαπωνία) με εξαιρετικά υψηλή καθαρότητα He ως αέριο σύγκρουσης και N2 ως αέριο νεφελοποίησης. Οι βελτιστοποιημένες παράμετροι πηγής ESI ήταν οι εξής: ρυθμός ροής αερίου περιβλήματος, 1,5 mL⋅min− 1; βοηθητικός ρυθμός ροής αερίου, 1,5 mL⋅min− 1; τάση ψεκασμού, 4,5 kV; τριχοειδική θερμοκρασία, 200 ◦C. Τα φάσματα καταγράφηκαν στην περιοχή 100–1500 m/z για ανάλυση πλήρους σάρωσης MS.

2.6. Επιδράσεις του χρόνου αντίδρασης, της τιμής του pH και της θερμοκρασίας στη δραστηριότητα του ενζύμου και κινητικές μελέτες του CtUGT1

Επιδράσεις του χρόνου αντίδρασης, της τιμής του pH και της θερμοκρασίας στην ενζυμική δραστηριότητα τουCtUGT1δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας UDPG ως δότη σακχάρου και 3 ως δέκτη ζάχαρης στις συνθήκες αντίδρασης όπως περιγράφηκαν παραπάνω. Για τον προσδιορισμό του βέλτιστου pH, η δραστηριότητα του ενζύμου συγκρίθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα 100 mM (κιτρικό οξύ-κιτρικό νάτριο) με τιμές pH που κυμαίνονται από 3.{12}} έως 6.{{ 14}}, 10{{20}} ρυθμιστικό διάλυμα mM (KH2PO4-K2HPO4) με τιμές pH που κυμαίνονται από 6.0 έως 8.{{29} }, 100 mM ρυθμιστικό διάλυμα (Tris-HCl) με τιμές pH κυμαινόμενες από 7,0 έως 9,0, 100 mM ρυθμιστικό διάλυμα (Na2CO3-NaHC03) με τιμές pH κυμαινόμενες από 9,0 έως 11,0. Για τον προσδιορισμό της βέλτιστης θερμοκρασίας αντίδρασης, οι αντιδράσεις επωάστηκαν σε διάφορες θερμοκρασίες που κυμαίνονται από 0 έως 65 ◦C. Οι χρονικές διαδρομές της αντίδρασης αξιολογήθηκαν σε 12 διαφορετικά χρονικά σημεία μεταξύ 0 και 24 ωρών. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα μίγματα της αντίδρασης αναλύθηκαν με HPLC-MS όπως περιγράφεται παραπάνω. Για κινητικές μελέτες τουCtUGT1, πραγματοποιήθηκαν ενζυματικές δοκιμασίες σε τελικό όγκο 100 μL που περιείχε 100 mM KH2PO4-ρυθμιστικό διάλυμα K2HPO4 (pH 8,0), 25 ug καθαρισμένουCtUGT1, 3 mM UDPG και ποικίλες συγκεντρώσεις (50–3000 μΜ) 3. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν στους 37 ◦C για 30 λεπτά και στη συνέχεια τερματίστηκαν με 100 μL παγωμένης μεθανόλης. Όλες αυτές οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και η ενζυμική δραστηριότητα αξιολογήθηκε μέσω ποσοτικοποίησης των αντίστοιχων γλυκοζυλιωμένων παραγώγων. Οι κινητικές παράμετροι, συμπεριλαμβανομένης της σταθεράς Michaelis–Menten (Km) και Vmax, υπολογίστηκαν με ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism 5.

2.7. Επιλεκτικότητα δότη υποστρώματος και ζάχαρης του CtUGT1

Για να εξερευνήσετε τις προτιμήσεις υποστρώματος τουCtUGT1, συνολικά 27 υποστρώματα που ανήκουν σε διαφορετικούς δομικούς τύπους δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας UDPG ως δότη. Οι χημικές τους πληροφορίες παρατίθενται στον Πίνακα S5 και οι δομές τους φαίνονται στα Σχ. S1 και S2. Για τη διερεύνηση της επιλεκτικότητας των δοτών ζάχαρηςCtUGT1, οι αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ουμπελιφερόνη (1), εσκουλετίνη (2), υμεκρομόνη (3), 4,4'-διυδροξυ βενζοφαινόνη (4), γενιστεΐνη (5) και αλόη-εμοδίνη (6) ως υποστρώματα με UDPG, UDP- Ν ακετυλογαλακτοζαμίνη, UDP-γαλακτόζη, GDP-μαννόζη, GDP-φουκόζη, UDP γαλακτουρονικό οξύ, UDP-ραμνόζη ως δότες ζάχαρης, αντίστοιχα. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα μίγματα της αντίδρασης αναλύθηκαν με HPLC-MS όπως περιγράφεται παραπάνω.

2.8. Παρασκευή του 4-methylumbelliferyl glucoside (ένωση 3a) από CtUGT1

Το παρασκευαστικό μείγμα αντίδρασης αποτελούνταν από {{0}},034 mmol ένωση υποστρώματος 3, 0,04 mmol UDPG, 5 mg καθαρισμένοCtUGT1σε 50 mL ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης. Οι αντιδράσεις αναδεύτηκαν ήπια στις βέλτιστες συνθήκες (100 mM KH2PO4-K2HPO4 με ρΗ 8,0, 37◦C). Μετά από επώαση στους 37 ◦C για 24 ώρες, το υπερκείμενο της αντίδρασης διαχωρίστηκε με χρωματογραφία στήλης με μακροπορώδη ρητίνη (MCI GEL CHP) μετά από φυγοκέντρηση στους 12,000 ×g για 30 λεπτά. Η κινητή φάση ήταν μια βαθμιδωτή έκλουση από 100 τοις εκατό νερό έως 100 τοις εκατό μεθανόλη. Κάθε κλάσμα αναλύθηκε με HPLC-UV. Τα κλάσματα που περιείχαν μόνο στοχευμένα προϊόντα εξατμίστηκαν μέχρι ξηρού υπό μειωμένη πίεση και χαρακτηρίστηκαν με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού 1Η (NMR) και φασματοσκοπία 13C NMR.

2.9. Μοριακή πρόσδεση και κατευθυνόμενη μεταλλαξιογένεση του CtUGT1

Το πρωτεϊνικό μοντέλο τουCtUGT1καθιερώθηκε χρησιμοποιώντας το SWISS-MODEL [21–25]. Η κρυσταλλική δομή της γλυκοζυλοτρανσφεράσης Medicago truncatula UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) επιλέχθηκε ως δομή προτύπου [26]. Το καθιερωμένο μοντέλο αξιολογήθηκε από το VERIFY-3D [27,28]. Το Auto-Dock Vina χρησιμοποιήθηκε για μελέτες μοριακής σύνδεσης [29]. Η κρυσταλλική δομή του UGT74F2 [30], μιας γλυκοζυλοτρανσφεράσης από Arabidopsis thaliana, σε σύμπλοκο με συνδέτη UDP και σαλικυλικό οξύ (PDB ID 5U6M) χρησιμοποιήθηκε ως δομή ελέγχου για ανάλυση τσέπης δότη ζάχαρης και τσέπης δέκτη ζάχαρης, αντίστοιχα . Τα Auto-Dock-Tools 1.5.6 από τα MGLTools (εργαλεία Molecular Graphics Laboratory) χρησιμοποιήθηκαν για την προετοιμασία του δότη ζάχαρης UDPG και του υποστρώματος 1, 2 για μοριακή σύνδεση. Οι πλευρικές αλυσίδες των υπολειμμάτων γύρω από την κοιλότητα της ενεργού θέσης τέθηκαν εύκαμπτες και οι περιστρεφόμενοι δεσμοί των προσδεμάτων αφέθηκαν ελεύθεροι να περιστραφούν. Η κορυφαία πόζα όπως κρίθηκε από το μοντέλο σύνδεσης Vina με την υψηλότερη συγγένεια (kcat/ mol) υποβλήθηκε σε οπτική ανάλυση χρησιμοποιώντας το λογισμικό PyMOL 2.0.

Για έρευνες μεταλλαξιογένεσης, η αλληλουχία βελτιστοποίησε το γονίδιο τουCtUGT1(Συμπληρωματικά δεδομένα Σημείωση 2) ​​συντέθηκε και δοκιμάστηκε ως άγριος τύπος. Τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξιογένεση τουCtUGT1διεξήχθη χρησιμοποιώντας το σύστημα Fast Mutagenesis System (TransGen Biotech). Οι μεταλλάξεις ενισχύθηκαν από το εκμαγείο του βελτιστοποιημένου γονιδίου που έχει κατασκευαστεί σε ένα φορέα ρΕΤ-28 χρησιμοποιώντας τους συγκεκριμένους εκκινητές που φαίνονται στον Πίνακα S1. Τα κατασκευασμένα μεταλλάγματα επαληθεύτηκαν με PCR και προσδιορισμό αλληλουχίας πριν μετασχηματιστούν σε Ε. coli (DE3) για ετερόλογη έκφραση. Ο καθαρισμός πρωτεΐνης και οι ενζυμικές αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

3. Αποτελέσματα και συζήτηση

3.1. Πλήρους μήκους cDNA κλωνοποίηση του γονιδίου CtUGT1 απόCistanche tubulosa

Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) είναι ένα παραδοσιακό κινέζικο φαρμακευτικό βότανο που παράγει μια μεγάλη ποικιλία βιοδραστικών φυσικών γλυκοσιδών. Θα πρέπει να υπάρχει ένας σημαντικός αριθμός νέων γονιδίων γλυκοζυλοτρανσφερασών που υπήρχαν στο γονιδίωμά του. Για την αναζήτηση νέων γλυκοζυλοτρανσφερασών με ενδιαφέρουσες δραστηριότητες κατάλυσης, σχεδιάστηκε ένας εκφυλισμένος εκκινητής για 3'-RACE με βάση το διατηρημένο μοτίβο PSPG για την κλωνοποίηση επιτρεπτικών UGT απόCistanche tubulosa. Η λαμβανόμενη τελική αλληλουχία 3' αναλύθηκε περαιτέρω με βλάστηση NCBI και ο ειδικός εκκινητής για το 5'-RACE σχεδιάστηκε με βάση την ληφθείσα αλληλουχία. Τα ενισχυμένα άκρα 5' cDNA και 3' άκρα cDNA ματίστηκαν και το πλήρες μήκος τουCtUGT1Η αλληλουχία, συμπεριλαμβανομένων 1739 νουκλεοτιδίων, ελήφθη (Εικ. S3) και καταγράφηκε στη Σημείωση Συμπληρωματικών δεδομένων 3. Στη συνέχεια, ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF)CtUGT1βρέθηκε από τα εργαλεία NCBI ORF Finder και η κωδικοποιητική αλληλουχία των 1482 bp κλωνοποιήθηκε επιτυχώς με ενίσχυση RT-PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές στον Πίνακα S1. Η αλληλουχία cDNA του CtUGT1 έχει υποβληθεί στο NCBI (αριθμός πρόσβασης MW629113).

3.2. Ανάλυση αλληλουχίας και ετερόλογη έκφραση του CtUGT1

οCtUGT1γονίδιο αναμενόταν να κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 493 υπολειμμάτων αμινοξέων με εκτιμώμενη μοριακή μάζα 55,78 kDa. Η έκρηξη NCBI αποκάλυψε ότι η συναγόμενη πρωτεϊνική αλληλουχία τουCtUGT1μοιράζεται την υψηλότερη ταυτότητα (76,39 τοις εκατό ) με ένζυμα τύπου UGT86A1-. Οι βιοχημικές λειτουργίες αυτού του είδους ενζύμου δεν έχουν πλήρως χαρακτηριστεί. Προβλέπεται ότι μπορεί να εμπλέκονται στην προσαρμογή του φυτού σε αβιοτικές καταπονήσεις. Η ευθυγράμμιση των αλληλουχιών αμινοξέων του CtUGT1 και άλλων φυτικών γλυκοζυλοτρανσφερασών φαίνεται στο Σχ. S4.

Τα εξαιρετικά διατηρημένα 44 υπολείμματα του μοτίβου PSPG βρέθηκαν στο C-τερματικό τουCtUGT1. Μέσα στο PSPG-box, μια πεπτιδική αλληλουχία του HCGWNS εντοπίστηκε στο 373ο αμινοξύ, το οποίο έχει ανιχνευθεί στο 95 τοις εκατό όλων των γλυκοζυλοτρανσφερασών [31]. Το τελικό υπόλειμμα του μοτίβου PSPG ήταν η γλουταμίνη, η οποία έδειξε ότι αυτό το ένζυμο τείνει να χρησιμοποιεί UDPG ως δότη σακχάρου [32] (Εικ. S4). Το φυλογενετικό δέντρο κατασκευάστηκε με βάση τις προβλεπόμενες πολυπεπτιδικές αλληλουχίες τουCtUGT1και διάφορα είδη γλυκοζυλοτρανσφερασών φυτικής προέλευσης που συμμετείχαν στη βιοσύνθεση διαφόρων δευτερογενών μεταβολιτών. Μέχρι στιγμής, οι περισσότερες από τις αναφερόμενες γλυκοζυλοτρανσφεράσες από φυτά αναγνώρισαν τα φλαβονοειδή ως τα υποστρώματά τους, όπως οι 7-Ο-γλυκοζυλοτρανσφεράσες φλαβονών, οι φλαβονοειδείς 3-Ο-γλυκοσυλτρανσφεράσες, οι ισοφλαβονικές 7-Ο-γλυκοζυλοτρανσφεράσες και γλυκοζυλοτρανσφεράσες χαλκόνης. Τα αποτελέσματα της φυλογενετικής ανάλυσης έδειξαν ότιCtUGT1δεν έχει ομαδοποιηθεί στην κατηγορία των φλαβονοειδών GT. Αντίθετα, βρίσκεται δίπλα στα UGT74T1 και UGT74S1 (λιγνάνες γλυκοζυλοτρανσφεράσες από Linum usitatissimum) και NtGT2 (μια γλυκοζυλοτρανσφεράση κουμαρίνης από Nicotiana tabacum), που έδειξε ότιCtUGT1μπορεί να έχει κάποιες νέες δραστηριότητες κατάλυσης προς υποστρώματα φαινυλοπροπανοειδών (Εικ. 1), λαμβάνοντας ιδιαίτερα υπόψη ότι μόνο περιορισμένα μέλη έχουν λειτουργικά ταυτοποιηθεί που ανήκουν σε αυτά τα clades.

Για να αποκαλύψει περαιτέρω την καταλυτική του δραστηριότητα, τοCtUGT1Η αλληλουχία εκφράστηκε υπό τον έλεγχο του προαγωγέα T7 lac σε κύτταρα Ε. coli Transetta (DE3) ως πρωτεΐνη σύντηξης με επισήμανση His6-. Ο ανασυνδυασμένος με ετικέτα HisCtUGT1καθαρίστηκε αποτελεσματικά μέχρι ομοιογένειας με χρωματογραφία συγγένειας Ni-NTA. Το μοριακό βάρος του καθαρισμένου ανασυνδυασμένου CtUGT1 ήταν περίπου 55 kDa (Εικ. S5), το οποίο είναι σύμφωνο με την προβλεπόμενη μοριακή μάζα.

3.3. Ιη vitro εξειδίκευση υποστρώματος δέκτη του CtUGT1

Για να ελεγχθεί η δραστηριότητα γλυκοζυλίωσης τουCtUGT1, πραγματοποιήθηκαν in vitro ενζυματικές δοκιμασίες. Το UDPG χρησιμοποιήθηκε ως δότης ζάχαρης. Οι δέκτες ζάχαρης επιλέχθηκαν με βάση διαφορετικές ανησυχίες. Πρώτον, τοCtUGT1γονίδιο κλωνοποιήθηκε απόCistanche tubulosaτων οποίων τα κύρια χημικά συστατικά είναι τα PhG. Για να επαληθεύσετε εάνCtUGT1εμπλέκεται στη βιοσύνθεση των PhGs, των κοινών αγλυκώνων των PhGsCistanche tubulosaόπως η τυροσόλη (ΝΡ1, Σχ. S2) και η σαλιδροζίτη (ΝΡ2, Σχ. S2) επιλέχθηκαν αρχικά ως υποστρώματα. Δυστυχώς, οι αναλύσεις HPLC και HRESI-MS δεν βρήκαν κανένα γλυκοζυλιωμένο προϊόν, γεγονός που έδειξε ότιCtUGT1μπορεί να μην εμπλέκεται στη βιοσύνθεση των PhGs.

Δεύτερον, με βάση την ευθυγράμμιση της αλληλουχίας και τα αποτελέσματα της φυλογενετικής ανάλυσης (Εικ. 1),CtUGT1σχετιζόταν φυλογενετικά με τις λιγνανοειδείς και τις γλυκοζυλοτρανσφεράσες της κουμαρίνης, γεγονός που υποδηλώνει ότιCtUGT1είναι πιθανώς μια φαινυλοπροπανοειδής γλυκοζυλοτρανσφεράση. Για την επαλήθευση αυτής της πρόβλεψης, τρία υποστρώματα κουμαρίνης 1, 2 και 3 μαζί με ένα λιγνανοειδές υπόστρωμα magnolol NP17 δοκιμάστηκαν ως δέκτες ζάχαρης, αντίστοιχα. Ως αρνητικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκαν ένζυμα αδρανοποιημένα με θερμότητα (100 ◦C, 10 λεπτά). Η ανάλυση HPLC-HRESI-MS των αντιδράσεων χρησιμοποιώντας το ΝΡ17 ως υπόστρωμα δεν βρήκε κανένα προϊόν. Σε αντίθεση,CtUGT1έδειξε εμφανείς ικανότητες γλυκοζυλίωσης έναντι των ελεγμένων υποστρωμάτων κουμαρίνης (1,2,3). Χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα 1 ως παράδειγμα, όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, δημιουργήθηκε μια νέα κορυφή (1α) με μειωμένο χρόνο συγκράτησης (11,46 λεπτά) σε σύγκριση με αυτόν του υποστρώματος 1 (19,75 λεπτά)CtUGT1με απόδοση 37,78 τοις εκατό. Το φάσμα απορρόφησης υπεριώδους ακτινοβολίας του αντιστοιχεί σε 1. Το φάσμα HRESI-MS έδειξε ότι η κορυφή 1a εμφάνισε [Μ συν Η] συν σε m/z 325,1029 και [Μ συν Na] συν σε m/z 347,0710 (υπολογ. 347,05Ha16O8N1 ) με τον προβλεπόμενο τύπο του C15H16O8, ο οποίος ήταν 162 amu μεγαλύτερος από αυτόν του 1 και συνεπής με τον θεωρητικό τύπο ενός γλυκοζυλιωμένου προϊόντος (Εικ. 2Α). Παρομοίως, το γλυκοζυλιωμένο προϊόν του υποστρώματος 2 (14,21 λεπτά, Σχ. 2Β) και 3 (21,92 λεπτά, Σχήμα 2C) βρέθηκε επίσης στο χρόνο κατακράτησης 10,85 λεπτών και 13,80 λεπτών, με ποσοστό μετατροπής 22,03 τοις εκατό και 68. , αντίστοιχα. Η μοριακή μάζα των προϊόντων ταιριάζει ακριβώς με την υπολογισμένη μάζα των γλυκοζυλιωμένων προϊόντων, γεγονός που επιβεβαίωσε ότιCtUGT1θα μπορούσε να καταλύσει τη γλυκοζυλίωση των ενώσεων κουμαρίνης 1–3 (Πίνακας 1).

Στη συνέχεια, λαμβάνοντας υπόψη ότι τα περισσότερα από τα πρόσφατα αναφερθέντα ένζυμα εμφάνισαν ακαταστασία κατάλυσης in vitro, για να διερευνηθεί περαιτέρω το φάσμα του υποστρώματοςCtUGT1, διεξήχθησαν εκτεταμένες δοκιμές ενζύμων για διάφορες ενώσεις που ανήκουν σε διαφορετικά είδη φυσικών προϊόντων, συμπεριλαμβανομένων φλαβονοειδή, φαινολικές ενώσεις, κουμαρίνες, στιλβένιο, ανθρακινόνες, βενζοφαινόνη, ναφθαλίνη και ιριδοειδή (Εικ. S1-S2), χρησιμοποιώντας UDPG ως ο δότης ζάχαρης. Βρέθηκε ότι το υπόστρωμα βενζοφαινόνης 4,4'-διυδροξυ βενζοφαινόνη (4), το υπόστρωμα ισοφλαβόνης γενιστεΐνη (5) και το υπόστρωμα ανθρακινόνης αλόη-εμοδίνη (6) θα μπορούσαν επίσης να καταλυθούν απόCtUGT1για να σχηματιστεί το αντίστοιχο γλυκοζυλιωμένο προϊόν 4a, 5a, 6a με υψηλότερη πολικότητα (Εικ. 3). Η ανάλυση HRESI-MS έδειξε ότι οι κορυφές ιόντων των προϊόντων ήταν όλες κατά 162 amu μεγαλύτερες από αυτές των υποστρωμάτων, υποδηλώνοντας ότιCtUGT1θα μπορούσε να καταλύσει τη γλυκοζυλίωση αυτών των ενώσεων για να σχηματίσει το αντίστοιχο μονογλυκοζιδικό προϊόν τους. Τα ποσοστά μετατροπής 4, 5 και 6 ήταν 4,12 τοις εκατό , 14,14 τοις εκατό και 23,33 τοις εκατό, αντίστοιχα (Πίνακας 1).

Η επιλεκτικότητα δότη ζάχαρης τουCtUGT1εξερευνήθηκε επίσης. Εκτός από το UDPG, έξι άλλοι δότες, συμπεριλαμβανομένων των UDP-N-ακετυλογαλακτοζαμίνης, UDP γαλακτόζης, GDP-μαννόζης, GDP-φουκόζης, UDP-γαλακτουρονικού οξέος και UDP ραμνόζης, δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας υποστρώματα 1-6 ως δέκτες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότιCtUGT1αποκλειστικά επιλεγμένο UDPG ως δότης ζάχαρης. Δεν παρατηρήθηκε προϊόν όταν δοκιμάστηκαν άλλα ενεργοποιημένα σάκχαρα (τα δεδομένα δεν φαίνονται).

3.4. Βιοχημικές ιδιότητες και κινητικές παράμετροι του CtUGT1

Βιοχημικές ιδιότητες τουCtUGT1διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας το 3 ως δέκτη ζάχαρης και το UDPG ως δότη ζάχαρης όπως φαίνεται στο Σχ. 4. Δραστηριότητα κατάλυσηςCtUGT1δοκιμάστηκε σε ένα εύρος θερμοκρασίας 4–60 ◦C, η βέλτιστη δραστηριότητα εντοπίστηκε στους 37 ◦C (Εικ. 4Α). Η ανάλυση της ενζυμικής δραστηριότητας μεταξύ ρΗ 3.0 και 9.0 έδειξε ότι η βέλτιστη τιμή ρΗ παρατηρήθηκε σε ρΗ 8.0 (ρυθμιστικό διάλυμα 100 mM KH2PO4-K2HPO4, Σχ. 4C). Η απόδοση του προϊόντος γλυκοζυλίωσης 3a αυξήθηκε γραμμικά μέσα σε 1 ώρα και ο ρυθμός ανάπτυξης εξομαλύνθηκε μετά από 5 ώρες (Σχ. 4Β). Η φαινομενική τιμή Km τουCtUGT1για το 3 ήταν 218,7 ± 7,176 μM και το Vmax ήταν 0.02255 ± 0,0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1.

3.5. Ενζυματική παρασκευή και δομική ταυτοποίηση γλυκοζυλιωμένων προϊόντων

Με βάση τα αποτελέσματα των ενζυμικών δοκιμών,CtUGT1τείνει να είναι μια ειδική γλυκοζυλοτρανσφεράση που θα μπορούσε να καταλύσει τη γλυκοζυλίωση διαφορετικών ειδών φυσικών προϊόντων. Οι πληροφορίες HPLC-HR-MS των προϊόντων συνοψίστηκαν στον Πίνακα 1. Μεταξύ αυτών, τα υποστρώματα κουμαρίνης εμφάνισαν σημαντικό ρυθμό μετατροπής. Η ενζυμική δράση έναντι των κουμαρινών αναλύθηκε περαιτέρω. Πρέπει να σημειωθεί ότι και τα τρία ελεγμένα υποστρώματα κουμαρίνης έγιναν αποδεκτά απόCtUGT1έχουν μια ομάδα υδροξυλίου στη θέση C-7, ενώ η εσκουλετίνη (2) έχει μια επιπλέον ομάδα υδροξυλίου στη θέση C-6. Το προφίλ HPLC του γλυκοζυλιωμένου προϊόντος της εσκουλετίνης φαίνεται στο Σχήμα 2. Παρατηρήθηκε μόνο ένα προϊόν, υποδηλώνοντας ότι η αντίδραση γλυκοζυλίωσης έλαβε χώρα ειδικά στη θέση C-6 ή C-7. Για να επιβεβαιωθεί η θέση γλυκοζυλίωσης, το προϊόν 2a ταυτοποιήθηκε με σύγκριση με τους αυθεντικούς γλυκοζίτες με ανάλυση HPLC-UV/HRESI-MS. Κατά την προσθήκη του αυθεντικού γλυκοζίτη κιχοριΐνη (γλυκοζυλιωμένη στη θέση 7-ΟΗ του 2) στο σύστημα αντίδρασης, η κορυφή επικαλύπτεται με 2a, προφίλ co-HPLC περαιτέρω επιβεβαίωσε ότι το γλυκοζυλιωμένο προϊόν του 2 καταλύεται απόCtUGT1είναι η κιχοριίνη [33], η οποία απέδειξε ότι το τμήμα γλυκοζυλίου μεταφέρθηκε ειδικά στη θέση C7-ΟΗ. Το προϊόν 1α ταυτοποιήθηκε επίσης σε σύγκριση με το πρότυπο αναφοράς. Τα φάσματα UV-HPLC μαζί με την ανάλυση co-HPLC (Εικ. 2) αποκάλυψαν ότι η χημική δομή του 1a αποδόθηκε ως skimming [34], το οποίο είναι το γλυκοζυλιωμένο προϊόν του 1 στη θέση C7-ΟΗ.

Το προϊόν 3α παρασκευάστηκε από μια κλιμακούμενη αντίδραση και χαρακτηρίστηκε δομικά με φασματοσκοπία HRESI-MS, 1Η NMR και 13C NMR (Σχήματα S13, S14 και Σημείωση 4). Στο σήμα 1H NMR, σε σύγκριση με το υπόστρωμα 3, ένα σήμα φαινολικού υδροξυλίου στη θέση C{{1{{0}} εξαφανίστηκε και το σήμα άνθρακα του C-7 μετατοπίστηκε δ 1.{{25} } ppm στο υψηλό πεδίο, ενώ τα σήματα C-6 και C-8 μετατοπίστηκαν στο χαμηλό πεδίο σε 13C NMR. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαίωσαν ότι το υπόλειμμα γλυκοπυρανοσυλίου ήταν προσκολλημένο στη φαινολική υδροξυλομάδα στη θέση C-7 του 3 [35]. Επιπλέον, το φάσμα 1Η NMR έδειξε ανωμερικά σήματα πρωτονίων σε δΗ 5.00 (1Η, d, J=7.0 Hz); το συστατικό σακχάρου υποδείχθηκε ότι είναι -D-γλυκοπυρανόζη. Αυτό το αποτέλεσμα αποδείχθηκεCtUGT1είναι μια Ο-γλυκοζυλοτρανσφεράση κουμαρίνης που καταλύει τη γλυκοζυλίωση της υδροξυ κουμαρίνης στη θέση 7-ΟΗ.

3.6. Μοντελοποίηση ομολογίας, μοριακή σύνδεση και κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση της πρωτεΐνης CtUGT1

Εκτεταμένες ενζυμικές αντιδράσεις αποκάλυψαν ότιCtUGT1θα μπορούσε να καταλύσει τη γλυκοζυλίωση τριών κουμαρινών στο αντίστοιχο γλυκοζυλιωμένο προϊόν τους και η γλυκοζυλιωμένη θέση συνέβη ειδικά στη θέση 7- ΟΗ. Να προσδιορίσει τα βασικά υπολείμματα που καθόρισαν τις δραστηριότητες κατάλυσης τουCtUGT1, διεξήχθησαν μοντελοποίηση ομολογίας, μοριακή σύνδεση και έρευνες μεταλλαξογένεσης κατευθυνόμενης θέσης του CtUGT1. Η ομόλογη μοριακή μοντελοποίηση για το CtUGT1 καθιερώθηκε χρησιμοποιώντας το SWISS-MODEL [21-25]. Η κρυσταλλική δομή της γλυκοσυλ τρανσφεράσης Medicago truncatula UGT85H2 (PDB ID 2PQ6), που προσδιορίστηκε σε ανάλυση 2,1 Α, έδειξε την υψηλότερη συνολική βαθμολογία με μέγιστη ομολογία αλληλουχίας και χαμηλή τιμή Ε, επιλέχθηκε ως δομή προτύπου [26]. Η αξιολόγηση ορθολογικότητας του καθιερωμένου μοντέλου παρουσιάστηκε στο διάγραμμα Ramachandran (Εικ. S6), το 88,5 τοις εκατό των υπολειμμάτων στο καθιερωμένο μοντέλο βρίσκονται στην πιο ευνοημένη περιοχή. Το μοντέλο ομολογίας του CtUGT1 αποτελείται από δύο παρόμοια μοτίβα πτυχώσεων τύπου Rossmann στο Ν- και C-τερματικό, αντίστοιχα (Εικ. 5Α). Η Ν-τερματική περιοχή έχει επτάκλωνα παράλληλα φύλλα γύρω από δέκα έλικες. Η Ο-τερματική περιοχή περιέχει εξάκλωνα φύλλα που πλαισιώνονται από εννέα έλικες (Εικ. 5Α, S7).

Για να διευκρινιστεί περαιτέρω η ενεργή τσέπη τουCtUGT1, πραγματοποιήθηκε μοριακή σύνδεση. Εφόσον το UGT85H2 έχει μόνο τη δομή μορφής apo, ένα άλλο ομόλογο UGT74F2 με UDP και σαλικυλικό οξύ ως δύο συνδέτες επιλέχθηκε ως το πρότυπο ελέγχου. Το UDPG παρασκευάστηκε ως δότης ζάχαρης. Δύο υποστρώματα κουμαρίνης 1 και 2 παρασκευάστηκαν ως δέκτες ζάχαρης αντίστοιχα. Οι θέσεις δέσμευσης του δότη και του δέκτη γλυκοζυλίου υπολογίστηκαν και τοποθετήθηκαν χωριστά όπως φαίνεται στο Σχήμα 5. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο θύλακες δέσμευσης βρίσκονται εντός της βαθιάς σχισμής στην περιοχή αλληλεπίδρασης της σφιχτά γεμισμένης περιοχής Ν-άκρου και C -τερματικό τομέα τουCtUGT1και χωρικά κοντά το ένα στο άλλο (Εικ. 5Α). Το C-άκρο τουCtUGT1εμπλέκεται κυρίως στην επαφή με τον δότη γλυκοζυλίου όπως περιγράφεται σε UGT άλλων φυτών, και τα περισσότερα από τα γύρω υπολείμματα είναι υδρόφιλα και εξαιρετικά διατηρημένα. Όπως το τυπικό κουτί PSPG, το υπόλειμμα W377 σε αυτό το μοτίβο θα μπορούσε να σχηματίσει δεσμούς υδρογόνου με την ομάδα γλυκόζης του UDPG (Εικ. 5Β). Τα N378 και S379 σε αυτό το μοτίβο θα μπορούσαν να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου με τη διφωσφορική ομάδα του UDPG (Εικ. 5Β). Επιπλέον, σύμφωνα με τα αποτελέσματα σύνδεσης, τα υπολείμματα των W356 και Q359 μπορεί να αλληλεπιδράσουν με την ομάδα ουριδίνης μέσω αλληλεπίδρασης δεσμού υδρογόνου για να σταθεροποιήσουν τον δότη στον ενεργό θύλακα. Για να επαληθευτεί η λειτουργία αυτών των προβλεπόμενων βασικών υπολειμμάτων, επιλέχθηκαν συνολικά 16 θέσεις και υποβλήθηκαν σε μεταλλαξιογένεση σάρωσης αλανίνης. Οι δραστηριότητες κατάλυσης αυτών των μεταλλαγμάτων δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας και τα έξι θετικά υποστρώματα που αναφέρθηκαν παραπάνω. Οι αναλύσεις HPLC έδειξαν ότι, όταν τα υπολείμματα των G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397 και D398 μεταλλάχθηκαν στη δραστηριότητα της γλυκοζυλίωσης της πρωτεΐνης, εντελώς χαμένο σε όλα τα ελεγμένα υποστρώματα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα παραπάνω 16 υπολείμματα είναι τα βασικά υπολείμματα που καθόρισαν τη δέσμευση του δότη UDPG και τη δραστηριότητα γλυκοζυλίωσης τουCtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 τοις εκατό ) όπως τα V14, V132, E153, T212 και I209 (Εικ. S8). Προβλέπεται ότι αυτά τα υδρόφοβα υπολείμματα που περιβάλλουν τον αρωματικό δακτύλιο θα μπορούσαν να σχηματίσουν αλληλεπιδράσεις van der Waals με το υπόστρωμα στον θύλακα σύνδεσης.

4. Συζήτηση

Η γλυκοζυλίωση είναι ένα από τα πιο σημαντικά στάδια τροποποίησης σε πολλές οδούς βιοσύνθεσης δευτερογενών μεταβολιτών. Η γλυκοζυλίωση θα μπορούσε να αυξήσει τη βιοδιαθεσιμότητα των φυσικών προϊόντων βελτιώνοντας τη υδατοδιαλυτότητά τους και μειώνοντας την τοξικότητά τους. Η κουμαρίνη θεωρείται η απλούστερη μορφή σε μια τεράστια κατηγορία φυσικώς απαντώμενων φαινολικών ουσιών που κατασκευάζονται από έναν δακτύλιο πυρόνης συντηγμένο με έναν δακτύλιο βενζολίου. Τόσο οι φυσικές όσο και οι συνθετικές ενώσεις με βάση την κουμαρίνη έχουν προσελκύσει μεγάλη προσοχή από τους φαρμακοποιούς και τους επιστήμονες σχεδιασμού φαρμάκων ως συνέπεια των διαφορετικών φαρμακολογικών και βιολογικών ιδιοτήτων τους [36]. Περαιτέρω γλυκοζυλιωμένη τροποποίηση των κουμαρινών θα μπορούσε να βοηθήσει στον εμπλουτισμό της δομικής ποικιλομορφίας αυτών των ενώσεων και επίσης στη βελτίωση της διαλυτότητας και της βιοδιαθεσιμότητας τους. Στα φυτά, μια τέτοια διαδικασία γλυκοζυλίωσης καταλύεται από την UDP-γλυκοζυλοτρανσφεράση. Αν και έχουν εντοπιστεί πολλαπλά UGT από διαφορετικά φυτά, μέχρι σήμερα, τα περισσότερα από τα αναφερόμενα UGT εμπλέκονται στη γλυκοζυλιωμένη τροποποίηση των φλαβονοειδών. Μόνο περιορισμένοι UGT αναφέρθηκαν ότι μπορούσαν να δέχονται κουμαρίνες ως υποστρώματα. Σε αυτή τη μελέτη, ένα νέο γονίδιο γλυκοζυλοτρανσφεράσηςCtUGT1κλωνοποιήθηκε από το παραδοσιακό κινέζικο βότανοCistanche tubulosa. Τα αποτελέσματα της ευθυγράμμισης αλληλουχίας και της φυλογενετικής ανάλυσης έδειξαν ότιCtUGT1είναι φυλογενετικά μακριά από τα περισσότερα από τα αναφερόμενα φλαβονοειδή UGT και πολύ κοντά στα φαινυλοπροπανοειδή UGT. Εκτεταμένες ενζυμικές δοκιμασίες αποκάλυψαν ότι το CtUGT1 δεν μπορούσε να καταλύσει τη γλυκοζυλίωση των ενώσεων φαινυλαιθανόλης για να σχηματίσει PhGs, το οποίο είναι το κύριο χημικό συστατικό τουCistanche tubulosa. Αντίθετα, θα μπορούσε να αναγνωρίσει τις κουμαρίνες ως υποστρώματά του και να διεξάγει την αντίδραση γλυκοζυλίωσης. Η διαλεύκανση της δομής των προϊόντων έδειξε ότι η θέση γλυκοζυλίωσης καταλύθηκε απόCtUGT1τοπικά συνέβη ειδικά στη θέση C7-OH των κουμαρινών. Χρησιμοποιώντας CtUGT1, τρεις γλυκοσίδες κουμαρίνης συμπεριλαμβανομένων των skimming (1a), cichoriin (2a) και 4-methylumbelliferyl glucoside (3a) συντέθηκαν επιτυχώς ενζυματικά και αναγνωρίστηκαν δομικά. Και οι τρεις αυτές ενώσεις αναφέρθηκαν ως φαρμακευτικώς δραστικά μόρια. Για παράδειγμα, το 1a έχει θεωρηθεί ότι διαθέτει διάφορες φαρμακολογικές δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένης της νενοπροστατευτικής δράσης, των αντιφλεγμονωδών, αντικαρκινικών και αντι αμοιβαδικών ιδιοτήτων [37]. Το 2a έδειξε υψηλή αντιβακτηριακή δράση έναντι ορισμένων Gram-θετικών βακτηρίων όπως ο Bacillus cereus και ο Staphylococcus aureus [38]. Το 3a μπορεί να βοηθήσει τα φυτά να βελτιώσουν τις ικανότητές τους απόκρισης σε χημικές ουσίες και τοξίνες [39].

Εκτός από τις κουμαρίνες, εκτενείς δοκιμές ενζύμων διαπίστωσαν ότιCtUGT1έδειξε επίσης παρατηρήσιμη δραστηριότητα γλυκοζυλίωσης προς το υπόστρωμα βενζοφαινόνης 4, το υπόστρωμα ισοφλαβόνης 5 και το υπόστρωμα ανθρακινόνης 6, γεγονός που έδειξε ότι το CtUGT1 έχει ορισμένη ανοχή υποστρώματος. Παρ 'όλα αυτά,CtUGT1δεν μπορούσε να καταλύσει τη βιοσύνθεση των συστατικών των γλυκοσιδών σεCistanche tubulosaόπως οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες (PhGs), οι λιγνανοειδείς γλυκοσίδες και οι ιριδοειδής γλυκοσίδες. Εξάλλου, σύμφωνα με τις προηγούμενες έρευνες, δεν απομονώθηκαν γλυκοσίδες κουμαρίνηςCistanche tubulosa. Έτσι, η in vivo λειτουργία τουCtUGT1χρειάζεται ακόμη περαιτέρω διερεύνηση. Η δραστηριότητα γλυκοζυλίωσης του CtUGT1 προς τα υποστρώματα κουμαρίνης καθιστά αυτό το ένζυμο χρήσιμο εργαλείο για την ενζυματική τροποποίηση γλυκοζυλίωσης των κουμαρινών και επίσης έδειξε ότι τα δευτερογενή μεταβολικά ένζυμα των φυτών θα μπορούσαν να εκτελούν ανεκτίμητες δραστηριότητες κατάλυσης που είναι πολύ πέρα ​​από τις εγγενείς λειτουργίες τους.

Δήλωση Ανταγωνιστικών Συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν συγκρούσεις συμφερόντων.

Αναγνώριση

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε οικονομικά από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών του Πεκίνου (Αρ. επιχορήγησης 7192112). Πρόγραμμα Χορηγίας Young Elite Scientists από το CAST (Αρ. επιχορήγησης CACM− 2018− QNRC1− 02); Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ. επιχορήγησης 81402809). Κρατικό Ταμείο Υποτροφιών του Συμβουλίου Υποτροφιών της Κίνας (Αρ. επιχορήγησης 201906555010) και Επιστημονικό Ίδρυμα για Ελίτ Νέους Υποτρόφους του Πανεπιστημίου Κινεζικής Ιατρικής του Πεκίνου (Αρ. επιχορήγησης 2018-JYB-XJQ006).

Παράρτημα Α. Συμπληρωματικά στοιχεία

Συμπληρωματικά δεδομένα σε αυτό το άρθρο μπορείτε να βρείτε στο διαδίκτυο στη διεύθυνση https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

Από: « Μοριακή κλωνοποίηση και βιοχημικός χαρακτηρισμός μιας νέας γλυκοζυλοτρανσφεράσης της κουμαρίνηςCtUGT1απόCistanche tubulosa' μεXiping Xu, et al

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

βιβλιογραφικές αναφορές

[1] Y. Li, S. Baldauf, EK Lim, DJ Bowles, Phylogenetic analysis of the UDPglycosyltransferase multigene family of Arabidopsis thaliana, J. Biol. Chem. 276 (2001) 4338–4343, https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200.
[2] LF Mackenzie, Q. Wang, RAJ Warren, SG Withers, Glycosynthases: mutant glycosidases for oligosaccharide synthesis, J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 5583–5584, https://doi.org/10.1021/ja980833d.
[3] CJ Thibodeaux, CE Melancon, HW Liu, Unusual sugar biosynthesis and natural product glycodiversification, Nature 446 (2007) 1008–1016, https://doi.org/ 10.1038/nature05814.
[4] Y. Ji, B. Li, M. Qiao, J. Li, H. Xu, L. Zhang, X. Zhang, Advances on the in vivo και in vitro glycosylations of flavonoids, Appl. Microbiol. Biotechnol. 104 (2020) 6587–6600, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] T. Koeduka, Y. Ueyama, S. Kitajima, T. Ohnishi, K. Matsui, Molecular cloning and characterization of UDP-glucose: volatile benzenoid/phenylpropanoid glucosyltransferase in petunia flowers, J. Plant Physiol. 252 (2020) 153245, https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245.
[6] S. Rahimi, J. Kim, I. Mijakovic, KH Jung, G. Choi, SC Kim, YJ Kim, Triterpenoid-biosynthetic UDP-glycosyltransferases from plants, Biotechnol. Adv. 37 (2019) 107394, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
[7] G. Singh, YV Dhar, MH Asif, P. Misra, Exploring the functional significance of sterol glycosyltransferase enzymes, Prog. Lipid Res. 69 (2018) 1–10, https://doi. org/10.1016/j.plipres.2017.11.001.
[8] KF McCue, PV Allen, LV Shepherd, A. Blake, J. Whitworth, MM Maccree, DR Rockhold, D. Stewart, HV Davies, WR Belknap, Η πρωτογενής in vivo στεροειδές αλκαλοειδές γλυκοζυλοτρανσφεράση από πατάτα, Φυτοχημεία. 67 (2006) 1590–1597, https://doi.org/10.1016/j.phytochem.
[9] J. Yu, L. Wang, RL Walzem, EG Miller, LM Pike, BS Patil, Αντιοξειδωτική δράση λιμονοειδών, φλαβονοειδών και κουμαρινών εσπεριδοειδών, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 2009–2014, https://doi.org/10.1021/jf0484632.
[10] HJ Cho, SG Jeong, JE Park, JA Han, HR Kang, D. Lee, MJ Song, Αντιϊκή δράση της αγγελισίνης κατά των ιών γάμμαερπης, Antivir. Res. 100 (2013) 75–83, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009.
[11] Z. Xu, Q. Chen, Y. Zhang, C. Liang, Παράγωγα με βάση την κουμαρίνη με ισχυρή δράση κατά του HIV, Fitoterapia. 150 (2021) 104863, https://doi.org/10.1016/j. fitote.2021.104863.
[12] AT Mossa, TM Heikal, M. Belaiba, EG Raoelison, H. Ferhout, J. Bouajila, Αντιοξειδωτική δραστηριότητα και ηπατοπροστατευτικό δυναμικό του Cedrelopsis grevei στο οξειδωτικό στρες και ηπατική βλάβη που προκαλείται από κυπερμεθρίνη σε αρσενικούς ποντικούς, Συμπλήρωμα BMC. Εναλλακτική. Med. 15 (2015) 251, https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2.
[13] Y. Bansal, P. Sethi, G. Bansal, Coumarin: ένας πιθανός πυρήνας για αντιφλεγμονώδη μόρια, Med. Chem. Res. 22 (2013) 3049–3060, https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6.
[14] M. Kumar, R. Singla, J. Dandriyal, V. Jaitak, Παράγωγα κουμαρίνης ως αντικαρκινικοί παράγοντες για θεραπεία καρκίνου του πνεύμονα: ανασκόπηση, Anti Cancer Agents Med. Chem. 18 (2018) 964–984, https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926.
[15] A. Stefanachi, F. Leonetti, L. Pisani, M. Catto, A. Carotti, Coumarin: a natural, privileged and versatile scaffold for bioactive compounds, Molecules 23 (2018) 250, https://doi.org /10.3390/molecules23020250.
[16] T. Taguchi, N. Ubukata, H. Hayashida, M. Yamamoto, Okazaki, κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός μιας γλυκοζυλοτρανσφεράσης που αντιδρά σε 7-υδροξυλική ομάδα φλαβονόλης και 3-υδροξυλική ομάδα κουμαρίνης από καπνοκύτταρα, Αρχ. Biochem. Biophys. 420 (2003) 95–102, https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027.
[17] L. Zhou, T. Tian, ​​B. Xue, L. Song, L. Liu, R. Yu, Biosynthesis of coumarin glycosides by transgenic hairy roots of Polygonum multiflorum, Biosci. Biotechnol. Biochem. 76 (2012) 1008–1010, https://doi.org/10.1271/bbb.110347.
[18] H. Kanoh, M. Kawauchi, M. Kuroyanagi, T. Arima, Molecular cloning and characterization of coumarin glucosyltransferase in hairy roots of Pharbitis nil (Ipomoea nil), Plant Tissue Cult. Κάτοικος της Λατβίας. 31 (2014) 21–28, https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a.
[19] JB He, P. Zhao, ZM Hu, S. Liu, Y. Kuang, M. Zhang, B. Li, CH Yun, X. Qiao, M. Ye, Molecular and structural characterization of a promiscuous Cglycosyltransferase from Trollius Chinensis, Angew. Chem. Int. Εκδ. Eng. 58 (2019) 11513–11520, https://doi.org/10.1002/anie.201905505.
[20] S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis έκδοση 7.0 για μεγαλύτερα σύνολα δεδομένων, Μολ. Biol. Evol. 33 (2016) 1870–1874, https://doi. org/10.1093/molbev/msw054.
[21] A. Waterhouse, M. Bertoni, S. Bienert, G. Studer, G. Tauriello, R. Gumienny, FT Heer, TAP de Beer, C. Rempfer, L. Bordoli, R. Lepore, T. Schwede, SWISS-MODEL: μοντελοποίηση ομολογίας πρωτεϊνικών δομών και συμπλεγμάτων, Nucleic Acids Res. 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427.
[22] N. Guex, MC Peitsch, T. Schwede, Automated comparative protein structure modeling with SWISS-MODEL and Swiss-Pdb viewer: a history view, Electrophoresis 30 (2009) S162–S173, https://doi.org/ 10.1002/elps.200900140.
[23] S. Bienert, A. Waterhouse, TAP de Beer, G. Tauriello, G. Studer, L. Bordoli, T. Schwede, The SWISS-MODEL repository-new features and functionality, Nucleic Acids Res. 45 (2017) D313–D319, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132.
[24] G. Studer, C. Rempfer, AM Waterhouse, G. Gumienny, J. Haas, T. Schwede, QMEANDisCo-distance περιορισμοί που εφαρμόζονται στην εκτίμηση ποιότητας μοντέλου, Βιοπληροφορική. 36 (2020) 1765–1771, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btz828.
[25] M. Bertoni, F. Kiefer, M. Biasini, L. Bordoli, T. Schwede, Modeling protein τεταρτοταγούς δομής ομο- και ετερο-ολιγομερών πέρα ​​από τις δυαδικές αλληλεπιδράσεις με ομολογία, Sci. Rep. 7 (2017) 10480, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8.
[26] L. Li, LV Modolo, LL Escamilla-Trevino, L. Achnine, RA Dixon, X. Wang, the Crystal structure of Medicago truncatula UGT85H2-insights into the structural based a multifunctional (iso)flavonoid γλυκοζυλοτρανσφεράση, J. ΜοΙ. Biol. 370 (2007) 951–963, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036.
[27] R. Lüthy, JU Bowie, D. Eisenberg, Assessment of protein models with three-dimension profiles, Nature 356 (1992) 83–85, https://doi.org/10.1038/ 356083a0.
[28] RA Laskowski, MW MacArthur, DS Moss, JM Thornton, PROCHECK: ένα πρόγραμμα για τον έλεγχο της στερεοχημικής ποιότητας των πρωτεϊνικών δομών, J. Appl. Crystallogr. 26 (1993) 283–291, https://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
[29] O. Trott, AJ Olson, AutoDock Vina: βελτίωση της ταχύτητας και της ακρίβειας της σύνδεσης με μια νέα λειτουργία βαθμολόγησης, αποτελεσματική βελτιστοποίηση και πολλαπλών νημάτων, J. Comput. Chem. 31 (2010) 455–461, https://doi.org/10.1002/jcc.21334.
[30] AM George Thompson, CV Iancu, KE Neet, JV Dean, JY Choe, Differences in salicylic acid glucose conjugations by UGT74F1 and UGT74F2 from Arabidopsis thaliana, Sci. Απ. 7 (2017) 46629, https://doi.org/10.1038/srep46629.
[31] T. Vogt, P. Jones, Glycosyltransferases in plant natural product synthesis: χαρακτηρισμός οικογένειας υπεργονιδίων, Trends Plant Sci. 5 (2000) 380–386, https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9.
[32] A. Kubo, Y. Arai, S. Nagashima, T. Yoshikawa, Alteration of sugar donator specificities of plant glycosyltransferases by a single point mutation, Arch. Biochem. Biophys. 429 (2004) 198–203, https://doi.org/10.1016/j. αββ.2004.06.021.
[33] H. Kanho, S. Yaoya, T. Itani, T. Nakane, N. Kawahara, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Glucosylation of phenolic compounds by Pharbitis nil hairy roots: I. Glucosylation of coumarin και παράγωγα φλαβονών, Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (2004) 2032–2039, https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032.
[34] J. Bjerre, EH Nielsen, M. Bols, Hydrolysis of toxic natural glucosides catalysed by cyclodextrin dicyanohydrins, Eur. J. Org. Chem. 2008 (2010) 745–752, HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954.
[35] B. Xue, LB Zhou, JW Liu, RM Yu, Biotransformation of hydroxycoumarin παράγωγα από καλλιεργημένα αιωρήματα κυττάρων Catharanthus roseus, Pharmazie 67 (2012) 467–471, https://doi.org/10.1691217. .
[36] T. Al-Warhi, A. Sabt, EB Elkaeed, WM Eldehna, Πρόσφατες εξελίξεις των αντικαρκινικών παραγόντων που βασίζονται σε κουμαρίνη: μια ενημερωμένη ανασκόπηση, Bioorg. Chem. 103 (2020) 104163, https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163.
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, Effects of a coumarin παράγωγο, 4-methylumbelliferone, on seed germination and seedling install in Arabidopsis, J. Chem. Ecol. 37 (2011) 880–890, https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3.
[38] K. Xu, ZM Feng, YN Yang, JS Jiang, PC Zhang, Οκτώ νέα σεσκιτερπενοειδή τύπου eudesmane και eremophilane από Atractylodes lancea, Fitoterapia. 114 (2016) 115–121, https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017.
[39] Y. Lou, H. Wu, J. Zheng, X. He, Z. Wu, X. Lu, Y. Qiu, Determination and pharmacokinetic study of skimming by UHPLC-MS/MS in rat plasma, J. Pharm . Biomed. Πρωκτικός. 179 (2020) 112969, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969.