Το MicroRNA που προέρχεται από το εξώσωμα γάλακτος-2478 καταστέλλει τη μελανογένεση μέσω της οδού Akt-GSK3

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ο In-Seon Bae και ο Sang Hoon Kim

Αφηρημένη:Τα εξωσώματα συμμετέχουν στη διακυτταρική επικοινωνία μεταφέροντας μόρια από κύτταρα δότες προς δέκτη. Τα εξωσώματα βρίσκονται σε διάφορα σωματικά υγρά, συμπεριλαμβανομένου του αίματος, των ούρων, του εγκεφαλονωτιαίου υγρού και του γάλακτος. Τα εξωσώματα του γάλακτος περιέχουν πολλά ενδογενή μόρια microRNA. Τα MicroRNA είναι μικρά μη κωδικοποιητικά RNA και έχουν σημαντικούς ρόλους σε βιολογικές διεργασίες. Οι συγκεκριμένες βιολογικές λειτουργίες των εξωσωμάτων γάλακτος δεν είναι καλά κατανοητές. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τις επιπτώσεις τουγαλακτοσώματαγια την παραγωγή μελανίνης σε κύτταρα μελανώματος και μελανοκύτταρα. Το βρήκαμετα εξωσώματα του γάλακτος μειώθηκανπεριεχόμενα μελανίνης, δραστηριότητα τυροσινάσης και έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη μελανογένεση των κυττάρων του μελανώματος και των μελανοκυττάρων. Το ειδικό για τα βοοειδή miR-2478 σε εξωσώματα ανέστειλε την παραγωγή μελανίνης. Βρήκαμε ότι το Rap1a είναι ένα άμεσο γονίδιο στόχο του miR-2478 σε κύτταρα μελανώματος και μελανοκύτταρα. Η υπερέκφραση του MiR μείωσε την έκφραση Rap1a, η οποία οδήγησε σε μειωμένη ρύθμιση της παραγωγής μελανίνης και στην έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με τη μελανογένεση. Η αναστολή της έκφρασης Rap1a μειώθηκεμελανογένεσημέσω της οδού σήματος Akt-GSK3. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τον ρόλο του miR-2478 που προέρχεται από τα γαλακτοσώματα ως ρυθμιστή τουμελανογένεσημέσω άμεσης στόχευσης του Rap1a. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα εξωσώματα του γάλακτος θα μπορούσαν να είναι χρήσιμα καλλυντικά συστατικά για βελτίωσηλεύκανση.

Λέξεις-κλειδιά: μελανογένεση;εξωσώμα γάλακτος; miR-2478; Rap1a

βότανα κιστανάκιαείναι συστατικό που αναστέλλει τη μελανίνη

1. Εισαγωγή

Το Cosmeceutical είναι μια σύνθετη λέξη που συνδυάζει καλλυντικά και φαρμακευτικά προϊόντα και αναφέρεται σε καλλυντικά με λειτουργικά συστατικά που έχουν ιατρικά αποτελέσματα [1]. Στο παρελθόν, το δέρμα βελτιωνόταν μέσω δερματολογικών επεμβάσεων, αλλά πρόσφατα, το ενδιαφέρον για τα καλλυντικά έχει αυξηθεί λόγω της επιθυμίας των καταναλωτών να αποκτήσουν αυτά τα αποτελέσματα μέσω καλλυντικών. Η βιομηχανία καλλυντικών έχει επίσης δείξει αυξημένο ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια για τη χρήση νέων καλλυντικών συστατικών. 2]. Τα λειτουργικά καλλυντικά περιλαμβάνουν προϊόντα που βοηθούν στη λεύκανση του δέρματος αποτρέποντας την εναπόθεση μελανίνης στο δέρμα.

Η μελανίνη, ένα σημαντικό στοιχείο που καθορίζει το χρώμα του δέρματος και των μαλλιών, προστατεύει το δέρμα από τις υπεριώδεις ακτίνες [3]. Ωστόσο, ο υπερβολικός σχηματισμός μελανίνης προκαλεί ανομοιόμορφο τόνο του δέρματος, π.χ. κηλίδες και φακίδες [4]. Ο μεταγραφικός παράγοντας μικροφθαλμίας (MITF) είναι ένας κύριος ρυθμιστής της ανάπτυξης μελανοκυττάρων. Η τυροσινάση (TYR) είναι το πιο σημαντικό ένζυμο σύνθεσης μελανίνης. Η διαδικασία σύνθεσης μελανίνης προκαλείται από την ενεργοποίηση του TYR μέσω του MITF, το οποίο είναι ένα σημαντικό ένζυμο που εμπλέκεται στο αρχικό στάδιο της διαδικασίας σύνθεσης μελανίνης και χρησιμοποιεί τη μορφή L της τυροσίνης ή DOPA ως υπόστρωμα για να σχηματίσει μελανίνη [5].

Τα MicroRNA (miRs) είναι σύντομα μη κωδικοποιητικά RNA που συμμετέχουν σε πολλές βιολογικές διεργασίες ελέγχοντας τη μετα-μεταγραφική γονιδιακή έκφραση [6]. Μελέτες έχουν επίσης αποκαλύψει τον έλεγχο της βιοσύνθεσης μελανίνης από τα microRNA. Για παράδειγμα, έχει αναφερθεί ότι το miR-143-5p στοχεύει το γονίδιο Tak1 και μειώνει την έκφραση του MITF, αναστέλλοντας έτσι τη σύνθεση μελανίνης [7]. MiR-125b, ένας αρνητικός ρυθμιστής τουμελανογένεση, έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει το γονίδιο μελάγχρωσης SH3BP4 [8] και το miR-675 στα εξωσώματα που εκκρίνονται από τα κερατινοκύτταρα αναστέλλειμελανογένεσηστοχεύοντας το MITF [9].

Τα εξωσώματα είναι κυστίδια με μεμβράνη μεγέθους 30-200 nm και περιέχουν DNA, RNA και πεπτίδια [10]. Τα εσωτερικά συστατικά των εξωσωμάτων μπορούν να μεταδώσουν με ασφάλεια πληροφορίες σε γειτονικά ή απομακρυσμένα κύτταρα χωρίς να αποικοδομηθούν από ένζυμα σε βιολογικά υγρά, επηρεάζοντας έτσι το μικροπεριβάλλον γύρω από διάφορα κύτταρα [11].Εξωσώματα γάλακτοςείναι εξωκυτταρικά κυστίδια που προέρχονται από γάλα που είναι σταθερά στις πεπτικές διεργασίες του ανθρώπου [12]. Τα εξωσώματα που εξάγονται από το βόειο γάλα περιέχουν όχι μόνο αρκετές πρωτεΐνες, όπως η καζεΐνη και η γαλακτοσφαιρίνη, αλλά και microRNA, τα οποία λειτουργούν ως φορτίο [13-15]. Το βόειο γάλα περιέχει μικροRNA που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό, όπως miR-15b, miR-27b, miR-34a και miR-10. Αυτά τα microRNA είναι ιδιαίτερα άφθονα στο πρωτόγαλα [16].

Μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα συστατικά του γάλακτος αναστέλλουνμελανογένεσηστα μελανοκύτταρα, για παράδειγμα, πρωτεΐνες όπως η -λακτοσφαιρίνη και η κ-καζεΐνη στο γάλα ρυθμίζουν τη μελανογένεση [17,18]. Το υπερκείμενο του γάλακτος που έχει υποστεί ζύμωση Lactobacillus helveticus8-αναστέλλει τη βλάβη από την υπεριώδη ακτινοβολία και την υπερμελάγχρωση στο δέρμα [19]. Ωστόσο, δεν υπάρχει ακόμη αναφορά για το εάν τα microRNA στο βόειο γάλα εμπλέκονται στο δέρμαλεύκανση, αν και υπάρχουν 79 microRNAεξωσώματα γάλακτος[13]. Ως εκ τούτου, σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε εάν τα εξωσώματα γάλακτος που περιέχουν microRNA αναστέλλουν τη σύνθεση μελανίνης σε κύτταρα και μελανοκύτταρα μελανώματος ποντικού και ανθρώπου.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Κυτταρικής καλλιέργειας

Κύτταρα μελανώματος ποντικού B16F10 καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle Dulbecco (DMEM, Hyclone, Logan, UT, USA). Κύτταρα ΜΝΤ-1 ανθρώπινου μελανώματος αναπτύχθηκαν σε ελάχιστο απαραίτητο μέσο (MEM, Hyclone). Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10 τοις εκατό ορό εμβρύου (FBS, Hyclone, USA) και 1 τοις εκατό ενός διαλύματος πενικιλίνης-στρεπτομυκίνης. Φυσιολογικά ανθρώπινα επιδερμικά μελανοκύτταρα (NHEM, PromoCell, Heidelberg, Γερμανία) στον αριθμό 5 ή 6 διατηρήθηκαν σε ένα μέσο ανάπτυξης μελανοκυττάρων (PromoCell). Αυτά τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ◦C σε συνθήκες υγροποιημένης ατμόσφαιρας που περιείχε 5 τοις εκατό CO2.

2.2. Καθαρισμός Εξωσωμάτων

Το γάλα του εμπορίου (1 mL) φυγοκεντρήθηκε στα 2000× g για 10 λεπτό, στη συνέχεια το υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε σε 10,000× g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο γάλα διήλθε μέσω φίλτρου 0,45 μm και μετά φίλτρου 0,2 μm. Το προκύπτον διάλυμα (300 μL) αναμίχθηκε με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και 300 μL του διαλύματος καταβύθισης εξωσώματος Exoquick (Systems Biosciences, Palo Alto, CA, USA) και επωάστηκε για 30 λεπτά. Το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 x g για 30 λεπτά για να ληφθεί ένα ίζημα εξωσώματος, το οποίο στη συνέχεια επαναιωρήθηκε σε PBS. Η κατανομή μεγέθους των εξωσωμάτων προσδιορίστηκε σε Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments, Almelo, Γαλλία). Τα εξωσώματα αποθηκεύτηκαν στους -80 ◦C για περαιτέρω χρήση.

2.3. Κρυο-Ηλεκτρονική Μικροσκοπία

Ένα κλάσμα 3 μL φρέσκου εναιωρήματος εξωσωμάτων προσροφήθηκε σε ένα διάτρητο πλέγμα επικαλυμμένο με άνθρακα (2/2-3 C-flat· Protochips, Morrisville, NC, ΗΠΑ), το οποίο στη συνέχεια στυπώθηκε για 3 δευτερόλεπτα στο 4 ◦C και καταψύξτε με βουτιά χρησιμοποιώντας Vitrobot Mark IV (Thermo FisherScientific, Lafayette, CO, ΗΠΑ). Τα πλέγματα αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στη θήκη δειγμάτων κρυοπαρασκευασμάτων Gatan 626 (Gatan, Pleasanton, CA, USA). Τα δείγματα απεικονίστηκαν με ονομαστική μεγέθυνση 29,000× σε ένα κρυοηλεκτρονικό μικροσκόπιο (FEI Tecnai F20 TEM, FEI, Hillsboro, OR, ΗΠΑ), εξοπλισμένο με ένα τυπικό πιστόλι εκπομπής πεδίου (s-FEG) και μια κάμερα K2Summit (Gatan) σε τάση επιτάχυνσης 200 kV.

2.4. Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων (Δοκιμασία WST)

Κύτταρα μελανώματος (B16F10, MNT-1) και ανθρώπινα μελανοκύτταρα (NHEM) σπάρθηκαν σε 4 × 103 κύτταρα/φρεάτιο σε 96-πλάκες φρεατίων και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μεεξωσώματα γάλακτος(20 και 50 μg/mL) ή ένα μιμητικό microRNA (δικλωνικά ολιγονουκλεοτίδια RNA) για κάθε πείραμα. Στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ προσδιορισμού βελτιωμένης βιωσιμότητας κυττάρων EZ-CyTox (Daeil Lab Service, Σεούλ, Κορέα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm σε φασματοφωτόμετρο μικροπλάκας Vmax (Molecular Devices, San Jose, CA, USA).

2.5. Μέτρηση Περιεκτικότητας Μελανίνης

Κύτταρα μελανώματος και μελανοκύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή μεεξωσώματα γάλακτος(20 και 50 μg/mL) για 48 ώρες. Μετά από πλύση δύο φορές με παγωμένο PBS, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στα 2500 χ g για 10 λεπτά. Τα σφαιρίδια κυττάρων επαναιωρήθηκαν στους 90°C για 30 λεπτά σε 1 Ν NaOH που περιείχε 10 τοις εκατό διμεθυλοσουλφοξείδιο. Η συνολική περιεκτικότητα σε μελανίνη μετρήθηκε στο φασματοφωτόμετρο μικροπλακών Vmax (Molecular Devices) στα 405 nm.

2.6. Δοκιμασία δραστηριότητας τυροσινάσης

Κύτταρα μελανώματος και μελανοκύτταρα επωάστηκαν μεεξωσώματα γάλακτοςγια 48 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και λύθηκαν με PBS που περιείχε 1 τοις εκατό Triton Χ-100 και 0.1 mΜφαινυλομεθανοσουλφονυλοφθορίδιο. Μετά τη φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο συλλέχθηκε και μεταφέρθηκε σε μια πλάκα 96-πηγαδιού. Μετά την προσθήκη 0.1 ML-3,4-διυδροξυφαινυλαλανίνης, τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 ◦C για 1 ώρα. Η δραστικότητα τυροσινάσης μετρήθηκε με βάση την απορρόφηση στα 475 nm χρησιμοποιώντας το φασματοφωτόμετρο μικροπλάκας (Molecular Devices).

βότανα κιστανάκια

2.7. Ανθρώπινοι ιστοί δέρματος

Επιδερμικά ισοδύναμα που περιέχουν μελανοκύτταρα (MelanoDerm, MEL-300B) ελήφθησαν από την MatTek (Ashland, ΜΑ, ΗΠΑ) και διατηρήθηκαν σε μέσο ΕΡΙ-100-NMM-113-.Εξωσώματα γάλακτοςεφαρμόστηκαν σε ιστούς MelanoDerm τις Ημέρες 1, 3, 7, 9 και 12. Το PBS χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Οι ιστοί φωτογραφήθηκαν τις Ημέρες 3, 7, 9, 12 και 14. Η μελάγχρωση μετρήθηκε συγκρίνοντας τις αλλαγές στην τιμή L (Adobe PhotoshopCC 2015). Τα περιεχόμενα μελανίνης στον ανθρώπινο ιστό δέρματος μετρήθηκαν την Ημέρα 14 με έναν προσδιορισμό Διαλυτής μελανίνης. Εν συντομία, οι ιστοί MelanoDerm διαλυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Solvable (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 60°C. Τα δείγματα στροβιλίστηκαν και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 16.500 × g για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε στα φρεάτια μιας 96-πλάκας φρεατίου και διαβάστηκε στα 490 nm με ένα φασματοφωτόμετρο.

3. Αποτελέσματα

3.1. Χαρακτηρισμός των εξωσωμάτων που απομονώνονται από το γάλα

Για να διερευνήσουμε τα χαρακτηριστικά των εξωσωμάτων που εξάγονται από το αγελαδινό γάλα, πρώτα μετρήσαμε το μέγεθος των εξωσωμάτων με δυναμική σκέδαση φωτός. Ως αποτέλεσμα, τα εξωσώματα που εξάγονται από το γάλα βρέθηκαν να έχουν διάμετρο 80-190 nm (Εικόνα 1Α). Γιαγαλακτοσώμακαθαρισμού, το μείγμα υπερκειμένου Exoquick-γάλακτος φυγοκεντρήθηκε για να ληφθεί ένα ίζημα εξωσώματος γάλακτος. Η έκφραση των CD9, TSG101 και HSP70 ως εξωσωματικοί δείκτες ανιχνεύτηκε σε σφαιρίδια, αλλά αυτές οι πρωτεΐνες δεν υπήρχαν στο υπερκείμενο (Εικόνα 1Α). Επιπλέον, η σφαιρική μορφολογία και το μέγεθος των εξωσωμάτων επιβεβαιώθηκαν με κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία (Εικόνα 1Β). Τα εξωσώματα βρέθηκαν να έχουν στρογγυλό σχήμα με διάμετρο έως 200 nm. Στη συνέχεια, ερευνήσαμε εάν τα εξωσώματα που εξήχθησαν από το γάλα παραλήφθηκαν από τα κύτταρα. Κύτταρα B16F10 ποντικού επωάστηκαν μεεξωσώματα γάλακτοςεπισημασμένο με τη λιπόφιλη φθορίζουσα βαφή PKH26. Ως αποτέλεσμα, παρατηρήσαμε ότι τα επισημασμένα εξωσώματα ήταν παρόντα μέσα στα κύτταρα (Εικόνα S1).

3.2. Δραστηριότητα τυροσινάσης και παραγωγή μελανίνης που καταστέλλεται από εξωσώματα γάλακτος σε κύτταρα B16F10

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση των εκχυλισμένων εξωσωμάτων στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 2Α, αποκαλύψαμε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στη βιωσιμότητα των κυττάρων, ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση του εξωσώματος.

Για τη διερεύνηση των πιθανών κυττάρων του δέρματος-λεύκανσηεπίδραση τουεξωσώματα γάλακτος, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εξωσώματα γάλακτος. Βρήκαμε ότι η δραστηριότητα τυροσινάσης σε κύτταρα που εκτέθηκαν σε γαλακτοσώματα σε συγκεντρώσεις 20 ή 50 μg/mL μειώθηκε κατά 43 τοις εκατό και 59 τοις εκατό, αντίστοιχα (Εικόνα 2Β). Επειδή η μείωση της δραστικότητας του ενζύμου τυροσινάσης μπορεί να αναστείλει τη βιοσύνθεση μελανίνης, τα περιεχόμενα μελανίνης μετρήθηκαν μετά από θεραπεία με εξωσώματα γάλακτος. Σημειώσαμε την αναστολή της σύνθεσης μελανίνης σε κύτταρα που εκτέθηκαν σεεξωσώματα γάλακτος(20 ή 50 μg/mL) κατά 45 τοις εκατό και 55 τοις εκατό, αντίστοιχα (Εικόνα 2C). Επιπλέον, η έκφραση του MITF mRNA μειώθηκε καθώς η συγκέντρωση των εξωσωμάτων γάλακτος αυξήθηκε. Το επίπεδο του mRNA MITF μειώθηκε κατά 59 τοις εκατό στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 20 μg/mL εξωσώματα και κατά 84 τοις εκατό στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 50 μg/mL εξωσώματα, αντίστοιχα (Εικόνα 2Δ). Η έκφραση mRNA της τυροσινάσης (TYR) μειώθηκε επίσης κατά 49 τοις εκατό και 76 τοις εκατό στα κύτταρα που εκτέθηκαν σε αυτές τις συγκεντρώσεις εξωσωμάτων (Εικόνα 2D). Τα επίπεδα πρωτεΐνης MITF και τυροσινάσης μειώθηκαν επίσης καθώς η συγκέντρωση του γάλακτοςεξωσώματααυξήθηκε (Εικόνα 2Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα εξωσώματα γάλακτος αναστέλλουν τη μελανογένεση σε κύτταρα B16F10 ποντικιού.

3.3. Το ειδικό για τα βοοειδή miR-2478 από τα εξωσώματα γάλακτος καταστέλλει τη μελανογένεση

Προκειμένου να καθοριστεί εάν το miR-2478 προέρχεται απόεξωσώματα γάλακτοςεπηρεάζουν άμεσα τη μελανογένεση, ο αναστολέας miR-2478 διαμολύνθηκε στα κύτταρα που εκτέθηκαν σε γαλακτοσώματα (50 μg/mL). Παρουσία εξωσωμάτων γάλακτος, τα κύτταρα B16F10 που διαμολύνθηκαν με αναστολέα themiR-2478 έδειξαν σημαντικά υψηλότερη δραστηριότητα τυροσινάσης σε σύγκριση με εκείνη στον έλεγχο (Εικόνα 4Α). Τα περιεχόμενα μελανίνης ήταν επίσης υψηλότερα σε κύτταρα που έλαβαν miR-2478 αναστολέα από ότι στα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 4Β). Η έκφραση mRNA του MITF ήταν –2.{10}}φορές υψηλότερη στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αναστολέα miR 2478 από ότι στα κύτταρα ελέγχου και η έκφραση του mRNA του TYR ήταν –2-πολύ μεγαλύτερη όταν αναστέλλονταν το miR-2478 (Εικόνα 4Γ ). Τα επίπεδα των πρωτεϊνών MITF και TYR ανακτήθηκαν επίσης στα κύτταρα που εκτέθηκανεξωσώματα γάλακτοςαφού αυτά τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον αναστολέα miR-2478 (Εικόνα 4D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το miR-2478 που προέρχεται από εξωσώματα γάλακτος κατέστειλε άμεσα τη μελανογένεση σε κύτταρα μελανώματος ποντικού.

3.4. Τα εξωσώματα του γάλακτος καταστέλλουν τη μελανογένεση μέσω της οδού Akt-GSK3

Στη συνέχεια, εξετάσαμε πώς ναεξωσώματα γάλακτοςρυθμίζωμελανογένεσηγια τον εντοπισμό της σχετικής επηρεαζόμενης οδού στα κύτταρα μελανώματος. Αν και δεν είναι γνωστό εάν το Rap1a ελέγχει άμεσα τη μελανογένεση, έχει αναφερθεί ότι το Rap1a αναστέλλει τα καρκινικά κύτταρα φωσφορυλίωσης Akt [20]. Με βάση αυτές τις πληροφορίες, διερευνήσαμε εάν το Rap1a τροποποιεί το μονοπάτι Akt για προώθηση.

Στη σχετική με την Aktμελανογένεσημονοπάτι, το ενεργοποιημένο Akt επάγει τη φωσφορυλίωση του Gsk3 στο Ser9 και έτσι το απενεργοποιεί. αυτή η αλλαγή αναστέλλει τη μεταγραφική δραστηριότητα του MITF και ρυθμίζει προς τα κάτω την τυροσινάση [21,22]. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την έκφραση των Akt και GSK3 σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Rap1a siRNA. Σε αυτά τα κύτταρα, η ενεργοποίηση της φωσφορυλίωσης Akt αυξήθηκε και η ποσότητα του pGSK3 επίσης αυξήθηκε (Εικόνα 7Α). Το GSK3 απενεργοποιήθηκε με την ενεργοποίηση του Akt με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 20 ή 50 μg/mLεξωσώματα γάλακτος(Εικόνα 7Β). Τα επίπεδα των πρωτεϊνών Akt και GSK3 στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με το miR-2478μίμησαν ήταν σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα (Εικόνα 7Γ). Στη συνέχεια, δοκιμάσαμε εάν το miR-2478από τα εξωσώματα του γάλακτος επηρεάζει την οδό Akt-GSK3. Παρουσία εξωσωμάτων γάλακτος, η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Akt και GSK3 ήταν χαμηλότερη στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολέα themiR-2478 (Εικόνα 7D). Επιπλέον, η θεραπεία με τον αναστολέα AKT GSK690693 αύξησε την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται μεμελανογένεσησε κύτταρα που έχουν υποστεί επεξεργασία με εξωσώματα γάλακτος. (Εικόνα 7Ε). Αυτά τα ευρήματα σήμαιναν ότι το miR-2478 σεεξωσώματα γάλακτοςρυθμίζει προς τα κάτω το Rap1a και καταστέλλει τη μελανογένεση μέσω της οδού Akt-GSK3.

cistanche herbaλευκαντική επίδραση στο δέρμα σε αντιοξειδωτική δράση

3.8. Τα εξωσώματα του γάλακτος ανέστειλαν τη μελανογένεση σε κύτταρα ανθρώπινου μελανώματος, μελανοκύτταρα και ιστό μελανώματος

Δεδομένου ότιεξωσώματα γάλακτοςκομπλεξικόςμελανογένεσησε κύτταρα ποντικού, προσδιορίσαμε στη συνέχεια εάν τα εξωσώματα γάλακτος ήταν εξίσου αποτελεσματικά στα ανθρώπινα κύτταρα. Πρώτον, εξετάστηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων του ανθρώπινου μελανώματος MNT-1 και των ανθρώπινων μελανοκυττάρων NHEM μετά από επώαση με 20 ή 50 ug/mL εξωσωμάτων γάλακτος. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 8Α, δεν υπήρχε διαφορά στη βιωσιμότητα. Η δραστηριότητα της τυροσινάσης ανεστάλη κατά 43 τοις εκατό και 85 τοις εκατό, αντίστοιχα, σε κύτταρα ΜΝΤ-1 που εκτέθηκαν σε 20 ug/mL ή 50 ug/mL εξωσωμάτων γάλακτος (Εικόνα 8Β). Το NHEM μειώθηκε επίσης κατά 34 τοις εκατό και 66 τοις εκατό, αντίστοιχα, μέσω επεξεργασίας με 20 ug/mL ή 50 ug/mL εξωσωμάτων γάλακτος (Εικόνα 8Β). Επιπλέον, η περιεκτικότητα σε μελανίνη μετρήθηκε σε κύτταρα MNT-1 και NHEM που εκτέθηκαν σε εξωσώματα γάλακτος. Ως αποτέλεσμα, η σύνθεση μελανίνης σε κύτταρα MNT-1 που εκτίθενται σε 20 ug/mL ή 50 ug/mLεξωσώματα γάλακτοςανεστάλη κατά 37 τοις εκατό και 58 τοις εκατό, αντίστοιχα, και στα κύτταρα NHEM, η επεξεργασία εξωσώματος γάλακτος εμπόδισε τη σύνθεση μελανίνης κατά 36 τοις εκατό και 62 τοις εκατό, αντίστοιχα (Εικόνα 8Γ). Επιπλέον, η επίδραση της λεύκανσης του δέρματοςεξωσώματα γάλακτοςεπιβεβαιώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας ιστούς ανθρώπινου δέρματος. Μετά από θεραπεία με εξωσώματα γάλακτος σε ανθρώπινους ιστούς, σχετικήλεύκανση παρατηρήθηκαν επιδράσεις τις Ημέρες 3, 9, 12 και 14. Ως αποτέλεσμα, διαπιστώσαμε ότι το χρώμα του δέρματος στους εκτεθειμένους σε εξώσωμα ιστούς γάλακτος φαινόταν να είναι πιο φωτεινό από αυτό στους ιστούς ελέγχου (Εικόνα 8D). Ο βαθμός μελάγχρωσης υπολογίστηκε ως η τιμή L, η οποία είναι μια τιμή που αντιπροσωπεύει τη φωτεινότητα. Η μελάγχρωση προχώρησε πιο αργά στους ιστούς δέρματος που έλαβαν θεραπεία με εξώσωμα γάλακτος από ότι στους ιστούς του δέρματος ελέγχου (Εικόνα 8D). Η πειραματική ομάδα υποβλήθηκε σε θεραπεία μεεξωσώματα γάλακτοςέδειξε μικρότερο μέγεθος σωματιδίων μελανίνης και χαμηλή ποσότητα χρωστικής μελανίνης σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 8Ε). Ως αποτέλεσμα της μέτρησης της περιεκτικότητας σε μελανίνη μετά από 14 ημέρες γάλακτος, τα εξωσώματα ανέστειλαν τη σύνθεση μελανίνης στους ανθρώπινους ιστούς (Εικόνα 8F). Επομένως, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι τα γαλακτοσώματα αναστέλλουνμελανογένεσησε ανθρώπινα κύτταρα και ιστούς.

4. Συζήτηση

Μελέτες για τη ρύθμιση των εξωσωμάτωνμελανογένεσηέχουν αναφέρει ότι τα εξωσώματα που προέρχονται από κερατινοκύτταρα έχουν λευκαντική δράση. Τα μελανοκύτταρα και τα γύρω κερατινοκύτταρα συνδέονται λειτουργικά για να σχηματίσουν μονάδες μελανίνης στην επιδερμίδα [23,24]. Οι διαλυτοί παράγοντες που προέρχονται από κερατινοκύτταρα ρυθμίζουν τη μελανογένεση των γειτονικών μελανοκυττάρων. Τα εξωσώματα που εκκρίνονται από φυσιολογικά κερατινοκύτταρα προάγουν τη μελανογένεση ρυθμίζοντας προς τα πάνω την έκφραση τουμελανογένεση-σχετικές πρωτεΐνες [23-25]. Επιπλέον, σε αλεύκανσηΜελέτη που χρησιμοποίησε εξωσώματα που εξήχθησαν από κύτταρα, αναφέρθηκε πρόσφατα ότι τα εξωσώματα που εξήχθησαν από βλαστικά/στρωματικά κύτταρα που προέρχονται από ιστό ανθρώπινου λιπώδους ιστού έδειξαν αποτελεσματικότητα φωτισμού του δέρματος σε κύτταρα μελανώματος ποντικού [26]. Υπήρξε επίσης μια αναφορά ότι τα εξωσώματα που εξάγονται από φυτά έχουν λευκαντικό αποτέλεσμα. Τα εξωκυτταρικά κυστίδια που εξήχθησαν από φύλλα και στελέχη φυτών D. morbifera εμφάνισαν αντι-μελανογόνες επιδράσεις στα κύτταρα μελανώματος ποντικού και στο υγιές ανθρώπινο δέρμα [27]. Στη μελέτη μας, διερευνήθηκε η λευκαντική επίδραση των εξωσωμάτων που προέρχονται από το γάλα.

Σε σύγκριση με τα εξωσώματα που εξάγονται από πλάσμα αίματος ή υγρό καλλιέργειας, τα εξωσώματα που προέρχονται από γάλα έχουν τα πλεονεκτήματα όχι μόνο να έχουν μεγάλες ποσότητες εξωσωμάτων που μπορούν να εξαχθούν ανά μονάδα όγκου αλλά και χαμηλή τιμή [26,27]. Επειδήεξωσώματα γάλακτοςέχουν χημική σύνθεση παρόμοια με αυτή των κυτταρικών μεμβρανών, παρουσιάζουν χαμηλότερη ανοσογονικότητα και κυτταροτοξικότητα και έχουν υψηλή βιοσυμβατότητα [28,29]. Πρόσφατα, όταν τα εξωσώματα γάλακτος χορηγήθηκαν σε ποντίκια μοντέλου κολίτιδας που προκαλείται από DSS (θειικό άλας νατρίου δεξτράνης), η έκφραση των προφλεγμονωδών κυτοκινών IL-6 και TNF μειώθηκε σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, μειώνοντας έτσι τη φλεγμονή και βελτιώνοντας τη νεκρωτική εντερίτιδα [30, 31]. Επιπλέον, η κατάποση εξωσωμάτων γάλακτος σε ένα μοντέλο ποντικού της νόσου της οστεοπόρωσης βελτίωσε την αρθρίτιδα αυξάνοντας την οστική πυκνότητα και μειώνοντας τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες [32,33]. Μέχρι στιγμής, οι επιδράσεις των εξωσωμάτων γάλακτος έχουν επικεντρωθεί σε ανοσολογικά φαινόμενα που μειώνουν τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες και στην ανάπτυξη των οστών, όπως η ανακούφιση της εντερίτιδας και η βελτίωση της οστεοπόρωσης. Σε αυτή τη μελέτη, εκτός από τη μέθοδο λήψηςεξωσώματα γάλακτος, επιβεβαιώθηκε ότι όταν εφαρμόζεται στο δέρμα, ήταν αποτελεσματικό στο δέρμαλεύκανση. Αυτό δείχνει ότι μπορεί να εφαρμοστεί για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών ενισχύοντας τη φυσιολογική δραστηριότητα χρησιμοποιώντας εξωσώματα γάλακτος στο μέλλον.

Αν και αυτή η μελέτη πρότεινε ότιεξωσώματα γάλακτοςαναστέλλωμελανογένεση, είναι ήδη γνωστό ότι οι πρωτεΐνες ορού γάλακτος όπως η καζεΐνη, η -λακτοσφαιρίνη και η -λακταλβουμίνη έχουν λευκαντική δράση. -Η λακτοσφαιρίνη μειώνει τη δραστηριότητα της τυροσινάσης στα ανθρώπινα μελανοκύτταρα [18] και η κ-καζεΐνη αναστέλλει τη μελανογένεση σε κύτταρα μελανώματος Β16 ποντικού [17]. Είναι ενδιαφέρον ότι πολλά από αυτά τα συστατικά υπάρχουν επίσης στα εξωσώματα του γάλακτος. Σύμφωνα με τα πρωτεομερή αποτελέσματα των εξωσωμάτων γάλακτος, η καζεΐνη, η -λακτοσφαιρίνη και η -λακταλβουμίνη κατανέμονται στα εξωσώματα [15,34,35]. Τα εξωσώματα του γάλακτος περιέχουν microRNAs καθώς και πρωτεΐνες. Ως αποτέλεσμα μιας μικροσυστοιχίας miRNA που χρησιμοποιεί εξωσώματα γάλακτος από τον Izumi και τους συνεργάτες του, miR{-2478, miR-1777b,miR-1777a, let-7b και miR{{16 }} κατανεμήθηκαν σε μεγάλο βαθμό στα εξωσώματα του γάλακτος [13]. Σε αυτή τη μελέτη, με εξαίρεση το miR-2478, μεταξύ αυτών των microRNA, τα miR-1777b, miR-1777a,let-7b και miR-1224 έδειξαν καμία διαφορά στη δραστηριότητα τυροσινάσης από την ομάδα ελέγχου (Εικόνα S2). Το miR-2478 ήταν πιο άφθονοεξωσώματα γάλακτοςκαι μειωμένη δραστηριότητα τυροσινάσης. Ωστόσο, η έκφραση των γονιδίων MITF και TYR που σχετίζονται με τη λεύκανση μειώθηκε περισσότερο στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία μεεξωσώματα γάλακτοςπαρά στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με το miR-2478. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι πολλά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων των microRNA στα γαλακτοσώματα, εμπλέκονται στολεύκανσηδράση.

Τα περισσότερα από τα microRNA στα εξωσώματα του γάλακτος ασκούν βιολογικές λειτουργίες αναστέλλοντας την έκφραση των γονιδίων-στόχων στα κύτταρα-δέκτες. Σε αυτήν τη μελέτη, το miR-2478 ανέστειλε επίσης τη σύνθεση μελανίνης στοχεύοντας το Rap1a ως γονίδιο στόχο. Αν και δεν ήταν microRNA που προέρχονται από το γάλα, έχουν ήδη αναφερθεί microRNA που ελέγχουν την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη λεύκανση. Όταν η ανθρώπινη μίμηση miR-27a-3p εφαρμόστηκε σε μελανοκύτταρα ποντικού, ανέστειλε την έκφραση Wnt3a και ως εκ τούτου ανέστειλε τη σύνθεση μελανίνης [36] και το έκτοπο miR-218 ανέστειλε τη δραστηριότητα TYR μειώνοντας την έκφραση MITF σε μελανοκύτταρα μελανώματος ποντικού [37]. Το miR{10}} προωθείμελανογένεσημέσω της οδού CREB1/MITF/Rab27 στοχεύοντας το Kif5b στο μελάνωμα [38]. Υπάρχουν 79 microRNA στα εξωσώματα του γάλακτος

microRNAs σεεξωσώματα γάλακτοςπου προέρχεται από αγελάδες [13]. Ως εκ τούτου, απαιτείται περαιτέρω έρευνα σχετικά με τη φυσιολογική δραστηριότητα των εξωσωμάτων γάλακτος.

5. Συμπεράσματα

Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότιεξωσώματα γάλακτοςείναι υποψήφιοι για αντι-μελανογόνους παράγοντες που μειώνουν τη μελάγχρωση αναστέλλοντας την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη μελανίνη (Εικόνα 10). Στα κύτταρα και τα μελανοκύτταρα μελανώματος, τα εξωσώματα γάλακτος έδειξαν αναστολή TYR και μείωση της περιεκτικότητας σε μελανίνη σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο. Επιπλέον, αυτά τα αποτελέσματα διαμεσολαβήθηκαν από το miR-2478 απόεξωσώματα γάλακτος. Ως εκ τούτου, τα εξωσώματα γάλακτος μπορεί να είναι χρήσιμα για την ανάπτυξη λειτουργικώνλεύκανσηκαλλυντικά με χαμηλή κυτταροτοξικότητα.

κιστανάκιλευκαντική επίδραση στο δέρμα σε αντιοξειδωτική δράση