Ο ιασμονικός μεθυλεστέρας προκαλεί χαρακτηριστικές αποκρίσεις υδρολυόμενης τανίνης, φαβονοειδών και φυτο-οξυλιπίνης σε φύλλα ροδιού (Punica Granatum L.) Μέρος 1

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη:Ο ιασμονικός μεθυλεστέρας (MeJA) που παράγεται στα φυτά μπορεί να μεσολαβήσει στην απόκρισή τους στις περιβαλλοντικές πιέσεις. Η εξωγενής εφαρμογή του MeJA έχει επίσης αποδειχθεί ότι ενεργοποιεί μονοπάτια σηματοδότησης και προκαλεί συσσώρευση φυτοαλεξίνης σε πολλά είδη φυτών. Για να κατανοήσουμε πώς τα φυτά της ροδιάς ανταποκρίνονται βιοχημικά στις περιβαλλοντικές πιέσεις, διεξήχθη ανάλυση μεταβολιτών σε φύλλα ροδιού που υποβλήθηκαν σε εφαρμογή MeJA και αποκάλυψε μοναδικές αλλαγές στις υδρολυόμενες τανίνες, τα φλαβονοειδή και τις φυτο-οξυλιπίνες. Επιπρόσθετα, οι αναλύσεις μεταγραφής και qPCR σε πραγματικό χρόνο των φύλλων ροδιού που υποβλήθηκαν σε ψεύτικη και MeJA αγωγή εντόπισαν διαφορικά εκφραζόμενα μεταβολικά γονίδια και παράγοντες μεταγραφής που πιθανώς εμπλέκονται στον έλεγχο τηςυδρολυόμενομονοπάτια ταννίνης, φλαβονοειδών και φυτο-οξυλιπίνης. Μοριακός, βιοχημικός και βιοπληροφορικός χαρακτηρισμός του μοναδικούλιποξυγενάσημε παρατεταμένη, επαγόμενη από MeJA έκφραση έδειξε ότι είναι ικανό να οξειδώνει πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, αν και δεν βρίσκεται στο υποκυτταρικό διαμέρισμα όπου παρήχθησαν μη ιασμονικές (μη JA) φυτο-οξυλιπίνες. Αυτά τα αποτελέσματα συλλογικά πρότειναν ότι ενώ η ευρεία καταστολή των φλαβονοειδών και των ανθοκυανινών ελέγχεται τουλάχιστον εν μέρει σε μεταγραφικό επίπεδο, η επαγόμενη βιοσύνθεση μη-JAΦυτο-οξυλιπίνεςπιθανότατα δεν ρυθμίζεται μεταγραφικά. Συνολικά, η καλύτερη κατανόηση του τρόπου με τον οποίο τα φύλλα του ροδιού ανταποκρίνονται στις περιβαλλοντικές πιέσεις όχι μόνο θα προάγει την υγεία και την παραγωγικότητα των φυτών, αλλά θα έχει επίσης αντίκτυπο στην ανθρώπινη υγεία καθώς οι καρποί που παράγονται από φυτά ροδιού αποτελούν πλούσια πηγή θρεπτικών ενώσεων.

Λέξεις-κλειδιά:Ιασμονικός μεθυλεστέρας.Φλαβονοειδές·Ανθοκυανίνη· Λιπαρά οξύ.Φυτο-οξυλιπίνη·Λιποξυγενάση

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Εισαγωγή

Όταν τραυματίζονται ή δέχονται επίθεση από φυτοφάγα και παθογόνα, τα φυτά παράγουν και εκπέμπουν ιασμονικό μεθύλιο (MeJA), το οποίο γίνεται αντιληπτό από μη τραυματισμένους φυτικούς ιστούς και γειτονικά φυτά ότι ενεργοποιεί την αμυντική απόκριση (Cheong and Choi 2003). Επιπλέον, η εξωγενής εφαρμογή του MeJA σε ένα φυτό έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί μονοπάτια σηματοδότησης καθώς και την παραγωγή πρωτεϊνών που σχετίζονται με την παθογένεση και χημικών άμυνας γνωστών ως φυτοαλεξίνες. Οι φαινολικές φυτοαλεξίνες, π.χ. φλαβονοειδή και ανθοκυανίνες, έχουν παρουσιάσει αυξημένη συσσώρευση ως απόκριση στη θεραπεία με MeJA σε διάφορα φυτά, όπως Arabidopsis thaliana, σταφύλι (Vitis vinifera), μπανάνα (Musa acuminate), μήλο (Malus Domestica) και κόκκινο βατόμουρο (Rbusu). )(Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret al.2012; Shafiq et al.2011; Flo-res and Ruiz del Castillo 2014). Η βιοσύνθεση φλαβονοειδών και ανθοκυανινών ξεκινά με το σχηματισμό ναριγγενίνης χαλκόνης από κουμαροϋλ CoA και τριών μορίων μηλονυλ CoA που καταλύεται από συνθάση χαλκόνης (CHS) και τον επακόλουθο ισομερισμό της χαλκόνης ναριγγενίνης σε ναριγγενίνη από τη χαλκόνη (CHS). Στη συνέχεια, η ναριγγενίνη χρησιμοποιείται για τη δημιουργία των σκελετών του πυρήνα των φλαβονοειδών και της ανθοκυανίνης, οι οποίοι τροποποιούνται περαιτέρω με λειτουργικές ομάδες γλυκοζυλίου, μεθυλίου, υδροξυλίου και πρενυλίου για να δημιουργήσουν διαφορετικές δομές και λειτουργίες (Tian et al. 2008).

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει την ανοσία

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75 τοις εκατό ομοιότητα) και δεν περιέχουν πεπτίδιο σήματος, ενώ τα LOX τύπου II έχουν μια συνολική χαμηλή ομοιότητα αλληλουχίας (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Το ρόδι (Punica granatum L.) είναι μια ειδική κηπευτική καλλιέργεια που εκτιμάται για τις άφθονες φαινολικές ενώσεις στον καρπό της, όπως φλαβονοειδή, ανθοκυανίνες και υδρολυόμενες τανίνες (HTs) που προέρχονται από ένα ενδιάμεσο της οδού σικιμικού (Ono et al.201). ). Πολλές μελέτες έχουν εστιάσει μέχρι στιγμής στο ρόλο των φαινολικών ουσιών του ροδιού στην ανακούφιση από το στρες και τις ασθένειες στον άνθρωπο (Wu and Tian 2017). Αντίθετα, λίγα είναι γνωστά για τη λειτουργία των φαινολικών και άλλων φυτοχημικών στην υπεράσπιση του ροδιού έναντι αβιοτικών και βιοτικών παραγόντων (π.χ. τραυματισμό, παθογόνα, επαγωγή MeJA) σε φύλλα και καρπούς. Δύο πρόσφατες αναφορές αξιολόγησαν τη θεραπεία MeJA πριν από τη συγκομιδή σχετικά με την ποιότητα των καρπών του ροδιού μετά τη συγκομιδή (Koushesh Saba και Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). Οι συνολικές ανθοκυανίνες, φλαβονοειδή και φαινολικά συστατικά των καρπών που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MeJA, αλλά όχι των φύλλων, αναλύθηκαν συλλογικά χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο. Μία από τις μελέτες ανέλυσε επίσης μεμονωμένες ανθοκυανίνες χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας (Garcia-Pastor et al.2020). Ωστόσο, παραμένει ασαφές πώς οι φυτικοί ιστοί του ροδιού, είτε φύλλα είτε καρποί, ανταποκρίνονται στις περιβαλλοντικές πιέσεις πριν από την καρπόδεση.

Για να ξεκινήσουμε την ανατομή των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των φυτών της ροδιάς και των περιβαλλοντικών παραγόντων, διερευνήσαμε τη μεταβολική απόκριση των φύλλων του ροδιού στην εξωγενή εφαρμογή MeJA χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) και διαδοχική φασματομετρία μάζας ιονισμού υγρής χρωματογραφίας-ηλεκτροψεκασμού (LC-ESI-MS/MS) . Μοναδικές αλλαγές σε HTs, φλαβονοειδή και ανθοκυανίνες, καθώς και αλλαγές στα λιπίδια, τα λιπαρά οξέα και τις φυτο-οξυλιπίνες παρατηρήθηκαν σε φύλλα ροδιού που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MeJA. Η συγκριτική ανάλυση μεταγραφώματος, που επικυρώθηκε με ανάλυση qPCR σε πραγματικό χρόνο, αποκάλυψε ότι τα δομικά ή/και ρυθμιστικά γονίδια που εμπλέκονται στον μεταβολισμό της HT, των φλαβονοειδών, της ανθοκυανίνης και της φυτο-οξυλιπίνης εκφράστηκαν διαφορικά σε φύλλα ροδιού που είχαν υποστεί ψεύτικη και MeJA-επεξεργασία. Το μόνο γονίδιο LOX που εμφάνισε μια παρατεταμένη ρυθμισμένη προς τα πάνω έκφραση σε φύλλα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MeJA υποβλήθηκε σε περαιτέρω μοριακό, βιοχημικό και φυλογενετικό χαρακτηρισμό.

Υλικά και μέθοδοι

Χημικά

Τα πρότυπα -γλυκογαλίνης και πενταγαλλοϋλογλυκόζης αγοράστηκαν από την Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Τα χημικά που χρησιμοποιήθηκαν στον προσδιορισμό LOX ελήφθησαν από τους ακόλουθους προμηθευτές: 3-(διμεθυλαμινο)βενζοϊκό οξύ (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, Κίνα), λινολεϊκό οξύ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ),3-μεθυλ-2-βενζοθειαζολινόνη (MBTH) και αιμοσφαιρίνη (Sangon Biotech Co., Ltd., Σαγκάη, Κίνα).

Φυτικά υλικά

Οι καρποί και οι σπόροι του ροδιού (cv. Wonderful) παρασχέθηκαν γενναιόδωρα από την Panzhihua Academy of Agricultural and Forest Sciences και αναγνωρίστηκαν από τον Dr. Binjie Ge στον Βοτανικό Κήπο της Σαγκάης Τσενσάν. Ένα δείγμα κουπονιού (αρ. CSHO173966) κατατέθηκε στο ερμπάριο του Βοτανικού Κήπου Shanghai Chenshan, Σαγκάη, Κίνα. Τα σπορόφυτα ροδιού αναπτύχθηκαν σε ένα δωμάτιο ανάπτυξης ελεγχόμενης θερμοκρασίας για 6 εβδομάδες στους 25 βαθμούς και 16 ώρες φως/8 ώρες σκοτάδι. Η συγκέντρωση MeJA για εφαρμογή ψεκασμού σε φυτικούς ιστούς φέρεται να κυμαίνεται από 100 έως 250 μM（Ku et al.2014; Hickman et al.2017). Διαφορετικές συγκεντρώσεις MeJA εφαρμόστηκαν αρχικά σε φύλλα ροδιού, εκ των οποίων τα 200μM MeJA οδήγησαν σε μια ευδιάκριτη μεταβολική απόκριση στην προκαταρκτική ανάλυση και χρησιμοποιήθηκαν για τις αναλύσεις έκφρασης μεταβολιτών και γονιδίων που περιγράφονται σε αυτή τη μελέτη. Πριν από τη θεραπεία MeJA, τα μισά από τα φυτά ροδιού μεταφέρθηκαν σε άλλο δωμάτιο ανάπτυξης με παρόμοιες συνθήκες. Ενώ τα φυτά σε ένα δωμάτιο ανάπτυξης ψεκάστηκαν με 200 μM MeJA, αυτά στο άλλο δωμάτιο ανάπτυξης ψεκάστηκαν με νερό (δηλ. εικονικός έλεγχος). Στις 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,{36-h,48-h, and72-h μετά τη θεραπεία, φεύγει από 3 συγκεντρώθηκαν σε 5 εικονικά ή MeJA φυτά, τα οποία αποτελούν ένα βιολογικό αντίγραφο. Τρία βιολογικά αντίγραφα συλλέχθηκαν για τα πειράματα εικονικής και MeJA-θεραπείας. κάθε βιολογικό αντίγραφο χωρίστηκε σε κλάσματα για το προφίλ μεταβολίτη και τις αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης.

Ανάλυση προφίλ μεταβολισμού

Τα φύλλα του ροδιού λυοφιλοποιήθηκαν, ζυγίστηκαν και αλέστηκαν σε λεπτή σκόνη χρησιμοποιώντας σφαιρίδια ζιρκονίας σε χτυπητήρι σφαιριδίων (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Γερμανία) για τη δεκαετία του '90 στα 30 Hz. Για ανάλυση HPLC, το δείγμα φύλλου εκχυλίστηκε σε 70 τοις εκατό μεθανόλη για 60 λεπτά υπό υπερήχους και φυγοκεντρήθηκε στις 13,000 rpm για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε φιαλίδιο HPLC, εκ των οποίων 30 μL εγχύθηκαν σε HPLC αντίστροφης φάσης (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) και αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Wil-son et al.2019). Οι μεταβολίτες ανιχνεύθηκαν με απορρόφηση UV στα 254 nm, 280 nm, 320 nm και 360 nm. Κατασκευάστηκαν πρότυπες καμπύλες βαθμονόμησης -γλυκογαλίνης και πενταγαλλοϋλογλυκόζης. Χρησιμοποιήθηκαν για τη μετατροπή των περιοχών των κορυφών που ταιριάζουν με τους χρόνους κατακράτησης και τα φάσματα απορρόφησης της -γλυκογαλίνης και της πενταγαλλοϋλογλυκόζης στις αντίστοιχες συγκεντρώσεις.

Για ανάλυση LC-ESI-MS/MS, το ομογενοποιημένο δείγμα φύλλου (100 mg) εκχυλίστηκε σε 1 mL μεθανόλης 70 τοις εκατό στους 4 βαθμούς Καλύτερης νύχτας. Την επόμενη ημέρα, το μεθανολικό εκχύλισμα φυγοκεντρήθηκε στους 10°C ,000×g για 10 λεπτά και το υπερκείμενο διοχετεύθηκε μέσω ενός φυσιγγίου CNWBOND Carbon-GCB SPE (ANPEL, Σαγκάη, Κίνα) και ενός φίλτρου σύριγγας 0.22-μm (ANPEL) πριν από την ανάλυση μεταβολιτών.

Το εκχύλισμα (2 μL) αναλύθηκε χρησιμοποιώντας LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) και στήλη C1s αντίστροφης φάσης (ACQUITY UPLC HSS T3,1,8 m, 2,1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, ΗΠΑ). Οι μεταβολίτες εκλούστηκαν χρησιμοποιώντας διαλύτες (Α) νερό που περιείχε 0,04 τοις εκατό οξικό οξύ και (Β)ακετονιτρίλιο που περιέχει 0,04 τοις εκατό οξικό οξύ σε διαβάθμιση 0-11 min,95-5 τοις εκατό Α;11-12 min, 5 τοις εκατό Α;12-12.1 λεπτό ,5-95% A;12.1-15min,95% A. Ο ρυθμός ροής διατηρήθηκε στα 0,4 mL min-1. Οι σαρώσεις γραμμικής παγίδας ιόντων (LIT) και τριπλού τετραπολικού (QQQ) MS αποκτήθηκαν σε τρόπους θετικού και αρνητικού ιόντος. Η πηγή ιόντων ψεκασμού στροβιλοκινητήρα λειτουργούσε στους 500 βαθμούς C με τάση ιονισμού 5500 V. Το αέριο πηγής ιόντων Ι, το αέριο Ι και το αέριο κουρτίνας ρυθμίστηκαν στα 55 psi, 60 psi και 25 psi, αντίστοιχα. Το αέριο σύγκρουσης (άζωτο) ρυθμίστηκε στα 5 psi. Για την ανάλυση MRM, το δυναμικό αποσύνθεσης (DP) και η ενέργεια σύγκρουσης (CE) βελτιστοποιήθηκαν για κάθε μετάβαση ιόντων προδρόμου-προϊόντος.

For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>Οι =1 θεωρήθηκαν ότι έχουν αλλάξει σημαντικά.

Μεταγραφική ανάλυση

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε από φύλλα ροδιού χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRIZol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Η ακεραιότητα των δειγμάτων RNA επαληθεύτηκε μέσω διαχωρισμού σε πήκτωμα αγαρόζης (χωρίς ορατή αποικοδόμηση) και προσδιορισμού της αναλογίας OD20/28o (μεταξύ 1,8 και 2,2) χρησιμοποιώντας Nanodrop2000. Ο εμπλουτισμός του mRNA από το ολικό RNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας τα μαγνητικά σφαιρίδια ολίγο (dT) (Invitrogen). Οι βιβλιοθήκες mRNA-Seq κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ προετοιμασίας βιβλιοθήκης Truseq RNA (Illumina, San Diego, CA, USA). Πραγματοποιήθηκε ανάλυση μεταγραφώματος στο Illumina HiSeq4000 και ελήφθησαν 55-60 εκατομμύρια 150-bp αναγνώσεις ζευγαριού τέλους (PE150) για κάθε βιβλιοθήκη δειγμάτων.

Τα ακατέργαστα δεδομένα ακολουθίας υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την αφαίρεση των ακολουθιών προσαρμογέων καθώς και με σύντομη(<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS:GitHub. com/Joshi/sickle).Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1, και προσαρμοσμένη τιμή P<>

Ανάλυση qPCR σε πραγματικό χρόνο

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε από φύλλα ροδιού που είχαν υποστεί ψεύτικη επεξεργασία και MeJA χρησιμοποιώντας το κιτ Pure Plant Kit RNAprep (Tiangen Biotech Co., Ltd., Πεκίνο, Κίνα). Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ολικό RNA και το κιτ αντιδραστηρίων PrimeScriptTM RT (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japan). Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR (qPCR) χρησιμοποιώντας το κιτ TB GreenTM Premix Ex Taq TM (Tli RNaseH Plus) ( Takara) και ένα σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο StepOnePlus (Ther-moFisher Scientific). Διεξήχθη ανάλυση καμπύλης τήξης και έδειξε ένα μόνο προϊόν ενίσχυσης για κάθε ζεύγος εκκινητών. Για την ανάλυση RT-qPCR, τρία βιολογικά αντίγραφα και το καθένα με τρία τεχνικά αντίγραφα εξετάστηκαν για δείγματα που υποβλήθηκαν σε ψεύτικη και MeJA. Η γονιδιακή έκφραση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο C,(△AC) (Livak and Schmittgen 2001) και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα σημαντικότητας χρησιμοποιώντας μια δοκιμή t-test Student δύο ουρών. Οι αλληλουχίες εκκινητών για την ανάλυση qPCR σε πραγματικό χρόνο και οι αποτελεσματικότητες ενίσχυσης των ζευγών εκκινητών παρουσιάζονται στον Πίνακα S1.

Έκφραση και καθαρισμός ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και δοκιμασίες ενζύμων

Το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης του Pgr025417 (που κωδικοποιεί ένα υποτιθέμενο LOX) συντέθηκε για βέλτιστη χρήση κωδικονίων στο E. coli (Genewiz, Suzhou, Κίνα) και κλωνοποιήθηκε σε pET28a. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο μετασχηματίστηκε σε E. coli BL21 (DE3) κύτταρα. Μια καλλιέργεια 5-mL Luria Bertani (LB) με 50μg mL-ικαναμυκίνη ξεκίνησε από μία μόνο αποικία και επωάστηκε όλη τη νύχτα με ανακίνηση στους 37 C. Η ολονύκτια καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε για τον ενοφθαλμισμό ενός 100-mL LB μέσου με 50 mg mL-καναμυκίνης και αφέθηκε να αναπτυχθεί σε OD600 0,5. Στη συνέχεια προστέθηκε ισοπροπυλ- -D-θειογαλακτοσίδη (IPTG) σε τελική συγκέντρωση 0,1 mM για επαγωγή έκφρασης πρωτεΐνης. Μετά από επώαση με ανακίνηση στους 16 βαθμούς για 18 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση. Τα σφαιρίδια κυττάρων επαναιωρήθηκαν στο ρυθμιστικό λύσης (50 mM NaH, PO, ρΗ 7,4,300 mM NaCl, 10 mM ιμιδαζόλη) και ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν διασπαστή κυττάρων (Constant Systems Ltd, Northants, UK). Οι επισημασμένες πρωτεΐνες καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας Σφαιρίδια Ni-NTA (ThermoFisher Scientific) με το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (50 mM NaH, PO, pH 7,4,300 mM NaCl, 25 mM ιμιδαζόλη) και το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (50 mM NaH, PO, pH 7,4,300 mM NaCl, 500 mM ιμιδαζόλη). Οι καθαρισμένες πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε πήκτωμα 10 τοις εκατό SDS-PAGE για οπτικοποίηση της καθαρότητας πρωτεΐνης. Η συγκέντρωση των καθαρισμένων πρωτεϊνών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Bradford (Bradford 1976).

Για τον προσδιορισμό LOX, το λινολεϊκό οξύ χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα σε μια χρωματομετρική μέθοδο δύο σταδίων με μικρές τροποποιήσεις (Anthon and Barrett 2008). Το μίγμα αντίδρασης 500-μL, συμπεριλαμβανομένου 50 mM φωσφορικού νατρίου, pH 6, 10 mM DMAB, 0,5 mM λινολεϊκού οξέος και διαφόρων ποσοτήτων καθαρισμένων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών (1,5 mg mL-), επωάστηκε στους 25 βαθμούς για 10 λεπτά. Ένα δεύτερο διάλυμα (500 μL) που περιείχε 0,2 mM MBTH και 0,1 mg mL αιμοσφαιρίνης προστέθηκε στο μίγμα της αντίδρασης, το οποίο επωάστηκε για επιπλέον 5 λεπτά. Η αντίδραση τερματίστηκε με την προσθήκη 500 μL 1 τοις εκατό (w/v) λαυρυλοθειικού νατρίου. Προσδιορίστηκε η απορρόφηση φωτός στα 598 nm.

Υποκυτταρικός εντοπισμός και φυλογενετικές αναλύσεις

Μια αναζήτηση του σχολιασμένου γονιδιώματος του ροδιού (Qin et al. 2017) εντόπισε 1 λίτρο πιθανών πλήρους μήκους LOX (786 aa έως 970 aa), συμπεριλαμβανομένων Pgr025413, Pgr020032, Pgr025418, Pgr025418, Pgr025418, Pgr025418, Pgr025418, Pgr025418, Pgr025414, Pgr025414, Pgr025414, Pgr025418, Pgr025418, Pgr020032, Pgr025413 πλήρους μήκους ακολουθία σε GenBank XP_031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 και PgrO13780. Οι θέσεις υποκυτταρικού εντοπισμού και διάσπασης των πεπτιδίων σήματος για τα LOX του ροδιού προβλέφθηκαν χρησιμοποιώντας το TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros et al.2019).

Ανάλυση θέσης δέσμευσης TF

Για την πρόβλεψη των θέσεων δέσμευσης των TF, ελήφθησαν 1000 bp ανάντη του κωδικονίου έναρξης ATG των γονιδίων-στόχων από την GenBank και αναζητήθηκαν έναντι των Eucalyptus Grandis TF στο PlantRegMap (έκδοση 5) (Tian et al.2020). Η τιμή κατωφλίου για τη δέσμευση Η αναγνώριση τοποθεσίας ορίστηκε στο P Λιγότερο ή ίσο με le-4.

Στατιστική ανάλυση

Στατιστική ανάλυση για την ποσοτικοποίηση του μεταβολίτη, το μεταγραφικό και τα δεδομένα qPCR σε πραγματικό χρόνο περιγράφονται στις αντίστοιχες ενότητες.

Αποτελέσματα

Το MeJA ρυθμίζει την κυτταρική σηματοδότηση και τις μεταβολικές οδούς στα φύλλα του ροδιού

Για να κατανοήσετε τη μεταγραφική απόκριση του ροδιού σε ολόκληρο το γονιδίωμα στην πρόκληση MeJA, τα μεταγραφικά φύλλα ροδιού στις 2-h,6-h,24-h και 72-h μετά από MeJA ή Η εικονική επεξεργασία (η καθεμία με τρία βιολογικά αντίγραφα) αναλύθηκε (Εικ. S1). Λήφθηκαν περίπου 55 εκατομμύρια ακατέργαστες αναγνώσεις αλληλουχίας (2×150 bp ζευγαρωμένο άκρο) για κάθε μεταγραφή με περιεχόμενο GC περίπου 52 τοις εκατό και τιμές Q30 που κυμαίνονται από 91,6 έως 95 τοις εκατό (Πίνακας S2). Για όλα τα μεταγραφήματα, περισσότερο από το 96 τοις εκατό των αναγνώσεων καθαρισμένης αλληλουχίας χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα του ροδιού αναφοράς (Qin et al.2017) (Πίνακας S3). Η πλειοψηφία των συγκεντρωμένων μεταγραφών ήταν μικρότερη από 1000 bp (34,3 τοις εκατό), 1000 bp- 2000 bp (32,9 τοις εκατό ) ή 2000 bp—3000 bp (18,1 τοις εκατό ) (Πίνακας S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, προσαρμοσμένο P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="">

Τα γονίδια της οδού Shikimate και HT και οι μεταβολίτες HT προκλήθηκαν σε φύλλα ροδιού που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με MeJA Όπως αποκαλύφθηκε στην ανάλυση εμπλουτισμού της οδού μεταγραφής και KEGG, τρία γονίδια βιοσυνθετικής οδού σικιμάτη έδειξαν ρυθμισμένη προς τα πάνω έκφραση σε φύλλα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με MeJA σε σχέση με ψευδείς μάρτυρες στο {{3 }}h, συμπεριλαμβανομένης της 3-δεοξυ-D-αραβινόζης-επτουλοσονικής-7-φωσφορικής συνθάσης (DAHPS), 3-αφυδρογονικής συνθάσης (DHS) και της διλειτουργικής 3-αφυδρογονικής αφυδατάσης/ αφυδρογονάση σικιμικού (DHQ/SDH, συντομογραφία SDH) (Εικ. S1b και la). Ειδικότερα, ταυτοποιήθηκαν τρεις ισομορφές SDH ροδιού και έδειξαν διαφορική έκφραση στην ανάλυση μεταγραφοτομίας, Pgr020271, Pgr019030 και Pgr019029,

Για να προσδιοριστεί εάν οι αλλαγές στην ποσότητα των μεταγραφών του σικιμικού και των βιοσυνθετικών γονιδίων HT μπορεί να επηρεάσουν το επίπεδο των μεταβολιτών που προέρχονται από αυτές τις οδούς, εξήχθησαν φαινολικοί μεταβολίτες από φύλλα που συγκομίστηκαν σε 24-h, 30-h. 36-h,48-h και 72-h μετά από MeJA ή ψευδή εφαρμογή και αναλύθηκαν με HPLC(Εικ.2). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτά τα χρονικά σημεία επιλέχθηκαν για να λάβουν υπόψη τον χρόνο που απαιτείται για τη σύνθεση πρωτεϊνών και την παραγωγή και συσσώρευση μεταβολιτών μετά τις παρατηρούμενες αλλαγές έκφρασης των βιοσυνθετικών γονιδίων σικιμικού και ΗΤ σε 6- ώρα. Οι χρόνοι κατακράτησης και τα φάσματα απορρόφησης δύο μεταβολιτών που εκλούστηκαν στα 4,57 λεπτά (αιχμή 1) και 24,98 λεπτά (αιχμή 2) ταιριάστηκαν με αυτά των ενδιάμεσων οδών ΗΤ -γλυκογαλίνη και κράματα Penta-γλυκόζη, αντίστοιχα (Εικ. la και 2a). Και οι δύο κορυφές έδειξαν σημαντικές αλλαγές σε ολοκληρωμένες περιοχές αιχμής σε πολλαπλά χρονικά σημεία (Εικ.2β). Συγκεκριμένα, η κορυφή 1 αυξήθηκε στα φύλλα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MeJA σε σχέση με τα εικονικά στοιχεία ελέγχου στις 30-h, 36-h και 48-h(Εικ.2b). Είναι ενδιαφέρον ότι τα φύλλα κορυφής 2 ιντσών που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MeJA αρχικά μειώθηκαν στις 24-h, αλλά στη συνέχεια αυξήθηκαν στις 30-h και 36-h πριν επιστρέψουν σε επίπεδο παρόμοιο με τους εικονικούς ελέγχους στις 48- h και 72-h (Εικ.2β).

Η μείωση των περισσότερων φλαβονοειδών και ανθοκυανινών, καθώς και αυξημένες μεθυλιωμένες φλαβόνες και φλαβονόλες, ήταν εμφανής στα φύλλα ροδιού που είχαν υποστεί επεξεργασία με MeJA

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Πίνακες S5 και S6). Για τους διαφορικά συσσωρευμένους μεταβολίτες, υπήρξε ένας συνολικός εμπλουτισμός μεταβολιτών που εμπλέκονται στον δευτερογενή/εξειδικευμένο μεταβολισμό των φυτών (67 από 102), ιδιαίτερα φαινολικών ενώσεων (63 από 102) (Πίνακας S6).

Μεταξύ των φαινολικών, μια συντονισμένη μείωση σε ένα ευρύ φάσμα φλαβονοειδών και ανθοκυανινών (42 από τις 73 μειωμένες ενώσεις) ήταν εμφανής σε φύλλα που είχαν υποστεί επεξεργασία με MeJA (Εικ. 3, Πίνακας S6). Περιέργως, τρεις μονο- ή δι-Ο-μεθυλιωμένες φλαβόνες και φλαβονόλες, συμπεριλαμβανομένης της δι-Ο-μεθυλο κερκετίνης, της χρυσοβερυλο Ο-εξοσυλ-Ο-εξοσίδης και των πωλήσεων 5-Ο-εξοσίδης, αυξήθηκαν στα φύλλα που έχουν υποστεί επεξεργασία με MeJA (Εικ. 3, Πίνακας S6). Αρκετά ενδιάμεσα των οδών φλαβονοειδών και ανθοκυανίνης, συμπεριλαμβανομένης της λουτεολίνης, του χρυσοβερυλίου, της διυδροκαεμπφερόλης, της διυδροκουερσετίνης, της διυδρομυρικετίνης, της επικατεχίνης, της δελφινιδίνης και της Πελαργονιδίνης, ήταν ανιχνεύσιμα αλλά δεν παρουσίασαν σημαντικές αλλαγές στα φύλλα που είχαν υποστεί επεξεργασία με MeJA. Τα παράγωγα υδροξυκίνης-ναμοϋλ, ισοφλαβόνες και κουμαρίνες ήταν μεταξύ άλλων φαινολικών που παρουσίασαν μειωμένη συσσώρευση κατά την επαγωγή MeJA (Πίνακας S6). Αντίθετα, δύο φαινολικά οξέα, 2,3-διυδροξυβενζοϊκό οξύ και πρωτοκατεχουϊκό οξύ (3,4-διυδροξυβενζοϊκό οξύ) και μια κουμαρίνη, 6-μεθυλοκουμαρίνη, αυξήθηκαν στα φύλλα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MeJA (Πίνακας S6).

Σε συμφωνία με τα σε μεγάλο βαθμό μειωμένα φλαβονοειδή και ανθοκυανίνες στα φύλλα ροδιού που έχουν υποστεί επεξεργασία με MeJA, οι μεταγραφές δύο βασικών ενζύμων για τη βιοσύνθεση φλαβονοειδών και ανθοκυανίνης. Το CHS(Pgr005566) και το CHI (Pgr025966), μειώθηκαν σημαντικά στις 6-h και 24-h μετά την εφαρμογή MeJA σύμφωνα με την ανάλυση μεταγραφομετρίας (Εικ. 4). Πραγματοποιήθηκε ανάλυση qPCR σε πραγματικό χρόνο για να εξεταστεί η έκφραση CHS και CHI με επιπλέον χρονικά σημεία, συμπεριλαμβανομένων των 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{{ . έλεγχοι έως 72-h, με τη μεγαλύτερη μείωση στις 12-h. Αντίθετα, η μείωση στην έκφραση CHI ήταν σημαντική μόνο σε 24-h, 48-h και 72-h μετά τη θεραπεία MeJA (Εικ. 4).

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9