Η μετφορμίνη προστατεύει τα επιθηλιακά κύτταρα του φακού από τη γήρανση σε ένα μοντέλο ποντικιού με φυσική ηλικία

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Τα επιθηλιακά κύτταρα του φακού (LECs) σχηματίζουν μια μονοστοιβάδα κυττάρων που επενδύουν την πρόσθια κάψουλα του φακού και εκτείνονται μέχρι το τόξο του ισημερινού φακού [1, 2]. Η κανονική κατασκευή και λειτουργία των LEC είναι απαραίτητες για τη διατήρηση της διαφάνειας και της μεταβολικής ομοιόστασης ολόκληρου του φακού[3]. Όλο και περισσότερες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι η γήρανση των LEC μπορεί να προκαλέσει τροποποίηση, μετουσίωση και συσσώρευση πρωτεϊνών του φακού, συμπεριλαμβανομένων των ενζύμων και των κρυσταλλινών, οδηγώντας έτσι σε θολότητα του φακού ή ακόμα και καταρράκτη [3-5]. Ο καταρράκτης που σχετίζεται με την ηλικία (ARC) παραμένει η κύρια αιτία της όρασης και της τύφλωσης, η οποία επηρεάζει σοβαρά την ποιότητα ζωής των ηλικιωμένων [6]. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν αποτελεσματικές στρατηγικές για την πρόληψη της εξέλιξης του ARC. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να αναπτυχθεί μια φαρμακολογική παρέμβαση που μπορεί να βελτιώσει τη διαφάνεια του φακού και να καθυστερήσει την εξέλιξη του ARC.

Τις τελευταίες δεκαετίες, οι επιστήμονες έχουν επιτύχει αξιοσημείωτη πρόοδο στη βελτίωση της υγείας και την παράταση της διάρκειας ζωής χρησιμοποιώντας διάφορες γενετικές, διατροφικές και φαρμακολογικές παρεμβάσεις [7]. Η μετφορμίνη (MET) είναι ένας από τους εκτενώς μελετημένους αντιγηραντικούς παράγοντες. Ουσιαστικές μελέτες υποδηλώνουν ότι το MET μπορεί να ανακουφίσει τη γήρανση και να παρατείνει μια υγιή διάρκεια ζωής σε διάφορα συστήματα ζωικών μοντέλων. Το MET όχι μόνο μπορεί να παρατείνει τη διάρκεια ζωής του Caenorhabditis elegans αλλά και να ενισχύσει την υγεία και τη ζωτικότητά του [8]. Το MET μπορεί να μειώσει τη συσσώρευση βλάβης του DNA που σχετίζεται με την ηλικία και το οξειδωτικό στρες στα βλαστοκύτταρα του μεσαίου εντέρου Drosophila για να παρατείνει τη διάρκεια ζωής τους [9]. Προηγούμενες μελέτες δείχνουν επίσης ότι η χρόνια χορήγηση χαμηλής δόσης MET βελτιώνει την υγεία και τη διάρκεια ζωής των ποντικών [10]. Επιπλέον, αναδυόμενα στοιχεία δείχνουν ότι όταν οι ασθενείς με διαβήτη υποβάλλονται σε θεραπεία με ΜΕΤ, εκδηλώνουν οφέλη επιβίωσης, ακόμη και σε σύγκριση με μάρτυρες που δεν έχουν διαβήτη [11].

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Εκτός από τη δραστηριότητα που προάγει τη διάρκεια ζωής του MET σε διάφορους οργανισμούς-μοντέλους, το MET στοχεύει πολλαπλά μονοπάτια κυτταρικής μετάδοσης σήματος για τη βελτίωση των ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία. Το MET έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει την αυτοφαγία κυρίως μέσω της ενεργοποίησης της ενεργοποιημένης πρωτεϊνικής κινάσης από μονοφωσφορική αδενοσίνη (AMP) (AMP) και αποτρέπει τον νευροεκφυλισμό και τη νευροφλεγμονή να παίζει νευροπροστατευτικό ρόλο στη νόσο του Πάρκινσον [12]. Ομοίως, το MET βελτιώνει τις αλλαγές που σχετίζονται με την ηλικία στο ηπατικό ημιτονοειδές ενδοθηλιακό κύτταρο μέσω των οδών AMPK και ενδοθηλιακού μονοξειδίου του αζώτου [13].cistanche δοσολογία redditΕπιπλέον, η χρόνια ενεργοποίηση της AMPK από το MET αποτρέπει την μυοκαρδιοπάθεια ρυθμίζοντας προς τα πάνω την αυτοφαγία σε ποντικούς OVE26 με διαβήτη [14]. Επιπλέον, το MET ανακουφίζει την καρδιαγγειακή επιδείνωση που σχετίζεται με την ηλικία ενισχύοντας την αυτοφαγία και τον θερμιδικό περιορισμό [15]. Επιπλέον, η θεραπεία MET μπορεί να αναστείλει την αθηροσκλήρωση που σχετίζεται με την ηλικία σε ποντίκια και κουνέλια ApoE-7- που προκαλείται από δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά, αποτρέποντας σημαντικά την ασβεστοποίηση της αθηροσκληρωτικής πλάκας, μειώνοντας τα επίπεδα υψηλής ευαισθησίας C-αντιδρώσας πρωτεΐνης και καταστέλλοντας την ενεργοποίηση της μονοπάτι πυρηνικού παράγοντα κάπα B(NF-kB) στα αιμοφόρα αγγεία [16-18].

Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, η παρούσα μελέτη επιχείρησε να διερευνήσει εάν το MET μπορεί να καθυστερήσει τη γήρανση του ARC και τον υποκείμενο μοριακό μηχανισμό. Τα ευρήματά μας είναι τα εξής: (i) η χρόνια θεραπεία με χαμηλή δόση MET καθυστέρησε τη γήρανση των LEC σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια, αναστέλλοντας έτσι την αδιαφάνεια του φακού. ) η χρόνια θεραπεία MET χαμηλής δόσης καθυστέρησε τη γήρανση των LEC σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια ενεργοποιώντας την οδό AMPK και ενισχύοντας την αυτοφαγία. Τα ευρήματά μας τεκμηριώνουν τον υποτιθέμενο αντιγηραντικό ρόλο του MET και παρέχουν επαρκή στοιχεία ότι το MET μπορεί να αποδειχθεί μια πιθανή θεραπευτική επιλογή για το ARC.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Η γήρανση των LEC συσχετίστηκε με το ARC σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια

Πολλαπλοί πιθανοί μηχανισμοί του ARC, συμπεριλαμβανομένης της επίδρασης της γήρανσης, έχουν διερευνηθεί εκτενώς.οφέλη από το εκχύλισμα κιστάνς,Ωστόσο, η συσχέτιση μεταξύ της γήρανσης των LEC και του ARC in vivo παραμένει ασαφής. Υποθέσαμε ότι η γήρανση των LEC μπορεί να οδηγήσει σε ARC in vivo. Επομένως, κατασκευάσαμε ένα μοντέλο ποντικιού του ARC. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι η διαφάνεια του φακού σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια (μεγαλύτερα ποντίκια) μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με αυτή στην ομάδα ελέγχου (νεαρά ποντίκια) (Εικ. 1α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1β, η συχνότητα εμφάνισης καταρράκτη στην φυσικά ηλικιωμένη ομάδα ήταν 95,23 τοις εκατό. Η δοκιμασία χρώσης H&E έδειξε ότι τα LEC στην ομάδα ελέγχου είχαν στρογγυλό σχήμα και τακτοποιημένα, και η πυκνότητα των κανονικών LEC ήταν σχετικά υψηλή, ενώ τα LEC των φυσικά ηλικιωμένων ποντικών ήταν επίπεδα σχήματος και διατεταγμένα άνισα, και η πυκνότητα των τα γηρασμένα LEC μειώθηκαν σημαντικά (Εικ. 1γ). Επιπλέον, η χρώση SA- -Gal έδειξε ότι η αναλογία των γηρασμένων LEC ήταν αυξημένη σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια (Εικ. 1δ). Επιπλέον, αναλύσαμε την έκφραση πρωτεΐνης δεικτών που σχετίζονται με τη γήρανση μέσω χρώσης IHC και ανάλυσης western blot. Η χρώση με IHC αποκάλυψε ότι η έκφραση των ρ21 και ρ53 ήταν αυξημένη στα LEC φυσικώς ηλικιωμένων ποντικών σε σύγκριση με νεαρά ποντίκια (Εικ. 1e, f). Ομοίως, ανακαλύψαμε περαιτέρω ότι η έκφραση πρωτεΐνης των p21 και p53 ήταν υψηλότερη στις κάψουλες φακών ποντικών με φυσική ηλικία από ότι στις κάψουλες φακών νεαρών ποντικών (Εικ. 1g). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η γήρανση των LEC συσχετίστηκε με ARC σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια.

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

Η χρόνια χορήγηση MET χαμηλής δόσης βελτίωσε τη διαφάνεια του φακού και μείωσε τη γήρανση των LEC Πριν δοκιμάσουμε την επίδραση της μετφορμίνης στο ARC, προσδιορίσαμε εάν η χρόνια χορήγηση χαμηλής δόσης MET είναι ασφαλής για τα ποντίκια. Μετά από θεραπεία με MET για 10 μήνες, 28 ποντίκια (18 στην ομάδα φυσικά ηλικιωμένων και 10 στην ομάδα MET) πέθαναν από φυσικά αίτια. Βρήκαμε ότι τα ζωντανά ποντίκια και στις δύο ομάδες ήταν υγιή και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο σωματικό βάρος και στο βάρος των οργάνων μεταξύ των δύο ομάδων (Πίνακας 1). Επομένως, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δόση της μετφορμίνης που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη ήταν ασφαλής για τα ζώα και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για μεταγενέστερα πειράματα.

Στη συνέχεια, χορηγήθηκε χρόνια χαμηλή δόση MET για να αξιολογηθεί εάν το MET θα μπορούσε να αναστείλει την αδιαφάνεια του φακού και να ανακουφίσει τη γήρανση των LEC που σχετίζεται με την ηλικία σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια. Όπως ήταν αναμενόμενο, η διαφάνεια του φακού στην ομάδα MET βελτιώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τη διαφάνεια του φακού στην ομάδα φυσικά ηλικιωμένων (Εικ.2α). Επιπλέον, μορφολογικές παρατηρήσεις επιβεβαίωσαν ότι ο φακός της ομάδας MET παρουσίασε μείωση της αδιαφάνειας. Η συχνότητα εμφάνισης καταρράκτη στην φυσικά ηλικιωμένη ομάδα ήταν 95,23 τοις εκατό, ενώ στην ομάδα MET ήταν 19,00 τοις εκατό (Εικ. 2β). Η ανάλυση χρώσης H&E αποκάλυψε ότι η πυκνότητα των LEC στην ομάδα MET ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτό στα φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια (Εικ. 2γ). Επιπλέον, τα LEC της ομάδας MET είχαν σχετικά στρογγυλό σχήμα σε σύγκριση με εκείνα της φυσικά ηλικιωμένης ομάδας (Εικ.2γ). SA- -Η χρώση με Gal έδειξε ότι η αναλογία των γηρασμένων LEC μειώθηκε σημαντικά στην ομάδα MET σε σύγκριση με αυτήν στην ομάδα φυσικά ηλικιωμένης (Εικ. 2δ). Η ανάλυση IHC αποκάλυψε ότι η έκφραση των p21 και p53 μειώθηκε περισσότερο στα LEC της ομάδας MET παρά στην φυσικά ηλικιωμένη ομάδα (Εικ. 2e, f). Παρομοίως, η ανάλυση western blot αποκάλυψε ότι η έκφραση πρωτεΐνης των p21 και p53 ήταν αξιοσημείωτα μειωμένη στις κάψουλες φακών της ομάδας MET σε σύγκριση με εκείνες της φυσικά ηλικιωμένης ομάδας (Εικ. 2g). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χρόνια χορήγηση MET χαμηλής δόσης θα μπορούσε να βελτιώσει τη διαφάνεια του φακού και να ανακουφίσει τη γήρανση των LEC.

Η χρόνια χορήγηση MET χαμηλής δόσης μείωσε τη γήρανση των LEC σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια μέσω ενεργοποίησης AMPK. Ένας συντριπτικός όγκος δεδομένων υποστηρίζει το συμπέρασμα ότι η ενεργοποίηση του AMPK είναι επαρκής για να παρατείνει τη διάρκεια ζωής σε οργανισμούς-μοντέλους, αυξάνοντας την ελκυστικότητά του ως στόχος μακροζωίας [19,20] . Λαμβάνοντας υπόψη αυτή τη θεωρία, αξιολογήσαμε την έκφραση της οδού AMPK σε LEC ποντικών. Το σχετικό επίπεδο mRNA του FAS μειώθηκε στην φυσικά ηλικιωμένη ομάδα και αυξήθηκε στην ομάδα MET (Εικ. 3α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3b,c, η έκφραση του φωσφορυλιωμένου AMPKa (Thr172) και του φωσφορυλιωμένου ACC (Ser79) μειώθηκε στα LEC φυσικώς ηλικιωμένων ποντικών σε σύγκριση με αυτά των νεαρών ποντικών. Ωστόσο, η έκφραση του φωσφορυλιωμένου AMPKa (Thr172) και του φωσφορυλιωμένου ACC (Ser79) ήταν αυξημένη στα LEC της ομάδας MET σε σύγκριση με εκείνα της φυσικά ηλικιωμένης ομάδας. Επιπλέον, η ανάλυση western blot αποκάλυψε ότι η έκφραση πρωτεΐνης του φωσφορυλιωμένου AMPKa (Thr172) και του φωσφορυλιωμένου ACC (Ser79) μειώθηκε σημαντικά στις κάψουλες φακών των φυσικώς ηλικιωμένων και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης του φωσφορυλιωμένου AMPKa (Thr172) και του φωσφορυλιωμένου ACC (ACC) Οι Ser79) αυξήθηκαν στις κάψουλες φακών της ομάδας MET (Εικ. 3δ). Αυτά τα δεδομένα αποκάλυψαν ότι η οδός AMPK αδρανοποιήθηκε στα LEC ποντικών φυσικά ηλικιωμένων. Επιπλέον, η χρόνια χορήγηση ΜΕΤ χαμηλής δόσης μείωσε τη γήρανση των LEC σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια μέσω ενεργοποίησης AMPK.

Η χρόνια χορήγηση MET χαμηλής δόσης αποκατέστησε την αυτοφαγική ροή για να ανακουφίσει τη γήρανση των LEC σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η αυτοφαγία μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην καταπολέμηση των δυσμενών επιπτώσεων της γήρανσης [21,22]. Για να αναλύσουμε περαιτέρω τις μοριακές και κυτταρικές αλλαγές στον φακό μετά τη θεραπεία με MET, προσδιορίσαμε την έκφραση των LC3 και p62 επειδή είναι ευρέως αποδεκτοί ως βιοδείκτες των επιπέδων αυτοφαγίας. Όπως καταδεικνύεται στο Σχ. 4α, το σχετικό επίπεδο έκφρασης mRNA του p62 αυξήθηκε σημαντικά στην φυσικά ηλικιωμένη ομάδα σε σύγκριση με αυτό της ομάδας ελέγχου. Ωστόσο, το σχετικό επίπεδο έκφρασης mRNA του ρ62 ήταν ουσιαστικά προς τα κάτω στην ομάδα MET σε σύγκριση με αυτό στην φυσικά ηλικιωμένη ομάδα.Cistanche Genghis KhanΕπιπλέον, η χρώση IHC αποκάλυψε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης 1 ελαφριάς αλυσίδας 3(LC{3}}II/l) και της ρ62 που σχετίζεται με μικροσωληνίσκους ήταν αυξημένα στα LEC ποντικών φυσικά ηλικιωμένων. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα επίπεδα LC3-II/l και p62 μειώθηκαν αξιοσημείωτα στα LEC της ομάδας MET (Εικ. 4β, γ). Τα επίπεδα πρωτεΐνης των LC3-ll και p62 ήταν αξιοσημείωτα αυξημένα στις κάψουλες των φακών της φυσικά ηλικιωμένης ομάδας (Εικ. 4δ). Συνολικά, υποθέσαμε ότι η αυτοφαγική ροή ήταν εξασθενημένη στα LEC ποντικών φυσικής ηλικίας και θα μπορούσε να αποκατασταθεί με χρόνια χορήγηση MET χαμηλής δόσης για την ανακούφιση της γήρανσης των LEC σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια.

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Ο μη θεραπευμένος καταρράκτης είναι η κύρια αιτία τύφλωσης παγκοσμίως, που χαρακτηρίζεται από θολότητα του κρυσταλλικού φακού [23]. Επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η ηλικία είναι ο κυρίαρχος παράγοντας κινδύνου για τον καταρράκτη, γνωστό ως ARC, και η μόνη θεραπεία είναι η χειρουργική αφαίρεση [24]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η γήρανση των LEC είναι η κύρια αιτία του ARC [25]. Μέχρι σήμερα, δεν έχουν υπάρξει αποτελεσματικοί θεραπευτικοί παράγοντες για την αναστολή της θολότητας του φακού και την εξασθένιση της γήρανσης των LEC χωρίς ανεπιθύμητες παρενέργειες. Το επίκεντρο της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση της μοριακής βιολογικής βάσης για τη γήρανση των LEC και του μηχανισμού προστασίας των φυσιολογικών LEC από τη γήρανση. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι η αδρανοποίηση της AMPK και η εξασθένηση της αυτοφαγίας συσχετίστηκαν με τη γήρανση των LEC και του ARC. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι το MET μπορεί να προστατεύει τα LEC από τη γήρανση και να αναστέλλει τη θολότητα του φακού ενεργοποιώντας το AMPK και ενισχύοντας την αυτοφαγία.

Η γήρανση είναι μια θεμελιώδης βιολογική διαδικασία που συνοδεύεται από γενική έκπτωση στη λειτουργία των ιστών. Καθώς η διάρκεια ζωής αυξάνεται, οι δυσλειτουργίες που σχετίζονται με την ηλικία, όπως το ARC, γίνονται σοβαρές για την υγεία

θέματα [26]. Η γήρανση των LEC έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται στην εμφάνιση και την ανάπτυξη του ARC [5]. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι τα LEC των φυσικά ηλικιωμένων ποντικών ήταν επίπεδα σχήματος και διατεταγμένα άνισα και η πυκνότητα των LEC μειώθηκε σημαντικά (Εικ. 1c, d). Επιπλέον, η έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με τη γήρανση (p21 και p53) ρυθμίστηκε προς τα πάνω στα LEC των φυσικώς ηλικιωμένων ποντικών (Εικ. 1e, f, g). Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η γήρανση των LEC συσχετίστηκε με την εμφάνιση και την ανάπτυξη του ARC. Ως εκ τούτου, μια ακριβής κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τη γήρανση των LEC μπορεί να απαιτείται για την παροχή μιας λογικής για νέες στρατηγικές θεραπείας.

Το MET είναι το πιο ευρέως συνταγογραφούμενο από του στόματος υπογλυκαιμικό φάρμακο για τον διαβήτη τύπου 2 παγκοσμίως. Τα αναδυόμενα στοιχεία δείχνουν ότι το MET έχει ευεργετικά αποτελέσματα στην υγεία πέρα ​​από εκείνα που σχετίζονται με τη βελτίωση της γλυκόζης [27]. Έχει επιβεβαιωθεί ότι οι μηχανισμοί του MET είναι σημαντικοί για τη στόχευση θεμελιωδών οδών στη βιολογική γήρανση, όπως η ενεργοποίηση της AMPK, η αύξηση της αυτοφαγίας, η αναστολή της φλεγμονής και η άσκηση αντιοξειδωτικών επιδράσεων [28]. Στον άνθρωπο, το MET χρησιμοποιείται στην κλινική πράξη για περισσότερα από 60 χρόνια. έχει υψηλό προφίλ ασφάλειας και είναι μοναδικά τοποθετημένο για να παρεμβαίνει σε πολλά κρίσιμα μονοπάτια που ευθύνονται για τη γήρανση και τις ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία. Ωστόσο, οι επιπτώσεις του MET στο ARC και ο ρυθμιστικός μηχανισμός αυτών των επιπτώσεων δεν έχουν ποτέ αναφερθεί. Συνεπώς, στη μελέτη μας, η χρόνια χορήγηση ΜΕΤ χαμηλής δόσης σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια βελτίωσε τη διαφάνεια του φακού (Εικ. 2α) και μείωσε τη γήρανση των LEC in vivo (Εικ. 2).

Είναι ευρέως αποδεκτό ότι το MET ενεργοποιεί το μονοπάτι AMPK που είναι ο πιθανός μηχανισμός του MET να ασκήσει αντιγηραντική δράση [29]. Το AMPK, ένας αισθητήρας κυτταρικής ενέργειας, διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής ενεργειακής ισορροπίας [30]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι το AMPK χρησιμεύει ως ολοκληρωτής και μεσολαβητής πολλών οδών και διαδικασιών που συσχετίζουν την ενέργεια με τη μακροζωία. Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι η απενεργοποίηση του AMPK ήταν χαρακτηριστικό των γηρασμένων LEC σε φυσικά ηλικιωμένα ποντίκια (Εικ. 3). Στη συνέχεια, το MET αποδείχθηκε ότι διεγείρει την οδό AMPK για να αποτρέψει τη γήρανση των LEC (Εικ. 3). Ως καθιερωμένος ενεργοποιητής AMPK, ο ρόλος του MET στην πρόληψη της γήρανσης αποδίδεται γενικά στις επιδράσεις του στη διαμόρφωση των κατάντη οδών σηματοδότησης, όπως η αποκατάσταση της αυτοφαγίας, η ενεργοποίηση των Sirt1 και Foxo1 και η καταστολή του mTOR [31,32]. Η μελέτη μας παρείχε μια νέα σειρά αποδεικτικών στοιχείων που τονίζουν τη σημασία της λειτουργίας AMPK που ενεργοποιείται από το MET για την πρόληψη της εμφάνισης ARC.

Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, το AMPK επικοινωνεί με πολυάριθμες οδούς και πρωτεΐνες για να ασκήσει ένα αποτέλεσμα κατά της γήρανσης, συμπεριλαμβανομένης της αύξησης της αυτοφαγίας. Η αυτοφαγία, που αναδεικνύεται ως βασική διαδικασία για τη διασφάλιση της μακροζωίας, έχει προσελκύσει ευρέως διαδεδομένο ενδιαφέρον ως πιθανός θεραπευτικός στόχος για ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία. Η αυτοφαγία είναι μια ρευστή, πολύπλοκη βιολογική διαδικασία πολλαπλών σταδίων. Η πλήρης διαδικασία της αυτοφαγίας ονομάζεται αυτοφαγική ροή, η οποία χρησιμοποιείται ευρέως για να αντανακλά το επίπεδο της αυτοφαγίας. Ως δείκτης αυτοφαγίας, η LC3-Il είναι στενά συνδεδεμένη με την αυτοφαγοσωματική μεμβράνη που αποικοδομείται από τα λυσοσωμικά ένζυμα.παράταση ζωής cistancheΟμοίως, το p62, ένα ειδικό για την αυτοφαγία υπόστρωμα, συνήθως αποικοδομείται στο αυτοφαγολυσόσωμα και η έκφρασή του αντανακλά έμμεσα το επίπεδο της αυτοφαγίας. Στην παρούσα μελέτη, τα ευρήματά μας υποδήλωναν ότι το επίπεδο της αυτοφαγίας μειώθηκε σαφώς στα γηρασμένα LECs (Εικ. 4), ενώ το MET ανέστρεψε τη σχετιζόμενη με την ηλικία βλάβη της αυτοφαγίας (Εικ. 4). Ο αντιγηραντικός μοριακός μηχανισμός του MET αποδίδεται στην κύρια λειτουργία του AMPK στα κύτταρα επειδή γενικά ενισχύει την αυτοφαγία μέσω της ενεργοποίησης του AMPK [33]. Επιπλέον, το MET φαίνεται να αυξάνει άμεσα την αυτοφαγία, συμβάλλοντας έτσι στην πρόληψη της γήρανσης [34]. Ωστόσο, απαιτούνται πιο λεπτομερείς μελέτες για την αποσαφήνιση των υποκείμενων μηχανισμών, αποδεικνύοντας ότι το MET αυξάνει την αυτοφαγία μέσω μιας ανεξάρτητης ή εξαρτημένης οδού AMPK.

Έχει αποδειχθεί ότι ο επιπολασμός του ARC δεν έχει συσχετιστεί με το φύλο σε πληθυσμούς ασιατικής καταγωγής [35, 36]. Επομένως, δεν θεωρήσαμε το σεξ ως παράγοντα που μπορεί να επηρεάσει το ARC. Η μελέτη μας θα πρέπει να ερμηνευτεί λαμβάνοντας υπόψη τους προαναφερθέντες περιορισμούς.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ

Συνοπτικά, αποδείξαμε ότι η αδρανοποίηση της οδού AMPK και η σχετιζόμενη με την ηλικία βλάβη της αυτοφαγίας μπορεί να συμβάλλουν στη γήρανση των LEC και στην εμφάνιση ARC. Επιπλέον, τα δεδομένα από τα πειράματά μας αποκάλυψαν ότι το MET καθυστέρησε αποτελεσματικά τη γήρανση των LEC και το σχηματισμό του ARC μέσω της ενεργοποίησης της οδού AMPK και της αύξησης της αυτοφαγίας. Τα ευρήματά μας αποτελούν βασική γραμμή για περαιτέρω διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που είναι χρήσιμοι στο ρόλο του MET κατά τη διαδικασία γήρανσης του ARC και θα είναι ενημερωτικές για πιο εντατικές μελέτες για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών κατά της εμφάνισης και ανάπτυξης του ARC.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αντιδραστήρια

Το MET αγοράστηκε από την Bristol-Myers Squibb Company (Κίνα). Αντισώματα έναντι του p21 (ab188224), του p53 (ab131442), του φωσφορυλιωμένου AMPKa (p-AMPK) (Thr172) (ab133448), του AMPKa1 (ab32047) και του 2actin (2) Το SQSTM1/p62 (3340-1) ελήφθη από την Abcam (MA, ΗΠΑ). Αντισώματα έναντι LC3 (12741) και φωσφο-ακετυλο CoA καρβοξυλάσης (p-ACC) (Ser79) (3661) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology ( MA, ΗΠΑ).

Ζώα και θεραπεία

Αρσενικά ποντίκια C57BL6J ηλικίας 3 και 8 μηνών αγοράστηκαν από την Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Πεκίνο, Κίνα). Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε συνθήκες ελεγχόμενης θερμοκρασίας (θερμοκρασία, 20-25 βαθμοί και σχετική υγρασία, 55±15 τοις εκατό) με κύκλο φωτός/σκότους 12 ωρών, με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Όλες οι διαδικασίες και τα πρωτόκολλα που διεξήχθησαν σε ζώα εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας του Ιατρικού Πανεπιστημίου του Χάρμπιν.

Τα ποντίκια χωρίστηκαν στις ακόλουθες τρεις ομάδες: (i) ομάδα ελέγχου που είχε νεαρά ποντίκια (ηλικίας 3 μηνών, σωματικό βάρος=29.72± 1,66 g, n =40) έλαβε μια τυπική καθαρισμένη δίαιτα ποντικών και νερό ad libitum? Όταν τα ποντίκια ήταν 10 μηνών, 120 ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες: ομάδα φυσικής ηλικίας και ομάδα MET. (i) η φυσικά ηλικιωμένη ομάδα (μεγαλύτερα ποντίκια, 20 μηνών, σωματικό βάρος=32.98±1,93g, n{=60) έλαβε μια τυπική καθαρισμένη δίαιτα ποντικών και νερό κατά βούληση· (ii)ομάδα ΜΕΤ ( 20 μηνών, σωματικό βάρος=31.21±2,81 g,n=60) διατηρήθηκε σε μια τυπική καθαρισμένη δίαιτα ποντικών και νερό μέχρι τα ποντίκια να φτάσουν τους 10 μήνες. μετά από αυτό, ξεκίνησαν οι θεραπείες. Τα ποντίκια στην ομάδα MET τράφηκαν με δίαιτα συμπληρωμένη με 0,1 τοις εκατό MET (Bristol Myers Squibb, Κίνα) και νερό δωρεάν για 10 μήνες.

απομόνωση φακών και καψουλών φακών

Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία μέσω εξάρθρωσης του τραχήλου της μήτρας. Ολόκληρο το μάτι αφαιρέθηκε αμέσως από όλα τα πειραματόζωα και τοποθετήθηκε σε στείρο φυσιολογικό ορό. Το οπτικό νεύρο τοποθετήθηκε προς τα πάνω και στερεώθηκε με τσιμπιδάκια. Στη συνέχεια έγινε μια τομή στο οπτικό νεύρο που εισέρχεται στο μάτι και ο σκληρός χιτώνας τραβήχτηκε προς τα πίσω για να εκτεθεί ο φακός.cistanche nzΣτη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε τσιμπιδάκια για να αφαιρέσουμε απαλά τα θραύσματα του ακτινωτού σώματος που είναι προσαρτημένα στο ισημερινό επίπεδο του φακού. Οι φωτογραφίες του φρέσκου φακού λήφθηκαν αμέσως και ο φακός σταθεροποιήθηκε γρήγορα με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη σε θερμοκρασία δωματίου. Ολόκληρες οι κάψουλες φακών ξεφλουδίστηκαν γρήγορα από τον υπόλοιπο φακό, καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους 80 βαθμούς C για επόμενα πειράματα.

Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (H&E)

Ο φρέσκος φακός σταθεροποιήθηκε αμέσως με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης σε θερμοκρασία δωματίου και ενσωματώθηκε σε παραφίνη. Για ιστολογική εξέταση, οι ιστοί κόπηκαν σε φέτες 4-μm. Μετά την αποπαραφίνη και την επανυδάτωση, οι παρασκευασμένες τομές παραφίνης χρωματίστηκαν με διάλυμα αιματοξυλίνης (Η) για 8 λεπτά, ακολουθούμενες από 5 εμβαπτίσεις σε όξινη αιθανόλη 1 τοις εκατό (1 τοις εκατό HCI σε 70 τοις εκατό αιθανόλη)

και ξεπλένετε με απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια, οι τομές χρωματίστηκαν με διάλυμα ηωσίνης (Ε) για 3 λεπτά, ακολουθούμενο από αφυδάτωση με διαβαθμισμένη αλκοόλη και καθαρισμό με ξυλόλιο. Μορφολογικές αλλαγές παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο (Nikon, Eclipse, Japan).

Δοκιμασία γαλακτοσιδάσης που σχετίζεται με γήρανση (SA- -Gal) Η δραστηριότητα της γαλακτοσιδάσης που σχετίζεται με τη γήρανση (SA- -Gal) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ χρώσης SA- -Gal (Sigma, CS{ {12}}030). Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, τα τμήματα ιστού, μετά από μια σειρά επεξεργασιών, πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) για 5 λεπτά (τρεις) και στη συνέχεια επωάστηκαν σε διάλυμα χρώσης SA{10}gal (pH 6,0) σε 37 βαθμούς χωρίς CO2 για 24 ώρες. Οι εικόνες καταγράφηκαν με μικροσκόπιο φωτός (Nikon, Eclipse, Ιαπωνία). Το ποσοστό των SA{16}}θετικών κυττάρων σε gal υπολογίστηκε ως ο μέσος αριθμός θετικών κυττάρων/ο μέσος αριθμός των συνολικών κυττάρων.

Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (gRT-PCR) Το συνολικό RNA από τις κάψουλες φακών των ποντικών εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TRlzol. Η αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με το κιτ αντιδραστηρίων ExScript RT (Invitrogen). Πραγματοποιήθηκε ποσοτική ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης ανάστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης (qRT-PCR) χρησιμοποιώντας SYBR Green Supermix

κιτ (Takara, Tokyo, Japan), με -ακτίνη ως ενδογενή έλεγχο. Οι μεταγραφές διερευνήθηκαν για πολλά γονίδια-στόχους, συμπεριλαμβανομένων FAS (εμπρός, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'και αντίστροφη,5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (προς τα εμπρός,5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{{ 10}} και αντίστροφα,5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') και -ακτίνη (εμπρός, 5 '-TCGTGGGGCCGCCCTAGGCAC-3'και αντίστροφα,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGGG{{20}'. επίπεδα έκφρασης κάθε γονιδίου ήταν

μέθοδος. κανονικοποιήθηκε σε -ακτίνη και υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη χρώση 2-△△ct r Ανοσοϊστοχημική (IHC) Χρησιμοποίησαν συνολικά 5 αντιπροσωπευτικές τομές από κάθε έναν από τους 10 επιλεγμένους φακούς ανά ομάδα για ανοσοϊστοχημική (IHC) ανάλυση για την αξιολόγηση της έκφρασης των p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 και p62. Αφού τα παρασκευασμένα δείγματα επωάστηκαν στους 60 βαθμούς για 2 ώρες, πέρασαν από σειρές ξυλολίου και διαβαθμισμένης αλκοόλης για αποπαραφίνη. Στη συνέχεια, τα δείγματα βράστηκαν σε 0,1 Μ κιτρικού οξέος (ρΗ 6,1) για 30 λεπτά και ψύχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση τρεις φορές με PBS, τα δείγματα εμποτίστηκαν με 0,3 τοις εκατό ΗΟ, για να αναστείλουν την ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης. Στη συνέχεια, προστέθηκαν πρωτογενή αντισώματα και ψύχθηκαν στους 4 βαθμούς C, όλη τη νύχτα. Τα αντίστοιχα δευτερεύοντα αντισώματα επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 βαθμούς C. Μετά από πλύση με PBS, τα δείγματα επωάστηκαν σε διαμινοβενζιδίνη (DAB) μέχρι να αναπτυχθεί η επιθυμητή ένταση χρώσης. Εικόνες των ανοσοχρωματισμένων κυττάρων λήφθηκαν χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, Japan).

Ανάλυση Western blot

Η ολική πρωτεΐνη από κάψουλες φακών ποντικών εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα ραδιο-ανοσοκαθίζησης (RIPA) με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Pierce, ΗΠΑ) και ένα κιτ δικινχονικού οξέος (BCA) (Thermo Fisher Scientific, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης . Η συνολική πρωτεΐνη (40 ug) αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκε ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Milipore, Γερμανία). Οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύχτα με ένα πρωτεύον αντίσωμα στους 4 βαθμούς C. Την επόμενη ημέρα, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντίστοιχα δευτερεύοντα αντισώματα για 1 ώρα στους 37 βαθμούς C. Οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο υποστρώματος χημειοφωταύγειας με ένα Super Signal West Pico κιτ (Pierce Biotechnology, ΗΠΑ). Πραγματοποιήθηκαν τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism 7.0 και το Microsoft Excel. Η πρωτεΐνη ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J. Το τεστ t Student και η ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της στατιστικής σημασίας των πειραματικών δεδομένων. Διαφορές με μια τιμή P<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

ΔΙΑΘΕΣΙΜΟΤΗΤΑ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ

Τα σύνολα δεδομένων που χρησιμοποιήθηκαν και αναλύθηκαν κατά την τρέχουσα μελέτη περιλαμβάνονται σε αυτό το δημοσιευμένο άρθρο.

Αυτό το άρθρο προέρχεται από τη διεύθυνση www.nature.com/cddiscovery