Μετα-αναλύσεις Προσδιορίζουν τη μεθυλίωση του DNA που σχετίζεται με τη λειτουργία και τη βλάβη των νεφρών

edmund.chen@wecistanche.com

ΧρόνιοςΝεφρική Νόσοςαποτελεί σημαντική επιβάρυνση για τη δημόσια υγεία. Η αυξημένη αναλογία λευκωματίνης προς κρεατινίνη ούρων αποτελεί μέτρονεφρική βλάβη,και χρησιμοποιείται για τη διάγνωση και τη σταδιοποίηση του χρόνιουΝεφρική Νόσος. Να επεκτείνει τις γνώσεις σχετικά με τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς που σχετίζονται μενεφρική λειτουργίακαι ασθένεια, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη συσχέτισης με βάση το αίμα σε επίπεδο επιγονιδιώματος για τον εκτιμώμενο ρυθμό σπειραματικής διήθησης (n=33,605) και την αναλογία λευκωματίνης ούρων προς κρεατινίνη (n=15,068) και εντοπίσαμε 69 και επτά θέσεις CpG όπου η μεθυλίωση του DNA συσχετίστηκε με το αντίστοιχο χαρακτηριστικό. Η πλειονότητα αυτών των ευρημάτων έδειξε κατευθυντικά συνεπείς συσχετίσεις με τις αντίστοιχες κλινικές εκβάσεις της χρόνιαςΝεφρική Νόσοςκαι μέτρια αυξημένη λευκωματουρία. Συσχετίσεις μεθυλίωσης DNA μενεφρική λειτουργία, όπως τα CpG στο JAZF1, PELI1 και CHD2 επικυρώθηκαν σενεφρικό ιστό. Η μεθυλίωση σε PHRF1, LDB2, CSRNP1 και IRF5 έδειξε αιτιολογικές επιδράσεις σενεφρική λειτουργία. Οι αναλύσεις εμπλουτισμού αποκάλυψαν μονοπάτια που σχετίζονται με την αιμόσταση και τη μετανάστευση των κυττάρων του αίματος για τον εκτιμώμενο ρυθμό σπειραματικής διήθησης και την ενεργοποίηση και απόκριση των ανοσοκυττάρων για τα CpG που σχετίζονται με την αναλογία λευκωματίνης προς κρεατινίνη ούρων.

Λέξεις-κλειδιά:Νεφρική Νόσος; νεφρική βλάβη? νεφρική λειτουργία? νεφρικός ιστός? δομή των νεφρών

χρόνιοςΝεφρική Νόσος(ΧΝΝ) αποτελεί σημαντική επιβάρυνση για τη δημόσια υγεία. Επηρεάζει περισσότερο από το 10 τοις εκατό των ενηλίκων παγκοσμίως και περισσότερο από το 40 τοις εκατό των ατόμων ηλικίας 70 ετών και άνω1,2. Η ΧΝΝ είναι η κύρια αιτία θανάτου παγκοσμίως3 και συμβάλλει σημαντικά στην καρδιαγγειακή νοσηρότητα και θνησιμότητα2,4,5. Η ΧΝΝ ορίζεται ως η παρατεταμένη παρουσία ανωμαλιών τουνεφρόδομή ή λειτουργία. ονεφρική λειτουργίαΤα μέτρα που χρησιμοποιούνται πιο συχνά είναι ο ρυθμός σπειραματικής διήθησης, που συνήθως υπολογίζεται από τις συγκεντρώσεις κρεατινίνης ορού (eGFR) και ο λόγος λευκωματίνης προς κρεατινίνη ούρων (UACR)6. Το αυξημένο UACR είναι ένα μέτρο τουνεφρική βλάβη, χρησιμοποιείται για τη διάγνωση και το στάδιο της ΧΝΝ7 και σχετίζεται με διαβητικούς και υπερτασικούςΝεφρική Νόσος8. Ακόμη και η μέτρια αυξημένη UACR είναι παράγοντας κινδύνου για καρδιαγγειακές παθήσεις, ανεξάρτητα από άλλεςνεφρική λειτουργία markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 γενετικοί τόποι που σχετίζονται μενεφρική λειτουργία10,12,13. Οι παραλλαγές του δείκτη σε γνωστούς τόπους που σχετίζονται με το eGFR εξηγούν ένα εκτιμώμενο 8,9 τοις εκατό της διακύμανσης του eGFR12.Μια πρόσφατη μετα-ανάλυση GWAS των ενσωματωμένων περιοχών ανοικτής χρωματίνης με eGFR με μικρά σύνολα πολυμορφισμών απλού νουκλεοτιδίου (SNPs)10. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης υποστηρίζουν τη σημασία της τροποποιημένης μεταγραφικής ρύθμισης ως μηχανισμού που συμβάλλει στην ΚΥΠ. Για τη διερεύνηση της μεθυλίωσης του DNA, σε σχέση μενεφρική λειτουργία, έχουν διεξαχθεί μελέτες συσχέτισης σε επίπεδο επιγονιδιώματος (EWAS) του eGFR και της ΧΝΝ. Ως βασικός ρυθμιστής της μεταγραφής που μπορεί να αξιολογηθεί με τρόπο οικονομικά αποδοτικό και υψηλής απόδοσης, η μεθυλίωση του DNA έχει μελετηθεί σε θέσεις CpG (CpG) με ανάλυση μίας βάσης. Διεξάγαμε προηγουμένως ένα EWAS που περιελάμβανε 4859 ενήλικες από δύο μελέτες με βάση τον πληθυσμό και εντοπίσαμε 18 επικυρωμένες, διαφορικά μεθυλιωμένες θέσεις στο πλήρες αίμα που σχετίζονται με το eGFR14. Αν και αυτή η μελέτη αποκάλυψε γνώσεις για τους γονιδιακούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς τουνεφρόλειτουργία, τα συσχετισμένα CpG εξηγούν μόνο το 1,2 τοις εκατό της διακύμανσης του eGFR. Άλλες προηγούμενες μελέτες επικεντρώθηκαν σε ασθενείς με ΧΝΝ και/ή ασθενείς με διαβήτη ή ασθενείς με λοίμωξη από τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας ή περιορίστηκαν από μικρό μέγεθος δείγματος, έλλειψη αντιγραφής, έλλειψη προσαρμογής για πιθανούς συγχυτές ή συνδυασμό αυτών14–19. Άλλες μελέτες επικεντρώθηκαν στα πρότυπα μεθυλίωσης του DNA των διαβητικώνΝεφρική Νόσος(DKD) ασθενείς 20–22.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ

Εδώ, πραγματοποιήσαμε ένα EWAS τουνεφρική λειτουργίαχαρακτηριστικά για τον εντοπισμό πρόσθετων CpG που σχετίζονται με γονιδιακούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς δυνητικής σημασίας για τη ΧΝΝ. Επεκτείναμε το πρώην EWAS για eGFR και CKD αυξάνοντας ουσιαστικά το μέγεθος του δείγματος σε 33.605 άτομα. Επιπλέον, συμπεριλάβαμε το UACR και τη μέτρια αυξημένη λευκωματουρία (μικρολευκωματινουρία) ως πρόσθετα χαρακτηριστικά. Τα EWAS διεξήχθησαν σε μελέτες βασισμένες κυρίως στον πληθυσμό που προσαρμόστηκαν για το φύλο, την ηλικία, τον διαβήτη, την υπέρταση, τον δείκτη μάζας σώματος (ΔΜΣ), την κατάσταση καπνίσματος και τις πιο άφθονες αναλογίες λευκών αιμοσφαιρίων. Αντιγράψαμε τα αποτελέσματά μας EWAS σε ξεχωριστά δείγματα, συσχετίσαμε τις θέσεις CpG με επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε διαφορετικούς ιστούς, εφαρμόσαμε τα ευρήματα στα κλινικά αποτελέσματα και αξιολογήσαμε την αιτιότητα μεταξύ μεθυλίωσης DNA καινεφρική λειτουργία(Συμπληρωματικό Σχ. 1).

Αποτελέσματα

Μελέτη των χαρακτηριστικών του δείγματος. Σε αυτήν την έρευνα, 36 μελέτες με συνολικά 33.605 συμμετέχοντες συνεισέφεραν στο EWAS του eGFR και 15.068 στο EWAS του UACR. Τα συγκεντρωτικά χαρακτηριστικά τους φαίνονται στον Πίνακα 1 και οι μεμονωμένες περιγραφές της μελέτης παρέχονται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 1 και 2.

EWAS του eGFR και του UACR.Ερευνήσαμε τη συσχέτιση τωννεφρόχαρακτηριστικά με μεθυλίωση DNA στο αίμα έως και 441.870 CpG, την επικάλυψη των CpG που καλύπτονται από το Illumina MethylationnEPIC BeadChip και τη σειρά Illumina HumanMethylation450 BeadChip, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για μέτρηση από όλες εκτός από μία μελέτη (Συμπληρωματικά Δεδομένα 3). Όλες οι μελέτες πραγματοποίησαν καθαρισμό δεδομένων συστοιχιών και εφάρμοσαν κεντρικά αναπτυγμένα σενάρια για την προετοιμασία τουνεφρότιμές χαρακτηριστικών, οι οποίες στη συνέχεια σχετίζονταν με τη μεθυλίωση του DNA χρησιμοποιώντας μοντέλα γραμμικής παλινδρόμησης προσαρμοσμένα σε συμμεταβλητές με τιμές μεθυλίωσης ως εξαρτημένη μεταβλητή μετά από προκαθορισμένα πρωτόκολλα μελέτης (βλ. Μέθοδοι). Παρατηρήσαμε καθόλου ή μικρό πληθωρισμό στο EWAS για τη μελέτη (μέσος πληθωρισμός eGFR=1.00, μέσος πληθωρισμός UACR=1.00, Συμπληρωματικά δεδομένα 1 και 2). Σε ένα πολυμεταβλητό διεθνές EWAS, 69 CpG συσχετίστηκαν σημαντικά με το eGFR και αναπαράχθηκαν (Εικ. 1Α, Συμπληρωματικά Δεδομένα 4, βλέπε Μέθοδοι), συμπεριλαμβανομένων εκείνων που αναφέρθηκαν προηγουμένως14. Οι αναπαραχθείσες θέσεις έδειξαν ένα σαφές μοτίβο χαμηλότερης μεθυλίωσης (60 CpGs, Pbinom=2.2E−10; Εικ. 1Α).

Εικ. 1 Αποτελέσματα EWAS του eGFR και του UACR. Σικάγο απεικονίζει τα αποτελέσματα της μελέτης συσχέτισης σε επίπεδο επιγονιδιώματος (EWAS) για τον εκτιμώμενο ρυθμό σπειραματικής διήθησης (eGFR) (A) και την αναλογία λευκωματίνης ούρων προς κρεατινίνη (UACR) (Β) χρησιμοποιώντας το συνδυασμένο δείγμα ανακάλυψης και αντιγραφής. Οι θέσεις ταξινομούνται με βάση τη χρωμοσωμική τους θέση στον άξονα x, με την τιμή –log10 P του συσχετισμού Wald-test να παρέχεται στον άξονα y. Τα CpG που συσχετίζονται θετικά με το χαρακτηριστικό απεικονίζονται στο πάνω μέρος, θέσεις με αρνητική συσχέτιση στο κάτω μέρος. Οι διακεκομμένες οριζόντιες γραμμές αντιπροσωπεύουν το επίπεδο σημαντικότητας (P-value < 1,1e−7).="" οι="" νέες="" τοποθεσίες="" αντιγραφής="" είναι="" χρωματισμένες="" με="" πορτοκαλί,="" οι="" γνωστές="" τοποθεσίες="" αναπαραγωγής="" είναι="" χρωματισμένες="" με="" τιρκουάζ="" και="" οι="" τοποθεσίες="" που="" συσχετίστηκαν="" επιπλέον="" με="" το="" αντίστοιχο="" δυαδικό="" χαρακτηριστικό="">Νεφρική Νόσος[CKD]/ μικρολευκωματινουρία [MA]) σημειώνονται με σταυρό.

Στη μετα-ανάλυση, οι χαμηλότερες τιμές P παρατηρήθηκαν για γνωστούς συσχετισμούς eGFR συμπεριλαμβανομένου του cg17944885 (ZNF788,=−1,75E−04, P-value=8.7E−41), cg23597162 (JAZF1 ,=−1.48E−04, P-value=3.2E−24) and cg06158227 (ZSCAN29,=−1.08E−04, P-value=8 .7E−20)14, ακολουθούμενο από ένα νέο εύρημα στο cg20777437 (CDCP2,=−8,28E−05, τιμή P=1.1E−17). Τα 69 αντιγραφόμενα CpG που σχετίζονται με το eGFR μόνα τους εξήγησαν το 15,7 τοις εκατό της παραλλαγής του eGFR σε ένα ξεχωριστό δείγμα μελέτης 1888 συμμετεχόντων (βλ. Μέθοδοι). Όταν προστέθηκαν όλες οι συμμεταβλητές (φύλο, ηλικία, διαβήτης, υπέρταση, ΔΜΣ, κάπνισμα και αναλογίες λευκών αιμοσφαιρίων) στο μοντέλο συσχέτισης, η συνολική αναλογία της εξηγούμενης διακύμανσης στο eGFR αυξήθηκε σε 36,3 τοις εκατό, με 2,4 τοις εκατό απόκλιση να αποδίδεται στα 69 CpG ανεξάρτητα από τις άλλες συμμεταβλητές.

Στη διεθνική ανάλυση του UACR, επτά CpG συσχετίστηκαν σημαντικά και αναπαράχθηκαν (Εικ. 1Β, Συμπληρωματικά Δεδομένα 5, βλέπε Μέθοδοι). Από τα ευρήματα, cg18181703 (SOCS3,=−2,58E−03, P-value=2.6E−13) και cg02711608 (SLC1A5,=−1,63 E−03, P-value=9.9E−13) είχε τις μικρότερες τιμές P συσχετισμού μετα-ανάλυσης. Σε έξι από τα επτά CpG, η χαμηλότερη μεθυλίωση συσχετίστηκε με υψηλότερο UACR. Λόγω του αριθμού των αναπαραγόμενων τοποθεσιών, η ισχύς της διωνυμικής δοκιμής ήταν περιορισμένη (6 CpG, pbinom=0.13; Εικ. 1Β). Τα αναπαραγόμενα CpG εξηγούν το 3,9 τοις εκατό και το πλήρες μοντέλο το 14,6 τοις εκατό της διακύμανσης στα επίπεδα UACR, με το 0,07 τοις εκατό να αποδίδεται στα CpG ανεξάρτητα από τις άλλες συμμεταβλητές.

Υπήρχε χαμηλή επικάλυψη μεταξύ των αντιγραφόμενων θέσεων EWAS και των προηγουμένως αναφερθέντων θέσεων GWAS τόσο για το eGFR (επικάλυψη=10 από 69· Συμπληρωματικά δεδομένα 4) όσο και για το UACR (επικάλυψη=1 από 7· Συμπληρωματικά δεδομένα 5). Δεν υπήρχε αλληλεπικάλυψη των αναδιπλασιασμένων CpG μεταξύ eGFR και UACR, υποδεικνύοντας ειδικά για το χαρακτηριστικό προφίλ μεθυλίωσης DNA στο αίμα. Ακόμη και μεταξύ των 967 και 270 ενδεικτικών συσχετίσεων (P-value < 1e−05)="" μιας="" συνδυασμένης="" μετα-ανάλυσης="" δειγμάτων="" ανακάλυψης="" και="" αντιγραφής="" για="" egfr="" και="" uacr,="" αντίστοιχα,="" μόνο="" 10="" τοποθεσίες="" επικαλύπτονταν="" μεταξύ="" των="" δύο="" χαρακτηριστικών.="" τα="" λεπτομερή="" αποτελέσματα="" από="" αυτές="" τις="" μετα-αναλύσεις="" για="" όλες="" τις="" υποδηλωτικές="" συσχετίσεις="" παρέχονται="" στα="" συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 6="" (egfr)="" και="" 7="">Προγονική ετερογένεια και ευρωστία των ευρημάτων. Για να αξιολογήσουμε εάν τα αποτελέσματα συσχέτισης για το eGFR και το UACR μπορεί να οδηγούνται από μια συγκεκριμένη καταγωγή, πραγματοποιήσαμε μετα-ανάλυση EWAS με στρωματοποιημένη καταγωγή δειγμάτων ευρωπαϊκής καταγωγής (EA) και αφροαμερικανικής καταγωγής (AA) με αποτελέσματα από πολλαπλές μελέτες που συμβάλλουν σε αυτά τα δύο εθνότητες. Σύγκριση των αποτελεσμάτων συσχέτισης των αναδιπλασιασμένων CpG σε δείγματα EA (Negar=23,671; nUACR=9806) με τα δείγματα AA (neGFR =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) εντός ή εντός 50 bp από τα 69 αναπαραγόμενα CpG αξιολογήθηκε για να αξιολογηθεί εάν η παρουσία SNP θα μπορούσε να επηρεάσει τη δέσμευση του ανιχνευτή. Τέσσερις ανιχνευτές εντοπίστηκαν κοντά σε ένα κοινό SNP (Συμπληρωματικά δεδομένα 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg06930757-rs112223111), το οποίο, ωστόσο, δεν συσχετίστηκαν με κανένα χαρακτηριστικό GWAS σύμφωνα με τον πόρο του PhenoScanner V2 (πρόσβαση 02/12/2021, pGWAS < 5e−8,="" συμπεριλαμβανομένων="" των="" snp="" μεσολάβησης="" με="" eur="" r²=""> 0,8)23. Αυτό δείχνει ότι τα αποτελέσματα EWAS είναι απίθανο να συγχέονται με ένα κοινό χαρακτηριστικό που είναι γνωστό ότι σχετίζεται μενεφρική λειτουργίααπό κοντινή παραλλαγή αλληλουχίας DNA. Τα εσωτερικά SNP του ανιχνευτή, τα οποία απείχαν περισσότερες από πέντε βάσεις από το 3'-άκρο του ανιχνευτή, βρέθηκαν γενικά να έχουν αμελητέα συνέπεια24.

Σχέση με ΧΝΝ και μικρολευκωματινουρία.Από τα 69 CpG που σχετίζονται με το eGFR, 53 συσχετίστηκαν επίσης με επικρατούσα ΧΝΝ σε μια μετα-ανάλυση 25,609 ατόμων συμπεριλαμβανομένων 2376 περιπτώσεων με σταθερή κατεύθυνση επίδρασης (τιμή P < 0).="" 05/69;="" συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 4,="" συμπληρωματικό="" σχ.="" 3α).="" η="" συσχέτιση="" μεταξύ="" των="" επιδράσεων="" egfr="" και="" χνν="" ήταν="" υψηλή="" (r="-0,93;" εικ.="" 3α).="" σε="" μια="" ανεξάρτητη="" κοόρτη="" 551="" ασθενών="" με="" χνν,="" 65="" cpg="" ήταν="" κατευθυντικά="" συνεπείς="" με="" τη="" μετα-ανάλυση="" egfr="" και="" πέντε="" επαναλήφθηκαν="" (p-value="">< 0,05/69,="" r="0.77;" συμπληρωματικό="" σχήμα="" 4,="" συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 4,="" βλέπε="" μέθοδοι).="" στην="" ίδια="" κοόρτη,="" τα="" cpg="" που="" σχετίζονται="" με="" egfr="" cg18194850="" (p-value="1.6E−5)" και="" cg07242931="" (p-τιμή="2.3E−5)" συσχετίστηκαν="" επίσης="" με="" το="" χρόνο="">νεφρική ανεπάρκειαή οξείανεφρική βλάβη(Συμπληρωματικά δεδομένα 8, βλ. Μέθοδοι). Και οι επτά CpG που σχετίζονται με το UACR συσχετίστηκαν επίσης σημαντικά με μικρολευκωματινουρία σε ένα δείγμα 7279 ατόμων συμπεριλαμβανομένων 1186 περιπτώσεων με την ίδια κατεύθυνση επίδρασης όπως για το UACR (τιμή P < 0.05/7,="" r="" {{7}="" }.98·="" εικ.="" 3β,="" συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 5,="" συμπληρωματικό="" σχ.="">

Συσχέτιση με γονιδιακή έκφραση. Για να αποκτήσουμε πληροφορίες σχετικά με πιθανούς λειτουργικούς μηχανισμούς των CpG που σχετίζονται με eGFR και UACR, δοκιμάσαμε τη συσχέτιση των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA τους με τα επίπεδα mRNA γονιδίων που κωδικοποιούνται σε cis στο πλήρες αίμα καθώς και στα μονοκύτταρα του αίματος (βλ. Μέθοδοι, Συμπληρωματικά Δεδομένα 9 ). Το γνωστό σχετιζόμενο με eGFR cg17944885 στο χρωμόσωμα 19 κοντά στο ZNF788 συσχετίστηκε με το αντίγραφο που κωδικοποιήθηκε από την απομακρυσμένη πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου 439 240 kb (ZNF439, Πίνακας 2). Επιπλέον, η μεθυλίωση του cg04864179 στον ρυθμιστικό παράγοντα ιντερφερόνης 5 (IRF5) συσχετίστηκε και με τα μεταγραφήματα mRNA που κωδικοποιούνται από το IRF5 και με την κοντινή μεταφορίνη 3 (TNPO3) (Συμπληρωματικό Σχήμα 5Α). Από τις συσχετίσεις UACR, οι δύο αναδιπλασιασμένες CpGs cg02711608 και cg22304262 στην οικογένεια φορέα 1 διαλυμένης ουσίας 5 (SLC1A5) αποκάλυψαν σημαντικές συσχετίσεις με τα επίπεδα mRNA του SLC1A5 και το cg23570810 στην επαγόμενη από ιντερφερόνη μεταγραφική πρωτεΐνη (transscriptsIFTM) 2). Όλα τα αποτελέσματα της ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης παρέχονται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 9.

Επιδράσεις στον ιστό των νεφρών.Για να εκτιμηθεί εάν οι παρατηρούμενες επιδράσεις μεθυλίωσης στο αίμα μεταφράζονται σενεφρικός ιστός,εφαρμόσαμε ένα μοντέλο παλινδρόμησης για να ελέγξουμε τις συσχετίσεις των αναδιπλασιασμένων CpG για σημαντικό (ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης (FDR) < 0.05) και συσχέτιση συνεπούς κατεύθυνσης με eGFR καινεφρόίνωση, αντίστοιχα, σε 506 μικροδιατομήνεφρικό ιστόδείγματα. Σε αυτά τα δείγματα,νεφρό-Η μεθυλίωση DNA με βάση τον ιστό των αντιγραφόμενων CpG που σχετίζονται με eGFR cg23597162 στο JAZF1, cg26099045 κοντά στο PELI1 και cg12644285 στο CHD2 συσχετίστηκαν σημαντικά με το eGFR με την ίδια κατεύθυνση επίδρασης όπως στο αίμα (Σημ. . Επιπλέον, το ίδιο CpG στο PELI1 και έξι επιπλέον

οι τοποθεσίες (cg20146909 στο LRRC8D, cg25767870 κοντά στο FAM46C, cg16618493 στο ZBTB7B, cg10632966 κοντά στο RPEL1, cg01068906 στο NOD2 και το cg0329773 στο GDF)νεφρόδείγματα ιστού με συνεπείς (δηλαδή, αντίστροφες) κατευθύνσεις επίδρασης (Συμπληρωματικό Σχ. 6Β, Πίνακας 2). Από τις αντιγραφόμενες θέσεις UACR, τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA σενεφρόιστός του cg00008629 σε PTBP3 και cg24859433 κοντά στο IER3 συσχετίστηκαν με ίνωση και εμφάνισαν την ίδια κατεύθυνση επίδρασης (Συμπληρωματικό Σχήμα 6D, Πίνακας 2). Σύμφωνα με τα ευρήματα EWAS, δεν βρέθηκε σημαντική συσχέτιση των CpG που σχετίζονται με UACR με eGFR στους δότες δείγματος νεφρού (Συμπληρωματικό Σχήμα 6C, Συμπληρωματικά Δεδομένα 10).

Αιτιώδεις επιδράσεις μεταξύ μεθυλίωσης DNA καινεφρική λειτουργίαχαρακτηριστικά. Για να εκτιμηθεί εάν τονεφρική λειτουργίαΤα χαρακτηριστικά επηρεάζουν αιτιολογικά τη μεθυλίωση του DNA ή αντίστροφα, πραγματοποιήσαμε μια αμφίδρομη ανάλυση δύο δειγμάτων Mendelian randomization (MR) των σημαντικά συσχετισμένων CpG. Η ανάλυση MR κατεύθυνσης προς τα εμπρός έδειξε ότι τα CpGs cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) και cg04864179 (IRF5) επηρεάζουν αιτιολογικά τα επίπεδα eGFR (Πίνακας 3). Οι εκτιμήσεις κληρονομικότητας αυτών των τεσσάρων CpG διέφεραν μεταξύ των τριών συνόλων δεδομένων από πληθυσμούς ευρωπαϊκής καταγωγής, αλλά ήταν σταθερά υψηλότερες από τη μέση κληρονομικότητα σε όλα τα CpG που αξιολογήθηκαν σε καθεμία από τις τρεις μελέτες: 0,34 (αιτιώδης CpG eGFR) έναντι 0,16 (συστοιχία HM450K) με βάση τους Hannon et al.25, 0.55 έναντι 0.19 για Dongen et al.26 και 0.51 έναντι 0.19 για McRae et al.27. Δεν εντοπίστηκαν σημαντικές αιτιολογικές συσχετίσεις για οποιαδήποτε CpG που σχετίζονται με UACR. Για την αντίστροφη μαγνητική τομογραφία, η μόνη σημαντική επίδραση ήταν αυτή του eGFR στο cg23597162 (JAZF1) όταν χρησιμοποιήθηκε η κύρια μέθοδος αντίστροφης διακύμανσης. Ωστόσο, δεν εντοπίστηκαν/παρατηρήθηκαν σημαντικές επιδράσεις στις πολλαπλές αναλύσεις ευαισθησίας αντίστροφης μαγνητικής τομογραφίας. Οι μεμονωμένες αναλύσεις δεν έδειξαν καμία ένδειξη ότι τα αποτελέσματα της μαγνητικής τομογραφίας μπορεί να οδηγούνται από ένα μόνο SNP. Επιπλέον, ο αποκλεισμός των SNP που συσχετίστηκαν με τον σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 αποτελεί σημαντικό παράγοντα κινδύνου γιαΝεφρική Νόσοςδεν οδήγησαν σε διαφορετικά ευρήματα. Τα αποτελέσματα για όλες τις πρωτογενείς αναλύσεις και τις αναλύσεις MR ευαισθησίας φαίνονται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα 11 και 12 και στο Συμπληρωματικό Σχήμα 7. Οι αναλύσεις ευαισθησίας υποστηρίζουν τα πρωτεύοντα ευρήματα των σημαντικών μπροστινών αποτελεσμάτων MR (FDR < 0.05,="" βλ.="" μέθοδοι)="" με="" εκτιμήσεις="" συνεπούς="" επίδρασης="" κατεύθυνσης,="" υποδεικνύοντας="" πιθανές="" αιτιώδεις="" σχέσεις="" από="" τη="" μεθυλίωση="" του="" dna="" στον="" egfr="" αλλά="" όχι="" το="">

Δέσμευση παράγοντα μεταγραφής, σημάδι ιστόνης και αναλύσεις εμπλουτισμού οδού. Πραγματοποιήσαμε αναλύσεις εμπλουτισμού θέσης δέσμευσης μεταγραφικού παράγοντα, σημάδι ιστόνης και οδού με βάση τα 967 CpG που έδειξαν ενδεικτική συσχέτιση με το eGFR (Pvalue < 1e−05,="" συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 6)="" και="" τα="" 270="" cpg="" που="" έδειξαν="" ενδεικτικές="" συσχετίσεις="" με="" uacr="" (p-value="">< 1e−5;="" συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 7)="" στη="" μετα-ανάλυση="" για="" μεγιστοποίηση="" της="" στατιστικής="" ισχύος="" των="" αναλύσεων="" εμπλουτισμού="" (βλ.="" μέθοδοι)="" 14="" αρχικά,="" αξιολογήσαμε="" εάν="" τα="" cpg="" που="" σχετίζονται="" με="" egfr="" χαρτογραφήθηκαν="" κατά="" προτίμηση="" σε="" θέσεις="" δέσμευσης="" 169="" παραγόντων="" μεταγραφής="" (tfs)="" με="" βάση="" το="" chro="" δεδομένα="" αλληλουχίας="" dna="" ανοσοκατακρήμνισης="" (chip-seq)="" από="" το="" έργο="" encode="" που="" συγκεντρώθηκαν="" με="" συναινετικές="" κλήσεις="" σε="" 91="" τύπους="" ανθρώπινων="" κυττάρων="" (161="" ίχνη="" tf)="" και="" συμπληρώθηκαν="" με="">νεφρόίχνη με βάση τον ιστό (βλ. Μέθοδοι). Μετά από διόρθωση πολλαπλών δοκιμών για 169 TF, οκτώ TF έδειξαν σημαντικό εμπλουτισμό για CpG που σχετίζονται με eGFR (FDR < 0.05;="" εικ.="" 4a,="" συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 13),="" συμπεριλαμβανομένου="" του="" cebpb="" (τιμή="" p="1)." 75e−06,="" cross-tissue="" track)="" και="" ep300="" (p-value="7.49E−09," cross-tissue="" track).="" αυτό="" είναι="" συνεπές="" με="" το="" εύρημα="" των="" chu="" et="" al.14="" σε="" ένα="" μικρότερο="" υποσύνολο="" 4859="" συμμετεχόντων="" από="" τους="" 33.605="" συμμετέχοντες="" που="" αναλύθηκαν="" εδώ.="" τα="" cpg="" που="" σχετίζονται="" με="" uacr="" εμπλουτίστηκαν="" σε="" θέσεις="" δέσμευσης="" 56="" tf="" (εικ.="" 4β,="" συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 14)="" με="" την="" ισχυρότερη="" συσχέτιση="" για="" το="" polr2a="" (p-value="6.93E−19)," fos="" (p-value="" {{32="" }}.28e−12)="" και="" ep300="" (p-value="">

Νεφρό-Τα CpG που σχετίζονται με τη λειτουργία εμπλουτίστηκαν ευρέως για πολλά σημάδια ιστόνης, με 82 από τους 195 συνδυασμούς κυτταρικού τύπου σημάδι ιστόνης σημαντικούς (FDR q < 0.05)="" για="" το="" egfr="" (εικ.="" 4c,="" συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 15)="" και="" 79="" από="" 195="" για="" uacr="" (εικ.="" 4d,="" συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 16).="" η="" τροποποίηση="" ιστόνης="" h3k4me1,="" ένα="" σήμα="" συγκεντρωμένο="" σε="" ενεργούς="" και="" αρχικούς="" ενισχυτές,="" εμπλουτίστηκε="" για="" όλους="" τους="" κυτταρικούς="" τύπους="" για="" cpg="" που="" σχετίζονται="" με="" uacr="" και="" σχεδόν="" όλους="" τους="" τύπους="" κυττάρων="" για="" cpg="" που="" σχετίζονται="" με="" egfr.="" ενώ="" τα="" cpg="" που="" σχετίζονται="" με="" uacr="" έδειξαν="" εμπλουτισμό="" για="" το="" σήμα="" προαγωγέα="" h3k4me3="" σε="" 34="" κυτταρικούς="" τύπους,="" μόνο="" τέσσερα="">

οι τύποι έδειξαν εμπλουτισμό για θέσεις που σχετίζονται με eGFR. Αντίθετα, το σήμα H3K36me3 που σχετίζεται με το γονιδιακό σώμα έδειξε έναν πολύ ευρύτερο εμπλουτισμό για CpG που σχετίζονται με eGFR (30 κυτταρικοί τύποι) από ότι τα CpG που σχετίζονται με το UACR (πέντε τύποι κυττάρων). Σε αντίθεση με τα H3K3me1/3 και H3K36me3, τα οποία έχουν συνδεθεί όλα με ενεργά γονίδια (ενισχυτές, ενεργοί προαγωγείς, ενεργή μεταγραφή), τα H3K9me3 και H3K27me3, τα οποία γενικά σχετίζονται με συστατική και προαιρετική ετεροχρωματίνη28–31, δεν ήταν σημαντικά εμπλουτισμένα με UACR συσχετισμένα CpG σε οποιονδήποτε τύπο κυττάρου που δοκιμάστηκε (Εικ. 4D, Συμπληρωματικά Δεδομένα 16). Εμπλουτισμός γονιδίων που εμπλέκονται απόνεφρική λειτουργία-τα συσχετισμένα CpG αξιολογήθηκαν στις βάσεις δεδομένων Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) και Reactome (βλ. Μέθοδοι)32–35. Σημαντικός εμπλουτισμός παρατηρήθηκε για 27 όρους (25 GO, ένα KEGG, ένα Reactome; Συμπληρωματικά δεδομένα 17, Εικ. 5Α) για το eGFR και 91 όρους (87 GO, τέσσερα Reactome; Συμπληρωματικά δεδομένα 18, Εικ. 5Β) για το UACR (Εικ. 5Β . 5Β). Οι οδοί που σχετίζονται με τη μετανάστευση τύπου λευκών αιμοσφαιρίων, τη μετάφραση του mRNA, την αιμόσταση και την πήξη, καθώς και την απόκριση στην ινσουλίνη έδειξαν σημαντικό εμπλουτισμό για τα CpG που σχετίζονται με eGFR (FDR < 0.05;="" εικ.="" 5α).="" οι="" οδοί="" με="" τις="" χαμηλότερες="" τιμές="" p="" εμπλουτισμού="" για="" θέσεις="" που="" σχετίζονται="" με="" uacr="" κυριαρχούνταν="" από="" την="" ενεργοποίηση="" και="" απόκριση="" των="" ανοσοκυττάρων="" και="" από="" τις="" οδούς="" που="" σχετίζονται="" με="" την="" ιντερφερόνη="" (εικ.="" 5β).="" πρόσθετες="" οδοί="" που="" εμπλουτίστηκαν="" περιελάμβαναν="" τη="" μετανάστευση="" λευκών="" αιμοσφαιρίων,="" όπως="" και="" για="" τα="" αποτελέσματα="" του="" egfr="" (συμπληρωματικά="" δεδομένα="">

Σχέση με γνωστούς συσχετισμούς EWAS με άλλα χαρακτηριστικά. Δεδομένου του παρατηρούμενου εμπλουτισμού των οδών που σχετίζονται με την ανοσοαπόκριση, των αποτελεσμάτων μεθυλίωσης του DNA, συμπεριλαμβανομένων των CpGs κοντά στα γονίδια της οδού ιντερφερόνης και του γεγονότος ότι η κατάσταση μεθυλίωσης του DNA αξιολογήθηκε κυρίως στα λευκοκύτταρα, αξιολογήσαμε εάν τα ευρήματά μας μπορεί να οφείλονται σε συγχυτικές επιδράσεις την ανοσολογική απόκριση ή την κατάσταση φλεγμονής. Έτσι, πραγματοποιήσαμε αναζήτηση των αναδιπλασιασμένων CpG σε ένα μεγάλο EWAS σε επίπεδα υψηλής ευαισθησίας C-αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP) ορού36. Μόνο δύο CpG, τα οποία συσχετίστηκαν επίσης με μεθυλίωση DNA και eGFR στονεφρικός ιστός,Το cg09610644 στο BDH1 και το cg12644285 στο CHD2, ήταν μεταξύ των τοποθεσιών που σχετίζονται με την CRP. Έτσι, μια γενική σύγχυση των αποτελεσμάτων μας μέσω της φλεγμονώδους κατάστασης όπως εκτιμάται από την CRP φαίνεται απίθανη.

Κάποια από τανεφρική λειτουργία-Τα συσχετισμένα CpG που προσδιορίστηκαν σε αυτή τη μελέτη σχετίζονται με πολλά άλλα χαρακτηριστικά που βασίζονται σε δημοσιευμένο EWAS. Είκοσι μία θέσεις eGFR συσχετίστηκαν με την αρτηριακή πίεση, την κατανάλωση αλκοόλ, το ΔΜΣ, το φύλο, τον υποδοχέα του διαλυτού παράγοντα νέκρωσης όγκου 2 ή/και την κατάσταση καπνίσματος και πέντε θέσεις UACR σχετίστηκαν προηγουμένως με την κατανάλωση αλκοόλ, την κατάσταση καπνίσματος, το ΔΜΣ, το μορφωτικό επίπεδο. -γλουταμυλική τρανσφεράση, διαλυτός υποδοχέας παράγοντα νέκρωσης όγκου 2, σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 και/ή αρκετοί μεταβολίτες ορού (Πίνακας 2, Συμπληρωματικά Δεδομένα 19). Τρία από αυτά τα CpG (όλες οι θέσεις UACR) συσχετίστηκαν με περισσότερα από δύο χαρακτηριστικά, συγκεκριμένα cg02711608 στο SLC1A5 (με -γλουταμυλοτρανσφεράση, -γλουταμυλοθρεονίνη, ΔΜΣ, κατανάλωση αλκοόλ), cg18181703 σε SOCS3 (με κατάσταση σακχαρώδους διαβήτη τύπου 2, BMI, , διαλυτός υποδοχέας παράγοντα νέκρωσης όγκου 2) και cg24859433 κοντά στο IER3 (με κατάσταση καπνίσματος, μορφωτικό επίπεδο, 4-βινυλοφαινόλη_θειική). Το συμπληρωματικό Σχήμα 5Β αποτελεί παράδειγμα ενός CpG, cg26099045, που συσχετίστηκε με eGFR και ίνωση σενεφρικό ιστόστην ανάλυσή μας, και επιπλέον σχετίζεται με το σεξ και το κάπνισμα σε προηγούμενα EWAS. Τέλος, το cg17944885 στο ZNF788 συσχετίστηκε επίσης με το eGFR σε ένα δείγμα ασθενών με DKD22.

Συζήτηση

Σε αυτό το EWAS τουνεφρική λειτουργία, αναγνωρίσαμε και αντιγράψαμε τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA του αίματος 69 CpG που σχετίζονται με το eGFR. Από αυτές, 60 τοποθεσίες δεν είχαν αναφερθεί προηγουμένως, όπως και οι επτά CpG που εντοπίστηκαν σε σχέση με το UACR. Η πλειονότητα των CpG που σχετίζονται με eGFR και UACR συσχετίστηκαν επίσης σημαντικά με τα κλινικά τους αποτελέσματα, π.χ. ΧΝΝ και μικρολευκωματινουρία, και επομένως μπορεί να έχουν τη δυνατότητα διαστρωμάτωσης ατόμων σε κίνδυνο. Η διακύμανση του eGFR που αποδόθηκε σε αυτά τα 69 CpG ήταν 2,4 τοις εκατό — διπλάσια από ένα προηγούμενο EWAS14 και είναι συγκρίσιμη με τη διακύμανση που εξηγήθηκε από 29 SNP που ανακαλύφθηκαν από το GWAS που περιλάμβαναν τρεις φορές μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος για την ανακάλυψη θέσεων37,38. Αυτό υποδηλώνει ότι η διαφορική μεθυλίωση του DNA σε μεμονωμένα CpG που ποσοτικοποιούνται από αίμα εξηγεί περισσότερο τη διακύμανση του eGFR από τα μεμονωμένα κοινά SNP σε δεδομένο μέγεθος δείγματος. Για το UACR, φαίνεται ότι απαιτούνται μεγαλύτερα μεγέθη δείγματος σε σύγκριση με το eGFR για την αποκάλυψη παρόμοιου αριθμού CpG που σχετίζονται με τα χαρακτηριστικά. Δεδομένου ότι η λευκωματίνη και η κρεατινίνη για τον υπολογισμό του UACR μετρώνται στα ούρα σε αντίθεση με τον ποσοτικό προσδιορισμό της κρεατινίνης από τον ορό για την εκτίμηση του GFR, αυτή η διαφορά δεν είναι απροσδόκητη και είναι σύμφωνη με τις παρατηρήσεις από το GWAS αυτών των χαρακτηριστικών10,13. Επιπλέον, η γενετική διαφοροποίηση φαίνεται να επηρεάζει τονεφρική λειτουργίαχαρακτηριστικά μέσω διαφορετικών οδών από τις αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA. Αυτό υποστηρίζεται από τη χαμηλή επικάλυψη μεταξύ των αναπαραγόμενων θέσεων EWAS και GWAS τόσο για το eGFR όσο και για το UACR.

Αυτή η μετα-ανάλυση EWAS περιελάμβανε δείγματα διαφορετικών πληθυσμών και εθνοτήτων. Παρατηρήσαμε υψηλή συσχέτιση των εκτιμήσεων των επιπτώσεων που λήφθηκαν από το μεγάλο υποδείγμα των ατόμων ΕΑ με τις επιπτώσεις που εκτιμήθηκαν στα άτομα ΑΑ (Εικ. 2). Παρά τη συμπερίληψη δεδομένων από σημαντικό αριθμό ατόμων με καταγωγή που δεν ανήκουν στην ΕΑ, τα συνολικά αποτελέσματα του διεθνικού EWAS μπορεί να βασίζονται σε δεδομένα από άτομα καταγωγής EA, τα οποία αντιπροσώπευαν το 70 τοις εκατό (eGFR) / 65 τοις εκατό (UACR) της μελέτης μας (Συμπληρωματικά Στοιχεία 3 και 4). Για να αντιμετωπιστεί αυτός ο περιορισμός, απαιτούνται μελλοντικές αναλύσεις με αυξημένη αναλογία δειγμάτων εκτός EA για μια αξιόπιστη και λεπτομερή αξιολόγηση της ετερογένειας μεταξύ των προγόνων. Η δυνατότητα μετάφρασης των γνώσεων από το EWAS για ποσοτικά χαρακτηριστικά σε μελέτες που βασίζονται κυρίως στον πληθυσμό σε άτομα με τη νόσο καταδεικνύεται από το γεγονός ότι οι εκτιμήσεις επίδρασης σε 65 από 69 σχετιζόμενες με eGFR CpG παρατηρήθηκαν προς την ίδια κατεύθυνση σε μια κοόρτη 551 ασθενών με ΧΝΝ. δείχνοντας προς μηχανισμούς που εφαρμόζονται σε ένα ευρύ φάσμα επιπέδων eGFR (Εικ. 3). Εξάλλου,

Το cg07242931 στο MAN1C1 και το cg18194850 στο SUCLG2 δεν συσχετίστηκε μόνο με το eGFR, αλλά προέβλεπε τον χρόνονεφρική ανεπάρκειαή οξείανεφρική βλάβη(Συμπληρωματικά Στοιχεία 8). Περαιτέρω στοιχεία για εμπλοκή του SUCLG2, το οποίο κωδικοποιεί την -υπομονάδα της συνθετάσης σουκινυλ-CoA, σε νεφρική νόσο προτάθηκε από ένα GWAS σε διαβητικούςΝεφρική Νόσοςστους Ινδιάνους της Αμερικής (SNP=rs4453858, P-value=2E−6)39. Η γενετική παραλλαγή σε αυτό το γονίδιο συσχετίστηκε επίσης με τα επίπεδα σουκινυλο-καρνιτίνης στα ούρα (C4DC, SNP=rs115560420, P-value=7E−15)40. Το C4DC είναι ένα μεταβολικό προϊόν από τον κύκλο του τρικαρβοξυλικού οξέος, το οποίο καταλύεται υπό τη συμμετοχή της συνθετάσης σουκινυλ-CoA και υψηλότερα επίπεδα C4DC στο αίμα που σχετίζονται με χαμηλότερο eGFR41. Ωστόσο, μια έρευνα στα αποτελέσματα των ποσοτικών θέσεων μεθυλίωσης (meQTL) του GoDMC (http://www.godmc.org.uk)42 δεν αποκάλυψε σημαντική συσχέτιση αυτών των δύο SNP με το cg18194850, υποδηλώνοντας ότι δεν υπάρχει άμεση σχέση μεταξύ αυτών των SNP και την τοποθεσία CpG.

Καθώς η μεθυλίωση του DNA είναι ένας κύριος ρυθμιστής της γονιδιακής έκφρασης, αξιολογήσαμε τη συσχέτιση των θέσεων μεθυλίωσης DNA που σχετίζονται με το χαρακτηριστικό με τα επίπεδα mRNA των γονιδίων στο cis. Γονίδια των οποίων τα επίπεδα mRNA συσχετίστηκαν σημαντικά μενεφρική λειτουργίαοι σχετικές θέσεις μεθυλίωσης του DNA σχετίζονταν με τις οδούς ιντερφερόνης (τόσο για το eGFR όσο και για το UACR). Αν και αυτά τα ευρήματα συμφωνούν με τα αποτελέσματα εμπλουτισμού μονοπατιού για το UACR (Εικ. 5Β, Συμπληρωματικά Δεδομένα 18), ο αριθμός των σημαντικών συσχετίσεων μεταξύ των CpG που σχετίζονται με το UACR και των επιπέδων μεταγραφής είναι αρκετά χαμηλός. Αυτό δεν προκαλεί έκπληξη λαμβάνοντας υπόψη το σχετικά μικρό μέγεθος δείγματος 1915 ατόμων που είναι διαθέσιμα για αυτήν την ανάλυση και την περιορισμένη κάλυψη του πόρου της μεταγραφικής. Είναι ενδιαφέρον ότι μεταξύ των σημαντικών ευρημάτων για το UACR, δύο CpG στην οικογένεια φορέα διαλυμένης ουσίας 1 μέλος 5 (SLC1A5) συσχετίστηκαν με διαφορική έκφραση γονιδίου και επίσης με αρτηριακή πίεση. Η μεθυλίωση του DNA στο SLC1A5, το οποίο κωδικοποιεί έναν εξαρτώμενο από νάτριο ουδέτερο μεταφορέα αμινοξέων, θα μπορούσε επομένως να είναι ένα επιπλέον στοιχείο που συμβάλλει στη γνωστή συσχέτιση μεταξύ UACR και αρτηριακής πίεσης.

Σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενα μεταγραφήματα δεν κωδικοποιούνταν πάντα από το πλησιέστερο γονίδιο (cg17944885 κοντά στο ZNF788), ή μια θέση CpG συσχετίστηκε με πολλαπλά γονίδια στο cis (cg04864179 στο IRF5). Ειδικότερα, είναι αξιοσημείωτη η συσχέτιση της μεθυλίωσης του DNA στο cg04864179 με τα επίπεδα μεταγραφής IRF5. Λαμβάνοντας υπόψη το σημαντικό αποτέλεσμα MR αυτού του CpG με eGFR, η μεθυλίωση του DNA στο IRF5 μπορεί να επηρεάσει αιτιολογικά το eGFR που προκαλείται από τη γονιδιακή του έκφραση. Λαμβάνοντας υπόψη τον μετασχηματισμό χαρακτηριστικών των υποκείμενων γενετικών συσχετίσεων (βλ. Μέθοδοι), παρατηρήσαμε ότι μια αύξηση στη μεθυλίωση του DNA κατά δέκα τυπικές αποκλίσεις είχε ως αποτέλεσμα 3,2 τοις εκατό υψηλότερο eGFR. Αν και αυτή η εκτιμώμενη επίδραση είναι πολύ μικρή, η αιτιολογική επίδραση των προτύπων μεθυλίωσης στα αιμοσφαίρια στη ΧΝΝ υποστηρίχθηκε επίσης από τη μαγνητική τομογραφία βασισμένη σε σύνοψη με διαφορετικό σύνολο δεδομένων meQTL σε μια πρόσφατη μελέτη, όπου η αιτιολογική επίδραση ήταν κατευθυντικά συνεπής με τα αποτελέσματά μας22. Εφαρμόζοντας εντοπισμό πολλαπλών χαρακτηριστικών, έδειξαν επίσης ότι τα γενετικά αποτελέσματα αυτού του τόπου στο eGFR μεσολαβούνταν από τη μεθυλίωση του IRF5 και την έκφραση γονιδίου στο αίμα. Επιπλέον, ο εντοπισμός της έκφρασης του γονιδίου IRF5 με eGFR φάνηκε τόσο στα σωληναριακά όσο και στα σπειραματικά διαμερίσματα τουνεφρόιστός43. Κατά την ερμηνεία του αιτιώδους αποτελέσματος που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας, θα πρέπει ωστόσο να ληφθεί υπόψη ότι οι αναλύσεις MR για CpG cg04864179 έδειξαν σημαντική ετερογένεια (p < 0,05)="" μεταξύ="" των="" οργάνων="" (συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 11="" και="" συμπληρωματικό="" σχήμα="" 7="">

Το IRF5 κωδικοποιεί ένα μέλος της οικογένειας του ρυθμιστικού παράγοντα ιντερφερόνης (IRF). Η ομάδα των μελών της οικογένειας IRF περιέχει μεταγραφικούς παράγοντες με διαφορετικούς ρόλους, όπως τη ρύθμιση της δραστηριότητας του ανοσοποιητικού συστήματος, την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση, καθώς και τον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης για την απόκριση ιντερφερόνης σε ιογενείς λοιμώξεις. Το IRF5 μπορεί να επηρεάσει την απόκριση των κυττάρων του ανοσοποιητικού. Πολλές μελέτες υποστηρίζουν ότι οι αλλαγές στη μεθυλίωση του IRF5 μπορεί να επηρεάσουννεφρική λειτουργίαμέσω ανοσολογικών οδών: Τα SNP στο IRF5 συνδέονται με ΣΕΛ μέσω αλλαγών στην έκφραση του IRF5 στα μονοκύτταρα του αίματος44-46. Ο ΣΕΛ είναι μια αυτοάνοση νόσος που χαρακτηρίζεται από μια ενεργοποίηση της οδού IFN που μπορεί να επηρεάσει τηννεφράως νεφρίτιδα λύκου47. Αναστολή της υπερενεργοποίησης IRF5 σε μοντέλο ποντικού SLE που προστατεύεται από την έναρξη και τη σοβαρότητα της νεφρίτιδας του λύκου και βελτιώθηκενεφρική λειτουργίακαι παθολογία48,49. Αν και το EWAS μας δεν επικεντρώθηκε στη μελέτη ασθενών με ΣΕΛ, μικρές επιδράσεις της μεθυλίωσης IRF5 σε σχετιζόμενα με τους νεφρούς αποτελέσματα, με μεσολάβηση τουλάχιστον εν μέρει από την έκφρασή του και τις επακόλουθες οδούς IFN, μπορεί να ανιχνευθούν ως επιδράσεις στο eGFR στο γενικό πληθυσμό.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΟΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΟ ΠΟΝΟ

Αρκετά από τα σχετιζόμενα με το eGFR CpG για τα οποία προσδιορίστηκε ποσοτικά η μεθυλίωση του DNA από τα κύτταρα του αίματος συσχετίστηκαν επίσης με το eGFR καινεφρόίνωση όταν ποσοτικοποιήθηκε η μεθυλίωση του DNA απόνεφρόιστού, αν και το μέγεθος του δείγματος ήταν σημαντικά μικρότερο σε σύγκριση με το σύνολο δεδομένων EWAS. Αυτό υποδηλώνει ότι τουλάχιστον μερικά από τα ευρήματα που λαμβάνονται από το αίμα μπορούν να μεταφραστούν σε έναν πρόσθετο ιστό-στόχο ειδικό για το χαρακτηριστικό. Εδώ, αίμα καινεφρόείναι οι δύο κύριοι ιστοί στόχοι ειδικοί για το χαρακτηριστικό, αφού τολειτουργίααπονεφρόείναι η διήθηση του αίματος για την απομάκρυνση των αποβλήτων. Αναλύσεις εμπλουτισμού τουνεφρική λειτουργίαΤα συσχετισμένα CpG έδειξαν κεντρικό ρόλο στη μεταγραφική ρύθμιση. Βρήκαμε εκτεταμένο εμπλουτισμό των H3K4me1/3 και H3K36me3. Το H3K4me1/3 συνδέεται με εκκινούμενους και ενεργούς ενισχυτές καθώς και με ενεργούς προαγωγείς και το H3K36me3 συσχετίζεται στενά με μεταγραμμένες περιοχές του γονιδιώματος50. Ο ρόλος της μεταγραφικής ρύθμισης υποστηρίζεται περαιτέρω από το ισχυρότερο σήμα εμπλουτισμού μεταγραφικού παράγοντα των CpG που σχετίζονται με UACR, που είναι η POLR2A, η μεγαλύτερη υπομονάδα του κύριου ενζύμου που συνθέτει mRNA στους ευκαρυώτες.

Οι πιθανοί περιορισμοί που σχετίζονται με τις αναλύσεις μαγνητικής τομογραφίας περιλαμβάνουν ότι έγκυρα όργανα δεν ήταν διαθέσιμα για όλα τα CpG για το μελλοντικό MR. Δεδομένου ότι όλα τα όργανα μιας CpG επιλέχθηκαν από περιοχές cis, δηλαδή της ίδιας γενετικής περιοχής, είναι πιθανό όλα τα όργανα μιας CpG να είναι είτε έγκυρα είτε άκυρα, περιορίζοντας έτσι τον αριθμό των διαφορετικών μεθόδων MR που μπορούν να εφαρμοστούν για τον έλεγχο του ευρωστία των αποτελεσμάτων51. Η αντίστροφη MR ήταν περιορισμένη σε ισχύ λόγω του μικρού μεγέθους δείγματος που είναι διαθέσιμο για την εκτίμηση των συσχετισμών μεθυλίωσης SNP-DNA. Μεγαλύτερες μελέτες meQTL, όπως το GoDMC, δεν μπόρεσαν να αποθηκεύσουν αποτελέσματα συσχέτισης για όλα τα SNP (δηλαδή, πάνω από μια ορισμένη αποκοπή τιμής P συσχέτισης) για τεχνικούς λόγους και επομένως δεν μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την αντίστροφη MR δύο δειγμάτων. Επομένως, τα μη σημαντικά ευρήματα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. Επιπλέον, η ερμηνεία του μεγέθους της αιτιώδους επίδρασης είναι δύσκολη, καθώς οι υποκείμενες γενετικές συσχετίσεις υπολογίζονται στην κλίμακα τυπικής απόκλισης των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA. Ένας άλλος πιθανός περιορισμός της μελέτης είναι ότι τα eGFR, CKD και UACR είναι φαινότυποι που εκτιμώνται από διαφορετικές υποκείμενες παραμέτρους και έχουν πολυπαραγοντικές επιρροές. Έτσι, πραγματοποιήσαμε αρκετές αναλύσεις για να διασφαλίσουμε ότι τα αποτελέσματα του EWAS δεν οδηγήθηκαν από γνωστούς συγχυτές, συμπεριλαμβανομένου του διαβήτη τύπου 2, ενός πιθανού συγχυτικού παράγοντα της σχέσης μεταξύ DNAm καινεφρική λειτουργία. Πρώτον, οι συσχετίσεις EWAS σε κάθε κοόρτη προσαρμόστηκαν για συγχυτές για να αφαιρέσουν τα αποτελέσματά τους σε μια κοόρτη. Δεύτερον, τα EWAS πραγματοποιήθηκαν σε κάθε κοόρτη ξεχωριστά και στη συνέχεια αναλύθηκαν μετα-ανάλυση, η οποία αντιστοιχεί π.χ. σε μια προσαρμογή για τον επιπολασμό του διαβήτη σε όλες τις κοόρτες. Τέλος, ελέγξαμε για συσχετίσεις των αναπαραγόμενων CpG μας σε δημοσιευμένες μελέτες EWAS για τον διαβήτη. Από όλες τις αναπαραχθείσες συσχετίσεις μας CpG, μόνο η συσχετισμένη με UACR CpG cg18181703 στο SOCS3 έδειξε συσχέτιση με διαβήτη τύπου 2. Αυτή η CpG συσχετίστηκε επίσης με την κατάσταση καπνίσματος, το ΔΜΣ και τα επίπεδα αίματος του διαλυτού υποδοχέα παράγοντα νέκρωσης όγκου 2. Λαμβάνοντας υπόψη ότι το EWAS μας προσαρμόστηκε επίσης για την κατάσταση καπνίσματος και το ΔΜΣ, υποθέτουμε ότι οι επιδράσεις του cg18181703 στο UACR είναι σε τουλάχιστον μερικώς ανεξάρτητο από διαβήτη τύπου 2, ΔΜΣ και κατάσταση καπνίσματος. Ενώ ελέγχαμε για αρκετούς από αυτούς τους γνωστούς παράγοντες, άλλοι παράγοντες όπως οι μη μετρημένες συμμεταβλητές δεν μπορούσαν να προσαρμοστούν ρητά στις αναλύσεις και μπορεί να επηρεάσουν τα ευρήματα.

Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες EWAS με αυξημένα μεγέθη δειγμάτων και με μεθυλίωση DNA ποσοτικοποιημένη από πρόσθετους ιστούς καθώς και λειτουργικές αναλύσεις για να επεκτείνουμε τις γνώσεις μας σχετικά με τους ρυθμιστικούς μηχανισμούςνεφρική λειτουργίακαι να βελτιώσει τελικά την πρόβλεψη και τη θεραπεία τουνεφρόνόσος. Αυτό ισχύει ειδικά για το UACR, δεδομένου του μικρότερου αριθμού παρατηρούμενων σημαντικών συσχετίσεων CpG. Συνοπτικά, αυτή η μεγάλης κλίμακας μετα-ανάλυση EWAS επέκτεινε ουσιαστικά τον αριθμό των CpG που συσχετίζονται με δυνατότητα αναπαραγωγής με eGFR και CKD και αποκάλυψε επτά συσχετίσεις για το UACR και τη μικρολευκωματινουρία. Η μεθυλίωση του DNA σε αυτές τις θέσεις εξήγησε ένα μεγάλο ποσοστό της διακύμανσης του eGFR και η διαφορική μεθυλίωση σε τέσσερα CpG έδειξε στοιχεία για μια πιθανή αιτιώδη σχέση με το eGFR. Πλήρης χαρακτηρισμός των αναδιπλασιασμένων CpG μεταξύ ασθενών με ΧΝΝ, σενεφρικός ιστός,για διαφορική έκφραση γονιδίων και για εμπλουτισμένα μονοπάτια και επιγενετικά σημάδια παρέχουν πληροφορίες γιανεφρική λειτουργία-σχετική μεταγραφική ρύθμιση.

Μέθοδοι

ΣΦΑΙΡΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ.Δημιουργήσαμε μια συλλογική μετα-ανάλυση με βάση ένα μοντέλο διανομής δεδομένων και διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου. Για να μεγιστοποιηθεί η τυποποίηση φαινοτύπων σε όλες τις μελέτες, ένα σχέδιο ανάλυσης και ένα σενάριο γραμμής εντολών (https://github.com/ generic-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno) δημιουργήθηκαν και παρασχέθηκαν σε όλες τις συμμετέχουσες μελέτες ( μελέτες βασισμένες στον πληθυσμό, συμπληρωματικά δεδομένα 1 και 2). Τα αρχεία σύνοψης που δημιουργούνται αυτόματα ελέγχθηκαν κεντρικά. Μετά την έγκριση φαινοτύπου, οι μελέτες έτρεξαν το EWAS τους και ανέβασαν αποτελέσματα και συγκεντρώθηκαν πληροφορίες μεθυλίωσης DNA σε έναν κεντρικό διακομιστή. Ο ποιοτικός έλεγχος EWAS πραγματοποιήθηκε με προσαρμοσμένα σενάρια για την αξιολόγηση του πληθωρισμού, των θετικών ελέγχων, της κατανομής των ανιχνευτών CpG και για σύγκριση μεταξύ των μελετών των συνολικών κατανομών των μεγεθών επιδράσεων, των τυπικών σφαλμάτων και των τιμών P. Όλα τα πρωτόκολλα μελέτης εγκρίθηκαν από τις αντίστοιχες τοπικές επιτροπές δεοντολογίας. Όλοι οι συμμετέχοντες σε όλες τις μελέτες παρείχαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση.

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΚΑΘΑΡΡΥΣΗ

Ορισμός φαινοτύπου.Οι τιμές κρεατινίνης που ελήφθησαν με τον προσδιορισμό Jaffé πριν από το 2009 βαθμονομήθηκαν πολλαπλασιάζοντας με 0,9552. Μελέτες υπολόγισαν το GFR με τη ΧρόνιαΝεφρική ΝόσοςEpidemiology Collaboration (CKD-EPI) εξίσωση53. Το eGFR έγινε winsorized στα 15 και 200 ml min−1 ανά 1,73 m2. Η ΧΝΝ ορίστηκε ως eGFR κάτω από 60 ml min−1 ανά 1,73 m2. Οι τιμές UACR που μετρήθηκαν σε mg/g μετατράπηκαν σε φυσικό log-μετασχηματισμό πριν από όλες τις αναλύσεις. Η μικρολευκωματινουρία ορίστηκε ως 1 για UACR > 30 mg/g και ως 0 για τιμές UACR < 10="">

Ποσοτικοποίηση και ποιοτικός έλεγχος μεθυλίωσης DNA.Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της μεθυλίωσης του DNA, το γονιδιωματικό DNA εκχυλίστηκε από το περιφερικό αίμα. Τα επίπεδα μεθυλίωσης DNA ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη συστοιχία BeadChip Infinium MethylationEPIC (EPIC), τη συστοιχία Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip (HM450K) ή τη διάταξη Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip (HM27K). Η προεπεξεργασία δεδομένων μεθυλίωσης DNA διεξήχθη σύμφωνα με μεμονωμένα πρωτόκολλα μελέτης, συμπεριλαμβανομένης της διόρθωσης υποβάθρου, της κανονικοποίησης ποσοστού, του φιλτραρίσματος ανιχνευτή, του φιλτραρίσματος δειγμάτων, της αντιστοίχισης SNP με τις θέσεις του ανιχνευτή ελέγχου SNP, του ακραίου φιλτραρίσματος και της διόρθωσης τύπου ανάλυσης (Συμπληρωματικά δεδομένα 3). Το επίπεδο μεθυλίωσης σε κάθε θέση αντιπροσωπεύτηκε και αναλύθηκε ως -τιμή. Οι ανιχνευτές CpG που επικαλύπτονται με SNP σχολιάστηκαν. Κάθε μελέτη υπολόγιζε τη μέση και τυπική απόκλιση κάθε θέσης CpG και αυτά τα συνοπτικά στατιστικά συγκρίθηκαν μεταξύ μελετών για συστηματικές διαφορές μεταξύ των CpG και παρακολουθήθηκαν με μεμονωμένους αναλυτές της μελέτης

Συμμεταβλητή αξιολόγηση.Η μεθυλίωση του DNA και οι συμμεταβλητές μετρήθηκαν στο ίδιο σημείο επίσκεψης/χρόνου. Ο επικρατών διαβήτης ορίστηκε ως γλυκόζη πλάσματος νηστείας μεγαλύτερη από ή ίση με 126 mg/dl, γλυκόζη πλάσματος μη νηστείας μεγαλύτερη από ή ίση με 200 mg/dl, θεραπεία για διαβήτη ή αυτοαναφορά διάγνωσης διαβήτη. Η επικρατούσα υπέρταση ορίστηκε ως συστολική αρτηριακή πίεση μεγαλύτερη από ή ίση με 140 mm Hg, διαστολική αρτηριακή πίεση μεγαλύτερη από ή ίση με 90 mm Hg ή θεραπεία για υπέρταση. Εάν η μετρηθείσα αρτηριακή πίεση δεν ήταν διαθέσιμη, η υπέρταση ορίστηκε με αυτοαναφορά. Η τρέχουσα κατάσταση καπνίσματος καθορίστηκε χρησιμοποιώντας πληροφορίες που αναφέρθηκαν από τον ίδιο. Ο ΔΜΣ (kg/m2) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας μετρήσεις βάρους και ύψους όπως αξιολογήθηκαν σε κάθε μελέτη. Η ηλικία συμπεριλήφθηκε ως συνεχής τιμή στα μοντέλα συσχέτισης. Η δομή του πληθυσμού σε μη οικογενειακές μελέτες προσαρμόστηκε από γενετικά κύρια συστατικά (PC). Οι αναλογίες των τύπων λευκών αιμοσφαιρίων υπολογίστηκαν με βάση τη μεθυλίωση του DNA54. Πρόσθετες τεχνικές συμμεταβλητές περιελάμβαναν τον ανιχνευτή ελέγχου PCs55, το κέντρο μελέτης, την παρτίδα επεξεργασίας, το αναγνωριστικό sentrix συστοιχίας και τη θέση sentrix.

Στατιστικές μέθοδοι και μετα-ανάλυση. Για να εξασφαλιστεί συγκρίσιμη ισχύς μεταξύ των αναλυόμενων θέσεων, μόνο αυτοσωμικά CpG που μετρήθηκαν και από τα δύο, EPIC και HM450K, συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις. Κάθε μελέτη διεξήγαγε αναλύσεις γραμμικής παλινδρόμησης χωρισμένες ανά ομάδες προγόνων. Για την αξιολόγηση της ευρωστίας των αποτελεσμάτων του EWAS, οι αναλύσεις περιορίστηκαν σε μελέτες και υποδείγματα ατόμων ευρωπαϊκής καταγωγής. Οι τιμές μεθυλίωσης του DNA μοντελοποιήθηκαν ως εξαρτημένες μεταβλητές με το χαρακτηριστικό να είναι είτε συνεχείς τιμές eGFR ή UACR είτε δυαδικές μεταβλητές CKD ή μικρολευκωματουρίας: μεθυλίωση DNA ~ χαρακτηριστικό συν φύλο συν ηλικία συν γενετικοί υπολογιστές συν αναλογίες λευκών αιμοσφαιρίων συν τεχνικές συμμεταβλητές συν διαβήτης συν υπέρταση συν ΔΜΣ συν τρέχον κάπνισμα Οι συμμετέχοντες χρειάζονταν πλήρεις πληροφορίες για όλες τις μεταβλητές και συνοπτικά στατιστικά της μελέτης και συμπεριλήφθηκαν μόνο εάν ήταν διαθέσιμοι τουλάχιστον 50 συμμετέχοντες για eGFR/UACR και 50 περιπτώσεις/μάρτυρες για ΧΝΝ/μικρολευκωματουρία, αντίστοιχα. Κάθε EWAS για συγκεκριμένη μελέτη προσαρμόστηκε για τον πληθωρισμό πριν από τη μετα-ανάλυση με την προσέγγιση BACON εάν η εκτίμηση του πληθωρισμού ήταν μεγαλύτερη ή ίση με ένα (Συμπληρωματικό Σχήμα 8)56. Οι μελέτες χωρίστηκαν σε ανακάλυψη και αντιγραφή με χρονολογική σειρά συμβολής στη μετα-ανάλυση της Κοινοπραξίας CKDGen (Συμπληρωματικά Δεδομένα 1 και 2). Πραγματοποιήθηκε μια σταθμισμένη μετα-ανάλυση αντίστροφης διακύμανσης σταθερού αποτελέσματος, όπως υλοποιήθηκε στο πακέτο R 'metafor' (έκδοση 2.1-0) για μελέτες ανακάλυψης, μελέτες αναπαραγωγής και για τις εκτιμήσεις των αποτελεσμάτων ανακάλυψης και αναπαραγωγής που προκύπτουν. Τα CpG εξαιρέθηκαν εάν λιγότερο από το μισό του αντίστοιχου μεγέθους δείγματος ήταν διαθέσιμο είτε κατά την ανακάλυψη είτε κατά την αναπαραγωγή ή εάν η εκτίμηση της ετερογένειας I2 ήταν μεγαλύτερη 95 τοις εκατό. Η επιτυχής αναπαραγωγή ενός συσχετισμένου CpG ορίστηκε ως η συνεπής κατεύθυνση των εκτιμήσεων του αποτελέσματος μεταξύ ανακάλυψης (δίσκος neGFR=22,347, δίσκος nUACR=11,458) και αναπαραγωγής (neGFR repl=11,258 , nUACR repl=3610) μετα-ανάλυση, μια προσαρμοσμένη Bonferroni σημασία της ανακάλυψης P-value (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης.Οι επιπτώσεις τουνεφρική λειτουργίαΤα CpG που σχετίζονται με τα χαρακτηριστικά δοκιμάστηκαν για συσχετίσεις με γονιδιακή έκφραση στο αίμα χρησιμοποιώντας δύο σύνολα δεδομένων: (1) επίπεδα mRNA μονοκυττάρων από 1202 συμμετέχοντες στη μελέτη MESA και (2) mRNA πλήρους αίματος 713 ατόμων KORA F4 μελέτη 57,58. Ως αρχικό βήμα, πραγματοποιήθηκε αναζήτηση των επιπέδων μεθυλίωσης CpG με επίπεδα mRNA διαθέσιμα στα αποτελέσματα συσχέτισης από τη μελέτη MESA. Για αυτήν την αναζήτηση, ήταν διαθέσιμα αποτελέσματα συσχέτισης με τιμή P < 1e{{1{0}}.="" η="" ανάλυση="" περιγράφηκε="" λεπτομερώς="" στους="" kennedy="" et="" al.59.="" εν="" συντομία,="" η="" γονιδιακή="" έκφραση="" αξιολογήθηκε="" χρησιμοποιώντας="" τις="" illumina="" humanht-12="" v3.0="" και="" v4.0="" beadchips="" έκφρασης="" και="" μεθυλίωση="" dna="" από="" τη="" διάταξη="" illumina="" hm450k.="" οι="" τιμές="" έκφρασης="" κανονικοποιήθηκαν="" χρησιμοποιώντας="" τον="" μετασχηματισμό="" σταθεροποίησης="" διακύμανσης.="" 13.933="" μεταγραφές="" από="" τις="" συστοιχίες="" v3.0="" και="" v4.0,="" οι="" οποίες="" εκφράστηκαν="" σημαντικά="" πάνω="" από="" τα="" επίπεδα="" φόντου="" (τιμή="" p="" ανίχνευσης="">< 0,01)="" σε="" τουλάχιστον="" 5="" τοις="" εκατό="" των="" θεμάτων.="" οι="" αναλύσεις="" συσχέτισης="" στο="" mesa="" πραγματοποιήθηκαν="" ως="" γραμμικό="" μικτό="" μοντέλο="" χρησιμοποιώντας="" τιμές="" έκφρασης="" λογαριθμικού="" μετασχηματισμένου="" γονιδίου="" ως="" εξαρτημένη="" μεταβλητή,="" τιμές="" βήτα="" μεθυλίωσης="" dna="" ως="" ανεξάρτητη="" μεταβλητή="" με="" ηλικία,="" φύλο,="" εθνικότητα="" και="" κέντρο="" μελέτης="" που="" προστέθηκαν="" ως="" συμμεταβλητές="" στο="" μοντέλο.="" μια="" δεύτερη="" δοκιμή="" συσχέτισης="" πραγματοποιήθηκε="" στο="" σύνολο="" δεδομένων="" kora="" f4.="" ο="" συσχετισμός="" του="" επιπέδου="" μεθυλίωσης="" σε="" αναδιπλασιασμένα="" cpg="" με="" επίπεδα="" γονιδιακής="" έκφρασης="" γονιδίων="" εντός="" ±500="" kb="" γειτνίασης="" υπολογίστηκε="" χρησιμοποιώντας="" τα="" log2-μετασχηματισμένα="" επίπεδα="" mrna="" που="" ελήφθησαν="" από="" τη="" συστοιχία="" έκφρασης="" γονιδίων="" illumina="" human="" ht-12v3.="" οι="" τιμές="" γονιδιακής="" έκφρασης="" υποχώρησαν="" στις="" τιμές="" βήτα="" μεθυλίωσης="" του="" dna="" προσαρμοσμένες="" για="" το="" φύλο="" και="" την="" ηλικία.="" πριν="" από="" την="" ανάλυση,="" οι="" τεχνικοί="" παράγοντες,="" καθώς="" και="" οι="" αναλογίες="" τύπων="" κυττάρων="" αίματος,="" υποχώρησαν="" από="" τα="" επίπεδα="" μεθυλίωσης="" mrna="" και="" dna="" και="" τα="" υπολείμματά="" του="" συμπεριλήφθηκαν="" στο="" τελικό="" μοντέλο="" συσχέτισης.="" οι="" έλεγχοι="" σχολιασμού="" και="" ποιοτικού="" ελέγχου="" των="" ανιχνευτών="" γονιδιακής="" έκφρασης="" βασίστηκαν="" στον="" πίνακα="" που="" παρέχεται="" στους="" schurmann="" et="" al.60.="" συσχετισμοί="" έκφρασης="" του="" γονιδίου="" cpg="" στο="" αίμα="" που="" ήταν="" διαθέσιμοι="" στα="" αποτελέσματα="" mesa="" και="" είχαν="" μια="" συσχέτιση="" τιμή=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

Μεθυλίωση DNA σε ιστό νεφρού.Οι αναλύσεις με χρήση μεθυλίωσης DNA σενεφρικό ιστόμε eGFR και ίνωση πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας δεδομένα από 506 μικροδιατομέςνεφρικό ιστόδείγματα χρησιμοποιώντας το Illumina EPIC BeadChip. Τα δείγματα νεφρικού ιστού συλλέχθηκαν χωριστά και είναι διαφορετικά από τα δείγματα αίματος που αναλύθηκαν στη μετα-ανάλυση EWAS. Αυτά τα δείγματα συλλέχθηκαν από ανεπηρέαστα τμήματα νεφρεκτομών όγκων και παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε πριν από το 61. Εν συντομία, το λογισμικό SeSAMe62 χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση προεπεξεργασίας και ποιοτικού ελέγχου, συμπεριλαμβανομένης της ανίχνευσης βάσει χαμηλής έντασης, διόρθωσης αιμορραγίας στην αφαίρεση υποβάθρου, διόρθωσης μη γραμμικής μεροληψίας βαφής. έλεγχος για τη μετατροπή διθειώδους, υπολογισμός των τιμών βήτα και εκτίμηση του κλάσματος λευκοκυττάρων. Οι τιμές βήτα των CpG που σχετίζονται με το eGFR και το UACR και οι κλινικές πληροφορίες εξήχθησαν για ανάλυση συσχέτισης. Εφαρμόστηκε ένα μοντέλο παλινδρόμησης για να ελεγχθούν οι συσχετίσεις των βήτα μεθυλίωσης του DNA των τελικών CpG ως εξαρτώμενες μεταβλητές με τα επίπεδα eGFR και ίνωσης, αντίστοιχα, ως ανεξάρτητες μεταβλητές προσαρμοσμένες για το φύλο, την ηλικία, τους γενετικούς υπολογιστές (1-5), την κατάσταση διαβήτη, την κατάσταση υπέρτασης , ΔΜΣ, ID συστοιχίας sentrix, θέση sentrix και έλεγχος μετατροπής διθειώδους και εκτιμώμενο κλάσμα λευκοκυττάρων.

Στοχευμένες έρευνες των ανιχνευτών eGFR σε ασθενείς με ΧΝΝ. Η συσχέτιση των 69 σχετιζόμενων με το eGFR και επικυρωμένων CpG από τον γενικό πληθυσμό με eGFR στη γερμανική χρόνιαΝεφρική Νόσος (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 mg g−1). Η παρακολούθηση των ασθενών για κλινικά τελικά σημεία είναι ακόμη σε εξέλιξη. Τα τελικά σημεία της μελέτης καταγράφονται συνεχώς με τυποποιημένο τρόπο με βάση τις εξιτήριο από το νοσοκομείο και τα πιστοποιητικά θανάτου και περιλαμβάνουν συμβάντα που σχετίζονται με τα νεφρά καθώς και θάνατο. Ο σχεδιασμός της μελέτης και ο στρατολογημένος πληθυσμός μελέτης περιγράφονται λεπτομερέστερα σε προηγούμενες δημοσιεύσεις63,64. Η Μελέτη GCKD εγκρίθηκε από τοπικές επιτροπές δεοντολογίας και καταχωρήθηκε στο εθνικό μητρώο κλινικών μελετών (DRKS 00003971). Ένα υποσύνολο 559 ασθενών με ΧΝΝ που αποδίδεται σε συστηματικό ερυθηματώδη λύκο, μεμβρανώδη νεφροπάθεια, εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρωση ή αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστικήΝεφρική Νόσοςεπιλέχθηκε για ποσοτικοποίηση μεθυλίωσης DNA και μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη διάταξη Infinium MethylationEPIC BeadChip (EPIC). Η συσχέτιση με το eGFR αξιολογήθηκε ανάλογα με την κύρια ανάλυση (βλ. Στατιστικές μέθοδοι και μετα-ανάλυση), εκτός από την προσαρμογή για το κάπνισμα που κωδικοποιήθηκε 0/1/2 για ποτέ-/πρώην-/τρέχοντες καπνιστές. Να αξιολογήσει τη συσχέτιση της μεθυλίωσης του DNA με το χρόνο έωςνεφρική ανεπάρκειααπό την είσοδο στη μελέτη, προσαρμόστηκαν μοντέλα παλινδρόμησης Cox για κάθε CpG και αναλόγως για ένα συνδυασμένο τελικό σημείονεφρική ανεπάρκειακαι οξείανεφρική βλάβη.Εκτός από τον προγνωστικό παράγοντα μεθυλίωσης DNA, τα μοντέλα προσαρμόστηκαν για την ηλικία, το φύλο και τον υποτύπο ΧΝΝ. Το μοντέλο παλινδρόμησης Cox παρέχει εκτιμήσεις για την αναλογία ειδικού αιτίου κινδύνου (HR) παρουσία των ανταγωνιστικών γεγονότων, δηλαδή οποιουδήποτε άλλου θανάτου εκτός από τον θάνατο που σχετίζεται με τα νεφρά. Πραγματοποιήθηκαν επιπλέον αναλύσεις κινδύνου υποκατανομής προκειμένου να αξιολογηθούν οι πιθανές έμμεσες επιδράσεις μέσω του διαγωνιστικού συμβάντος. Η υπόθεση αναλογικών κινδύνων αξιολογήθηκε με βάση τα κλιμακωμένα υπολείμματα Schoenfeld. Η γραφική αξιολόγηση για τα δύο συσχετισμένα CpG δεν αποκάλυψε στοιχεία σημαντικών παραβιάσεων (Συμπληρωματικό Σχήμα 9).

Οικόπεδα και σχολιασμός περιφερειακών ενώσεων. Τα διαγράμματα για το Συμπληρωματικό Σχ. 5 δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τα πακέτα 'Gviz' 65 και 'rtracklayer' 66 R. Στην γραφική παράσταση συμπεριλήφθηκαν το πολύ 40 τοποθεσίες εντός 50,000 bp ανάντη ή κατάντη της τοποθεσίας ενδιαφέροντος CpG. Εάν το διάστημα περιείχε περισσότερες από 40 θέσεις, η γραφική περιοχή μειώθηκε στην απόσταση της πιο απομακρυσμένης τοποθεσίας συν 10,000 bp. Η ενότητα RefSeq Genes βασίζεται στο κομμάτι UCSC NCBI RefSeq με σύμβολα γονιδίων από το πακέτο R 'org.Hs.eg.db', το τμήμα CpG Islands βασίζεται στο κομμάτι UCSC CpG Islands, το τμήμα Χάρτη πορείας chromHMM βασίστηκε στο Οι χάρτες πορείας 15- αναφέρουν το μοντέλο chromHMM του εμβρύουνεφρόεπιγονιδίωμα (Roadmap Epigenome ID: E086)67 και η ενότητα Common SNPs βασίζεται στην πίστα UCSC Common SNPs(151)68. Τέλος, η γραφική παράσταση συσχέτισης CpG στο κάτω μέρος του σχήματος βασίζεται σε δεδομένα των δειγμάτων μεθυλίωσης DNA της μελέτης KORA F4 χρησιμοποιώντας τη διάταξη Illumina HumanMethylation450 BeadChip, με τις θέσεις που λείπουν να είναι χρωματισμένες με ανοιχτό γκρι.

Η διακύμανση εξηγείται από τη μεθυλίωση του DNA.Το ποσοστό της φαινοτυπικής διακύμανσης που εξηγείται από τα 69 αντιγραφόμενα CpG που σχετίζονται με το eGFR υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας δεδομένα 1.888 συμμετεχόντων από τη μελέτη KORA FF4, την επταετή παρακολούθηση της μελέτης KORA F457,58. Το KORA FF4 δεν ήταν μέρος της μετα-ανάλυσης EWAS. Ωστόσο, 988 άτομα που συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση της επεξηγημένης διακύμανσης επικαλύπτονταν με τους συμμετέχοντες στο KORA F4 του EWAS. Σε αυτό το σύνολο δεδομένων, η διακύμανση που εξηγείται από όλα τα CpG ανεξάρτητα από τις συμμεταβλητές εκτιμήθηκε ως η διαφορά στο R2 του βασικού μοντέλου, συμπεριλαμβανομένων των CpG και αυτού χωρίς. Το βασικό μοντέλο ορίστηκε ωςνεφρόχαρακτηριστικό ~φύλο συν ηλικία συν αναλογίες λευκών αιμοσφαιρίων συν διαβήτης συν υπέρταση συν ΔΜΣ συν τρέχον κάπνισμα μενεφρόχαρακτηριστικό που αντιπροσωπεύει το eGFR και το UACR. Για δύο CpG που σχετίζονται με eGFR (cg06008406, cg20004659), δεν υπήρχαν διαθέσιμα δεδομένα στο σύνολο δεδομένων KORA FF4.

Αμφίδρομη Μεντελική ανάλυση τυχαιοποίησης.Στην μπροστινή μαγνητική τομογραφία, χρησιμοποιώντας το πακέτο R «TwoSampleMR»69, διερευνήσαμε πιθανές αιτιακές επιδράσεις της μεθυλίωσης του DNA στα αναπαραγόμενα CpG σε eGFR και UACR. Η μαγνητική τομογραφία χρησιμοποιεί γενετικά όργανα για την ελαχιστοποίηση της προκατάληψης λόγω συγχυτικής και αντίστροφης αιτιώδους συνάφειας70. Γενετικά όργανα για μεθυλίωση DNA (meQTL) ήταν διαθέσιμα για 47 και πέντε CpG για eGFR και UACR, αντίστοιχα, όπως είχε προηγουμένως αναγνωριστεί από την GoDMC σε έως και 27,750 άτομα42. Σύνοψη ευρωπαϊκής καταγωγής Δεδομένα GWAS για eGFR10 και UACR13 χρησιμοποιήθηκαν ως τα αντίστοιχα αποτελέσματα. Εφαρμόστηκαν φίλτρα για συμπερίληψη meQTL (pSNP < 1e−5="" με="" μεθυλίωση="" dna="" σε="" περιοχή="" cis="" ±="" 500="" kb,="" ανισορροπία="" σύνδεσης="" r2="">< 0,2="" σε="" περιοχή="" 1="" mb,="" φιλτράρισμα="" steiger,="" maf=""> 0,05). Πραγματοποιήσαμε αναλύσεις σταθμισμένης MR με αντίστροφη διακύμανση καθώς και αναλύσεις ευαισθησίας MR (απλή λειτουργία, σταθμισμένη λειτουργία, σταθμισμένη διάμεσος και MR Egger) ή τριγωνοποίηση υπολογίζοντας την αναλογία Wald σε περίπτωση που ήταν διαθέσιμο μόνο ένα όργανο ανά τοποθεσία CpG71–73. Οι εκτιμήσεις επιπτώσεων που λαμβάνονται από την MR εξαρτώνται από τις μονάδες των υποκείμενων συνόλων δεδομένων και σε αυτή την περίπτωση αντιστοιχούν σε μια αλλαγή ανά μονάδα σε μία τυπική απόκλιση των επιπέδων μεθυλίωσης σε φυσικό μετασχηματισμένο με λογαριθμικό έλεγχο eGFR και τυπική απόκλιση του φυσικού λογαριθμικού μετασχηματισμένου UACR. αντίστοιχα. Στην αντίστροφη μαγνητική τομογραφία, εξετάσαμε πιθανές αιτιακές επιδράσεις τουνεφρική λειτουργίαχαρακτηριστικά στη μεθυλίωση του DNA, χρησιμοποιώντας τα σημαντικά SNP σε όλο το γονιδίωμα από διαεθνοτικά GWAS σε eGFR10 και UACR13 ως γενετικά όργανα για eGFR και UACR, αντίστοιχα. Για να μεγιστοποιήσουμε την ισχύ στα δεδομένα αποτελέσματος, πραγματοποιήσαμε μια μετα-ανάλυση με το z-score συσχετισμών SNP-CpG από τις μελέτες KORA F4 (n=1662) ​​και FHS (n=3868). Οι εκτιμήσεις συνδυασμένων επιπτώσεων και τα τυπικά τους σφάλματα για το meQTL που περιλαμβάνεται στο MR εκτιμήθηκαν από το μέγεθος του δείγματος, τη συχνότητα των αλληλόμορφων και το z-score74. Εφαρμόστηκαν φίλτρα για συμπερίληψη SNP (P-value < 5e−8="">νεφρόχαρακτηριστικό, μονόπλευρη τιμή P < 0.05="" με="" άζωτο="" ουρίας="" αίματος="" για="" όργανα="" egfr,="" ετερογένεια="" καταγωγής="" τιμή="" p="" μεγαλύτερη="" από="" ή="" ίση="" με="" 0.0="" 1,="" steiger="" filtering,="" maf=""> 0.05). Πραγματοποιήσαμε σταθμισμένη μαγνητική τομογραφία αντίστροφης διακύμανσης με πολλαπλασιαστικά τυχαία αποτελέσματα (επειδή ήταν διαθέσιμος αρκετά μεγάλος αριθμός οργάνων από διαφορετικούς τόπους ανά χαρακτηριστικό)51 και αναλύσεις ευαισθησίας MR (απλή λειτουργία, σταθμισμένη λειτουργία, σταθμισμένη διάμεσος και MR Egger)71–73. Ως πρόσθετη ανάλυση ευαισθησίας που αντιμετωπίζει πλειοτροπικές παραλλαγές, αποκλείσαμε συνολικά 35 εργαλεία που συσχετίστηκαν με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 σε ένα πρόσφατο GWAS75 που περιλαμβάνει 898.130 άτομα: έντεκα SNP που είχαν σχέση P-value < 5e−8="" με="" τον="" διαβήτη="" και="" 24="" επιπλέον="" όργανα="" που="" βρίσκονταν="" σε="" ανισορροπία="" σύνδεσης="" (r2=""> 0,2 εντός 1 Mb, πίνακας αναφοράς 1000 G EUR) με ένα τέτοιο SNP που σχετίζεται με τον διαβήτη. Η ανισορροπία σύνδεσης αξιολογήθηκε μέσω LDlink76. Για την αντίστροφη μαγνητική τομογραφία, οι εκτιμήσεις επίδρασης παρέχουν την αλλαγή ανά μονάδα στο φυσικό μετασχηματισμένο με λογαριθμικό έλεγχο eGFR και την τυπική απόκλιση του φυσικού λογαριθμικού μετασχηματισμένου UACR, αντίστοιχα, σε μια τυπική απόκλιση των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA. Η προσαρμογή πολλαπλών δοκιμών P-value σύμφωνα με το Benjamini–Hochberg FDR < 0,05="" εφαρμόστηκε="" ανά="" χαρακτηριστικό="" νεφρού="" και="" για="" μπροστινή="" και="" ανάστροφη="" μαγνητική="" τομογραφία="" χωριστά77.="" οι="" τιμές="" p="" ετερογένειας="" ελήφθησαν="" από="" τις="" στατιστικές="">

Αναλύσεις εμπλουτισμού.Για να ενημερώσουμε τις πιθανές λειτουργικές επιδράσεις των συσχετιζόμενων CpGs, αξιολογήσαμε τον εμπλουτισμό αυτών των CpG σε θέσεις τροποποίησης DNase I ή ιστόνης (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), σύνολα γονιδίων που βασίζονται σε όρους και μονοπάτια GO στις βάσεις δεδομένων KEGG και Reactome32 –35. Οι αναλύσεις εμπλουτισμού TFBS πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως λεπτομερώς14. Εν συντομία, η δοκιμή εμπλουτισμού αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το eForge78 χρησιμοποιώντας μετάθεση με αντιστοίχιση για εντοπισμό γονιδίου και νησίδας CpG κατά τη δειγματοληψία. Τα δεδομένα προήλθαν είτε από τα έργα ENCODE (125 δείγματα) είτε από έργα Roadmap Epigenomics (299 δείγματα) που δημιουργήθηκαν με τη μέθοδο Hotspot67,79,80. Τα CpG που συσχετίστηκαν με το eGFR και το UACR, αντίστοιχα, στην τιμή P < 1e−05="" στη="" μετα-ανάλυση="" χρησιμοποιήθηκαν="" ως="" είσοδοι="" (συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 6="" και="" 7)="" και="" 10,000="" εκτελέσεις="" επαναδειγματοληψίας,="" ένα="" ενεργό="" φίλτρο="" εγγύτητας="" και="" θεωρήθηκε="" fdr="">< 0,05="" ως="" σημαντικό="" (συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 13="" και="" 14).="" οι="" αναλύσεις="" εμπλουτισμού="" σημάδι="" ιστόνης="" πραγματοποιήθηκαν="" αναλόγως="" (συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 15="" και="" 16).="" ο="" εμπλουτισμός="" σε="" σύνολα="" γονιδίων="" ή="" μονοπάτια="" αξιολογήθηκε="" χρησιμοποιώντας="" το="" πακέτο="" methylgsa="" και="" r="" έκδοση="" 3.6.181.="" η="" μέθοδος="" δοκιμής="" εμπλουτισμού="" ήταν="" το="" methylglm="" που="" εφαρμόζει="" μια="" λογιστική="" παλινδρόμηση="" που="" προσαρμόζεται="" για="" τον="" αριθμό="" των="" ανιχνευτών="" ανά="" γονίδιο="" και="" το="" αυτοσωματικό="" υπόβαθρο="" που="" επικαλύπτει="" 450k="" και="" συστοιχίες="" epic.="" δοκιμάστηκαν="" σύνολα="" γονιδίων="" ή="" μονοπάτια="" με="" 100–500="" γονίδια="" (προεπιλεγμένη="" ρύθμιση).="" θεωρήσαμε="" ότι="" ένα="" σύνολο="" γονιδίων="" ή="" μια="" οδός="" εμπλουτίστηκε="" σημαντικά="" σε="" fdr="">< 0,05="" διόρθωση="" για="" πολλαπλές="" δοκιμές="" σε="" κάθε="" βάση="" δεδομένων="" χρησιμοποιώντας="" τη="" μέθοδο="" benjamini="" και="" hochberg="" (συμπληρωματικά="" δεδομένα="" 17="" και="">