Μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα/εξωσώματα που προέρχονται από στρωματικά κύτταρα Μέρος 1

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη:Τα εξωσώματα είναι κυστίδια νανο-μεγέθους που χρησιμεύουν ως μεσολαβητές για την επικοινωνία από κύτταρο σε κύτταρο. Με τις μοναδικές συνθέσεις φορτίου νουκλεϊκών οξέων, πρωτεϊνών και λιπιδίων που αντικατοπτρίζουν τα χαρακτηριστικά των παραγωγών κυττάρων, τα εξωσώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως θεραπευτικά χωρίς κύτταρα. Μεταξύ των εξωσωμάτων που προέρχονται από διάφορες κυτταρικές προελεύσεις, τα εξωσώματα που προέρχονται από μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (MSC-εξωσώματα) έχουν κερδίσει μεγάλη προσοχή λόγω των ανοσοτροποποιητικών και αναγεννητικών λειτουργιών τους. Πράγματι, πολλές μελέτες έχουν δείξει αντιφλεγμονώδη, αντιγηραντικά και επουλωτικά αποτελέσματα των MSC-εξωσωμάτων σε διάφορα μοντέλα in vitro και in vivo. Επιπλέον, οι πρόσφατες εξελίξεις στον τομέα της βιολογίας των εξωσωμάτων επέτρεψαν την ανάπτυξη ειδικών κατευθυντήριων γραμμών και μεθόδων ποιοτικού ελέγχου, οι οποίες τελικά θα οδηγήσουν στην κλινική εφαρμογή των εξωσωμάτων. Αυτή η ανασκόπηση υπογραμμίζει πρόσφατες μελέτες που διερευνούν το θεραπευτικό δυναμικό των εξωσωμάτων MSC και τον σχετικό τρόπο δράσης για δερματικές παθήσεις, καθώς και μέτρα ποιοτικού ελέγχου που απαιτούνται για την ανάπτυξη θεραπευτικών μέσων που προέρχονται από εξωσώματα.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Λέξεις-κλειδιά:αντι γήρανση; αντιφλεγμονώδης? τριχοφυΐα? ανοσορύθμιση; μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (MSCs); MSC-εξωσώματα; Δερματικό φράγμα? θεραπευτική; αναγεννητική αισθητική? την επούλωση των πληγών

1. Εισαγωγή

Η ανακάλυψη των εξωκυτταρικών κυστιδίων (EVs) ή των εξωσωμάτων χρονολογείται από τη δεκαετία του 1940 και αυτά τα μικροσκοπικά κυστίδια αγνοήθηκαν ως κυτταρικοί κάδοι απορριμμάτων για μεγάλο χρονικό διάστημα [1-3]. Άρχισαν να τραβούν την προσοχή γύρω στα μέσα-2000μετά την εκ νέου ανακάλυψη των εξωσωμάτων ως αγγελιαφόρων για τις επικοινωνίες από κύτταρο σε κύτταρο [1,4-6]. Δεν είναι υπερβολή να πούμε ότι βρισκόμαστε στην αυγή της εξωσωμικής εποχής. Υπήρχαν περισσότερες από τρεις χιλιάδες δημοσιεύσεις για EVs ή εξωσώματα και σχετικά θέματα στο PubMed ετησίως το 2018 και το 2019[1].εκχύλισμα cistanche tubulosaΟ αγώνας προς την εμπορευματοποίηση των θεραπευτικών μέσων που βασίζονται σε εξωσώματα έχει ήδη ξεκινήσει [7-10]. Οι τέσσερις κορυφαίες νεοσύστατες εταιρείες εξωσωματικών, Codiak Biosciences, Exosome Diagnostics, Evox Therapeutics και ExoCoBio έχουν λάβει περίπου 386,2 εκατομμύρια δολάρια σε χρηματοδότηση από επενδυτές [8]. Επιπλέον, έχουν γίνει πολλές μεγάλες συμφωνίες μεταξύ εξωσωματικών νεοφυών επιχειρήσεων και μεγάλων φαρμακευτικών εταιρειών [10].

Τα εξωσώματα είναι εξωκυτταρικά κυστίδια (EVs) νανο-μεγέθους που απελευθερώνονται από όλα σχεδόν τα ευκαρυωτικά κύτταρα [11]. Γενικά, το μέγεθός τους κυμαίνεται από 30 nM έως 200 nM. Δύο άλλοι υποπληθυσμοί των EVs είναι τα μικροκυστίδια (100-1000 nM) και τα αποπτωτικά σώματα (500-2000 nM)[12-14]. Τα εξωσώματα που προέρχονται από βλαστοκύτταρα έχουν ελκυστικό θεραπευτικό δυναμικό από πολλές απόψεις [15]. Έχει διαπιστωθεί ότι ο τρόπος δράσης (MoA) για τις θεραπευτικές επιδράσεις των βλαστοκυττάρων είναι κυρίως παρακρινικές επιδράσεις που προκαλούνται από εκκρινόμενους παράγοντες από βλαστοκύτταρα [6,16]. Μεταξύ των τμημάτων του εκκριτικού των βλαστοκυττάρων, τα εξωσώματα έχουν αναφερθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στις παρακρινικές επιδράσεις [16-18]. Τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα/στρωματικά κύτταρα (MSCs) είναι η πιο προτιμώμενη πηγή θεραπευτικών εξωσωμάτων, καθώς τα ίδια τα MSCs φαίνεται να είναι ασφαλή με βάση έναν τεράστιο όγκο κλινικών δεδομένων την τελευταία δεκαετία [15]. Επιπλέον, τα εξωσώματα που προέρχονται από MSC (MSC-εξωσώματα) μπορούν να αποστειρωθούν με διήθηση και να παραχθούν ως προϊόν που δεν είναι διαθέσιμο στο ράφι, ενώ τα ίδια τα MSC δεν μπορούν. Επιπλέον, τα MSC-εξωσώματα θεωρούνται απαλλαγμένα από ζητήματα ασφάλειας στο πλαίσιο της θεραπείας με βάση τα κύτταρα, όπως το δυναμικό ογκογένεσης με κυτταρική χορήγηση [19,20].κριτικές cistanche tubulosaΠράγματι, τα MSC-εξωσώματα έχουν εφαρμοστεί ως εναλλακτικές στα MSC για νέες θεραπευτικές στρατηγικές χωρίς κύτταρα σε μια ποικιλία μοντέλων ασθενειών, όπως νευρολογικές, καρδιαγγειακές, ανοσολογικές, νεφρικές, μυοσκελετικές, ηπατικές, αναπνευστικές, οφθαλμικές και δερματικές παθήσεις, καθώς και καρκίνοι [15,17,19,21,22].

2. Τα MSCs ως Πηγές Εξωσωμάτων

Τα MSC έχουν τόσο δυνατότητες αυτοανανέωσης (δηλαδή, μπορούν να δημιουργήσουν περισσότερα MSC οι ίδιοι) όσο και δυνατότητες διαφοροποίησης (σε άλλους τύπους κυττάρων) [23]. Τα MSC μπορούν να ληφθούν από μια σειρά ιστών και σωματικών υγρών, όπως λιπώδης ιστός, μυελός των οστών (BM), οδοντικός πολφός, αρθρικό υγρό (SF), αμνιακό υγρό (AF), πλακούντας (PL), ομφάλιος λώρος (UC), αίμα ομφάλιου λώρου (UCB) και ζελέ Wharton (WJ) [24]. Τα MSC μπορούν επίσης να προέρχονται από εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (ESC) ή επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs) [25-27]. Τα MSC, ανάλογα με την προέλευσή τους, είναι σε θέση να διαφοροποιούνται σε διάφορους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των λιποκυττάρων, των χονδροκυττάρων, των οστεοβλαστών και των μυοκυττάρων [28]. Επιπλέον, τα MSCs έχουν ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες για να ρυθμίζουν διάφορα κύτταρα που εμπλέκονται σε ανοσοαποκρίσεις, όπως δενδριτικά κύτταρα (DCs), λεμφοκύτταρα, μακροφάγα, μαστοκύτταρα, ουδετερόφιλα και φυσικά κύτταρα φονείς (NK) [24]. Σε αυτές τις βάσεις, τα MSCs έχουν επισημανθεί ως ισχυρά κυτταρικά θεραπευτικά για διάφορες ασθένειες τις τελευταίες δεκαετίες.

Αντιγηραντική κάμερα Cistanche

Στις αναφερόμενες προκλινικές μελέτες των MSC-εξωσωμάτων, τα MSCs απομονώθηκαν από διάφορους ιστούς/κύτταρα με την ακόλουθη σειρά: BM (51 τοις εκατό ), ιστοί ομφάλιου / πλακούντα (23 τοις εκατό ), λιπώδης ιστός (13 τοις εκατό ), προερχόμενοι από ESCs ή iPSCs (8 τοις εκατό) και άλλοι (5 τοις εκατό)[29]. Δεδομένου ότι τα χαρακτηριστικά και η λειτουργικότητα των MSC εξαρτώνται από την προέλευσή τους, είναι προφανές ότι αυτά των MSC εξωσωμάτων ποικίλλουν ανάλογα με την προέλευση των MSC. Ωστόσο, οι συγκριτικές μελέτες των MSC-εξωσωμάτων με βάση την προέλευση του ιστού τους εξακολουθούν να είναι περιορισμένες και μόνο λίγες αναφορές έχουν συγκρίνει διαφορετικά MSC-εξωσώματα στην ίδια μελέτη (Πίνακας 1)[30-35]:(1)ανθρώπινος λιπώδης ιστός- Τα προερχόμενα από MSC(ASC)-εξωσώματα εμφάνισαν υψηλότερη δραστηριότητα της νεπριλυσίνης, ενός ενζύμου αποικοδόμησης του αμυλοειδούς (Α)πεπτιδίου στον εγκέφαλο, μετά τα εξωσώματα MSC (BM-MSC) ανθρώπινου μυελού των οστών, υποδηλώνοντας τη θεραπευτική σημασία των εξωσωμάτων ASC στη νόσο του Alzheimer [30];(2) ανθρώπινα BM-MSC-EVs και Wharton'sjelly MSC(WJ-MSC)-EVs μείωσαν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και προκάλεσαν απόπτωση, ενώ τα ASC-EVs αύξησαν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και δεν είχαν αποπτωτική επίδραση στα κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87MG [31 ]. Ωστόσο, οι επιδράσεις των MSC-εξωσωμάτων στα καρκινικά κύτταρα είναι αμφιλεγόμενες [36]. Για παράδειγμα, τα εξωσώματα ASC έχουν αναφερθεί ότι έχουν αντικαρκινική δράση στον καρκίνο του προστάτη τόσο in vitro όσο και in vivo[37]· (3) τα εξωσώματα MSC(MSC) και τα εξωσώματα BM-MSC προάγουν την ανάπτυξη νευρίτη σε φλοιώδεις και αισθητήριους νευρώνες, ενώ τα MSC-εξωσώματα ανθρώπινου χορίου και τα εξωσώματα UC-MSC όχι.cistanche UKΑυτό υποδηλώνει ότι μια κατάλληλη επιλογή πηγών MSC μπορεί να είναι απαραίτητη για τη θεραπεία νευροεκφυλιστικών ασθενειών [32]· (4)εξωσώματα ανθρώπινου iPSC MSC (MSC) και MSC αρθρικής μεμβράνης (SM-MSC)-εξωσώματα και τα δύο εξασθενημένη οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) σε ένα μοντέλο ποντικού, αλλά τα MSC-εξωσώματα είχαν ανώτερη θεραπευτική επίδραση σε σύγκριση με τα SM-MSC-εξωσώματα [33]·(5)μια μελέτη που συγκρίνει

Τα MSCs σκύλων ανέφεραν ότι τα BM-MSC απελευθέρωσαν υψηλότερο επίπεδο εκκριμάτων, συμπεριλαμβανομένων των εξωσωμάτων από ότι τα ASC [34]. και (6) MSCs ανθρώπινου αμνιακού υγρού (AF-MSCs) απελευθέρωσαν μεγαλύτερη ποσότητα εξωσωμάτων από τα BM-MSCs [35]. Ωστόσο, είναι δύσκολο να συγκριθούν άμεσα τα αποτελέσματα μεταξύ των παραπάνω μελετών, καθώς δεν πραγματοποιήθηκαν με συγκρίσιμες διαδικασίες ή μεθόδους απομόνωσης, χαρακτηρισμού και αξιολόγησης αποτελεσματικότητας για τα εξωσώματα. Επιπλέον, οι παραλλαγές από διαφορετικούς δότες ή μεθόδους προετοιμασίας για MSC παραμένουν μια σημαντική πρόκληση [38,39]. Παρόλα αυτά, προτείνεται ότι τα MSC-εξωσώματα μπορεί να παρουσιάζουν διαφορετικές ιδιότητες και αποτελεσματικότητες ανάλογα με την προέλευση των MSCs. Επομένως, βιολογικές διαφορές όπως η προέλευση των MSCs και η αποτελεσματικότητα των εξωσωμάτων τους θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη για συγκεκριμένες κλινικές εφαρμογές.

3. Ποιοτικός Έλεγχος EVs για Ανάπτυξη Θεραπευτικών EVs

Είναι σημαντικό να κατασκευάζονται ηλεκτρικά ηλεκτρικά οχήματα κλινικής ποιότητας με διαδικασία συμβατή με την καλή κατασκευαστική πρακτική (GMP) και ποιοτικό έλεγχο (QC) για την ανάπτυξη θεραπευτικών μέσων που βασίζονται σε EV[40-42]. Τα κατάλληλα QCs είναι επίσης ζωτικής σημασίας για αναπαραγώγιμες μελέτες σε ακαδημαϊκά περιβάλλοντα. Πρόσφατα, η International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) πρότεινε μια σειρά από τις ελάχιστες πληροφορίες για μελέτες εξωκυτταρικών κυστιδίων (MISEV), που οριστικοποιήθηκε ως MISEV2018[43-45]. Το Υπουργείο Ασφάλειας Τροφίμων και Φαρμάκων της Κορέας (MFDS) δημοσίευσε την πρώτη κατευθυντήρια γραμμή στον κόσμο για προϊόντα θεραπείας EV, με τίτλο Κατευθυντήρια γραμμή για την ποιότητα, τη μη κλινική και κλινική αξιολόγηση των προϊόντων θεραπείας με εξωκυτταρικά κυστίδια [46. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, τα περισσότερα από τα κριτήρια σε αυτές τις οδηγίες είναι παρόμοια[1] και έχουν ήδη εφαρμοστεί σε ρυθμίσεις GMP [42, A7,48]. Τα συνήθη κριτήρια QC περιλαμβάνουν τον προσδιορισμό της ποσότητας, του μεγέθους, της ταυτότητας και της καθαρότητας των EV.

Εφόσον αυτές οι μέθοδοι δεν μπορούν να διαφοροποιήσουν τα EV από τα μη σωματίδια EV, συνιστάται η σύγκριση των αποτελεσμάτων αυτών των μεθόδων με αποτελέσματα από TEM, AFM ή άλλες μικροσκοπικές παρατηρήσεις.2 Συνιστάται επίσης σύγκριση με αποτελέσματα από μεθόδους ποσοτικοποίησης, όπως η ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών. Συντομογραφίες: AF4, πολλαπλών γωνιών σκέδαση φωτός σε συνδυασμό με ασύμμετρη κλασμάτωση πεδίου ροής. AFM, μικροσκοπία ατομικής δύναμης. DLS, δυναμική σκέδαση φωτός. FCM, κυτταρομετρία ροής; FCS, φασματοσκοπία συσχέτισης φθορισμού; ISEV, International Society for Extracellular Vesicles; LAL, Limulus amebocyte lysate; MoA, τρόπος δράσης. MFDS, Υπουργείο Ασφάλειας Τροφίμων και Φαρμάκων. NTA, ανάλυση παρακολούθησης νανοσωματιδίων; RPS, αντίσταση ανίχνευσης παλμών. WB, Western blotting.

3.1. EVΠοσότητα και μέγεθος

Τόσο οι οδηγίες MISEV2018 όσο και οι κατευθυντήριες γραμμές MFDS συνιστούν τη χρήση τουλάχιστον δύο διαφορετικών μεθόδων για τον προσδιορισμό της ποσότητας των EV [45,46]. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των EVs μπορεί να επιτευχθεί μετρώντας τις συνολικές ποσότητες πρωτεϊνών, λιπιδίων ή RNA, καθώς τα EVs αποτελούνται από όλα αυτά τα μόρια. Αυτές οι μέθοδοι, ωστόσο, δεν παρέχουν πληροφορίες για τον αριθμό των σωματιδίων EV. Διάφορες μέθοδοι είναι διαθέσιμες για τη μέτρηση του αριθμού και του μεγέθους των σωματιδίων, συμπεριλαμβανομένης της ανάλυσης παρακολούθησης νανοσωματιδίων (NTA), της αντίστασης ανίχνευσης παλμών (RPS) και της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS). Η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι η NTA [42,47-53]. Το NTA καθορίζει τον αριθμό και το μέγεθος των σωματιδίων παρακολουθώντας την κίνηση Brown των μεμονωμένων σωματιδίων σε ένα υδατικό διάλυμα [54]. Ωστόσο, το NTA πάσχει από χαμηλή ανάλυση δειγμάτων πολυδιασκορπισμένων και υψηλές παραλλαγές, όπως παραλλαγές μεταξύ συσκευών, μεταξύ ανάλυσης και παραλλαγές μεταξύ και μεταξύ των ατόμων [55-57]. Επιπλέον, το NTA δεν διαφοροποιεί τα EVs από άλλα νανοσωματίδια, όπως τα πρωτεϊνικά συσσωματώματα.cistanche wirkungΠρόσφατα, έχουν εισαχθεί όργανα για NTA φθορισμού για την ανίχνευση ηλεκτρικών οχημάτων με φθορισμό με ειδικά αντισώματα [58]. Ωστόσο, η ποσοτικοποίηση των ηλεκτρικών οχημάτων παραμένει εξαιρετικά δύσκολη. Νέες τεχνολογίες και όργανα εισάγονται κάθε χρόνο, ειδικά κατά τη διάρκεια του συνεδρίου ISEV, όπως η νανοκυτταρομετρία ροής 59,60], η άμεση στοχαστική οπτική μικροσκοπία ανακατασκευής [61], το ExoCounter με την τεχνολογία οπτικού δίσκου [62] και η κυτταρομετρία ροής απεικόνισης [63] . Αν και θα χρειαστεί λίγος χρόνος για την ανάπτυξη εργαλείων πλήρως συμβατών με την GMP, τα μεγάλα βήματα προς τα εμπρός στις μεθοδολογίες για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ηλεκτρικών οχημάτων αναμένεται να έχουν ως αποτέλεσμα την υπέρβαση των σημερινών εμποδίων στο εγγύς μέλλον.

3.2. Ταυτότητα EV

Μια ποικιλία πρωτεϊνών έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται με την EV, ειδικά τα εξωσώματα, συμπεριλαμβανομένων των τετρασπανινών (CD9, CD63 και CD81), των ανεξινών, της Flotillin και της ALG-2-αλληλεπιδρούσας πρωτεΐνης X(Alix) και του γονιδίου ευαισθησίας όγκου 101 (TSG101)πρωτεΐνη [45,64]. Πρωτεΐνες όπως CD9, CD63, CD81, TSG101 και Alix συνιστώνται ως ειδικοί δείκτες για τα εξωσώματα, καθώς είναι γνωστό ότι είναι πολύ εμπλουτισμένες σε εξωσώματα σε σύγκριση με τα αρχικά κύτταρα [45,64-66]. Επιπλέον, επειδή το Alix και το TSG101 εμπλέκονται στο σχηματισμό πολυκυστιδιακών σωμάτων (MVBs), η παρουσία αυτών των πρωτεϊνών είναι απαραίτητη για την υποστήριξη της ενδοκυτταρικής προέλευσης των εξωσωμάτων |43,45,64]. Για την QC, συνιστώνται τουλάχιστον ημιποσοτικές μέθοδοι για την ανίχνευση αυτών των πρωτεϊνών σε εξωσώματα [46]. Η συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) και η κυτταρομετρική ανάλυση ροής είναι η καθεμία κατάλληλες τόσο για εγκαταστάσεις συμβατές με GMP όσο και για γενικά ακαδημαϊκά εργαστήρια. Αν και το Western blotting έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε ακαδημαϊκά εργαστήρια, αυτή η μέθοδος περιορίζεται από την έλλειψη κατάλληλης ποσοτικοποίησης και επικύρωσης μεθόδου [67].

3.3.EV Καθαρότητα

Η καθαρότητα των ηλεκτρικών οχημάτων είναι επίσης ένα κρίσιμο κριτήριο για το QC. Μια απλή μέθοδος για την παρακολούθηση της καθαρότητας των EVs είναι ο προσδιορισμός των αναλογιών σωματιδίου προς πρωτεΐνη, πρωτεΐνης προς λιπίδιο ή RNA προς σωματίδιο [45]. Η απουσία ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών, όπως οι ιστόνες, η λαμίνη A/C, η GRP94 (δηλαδή, HSP90B1), η GM130 (δηλαδή, GOLGA2) και το κυτόχρωμα C (δηλαδή, CYC1), είναι ένα άλλο σημαντικό κριτήριο για τον προσδιορισμό της καθαρότητας των EVsorexosome καθώς αυτά Οι πρωτεΐνες δεν εμπλουτίζονται σε εξωσώματα λόγω του αυστηρού κυτταρικού τους εντοπισμού [43,45]. Οι ακαθαρσίες από τη διαδικασία κυτταροκαλλιέργειας, συμπεριλαμβανομένων των αντιβιοτικών και του ορού, θα πρέπει επίσης να αναλύονται για την παρακολούθηση της απομάκρυνσης δυνητικά επικίνδυνων ουσιών [46]. Κάθε παρτίδα ηλεκτρικών οχημάτων θα πρέπει να πιστοποιείται με συνήθη QC πριν χρησιμοποιηθεί για θεραπευτικούς σκοπούς ή λειτουργικές δοκιμασίες, ακόμη και στα ακαδημαϊκά εργαστήρια, για να διασφαλιστεί η αναπαραγωγιμότητα.

3.4. Δοκιμασίες Ισχύος

Οι δοκιμές ισχύος είναι το πιο σημαντικό κριτήριο OC για την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας των EVs in vivo. Οι ρυθμιστικές αρχές όπως ο Οργανισμός Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ (FDA) συνιστούν τη χρήση κατάλληλων δοκιμών ισχύος για προϊόντα κυτταρικής και γονιδιακής θεραπείας [68]. Οι οδηγίες MISEV2018 και MFDS συνιστούν επίσης τη συμπερίληψη αναλύσεων ισχύος για EV QC [45,46]. Η ισχύς ορίζεται ως "η ειδική ικανότητα ή ικανότητα του προϊόντος, όπως υποδεικνύεται από τις κατάλληλες εργαστηριακές δοκιμές ή από επαρκώς ελεγχόμενα κλινικά δεδομένα που λαμβάνονται μέσω της χορήγησης του προϊόντος με τον προβλεπόμενο τρόπο, να επιφέρει ένα δεδομένο αποτέλεσμα"[68]. Πολλές βιολογικές και βιοχημικές αναλύσεις έχουν αναφερθεί ότι καταδεικνύουν την ισχύ των EVs ή των εξωσωμάτων [69,70]. Δεδομένου ότι ο ποσοτικός προσδιορισμός των EVs παραμένει πρόκληση, η καθιέρωση μιας κατάλληλης ανάλυσης ισχύος θα ήταν ένα ανεκτίμητο εργαλείο για την παρακολούθηση της συνέπειας από παρτίδα σε παρτίδα και τον προσδιορισμό της δόσης των EVs [71]. Αν και οι ιδανικοί προσδιορισμοί ισχύος πρέπει να αντιπροσωπεύουν το MoA, είναι δύσκολο να δημιουργηθεί ένας κατάλληλος προσδιορισμός ισχύος με μεμονωμένες βιοχημικές ή απομονωμένες κυτταρικές αναλύσεις λόγω της δυσκολίας στον εντοπισμό μεμονωμένων βιοδραστικών ουσιών στο σύνθετο φορτίο των EVs. Για παράδειγμα, είναι δύσκολο να μιμηθούν οι σύνθετες ανοσολογικές αποκρίσεις in vivo με in vitro κυτταρικές δοκιμασίες [70-73].

4. Αντιφλεγμονώδης και Ανοσοτροποποίηση από MSC-Exosomes

Τα κύτταρα του ανοσοποιητικού εκκρίνουν διαλυτούς παράγοντες όπως φλεγμονώδεις κυτοκίνες και μεσολαβητές, οι οποίοι μπορούν να συμβάλουν σε περίπτωση φλεγμονής [74,75]. Συγκεκριμένα, οι προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, συμπεριλαμβανομένου του παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF)-x, της ιντερλευκίνης (IL)-6 και της IL-1, παράγονται κυρίως από ενεργοποιημένα μακροφάγα. Αυτές οι κυτοκίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοδική ρύθμιση των φλεγμονωδών αποκρίσεων, όπως η ενεργοποίηση των μακροφάγων και η στρατολόγηση πρόσθετων κυττάρων του ανοσοποιητικού [74,75]. Αντίθετα, οι αντιφλεγμονώδεις κυτοκίνες παράγονται από ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Tregs), βοηθητικά κύτταρα Τ (Th)2, εναλλακτικά ενεργοποιημένα μακροφάγα και μονοκύτταρα, τα οποία ελέγχουν τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις και την ανοσία 75,76]. Οι κύριες αντιφλεγμονώδεις κυτοκίνες περιλαμβάνουν lL-1 αγωνιστή υποδοχέα (lL{-1RA), lL-4, IL-10 και αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού (TGF)- [76].βιοφλαβονοειδή εσπεριδοειδώνΑυτές οι κυτοκίνες αναστέλλουν τις αποκρίσεις Th1l και την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών [76].

Η φλεγμονή είναι ένας μηχανισμός έμφυτης ανοσίας ως απόκριση σε επιβλαβή ερεθίσματα, συμπεριλαμβανομένων παθογόνων, κατεστραμμένων κυττάρων ή ερεθιστικών παραγόντων, και τυπικά εκδηλώνεται ως θερμότητα, πόνος, ερυθρότητα, πρήξιμο και απώλεια λειτουργικότητας [77]. Οι ανεξέλεγκτες χρόνιες φλεγμονώδεις αποκρίσεις σχετίζονται με διάφορες φλεγμονώδεις ασθένειες όπως αλλεργία, άσθμα, αυτοάνοσες ασθένειες, φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (IBD), ΟΑ, αθηροσκλήρωση και ηπατίτιδα [77-79]. Επιπλέον, πολλοί επιστήμονες θεωρούν τώρα τη φλεγμονή ως τη βασική αιτία των περισσότερων χρόνιων ασθενειών όπως τα καρδιακά επεισόδια, τα εγκεφαλικά, ο διαβήτης τύπου 2, η νόσος του Αλτσχάιμερ, ακόμη και ο καρκίνος [80,81]. Ως εκ τούτου, η ρύθμιση της φλεγμονής είναι ένας σημαντικός θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία φλεγμονωδών ασθενειών. Έχει αποδειχθεί ότι τα MSC έχουν την ιδιότητα των εγγενών ανοσοκατασταλτικών ικανοτήτων να ανακουφίζουν τη φλεγμονή και τις ανοσολογικές αποκρίσεις [82]. Τα MSC-εξωσώματα μπορούν να είναι μια εξαιρετική εναλλακτική λύση για την κυτταρική θεραπεία με MSC, καθώς τα MSC-εξωσώματα έχουν παρόμοιες βιολογικές λειτουργίες με τα αρχικά κύτταρα, ενώ είναι πιο σταθερά και έχουν χαμηλότερη ανοσογονικότητα σε σύγκριση με τα αρχέγονά τους κύτταρα [83]. Στην πραγματικότητα, οι αντιφλεγμονώδεις και ανοσοτροποποιητικές λειτουργίες των MSC-εξωσωμάτων έχουν αναφερθεί εκτενώς (Πίνακας 3) [21,84-151].

4.1.Πόλωση Μακροφάγων

Υπάρχουν συσσωρευμένες ενδείξεις ότι τα MSC-εξωσώματα προάγουν την πόλωση των μακροφάγων από το Μ1 προς το Μ2. Τα μακροφάγα Ml χαρακτηρίζονται από την έκφραση ενός ευρέος φάσματος προφλεγμονωδών κυτοκινών και χημειοκινών, όπως IL-1, IL-12 και TNF-. Αντίθετα, ο φαινότυπος των μακροφάγων Μ2 επάγεται από τις κυτοκίνες Th2 και οδηγεί στην έκκριση αντιφλεγμονωδών παραγόντων, όπως IL{10}} και TGF- και δείκτες M2 όπως IL-1RA, CD163, και CC μοτίβο χημειοκίνης 22 (CCL22)[152]. Έχει αναφερθεί ότι τα ανθρώπινα BM-MSC-εξωσώματα και τα MSC (JM-MSC)-εξωσώματα μυελού των οστών της γνάθου προάγουν την επούλωση δερματικών πληγών [86] και βελτιώνουν τη βρογχοπνευμονική δυσπλασία (BPD)[86] μέσω πόλωση μακροφάγου Μ2. Το miR-223 που περιέχεται στα εξωσώματα ανακούφισε τη φλεγμονή και επιτάχυνε την επούλωση των πληγών προκαλώντας πόλωση Μ2 των μακροφάγων. Η συγκαλλιέργεια με εξωσώματα BM-MSC αύξησε την έκφραση του miR-223 και μείωσε την έκφραση της πρωτεΐνης PBX/knotted homeobox 1 (PKNOX1), ενός σημαντικού ρυθμιστή της πόλωσης των μακροφάγων, σε μακροφάγα που απομονώθηκαν από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος ( PBMC). Επιπλέον, μετά από συγκαλλιέργεια με BM-MSC-εξωσώματα CD206-τα θετικά μακροφάγα αυξήθηκαν και οι αναστολείς miR-223 ανέστρεψαν αυτήν την αύξηση [85]. Σε ένα μοντέλο ποντικού με δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά (HFD), η ανεπάρκεια miR-223 ενίσχυσε τη διήθηση των μακροφάγων Μ1 και αύξησε την παραγωγή προφλεγμονωδών κυτοκινών, αλλά μείωσε τους βιοδείκτες που σχετίζονται με Μ2-, συμπεριλαμβανομένου του υποδοχέα που ενεργοποιείται από τον πολλαπλασιαστή υπεροξισώματος (PPARy) και αργινάση 1 (ARG1)[153]. Μια άλλη μελέτη διευκρίνισε ότι τα ανθρώπινα UC-MSC-εξωσώματα προάγουν επίσης την ενεργοποίηση των μακροφάγων Μ2 και ρυθμίζουν την επούλωση του διαβητικού δερματικού τραύματος [87]. Σε σύγκριση με εκείνα από μη ρυθμισμένα UC-MSC, τα εξωσώματα από τα προρυθμισμένα με LPS UC-MSCs περιείχαν υψηλό επίπεδο let-7b, βελτίωσε τη φλεγμονή και προήγαγε την επούλωση των πληγών πιο έντονα. Τα εξωσώματα UC-MSC μείωσαν τις πρωτεΐνες του υποδοχέα 4(TLR4) και των πρωτεϊνών φωσφο (ρ)-ρ65, ανεξάρτητα από την προετοιμασία του LPS. Μετά τη θεραπεία των εξωσωμάτων UC-MSC που είχαν προετοιμαστεί με LPS, το ARG1, ένας δείκτης μακροφάγων Μ2, αυξήθηκε και η επαγώγιμη συνθάση μονοξειδίου του αζώτου (iNOS), ένας δείκτης μακροφάγου Μ1, μειώθηκε [88]. Το let-7b στοχεύει το TLR4, η ενεργοποίηση του οποίου οδηγεί στην ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα-kB(NF-kB). Επιπλέον, το let-7b μειώνει την έκφραση της κυκλοοξυγενάσης-2(COX{ {77}}) και πρωτεΐνες κυκλίνης D1 [154]. Αποκαλύφθηκε ότι τα εξωσώματα UC-MSC καταστέλλουν τη φλεγμονή και προάγουν την επούλωση των πληγών προκαλώντας έκκριση κυτοκινών από μακροφάγα Μ2 σε αρουραίους με σοβαρή φλεγμονή του δέρματος που προκαλείται από εγκαύματα μέσω της μείωσης της έκφρασης TLR4, NF-KB και p-p65 [89]. Ένα υψηλότερο επίπεδο miR-181c παρατηρήθηκε στα εξωσώματα UC-MSC σε σύγκριση με τα εξωσώματα των ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών (HDF). Το επίπεδο έκφρασης του miR-181c μειώθηκε από τραυματισμό εγκαυμάτων και αυξήθηκε μετά τη θεραπεία των εξωσωμάτων UC-MSC στο δερματικό τραύμα. Επιπλέον, η θεραπεία των UC-MSC-εξωσωμάτων μείωσε την έκφραση του TNF- και της IL-1 και αύξησε την έκφραση της IL-10. Αυτές οι επιδράσεις ενισχύθηκαν από εξωσώματα που προέρχονται από miR{101}}c-υπερεκφρασμένα UC-MSC [88]. Σε ένα πείραμα που διεξήχθη σε αστροκύτταρα ποντικού, το επίπεδο έκφρασης του miR-181c μειώθηκε από το LPS, έναν συνδέτη υποδοχέα TLR4. Η υπερέκφραση του miR{107}}c αύξησε την έκκριση IL-10 που προκαλείται από το LPS[155]. Στην πρωτοπαθή μικρογλοία, η στέρηση οξυγόνου-γλυκόζης (OGD) ρύθμισε προς τα πάνω το TLR4, ενώ το miR-181c ανέτρεψε αυτήν την ανοδική ρύθμιση. Το miR-181c μείωσε επίσης το NF-kB και τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες όπως το TNF-, το IL-1 και το iNOS που προκαλούνται από την OGD[156]. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι τα ανθρώπινα MSC-εξωσώματα προκάλεσαν πόλωση Μ2 των μακροφάγων, η οποία επιβεβαιώθηκε από την αυξημένη αναλογία ARG1/iNOS, η οποία οδήγησε στην ανακούφιση της φλεγμονής στο διαβητικό δερματικό τραύμα [89].

Επιπλέον, τα εξωσώματα που προέρχονται από διάφορα MSC παίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στην προώθηση της ενεργοποίησης των μακροφάγων Μ2 σε άλλες φλεγμονώδεις ασθένειες καθώς και σε δερματικά τραύματα. Βρέθηκε ότι τα εξωσώματα BM-MSC ποντικού ανακουφίζουν από τη φλεγμονή στην αθηροσκλήρωση μέσω της πόλωσης Μ2 των μακροφάγων in vivo μέσω της οδού let-7/ομάδας υψηλής κινητικότητας AT-Hook 2(HMGA2)/NF-kB [90]. Ο εμπλουτισμός της οικογένειας let-7 βρέθηκε σε εξωσώματα BM-MSC και η θεραπεία των εξωσωμάτων BM-MSC ρύθμισε προς τα πάνω το επίπεδο-7let σε ApoE-/-ποντίκια [90]. Οι Zhao et al. αποκάλυψαν ότι τα εξωσώματα BM-MSC ποντικού μείωσαν επίσης τον τραυματισμό της μυοκαρδιακής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης (IR) μέσω της πόλωσης των μακροφάγων προς τους φαινοτύπους M2 (iNOS-CD206 plus) και την αύξηση της IL-10 και του ARG1, οι οποίοι ρυθμίζονται από miR-182 με στόχευση TLR4[91]. Τα ανθρώπινα BM-MSC-εξωσώματα έχει αναφερθεί ότι μειώνουν την επαγόμενη από θειικό νάτριο δεξτράνη (DSS) IBD σε ποντίκια μέσω της πόλωσης των μακροφάγων M2b με τρόπο που εξαρτάται από τη μεταλλοθειονεΐνη-2 (MT2A) [92]. Μια άλλη αναφορά αποκάλυψε ότι τα ESC-εξωσώματα ποντικού βελτίωσαν την μυοκαρδιοπάθεια αυξάνοντας τα μακροφάγα Μ2 και την απελευθέρωση IL{40}} [157]. Επιπλέον, αναφέρθηκε ότι τα εξωσώματα ASC αρουραίου βελτίωσαν το έμφραγμα του μυοκαρδίου προάγοντας την πόλωση των μακροφάγων Μ2, η οποία ρυθμίζεται με την αύξηση του υποδοχέα φωσφορικής σφιγγοσίνης 1(S1PR1)[93]. Η σημασία του άξονα 1-φωσφορικής σφιγγοσίνης (S1P)/κινάσης σφιγγοσίνης 1 (SphK1)/S1PR επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με την αποσιώπηση του S1PR1, η οποία κατάργησε τη μείωση της απόπτωσης που προκαλείται από υποξία από τα εξωσώματα ASC στα κύτταρα H9c2. Ομοίως, τα ανθρώπινα ASC-εξωσώματα προκάλεσαν δείκτες μακροφάγων Μ2 σε ανθρώπινα PBMCs [94]. Οι Heo et al. αποκάλυψε ότι τα ανθρώπινα εξωσώματα ASC επάγουν επίσης τον φαινότυπο των μακροφάγων Μ2 επιβεβαιώνοντας το αυξημένο επίπεδο μεταγραφικών παραγόντων (π.χ. μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 6 (STAT6), μεταγραφικός παράγοντας B MAF BZIP (MafB), κ.λπ.), που οδήγησε σε ρύθμιση ανοσοτροποποιητικών και αντιφλεγμονωδών επιδράσεων όπως αυξημένα Tregs και αντιφλεγμονώδεις κυτοκίνες (π.χ. IL-10 και TNF{70}}διεγερμένο γονίδιο-6(TSG-6)[94) ]. Τα εξωσώματα ASC ποντικού προκάλεσαν επίσης πόλωση μακροφάγων Μ2 και μείωσαν τη φλεγμονή των λευκών λιπωδών ιστών (WAT) σε παχύσαρκα ποντίκια[96]. Αυτές οι επιδράσεις εξαρτώνται από έναν μεταγραφικό παράγοντα, STAT3, σε εξωσώματα ASC. Επιπλέον, τα μακροφάγα M2 που εκπαιδεύτηκαν με ASC-εξώσωμα προκάλεσαν τον πολλαπλασιασμό των ίδιων των ASC και την παραγωγή γαλακτικού από τα ASC, τα οποία προήγαγαν περαιτέρω τη δημιουργία WAT [95]. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για την κατανόηση του λεπτομερούς υποκείμενου μοριακού μηχανισμού για τη ρύθμιση της πόλωσης των μακροφάγων Μ2 από τα MSC-εξωσώματα.

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Cells 2020, 9, 1157. doi:10.3390/cells9051157 www.mdpi.com/journal/cells