Αναστολείς μελανογένεσης από το Rhizoma Of Ligusticum Sinense σε B16-F10 κύτταρα μελανώματος in vitro και Zebrafish in vivo

Επικοινωνία: ali.ma@wecistanche.com

Min-Chi Cheng 1,†, Tzong-Huei Lee 2,†, Yi-Tzu Chu 3, Li-Ling Syu 3, Su-Jung Hsu 4, Chia-Hsiung Cheng 5, Jender Wu 1,* και Ching-Kuo Lee 1,3,6,*

Αφηρημένη:Το ρίζωμα του Ligusticum sinense, ενός κινέζικου φαρμακευτικού φυτού, έχει χρησιμοποιηθεί από καιρό ως καλλυντικό γιαλεύκανσηκαι ενυδάτωση του δέρματος στην αρχαία Κίνα. Προκειμένου να διερευνήσουμε τα αντιμελανογόνα συστατικά του ριζώματος του L. sinense, πραγματοποιήσαμεαντιμελανογένεσηΚαθαρισμός καθοδηγούμενος από την ανάλυση χρησιμοποιώντας ημι-παρασκευαστική HPLC συνοδευόμενος από φασματοσκοπική ανάλυση για τον προσδιορισμό των δραστικών συστατικών. Με βάση την καθοδηγούμενη από βιοδοκιμασία μέθοδο, απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 24 ενώσεις από το στρώμα οξικού αιθυλεστέρα των μεθανολικών εκχυλισμάτων του L. sinense, και μεταξύ αυτών,5-[3-(4-υδροξυ{{ Το 7}}μεθοξυφαινυλ)αλλυλ]φερουλικό οξύ (1) και το cis-4-πεντυλκυκλοεξ-3-ένιο-1,2-διόλη (2) ήταν νέες ενώσεις. Όλα τα καθαρά στελέχη υποβλήθηκαν σε δοκιμασία αντιμελανογένεσης χρησιμοποιώντας κύτταρα B16-F10 μελανώματος ποντικού. Η ένωση 1 και το (3S,3aR)-νεοκνιδιλίδιο (8) παρουσίασαναντιμελανογένεσηδραστηριότητες με τιμές IC50 78,9 και 31,1 μΜ, αντίστοιχα, χωρίς εμφανή κυτταροτοξικότητα. Περαιτέρω διερεύνηση έδειξε ότι η ένωση 8 έδειξε σημαντική δράση κατά της μελάγχρωσης σε έμβρυα ψαριού ζέβρα (10-20 μΜ) σε σύγκριση με την αρμπουτίνη (20 μΜ) και χωρίς καμία κυτταροτοξικότητα έναντι των φυσιολογικών ανθρώπινων επιδερμικών κερατινοκυττάρων. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το (3S,3aR)-νεοκνιδιλίδιο (8) είναι ισχυρή αντιμελανογόνος και μη κυτταροτοξική φυσική ένωση και μπορεί να αναπτυχθεί δυνητικά ως ασκινλεύκανσηπαράγοντα για καλλυντικές χρήσεις.

Λέξεις-κλειδιά:Ligusticum sinense; ρίζωμα;αντιμελανογένεση; Β16-Κύτταρο μελανώματος F10. zebrafish; μελάγχρωση

Κάντε κλικ στοΣκόνη Cistanche tubulosa για την αναστολή της μελανίνης

Εισαγωγή

Η μελανίνη είναι μια καφέ-μαύρη χρωστική ουσία που είναι κυρίως υπεύθυνη για το χρώμα του δέρματος, των μαλλιών και των ματιών [1]. Η μελανίνη είναι ένα βιοπολυμερές και περιλαμβάνει δύο κύριες κατηγορίες χρωστικών στο ανθρώπινο δέρμα, την καφέ-μαύρη ευμελανίνη και την κοκκινοκίτρινη φαιομελανίνη [1]. Η βιοσύνθεση μελανίνης είναι μια σύνθετη διαδικασία πολλαπλών σταδίων που ονομάζεταιμελανογένεση, η οποία είναι μια φυσιολογική απόκριση του ανθρώπινου δέρματος για την πρόληψη των επιβλαβών επιπτώσεων της υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) και των περιβαλλοντικών ρύπων. Ωστόσο, η υπερβολική μελανογένεση μπορεί να οδηγήσει σε σκουρόχρωμο δέρμα και η μη φυσιολογική υπερμελάγχρωση προκαλεί διάφορα δερματολογικά προβλήματα, όπως πανάδες, μέλασμα, γεροντικές φακίδες, ακόμη και καρκίνο του δέρματος [2].

Η μελανίνη παράγεται σε συνδεδεμένα με μεμβράνη οργανίδια που αναφέρονται ως μελανοσώματα, τα οποία βρίσκονται σε εξειδικευμένα κύτταρα που ονομάζονται μελανοκύτταρα. Η σύνθεση μελανίνης ξεκινά από την υδροξυλίωση της L-τυροσίνης σε L-διυδροξυφαινυλαλανίνη (DOPA) και ακολουθείται από οξείδωση σε ντοπακινόνη. Οι δύο αντιδράσεις καταλύονται από το περιοριστικό της ταχύτητας ένζυμο τυροσινάση. Ελλείψει ουσιών θειόλης, η ντοπακινόνη κυκλοποιείται σε λευκόχρωμα, ακολουθούμενη από μια σειρά αντιδράσεων οξειδωτικής μείωσης που περιλαμβάνουν πρωτεΐνη που σχετίζεται με τυροσινάση-2 (Tyrp-2) για να παράγει το ενδιάμεσο ντοπαχρώμιο και 5,6-διυδροξυϊνδόλη{{ {9}}καρβοξυλικό οξύ (DHICA). Το DHICA υφίσταται επακόλουθη οξείδωση που καταλύεται από το Tyrp-1 και πολυμερίζεται για να σχηματίσει ευμελανίνη. Η ντοπακινόνη συζευγνύεται επίσης με κυστεΐνη και γλουταθειόνη για να δώσει κυστεϊνυλντόπα και γλουταθειονυλντόπα, οι οποίες προοδευτικά μετατρέπονται σε φαιομελανίνη [1].

Τα κύτταρα που περιβάλλουν τα μελανοκύτταρα όπως τα κερατινοκύτταρα και οι ινοβλάστες εμπλέκονται στη ρύθμιση τηςμελανογένεση[3]. Η συνεχής έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία προκαλεί βλάβες στο DNA στα ινκερατινοκύτταρα και οδηγεί σε ρ{1}}προκαλούμενη προς τα πάνω ρύθμιση της προοπιομελανοκορτίνης (POMC). Το POMC υφίσταται μεταμεταφραστική διάσπαση για την παραγωγή της μελανοκυτταροτρόπου ορμόνης (-MSH) και της ενδορφίνης. Με τη σειρά του, το -MSH συνδέεται με τον υποδοχέα μελανοκορτίνης 1 (MC1R) στα παρακείμενα μελανοκύτταρα, με αποτέλεσμα την ανοδική ρύθμιση του cAMP. Το αυξημένο cAMP διεγείρει την έκφραση του παράγοντα μεταγραφής που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία (MITF). Στη συνέχεια, το MITF ρυθμίζει τη μεταγραφή των ενζύμων μελάγχρωσης, συμπεριλαμβανομένων των τυροσινάσης, Tyrp-1 και Tyrp-2. Η οδός που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία οδηγεί τελικά σε σύνθεση μελανίνης και μεταφορά μελανοσωμάτων στα κερατινοκύτταρα [4-6]. Εκτός από τα εξωγενή ερεθίσματα, η παραγωγή μελανίνης επηρεάζεται επίσης από εγγενείς παράγοντες, όπως η ορμονική αλλαγή, οι γενετικές διαταραχές, η φλεγμονή και η ηλικία [3].

Στην Ανατολική Ασία, οι περισσότερες γυναίκες περιμένουν να αποφύγουν την ανομοιόμορφη μελάγχρωση του δέρματος και να επιδιώξουν τη λεύκανση του δέρματος. Για παράδειγμα, η αρβουτίνη, το κοτζικό οξύ, το αζελαϊκό οξύ, το ασκορβικό οξύ και το εκχύλισμα ρίζας λευκής μουριάς και γλυκόριζας έχουν χρησιμοποιηθεί ωςλεύκανσησυστατικά σε καλλυντικά παρασκευάσματα [7]. Η εκμετάλλευση του αποτελεσματικού και προληπτικού δέρματοςλεύκανσηπαράγοντες από φυσικές πηγές παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον στον τομέα των καλλυντικών, κυρίως λόγω της σχετικής μη τοξικότητας και των λιγότερων παρενεργειών [7,8]. Το ρίζωμα του Ligusticum sinenseOliv. Το (Umbelliferae) χρησιμοποιείται από καιρό ως παραδοσιακό κινέζικο φάρμακο εδώ και 2000 χρόνια και μέχρι σήμερα οι ρίζες του είναι ένα ιδιαίτερα συνιστώμενο τσάι από βότανα [9]. Το L. sinense, δηλαδή "Gaoben" στα κινέζικα, επίσης γνωστό ως κινέζικο λουλούδι, χρησιμοποιήθηκε για την αποβολή του κρύου του αέρα, την ανακούφιση από τον πόνο και τη ρευματική αρθραλγία και την ανακούφιση του ανεμοψυγμένου πονοκεφάλου. Η κύρια εξωτερική χρήση του L. sinense είναι για τη λεύκανση και την ενυδάτωση του δέρματος [10]. Μέχρι σήμερα, τα αναφερόμενα χημικά συστατικά που υπάρχουν στο L. sinense περιλαμβάνουν τερπενοειδή, ανάλογα φθαλιδίου και γλυκοσίδες φαινυλοπροπανοειδών [11-16]. Τέτοια συστατικά έχει αναφερθεί ότι ασκούν πολυάριθμες φαρμακολογικές επιδράσεις. Για παράδειγμα, τα αιθέρια έλαια από τις ρίζες και τα ριζώματα του L. sinense αναφέρθηκε ότι έχουν αναλγητική, καταπραϋντική και αντιμικροβιακή δράση [15,17]. Το Ligustilide, ένα κύριο φθαλίδιο που βρίσκεται ευρέως στο φυτό Umbelliferae, έδειξε διασταλτική δράση στο μυομήτριο και μειωμένη φλεγμονώδη και νευρογενές πόνο [18]. Το Cnidilide, ένα άλλο φθαλίδιο σε αφθονία στο φυτό Umbelliferae, έχει αποδειχθεί ότι έχει αντισπασμωδικά και φλεγμονώδη αποτελέσματα [19,20]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το εκχύλισμα του L. sinense ανέστειλεμελανογένεσησε κύτταρα μελανώματος ποντικού B16-F10 [21]. Ωστόσο, τα ενεργά συστατικά για την ανασταλτική δραστηριότητα της μελανογένεσης δεν είχαν ακόμη αναφερθεί.

φυσικά συστατικά

Στον προκαταρκτικό μας βιολογικό έλεγχο, βρέθηκε ότι τα μεθανολικά εκχυλίσματα του L. sinense παρουσίασαναντιμελανογένεσηδραστηριότητα σε κύτταρα B16-F10 με τιμή IC50 50 μg/mL [22], και οι αρχές της ενδιάμεσης νοογένεσης δεν έχουν ακόμη αποκαλυφθεί μέχρι στιγμής. Ξεκινήσαμε λοιπόν να διερευνήσουμε τη δραστική αρχή του ριζώματος του L. sinense με μια μέθοδο κατευθυνόμενη από βιοδοκιμασία, και αυτό οδήγησε στην απομόνωση και την ταυτοποίηση δύο νέων ενώσεων 1 και 2 μαζί με 22 γνωστές ενώσεις 3-24. Αυτό το άρθρο στόχευε επίσης στη διερεύνηση των επιδράσεων των ενώσεων 1 και 8 στα κύτταρα μελανώματος B16-F10 in vitro και στο ψάρι ζέβρα in vivo, να αξιολογήσει την ασφάλεια με κανονική δοκιμασία ανθρώπινου επιδερμικού κερατινοκυττάρου MTT και να ποσοτικοποιήσει 1 και 8 στο ρίζωμα του L. sinense .

2. Αποτελέσματα και Συζητήσεις

2.1. Απομόνωση και δομική διαλεύκανση

Σε μια προσπάθεια απομόνωσης και αναγνώρισης τουμελανογένεσηαναστολείς αποτελεσματικά από τα ενεργά κλάσματα, χρησιμοποιήσαμε μια στρατηγική κλασμάτωσης καθοδηγούμενη από βιοδοκιμασία. Ένα μεθανολικό εκχύλισμα ριζώματος του L. sinense κατανεμήθηκε για να δώσει οξικό αιθυλεστέρα, η-βουτανόλη και υδατοδιαλυτές στοιβάδες. Οι ληφθείσες τρεις στιβάδες στη συνέχεια δοκιμάστηκαν για αντιμελανογένεση σε κύτταρα μελανώματος Β16-F10 ποντικού. Το κύτταρο μελανώματος ποντικού Β16 είναι μια ευαίσθητη, αξιόπιστη και εφικτή πλατφόρμα για τον έλεγχο μεγάλου αριθμού μικρών μοριακώνμελανογένεσηρυθμιστές [23-25]. Στις συγκεντρώσεις 25-100 μg/mL, το διαλυτό σε οξικό αιθυλεστέρα στιβάδα έδειξε την πιο ισχυρή ανασταλτική δράση, ενώ παρατηρήθηκε ελαφρά αναστολή είτε για τα στρώματα n-βουτανόλης είτε για υδατοδιαλυτά (Εικόνα 1Α) όπως αποδεικνύεται από τα περιεχόμενα μελανίνης σε λυμένα Β16-Κύτταρα μελανώματος F10 (Εικόνα 1Β). Ο διαχωρισμός ανοικτής στήλης στρώματος οξικού αιθυλεστέρα πάνω από σιλικαζέλ ακολουθούμενος από καθαρισμό με HPLC έδωσε δύο μη αναφερθείσες χημικές οντότητες 1 και 2 (Εικόνα 2Α) μαζί με 22 γνωστές ενώσεις. Οι γνωστές ενώσεις χαρακτηρίστηκαν ως ευγενόλη (3) [26], {{17} }υδροξυ-4-μεθυλακετοφαινόνη(4) [27], 3S*,3aR*,7aS*-3-βουτυλοεξαϋδροφθαλίδιο (5) [28], καρβακρόλη (6) [29], σκουαλένιο (7) [30 ],(3S,3aR)-νεοκνιδιλίδιο (8) [31], κωνφερυλική αλκοόλη 9-μεθυλεστέρας (9) [32], bergapten (10) [33], μεθοξαλένιο (11) [34], βανιλικός μεθυλεστέρας ( 12) [35], 2,5-διυδροξυ-4-μεθυλακετοφαινόνη (13) [36],2-μεθοξυ-4-νιτροφαινόλη (14) [37], 2,{{ 55}}διμεθοξυφαινόλη (15) [38], φαλκαρινδιόλη (16) [39], (9Ζ)-επταδεκένιο-4,6-διίνη{-1,8-διόλη (17 ) [40], 3-Ο-(π-κουμαροϋλ)ουρσολικό οξύ (18) [41], πρεγνενολόνη (19) [42], (9Z,11E,13R)-13-υδροξυοκταδεκα{{79 }},11-διενοϊκό οξύ (20) [43], φερουλικό οξύ (21) [44], φερουλικό κωνοφόρο (22) [45], φερουλικό π-υδροξυφαιναιθυλεστέρα (23) [46] και βανίλια λικό οξύ (24) [47].

Η ένωση 1, που λήφθηκε ως άχρωμο έλαιο, είχε έναν τύπο C20H20O6 όπως συνάγεται από το 13C NMRand θετικού ιόντος HRESI-MS, το οποίο έδειξε ένα ιόν θραύσματος σε θετικό HRESI-MS m/z 357,1331 [Μ συν Η] συν (υπολογ. για C20H21O6, 357.1333). Οι IR απορροφήσεις του στα 3444, 1633 και 1509 cm−1 έδειχναν την παρουσία υδροξυ, ολεφινικών και αρωματικών λειτουργιών, αντίστοιχα. Στο 1Η NMR του 1, a 1,3,4,5-τετραυποκατεστημένο αρωματικό τμήμα [δΗ 7.07 (d, J=1.8 Hz, Η-6) και 7.22 (d, J=1.8 Hz, H{-2)],μια αρωματική λειτουργικότητα τύπου ABX [δH 6.69 (dd, J=7.9, 1.8 Hz, H-60) , 6.74 (d, J=7.9 Hz, H{-50) and6.87 (d, J {= 1.8 Hz, H{-20)], δύο trans- αμοιβαία συζευγμένα ολεφινικά πρωτόνια [δH 6.33 (d, J {= 15.9 Hz, H{-8) και 7.56 (d, J {= 15.9 Hz, H{-7) ], μια τερματική αλλυλική ομάδα [δH 4,99 (ddd, J=17.1, 1,8, 1,8 Hz, H-90a), 5,10, (br d,J=7,6 Hz , H{-70), 5.15 (ddd, J=10.1, 1.8, 1.8 Hz, H-90b) και 6.40 (ddd, J=17.1, 10.1 , 7,6 Hz, Η{-80)] και δύο συντονισμοί μεθοξυλίου [δΗ 3,77 (s, 30-OCH3) και 3,92 (s, 3-OCH3)] παρατηρήθηκαν. Είκοσι συντονισμοί άνθρακα, που αποδίδονται σε επτά μη πρωτονιωμένους αρωματικούς άνθρακες [δC 126.7 (C-1), 131.2 (C-5), 135.3 (C-10), 146.1 (C{116} }), 148,6 (C{-3), 147,2 (C{{-4) και 148,2 (C{{-30)], ένα οξύ καρβονύλιο (δC 168,4, C{-9), ονεμεθίνη (δC 48.2, C{-70), οκτώ ολεφινικές μεθίνες [δC 108.9 (C-2), 113.2 (C-20), 115.6 (C-50), 116.1 (C -8), 121,8 (C{-60), 123,8 (C{-6), 141,5 (C{-80) και 146,2 (C{-7)], ένα εξωμεθυλένιο (δC 115.9, C-90) και δύο μεθόξυλα [δC 56.4 (30-OCH3) και 56.6 (3-OCH3)], παρατηρήθηκαν στο φάσμα 13C NMR σε συνδυασμό με το φάσμα DEPT του 1 ( Τραπέζι 1). Η συνδεσιμότητα του 1 συνάγεται περαιτέρω από διασταυρούμενες κορυφές δH5.10 (H-70)/δC 113.2 (H-20), 115.9 (H-90), 121.8 (H{{{ 183}}), 123,8 (C-6), 131,2 (C{-5), 135,3 (C{-10), 141,5 (C{-80) και 147,2 (C{{{{{ 198}}), δΗ 7,56 (H{-7)/δC 108,9 (C-2), 116,1 (C{-8), 123,8 (C{-6), 126,7 (C -1) και 168,4 (C{-9), δΗ 3,77(30-OCH3)/δC 148,2 (C-30) και δΗ 3,92 (3-OCH3)/ δC 148.6 (C-3) στο φάσμα HMBC (Εικόνα 2Β), τα οποία επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω από τα αμοιβαία συσχετισμένα σήματα του δH 3.77 (30-OCH3)/δH 6.87(H-20 ) και δΗ 3,92 (3-OCH3)/δΗ 7,22 (Η-2) στο φάσμα NOESY (Εικόνα 2Β). Συνεπώς, το 1 χαρακτηρίστηκε όπως φαίνεται και ονομάστηκε 5-[3-(4-υδροξυ-3-μεθοξυφαινυλ)αλλυλ]φερουλικό οξύ. Από ό,τι γνωρίζουμε, 1 με δύο σετ μονάδων C6–C3 συνδεδεμένες στο C{-70 ήταν ένας νέος σκελετικός τύπος λιγνάνης.

Η ένωση 2 απομονώθηκε ως άχρωμο έλαιο με μοριακό τύπο C11H2{{2{0}}Ο2 όπως συνάγεται με θετικό ιόν HR-ESIMS, δείχνοντας ένα [Μ συν Η] συν ιόν σε m/z 185,1501 (υπολογ. για C11H21O2, 185.1541). Εμφανείς απορροφήσεις στα 3445 και 1660 cm−1 στο φάσμα IR του 2 έδειξαν την παρουσία υδροξυ και ολεφινικών λειτουργιών, αντίστοιχα. Το 1H NMR (Πίνακας 2) σε συνδυασμό με το φάσμα COSY του 2 έδειξε δύο αλειφατικές αλυσίδες σε δΗ 0,85–1,97 (–Η2-7–Η{3-11) και δΗ 1,66–5,44 (–Η-3 –Η-2–Η-1–Η2-6–Η2-5–). Οι παραπάνω εκχωρήσεις αντικατοπτρίζονται επίσης στο 13C NMR των 2 που υποστηρίζονται από φάσματα DEPT, στα οποία ένα μεθύλιο (δC 14.2, C-11), έξι μεθυλένια [δC 22.7 (C{-10), 26.3 (C{{{ 45}}), 27,2 (C-5), 27,4 (C-8), 31,8 (C-9) και 37,4 (C-7)], τρεις μεθίνες [δC Παρατηρήθηκαν 67,1 (C{-2), 69,2 (C{-1) και 121,0 (C-3)] και ένας τεταρτοταγής άνθρακας (δC 144,1, C-4). Στο φάσμα HMBC του 2 (Εικόνα 2C), διασταυρούμενες κορυφές δH 5,44 (H-3)/δC 27,2 (C-5) και 37,4 (C-7), δH 1,92– 2.01 και 2.04–2.10 (H2-5)/δC144.1 (C-4) και δH 1.97 (H2-7)/δC 144.1 (C-4) υποδεικνύεται C{ {100}}–C{-6 ήταν ένα τμήμα κυκλοεξενίου με διπλό δεσμό στο Δ3 και το C{103}}–C-11, μια κορεσμένη γραμμική αλειφατική αλυσίδα, προσαρτήθηκε στο C{105 }}. Οι σχετικές διαμορφώσεις των χειρόμορφων C{107}} και C{108}} που φέρουν υδροξυ προσεγγίστηκαν από τις τιμές J των καρβινοϋλοπρωτονίων H-1 (9.1, 4.2 Hz) και H-2 (4.2 Hz ), το οποίο έδειξε ότι τα H-1 και H{-2 ήταν ψευδο-αξονικά και ψευδο-ισημερινά, αντίστοιχα (Εικόνα 2C). Η σχετική διαμόρφωση του 1,2-διυδροξυ στο 2 συνάγεται έτσι σε cis. Συμπερασματικά, η δομή του 2 διευκρινίστηκε όπως φαίνεται και ονομάστηκε cis-4-πεντυλκυκλοεξ-3-ene-1,{2-διόλη.

2.2. Επιδράσεις των ενώσεων 1 και 8 στην περιεκτικότητα σε μελανίνη σε κύτταρα B16-F10 που διεγείρονται από -MSH

Για να εξακριβωθούν τα συστατικά αποχρωματισμού στο ρίζωμα του L. sinense, όλες οι καθαρές απομονώσεις υποβλήθηκαν σεαντιμελανογένεσηδοκιμασία σε κύτταρα μελανώματος B16-F10. Τα κύτταρα Β16-F10 μελανώματος ποντικού είναι ένα καθιερωμένο μοντέλο για την ανακάλυψη αντιμελανογόνων αρχών και έχουν υιοθετηθεί ευρέως σε προηγούμενες μελέτες [48]. -Η ορμόνη διέγερσης των μελανοκυττάρων (-MSH) είναι μια πεπτιδική ορμόνη και είναι υπεύθυνη για την παραγωγή μελανίνης από τα μελανοκύτταρα μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα μελανοκορτίνης 1 [49]. Σε αυτήν την έρευνα, τα κύτταρα Β16-F10 διεγέρθηκαν με -MSH (100 nM) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ταυτόχρονα με κάθε ένωση σε συγκεντρώσεις 25, 50 ή 100 μΜ. Η περιεκτικότητα σε μελανίνη των κυττάρων μελανώματος B16-F10 χωρίς θεραπεία με ένωση εκχωρήθηκε ως 100 τοις εκατό. Αρμπουτίνη, ένα κοινό δέρμαλεύκανσηπαράγοντα σε καλλυντικά προϊόντα, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Από αυτές τις ενώσεις, η 1 και η 8 αναστέλλουν την επαγόμενη από -MSH παραγωγή μελανίνης με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Οι τιμές IC50 των ενώσεων 1 και 8 ήταν 78,9 και 31,1 μΜ, αντίστοιχα (Εικόνα 3Β). Η ένωση 1 και 8 στις αποτελεσματικές συγκεντρώσεις δεν έδειξαν εμφανή αποτελέσματα στον προσδιορισμό ΜΤΤ (Εικόνα 3Α). Τα αποτελέσματα του ΜΤΤ μπορεί να προκύψουν από τις συνδυασμένες επιδράσεις της μείωσης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της αναστολής της κυτταρικής βιωσιμότητας σύμφωνα με τις πειραματικές συνθήκες. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα αντι-μελανογονικά αποτελέσματα της ένωσης 1 και 8 δεν αποδίδονται στον κυτταρικό θάνατο ή την αναστολή της ανάπτυξης.

Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο HPLC-DAD, τα κύρια αποτελεσματικά συστατικά (1 και 8) χαρακτηρίστηκαν από το ακατέργαστο εκχύλισμα (Εικόνα 4) συγκρίνοντας με το χρόνο κατακράτησης του καθαρού 1 (από εργαστηριακή σύνθεση, δεδομένα δεν έχουν δημοσιευθεί ακόμη) και 8 (από το Sigma) ως πρότυπα. Χρησιμοποιήθηκαν μητρικά διαλύματα των 1, 10, 20, 40, 60, 80 και 100 μg/mL. Κάθε συγκέντρωση εγχύθηκε εις τριπλούν. Οι αναλογίες περιεκτικότητας 1 και 8 στο εκχύλισμα ξηρού υλικού ποσοτικοποιήθηκαν σε 0,009 τοις εκατό και 0,15 τοις εκατό (β/β) με γραμμική παλινδρόμηση των αντίστοιχων περιοχών κορυφής.

2.3. In Vivo Δοκιμασία Μελάγχρωσης Zebrafish

Επιπλέον για την αξιολόγηση της επίδρασης του 8 στο in vitroαντιμελανογένεση, η in vivo αντι-μελάγχρωση του μέσω της δοκιμασίας μελάγχρωσης zebrafish διερευνήθηκε περαιτέρω. Το Zebrafish έχει θεωρηθεί ως ένας πλεονεκτικός οργανισμός πρότυπο σπονδυλωτών λόγω του μικρού του μεγέθους, της υψηλής γονιμότητας και των παρόμοιων γενετικών αλληλουχιών και συστημάτων οργάνων με τον άνθρωπο. Επιπλέον, η διαδικασία μελάγχρωσης μελανίνης στην επιφάνειά της που επιτρέπει την εύκολη παρατήρηση καθιστά το zebrafish ένα ιδιαίτερα χρήσιμο μοντέλο για τη διερεύνηση των vivomelanogenic αναστολέων ή διεγερτών [50]. Σε αυτή τη μελέτη, η αρβουτίνη στα 20 mM χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και η αρβουτίνη των 20 μΜ συμπεριλήφθηκε για σύγκριση με την ένωση 8 στο ίδιο επίπεδο συγκέντρωσης. Μετά την επώαση εμβρύων ζέβρα από 7 hpf σε 72 hpf, η ένωση 8 εμφάνισε υψηλότερη ανασταλτική δράση της μελάγχρωσης σε συγκεντρώσεις 10 και 20 μΜ σε σύγκριση με την αρβουτίνη (20 μΜ) (Εικόνα 5). Κατά την επεξεργασία της ένωσης 8 20 μΜ, το επίπεδο μελάγχρωσης του ψαριού ζέβρα μειώνεται σημαντικά περίπου 31 τοις εκατό. ενώ η ένωση 8 στα 10 μΜ μειώνει το επίπεδο μελάγχρωσης κατά 26,2 τοις εκατό.

2.4. Δοκιμασία βιωσιμότητας ισοδυνάμων ανθρώπινης επιδερμικής επιδερμίδας

Η ασφάλεια των καλλυντικών προϊόντων αποτελεί σοβαρή ανησυχία. Για παράδειγμα, η υδροκινόνη, ένας αποτελεσματικός παράγοντας λεύκανσης του δέρματος, έχει απαγορευτεί από την αγορά λόγω πολυάριθμων ανεπιθύμητων ενεργειών και διαφωνιών σχετικά με τον πιθανό κίνδυνο καρκινογένεσης [7]. Το Kojic acid, ένας ισχυρός αναστολέας της τυροσινάσης, μπορεί να προκαλέσει δερματίτιδα εξ επαφής και πιθανή γονοτοξικότητα [51,52]. Προκειμένου να αξιολογηθεί η ασφάλεια των ενώσεων 1 και 8 στο ανθρώπινο δέρμα, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων σε μοντέλο ισοδύναμα ανθρώπινου δέρματος (HSEs). Τα HSE είναι τρισδιάστατα συστήματα καλλιέργειας που δημιουργούνται με σπορά ανθρωποκερατινοκυττάρων σε κατάλληλο δερματικό υπόστρωμα προ-σπαρμένο με ανθρώπινους ινοβλάστες. Τα HSE είναι φυσιολογικά συγκρίσιμα με το φυσικό δέρμα και παρέχουν κατάλληλες εναλλακτικές λύσεις για δοκιμές σε ζώα. Κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες καλλιέργειας, τα HSE επιδεικνύουν υψηλή ομοιότητα με τον εγγενή ιστό από τον οποίο προήλθε [53]. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές βιωσιμότητας στα φυσιολογικά ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα (NHEKs) σε επιδερμικά μοντέλα Leiden (LEMs). Οι ενώσεις 1 και 8 δεν επηρέασαν τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε συγκεντρώσεις 10-100 μΜ. Οι κυτταρικές βιωσιμότητα της ένωσης 1 είναι 98 τοις εκατό και 106 τοις εκατό σε συγκεντρώσεις 10 και 100 μΜ, αντίστοιχα. Οι κυτταρικές βιωσιμότητα της ένωσης 8 είναι 97 τοις εκατό και 92 τοις εκατό σε συγκεντρώσεις 10 και 100 μΜ, αντίστοιχα. Συνεπώς, οι ενώσεις 1 και 8 δεν άσκησαν κυτταροτοξικότητα έναντι των NHEKs στα επιδερμικά μοντέλα Leiden σε συγκεντρώσεις κάτω από 100 μΜ (Εικόνα 6). Δεδομένου ότι η αποτελεσματική συγκέντρωση του 8 είναι κάτω από 100 μΜ, γεγονός που υποδηλώνει ότι το 8 μπορεί να είναι ασφαλές για το δέρμαλεύκανσηκάτω από τις δοκιμασμένες συγκεντρώσεις. Ωστόσο, στην πράξη, τα καλλυντικά προϊόντα μπορούν να εφαρμοστούν στο ανθρώπινο δέρμα για μεγάλο χρονικό διάστημα, επομένως πρέπει να διεξαχθεί περαιτέρω μια εκτεταμένη πειραματική περίοδος δοκιμασμένων ενώσεων σε HSEs.

2.5. Μελέτη μοριακής σύνδεσης της B16-Mus Musculus Tyrosinase

Η κατάλυση της τυροσινάσης είναι το περιοριστικό βήμα της βιοσύνθεσης μελανίνης. Έτσι, η αναστολή της τυροσινάσης είναι η πιο κοινή προσέγγιση για την επίτευξη λευκότητας του δέρματος [54,55]. Προκειμένου να καθοριστεί εάν ο Λ. sinense καταστέλλεταιμελανογένεσησε κύτταρα B16-F10 μέσω αναστολής τυροσινάσης, πραγματοποιήθηκαν μοντέλα τρισδιάστατων ραβδιών (Εικόνα 7Α) και ένα δισδιάστατο διάγραμμα (Εικόνα 7Β) μοριακής σύνδεσης με χρήση λογισμικού DS, το οποίο αποκάλυψε τον πιθανό ανασταλτικό μηχανισμό της ένωσης 8 σε ποντίκι (Mus musculus) τυροσινάση. Αποδείχθηκε ότι η ενεργή θέση της τυροσινάσης ποντικού βρισκόταν σε μια περιοχή που περιβάλλεται από αμινοξέα His377, Asn378, His381, Gly389, Thr391, Ser394 μαζί με δύο ιόντα χαλκού. Η ενέργεια αλληλεπίδρασης CDOCKER μεταξύ του ενζύμου και του αναστολέα ήταν -46,0067 kcal/mol. Τα αποτελέσματα της προσομοίωσης έδειξαν ότι τα υδρόφοβα αμινοξέα συμπεριλαμβανομένων των Gly389, Asn 378, Thr391 Ser394, His 404 και His192 γύρω από την καταλυτική θέση σχημάτισαν δυνάμεις van der Waals με την ένωση 8. Επιπρόσθετα, το οξυγονάτομο του τμήματος -λακτόνης του 8 και του His27 σχηματίζει υδρογόνο315 , ενώ η καρβονυλική του ομάδα σχηματίζει δεσμούς συντονισμού με δύο ιόντα χαλκού. Παρατηρήθηκε επίσης ότι ο δακτύλιος κυκλοεξενίου και το βουτάνιο άσκησαν ασθενή π-αλκυλική αλληλεπίδραση με τα His381 και His215, αντίστοιχα. Προηγούμενες μελέτες έχουν καταδείξει ότι το εκχύλισμα L. sinense εμφάνισε αναστολή της τυροσινάσης μανιταριού και προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης mRNA της τυροσινάσης σε κύτταρα B16-F10 [21,56]. Δεδομένου ότι η μοριακή πρόσδεση επέδειξε ισχυρή αλληλεπίδραση μεταξύ του ενεργού τομέα της τυροσινάσης ποντικού και της ένωσης 8, προτάθηκε έτσι ότι το (3S,3aR)-νεοκνιδιλίδιο (8) εμφάνισε δράση αντιμελανογένεσης λόγω της εξασθένησης της δραστηριότητας τυροσινάσης και περαιτέρω μείωσης της παραγωγής μελανίνης. Ωστόσο, εκτός από την αναστολή της τυροσινάσης, οι άλλοι υποκείμενοι μηχανισμοί τουαντιμελανογένεσηΗ δραστηριότητα του (3S,3aR)-νεοκνιδιλιδίου (8) παραμένει προς διερεύνηση περαιτέρω.

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1. Γενικός

Διαλύτες ποιότητας HPLC, η-εξάνιο, οξικός αιθυλεστέρας, μεθανόλη και ακετονιτρίλιο, αγοράστηκαν από την JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA). Η αιθανόλη αγοράστηκε από τη Merck (Darmstadt, Γερμανία). -Μελανοκυτταροδιεγερτική ορμόνη (-MSH), διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS), 3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2 ,5-βρωμιούχο διφαινυλ τετραζόλιο (MTT) αγοράστηκαν από τη Sigma Aldrich (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Πραγματοποιήθηκε χρωματογραφία ανοικτής στήλης σε σιλικαζέλ (70–230 mesh, Merck, Darmstadt, Γερμανία). Οι προεπικαλυμμένες πλάκες πυριτικής πηκτής 60 F254 και φύλλα αλουμινίου RP-18 F254S για TLC αγοράστηκαν από τη Merck (Darmstadt, Γερμανία). Οι οπτικές περιστροφές μετρήθηκαν σε πολόμετρο JASCO P{19}} (Jasco, Τόκιο, Ιαπωνία). 1Η και 13C NMR αποκτήθηκαν με φασματόμετρο Bruker Avance DRX-500 (Bruker, Rheinstetten, Γερμανία). Τα φάσματα μάζας χαμηλής ανάλυσης και υψηλής ανάλυσης λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ABI API 4000 Q-TRAP ESI-MS (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) και Q-Exactive Plus HR-ESI-MS (Thermo Fisher Scientific, MA, USA ), αντίστοιχα. Τα φάσματα IR καταγράφηκαν σε φασματόμετρο JASCO FT/IR 4100 (Jasco, Τόκιο, Ιαπωνία).

3.2. Φυτικά Υλικά

Ξηρό ρίζωμα L. sinense Oliv. αγοράστηκε από την Sheng Chang Pharmaceutical Co., Ltd., Taoyuan, Taiwan.

3.3. Απομόνωση και δομική διαλεύκανση

Αποξηραμένο ρίζωμα (9,9 kg) L. sinense θρυμματίστηκε και εκχυλίστηκε με μεθανόλη (40 L x τρεις φορές), η οποία διηθήθηκε και εξατμίστηκε για να δώσει ένα μαύρο υπόλειμμα (1758 g). Αυτό το υπόλειμμα στη συνέχεια εναιωρήθηκε σε Η2Ο (3.0 L) και κατανεμήθηκε με ίσο όγκο οξικού αιθυλεστέρα και n-BuOH τρεις φορές, διαδοχικά. Κάθε στιβάδα συμπυκνώθηκε υπό μειωμένη πίεση για να ληφθούν στοιβάδες EtOAc (415 g), n-BuOH (147 g) και Η2Ο (896 g). Στη συνέχεια, το ξηρό στρώμα οξικού αιθυλεστέρα (25{{100}} g) αναμίχθηκε με 375 g silica gel και φορτώθηκε σε μια ρυθμισμένη ανοιχτή στήλη γεμάτη με 3550 g silicagel και εκλούστηκε σε ένα στάδιο Μέθοδος βαθμίδωσης με μίγματα η-εξανίου, οξικού αιθυλεστέρα και μεθανόλης. Κάθε 500 mL συλλέχθηκε για ένα κλάσμα και αναλύθηκε με TLC. Στη συνέχεια, όλα τα κλάσματα συνδυάστηκαν σε οκτώ μέρη I-VIII σύμφωνα με τα αποτελέσματα των αναλύσεων TLC, τα οποία επαναδιαλύθηκαν στον ελάχιστο όγκο μιγμάτων κ-εξανίου-οξικού αιθυλεστέρα που χρησιμοποιήθηκαν στο επόμενο σύστημα HPLC. Το τμήμα II που εκλούστηκε με η-εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα (95:5) καθαρίστηκε με ημι-παρασκευαστική HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm) χρησιμοποιώντας κ-εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα (96:4) ως μέσο έκλουσης με ρυθμό ροής 3 mL/min για να δώσει 6(4,2 mg, tR=19}.8 λεπτά), 3 (6,1 mg, tR=21.2 λεπτά), 5 (32 mg, tR=23 0,5 λεπτά) και 7 (79 mg, tR=28,0 λεπτά). Το ίδιο τμήμα καθαρίστηκε με ημι-παρασκευαστική HPLC (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm) χρησιμοποιώντας εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα (99 :1) ως υγρό έκλουσης με ρυθμό ροής 3 mL/min για να δώσει 4 (36 mg, tR=32.5 λεπτά). Το τμήμα III που εκλούστηκε με η-εξάνιο-οξικός αιθυλεστέρας (90:10) καθαρίστηκε με μια ημι-παρασκευαστική HPLC (Phenomenex®Luna, 10 χ 250 mm) χρησιμοποιώντας η-εξάνιο-ακετόνη (95:5) ως διαλύτη έκλουσης με ρυθμό ροής 3 mL/λεπτό για να δώσει 8 (1,7 g, tR=19). 3 λεπτά). Το τμήμα IV που εκλούστηκε με η-εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα (80:20) καθαρίστηκε με ημι-παρασκευαστική HPLC (Phenomenex®Luna, 10 × 250 mm) χρησιμοποιώντας κ-εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα (85:15) ως μέσο έκλουσης με ρυθμό ροής 3 mL/min για να δώσει 15 (19 mg, tR=24.4 λεπτά), 12 (11 mg, tR=26.9 λεπτά), 9 (25 mg, tR=33 0,8 λεπτά), 10 (31 mg, tR=37,0 λεπτά), 11 (24 mg, tR=42,5 λεπτά). Το ίδιο τμήμα καθαρίστηκε από την ίδια στήλη χρησιμοποιώντας η-εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα (78:22) ως διαλύτη έκλουσης με ρυθμό ροής 3 mL/λεπτό για να ληφθούν 14 (10 mg, tR=20).1 λεπτό) και 13 ( 22 mg, tR=24.6 λεπτά). Το ίδιο τμήμα καθαρίστηκε από την ίδια στήλη χρησιμοποιώντας η-εξάνιο-οξικός αιθυλεστέρας-ακετόνη (80:10:10) ως μέσο έκλουσης με ρυθμό ροής 3 mL/λεπτό για να ληφθεί 20 (25 mg, tR=13).2 λεπτά ), 17 (15 mg, tR=16.3 λεπτά), 18 (28 mg, tR=18.5 λεπτά), 16 (132 mg, tR=21.8 λεπτά) και 19 (39 mg, tR=25.6 λεπτά). Το τμήμα V που εκλούστηκε με η-εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα (60:40) καθαρίστηκε με ημι-παρασκευαστική HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm) χρησιμοποιώντας κ-εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα-ακετόνη (68:27:5) ως μέσο έκλουσης με ρυθμό ροής 3 mL/min για να δώσει 21 (5,3 g, tR=10,2 min),23 (63 mg, tR=20,0 min), 22 (84 mg, tR { {164}}.0 λεπτά) και 24 (33 mg, tR=26.5 λεπτά). Το ίδιο τμήμα καθαρίστηκε με ημι-παρασκευαστική HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm) χρησιμοποιώντας η-εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα (72:28) ως μέσο έκλουσης με ταχύτητα ροής 3 mL/min για να δώσει 2 (24 mg, tR=24.3 λεπτά). Το τμήμα που εκλούστηκε με η-εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα (40:60) καθαρίστηκε με ημι-παρασκευαστική HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 × 250 mm) χρησιμοποιώντας κ-εξάνιο-οξικό αιθυλεστέρα (53:47) ως μέσο έκλουσης με ρυθμό ροής 3 mL/min για να δώσει 1 (47 mg, tR=13.2 λεπτά).

3.4. Φασματοσκοπικά Δεδομένα

{{0}}[3-(4-Υδροξυ-3-μεθοξυφαινυλ)αλλυλ]φερουλικό οξύ (1): άχρωμο λάδι. [ ]25D συν 5,6◦(c 0.12, CH3OH);IR (καθαρό) νmax 3444, 2935, 1633, 1509, 1434, 1376, 1267, 1153; θετικό ESI-MS m/z 357,2 [Μ συν Η] συν θετικό HRESI-MS m/z 357,1331 [Μ συν Η] συν (υπολογ. για C20H21O6, 357,1333); Δεδομένα 1Η και 13C NMR βλέπε Πίνακας 1. Cis-4-πεντυλκυκλοεξ-3-ένιο-1,2-διόλη (2): άχρωμο λάδι; [ ]22D-20.3◦(c 0,20, CH3OH); IR (καθαρό) νmax 3445,2919, 1660, 1455, 1371, 1225, 1084; ESIMS m/z 185,2 [Μ συν Η] συν; HRESI-MS m/z 185,1501 [Μ συν Η] συν (υπολογισθείσα για C11H21O2, 185,1541); Δεδομένα NMR 1Η και 13C βλέπε Πίνακα 2.

3.5. Ανάλυση HPLC–DAD

Πραγματοποιήθηκαν χρωματογραφικές αναλύσεις σε σύστημα Hitachi HPLC αποτελούμενο από L{{{0}}αντλία, L-7200 αυτόματη δειγματοληψία, L-7455 ανιχνευτή και D-7000 λογισμικό συλλογής δεδομένων διαχειριστή συστήματος ,σε στήλη XBridgeTM C18 (μήκος 250 mm, εσωτερική διάμετρος 4,6 mm, μέγεθος σωματιδίου 5 um· Waters). Η κινητή φάση αποτελούνταν από H2O (διαλύτης Α) και CH3CN (διαλύτης Β). Ο ρυθμός ροής ήταν 1,0 mL/min. Το πρόγραμμα έκλουσης ήταν ως εξής: ισοκρατικό με 2 τοις εκατό Β (0-5 λεπτά), 2-20 τοις εκατό Β (5-25 λεπτά), 20-90 τοις εκατό Β (25-30 λεπτά ), και ισοκρατικό με 90 τοις εκατό Β (30–35 λεπτά). Ο όγκος της έγχυσης ήταν 10 L. Το φάσμα UV-ορατού καταγράφηκε στα 240 nm.

3.6. Κυτταρικής καλλιέργειας

Τα κύτταρα μελανώματος ποντικού B16-F10 (CRL6475) αγοράστηκαν από το Food Industry Researchand Development Institute (FIRDI, Hsinchu, Taiwan). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 90 τοις εκατό Dulbecco'sModified Eagle's Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Sigma, St. Louis, MO, ΗΠΑ) και 1 τοις εκατό Φιάλες καλλιέργειας διαλύματος πενικιλίνης-στρεπτομυκίνης σε επωαστήρα CO2 με υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5 τοις εκατό CO2 στον αέρα στους 37 ◦C. Το μέσο καλλιέργειας άλλαζε κάθε δύο ημέρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψίνη όταν ήταν περίπου 85 τοις εκατό συρρέοντα, μετρήθηκαν με αιμοκυτταρόμετρο (Neubauer Improved., Marienfeld, Γερμανία) και σπάρθηκαν στους κατάλληλους αριθμούς σε φρεάτια πλακών κυτταροκαλλιέργειας για περαιτέρω πειράματα.

3.7. Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων

Για να προσδιοριστεί η ασφάλεια των διαφόρων εκχυλισμάτων, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από θεραπεία με εκχυλίσματα προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Αυτή η μέθοδος βασίζεται στην αναγωγή του3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,5-βρωμιούχου διφαινυλτετραζολίου (MTT) σε φορμαζάνη από μιτοχονδριαλένζυμα σε βιώσιμα κύτταρα [57]. Η ποσότητα φορμαζάνης που σχηματίζεται είναι ανάλογη με τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων που υπάρχουν και μπορεί να μετρηθεί φασματοφωτομετρικά. Εν συντομία, κύτταρα προεπεξεργασμένα με ορμόνη διέγερσης μελανοκυττάρων (-MSH) με 100 nM και σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 104 κύτταρα/φρεάτιο σε μια πλάκα 12-πηγαδιού για να προσκολληθούν όλη τη νύχτα. Στη συνέχεια προστέθηκαν καθαρά προϊόντα απομόνωσης ή αρβουτίνη σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για άλλες 72 ώρες. Στη συνέχεια, τα επεξεργασμένα κύτταρα επισημάνθηκαν με αντιδραστήριο βαφής ΜΤΤ (Applichem, Denmark) σε PBS (2 mg/mL) για 3 ώρες. Τα ιζήματα φορμαζάνης διαλύθηκαν με DMSO και οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν στα 570 nm σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: βιωσιμότητα κυττάρων ( ποσοστό )=(Ένα δείγμα/Α έλεγχος) × 100, όπου ένα δείγμα και ένα δείγμα ελέγχου είναι οι απορροφήσεις από το μείγμα με ή χωρίς την προσθήκη του δείγματος δοκιμής, αντίστοιχα.

3.8. Δοκιμασία Περιεχομένου Μελανίνης

Η περιεκτικότητα σε μελανίνη μετρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως με μικρές τροποποιήσεις [58]. Τα κύτταρα μελανώματος Β16-F10 σπάρθηκαν με 1 x 104 κύτταρα/φρεάτιο σε 3 mL μέσου σε 6-πλάκες καλλιέργειας φρεατίων και επωάστηκαν όλη τη νύχτα για να επιτραπεί στα κύτταρα να προσκολληθούν. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις (25, 50 και 100 μΜ) των καθαρών προϊόντων απομόνωσης ή της αρβουτίνης για 72 ώρες παρουσία 100 ηΜ -MSH. Στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με 150 μL 1 Ν NaOH (Merck, Γερμανία) που περιείχε 10 τοις εκατό DMSO για 1 ώρα στους 80°C. Η απορρόφηση στα 405 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας. Η περιεκτικότητα σε μελανίνη των κυττάρων μελανώματος B16-F10 χωρίς θεραπεία με ένωση εκχωρήθηκε ως 100 τοις εκατό και η περιεκτικότητα σε μελανίνη των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ένωση υπολογίστηκε σε σχέση με την ομάδα ελέγχου.

3.9. In Vivo Δοκιμασία Μελάγχρωσης Zebrafish

Το πρωτόκολλο χρήσης ζώων έχει αναθεωρηθεί και εγκριθεί από την Επιτροπή ή την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων (IACUC/IACUP) του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Ταϊπέι (Αρ. LAC-2017-0311). Οι μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν σε συμμόρφωση με τους σχετικούς νόμους και Οι εγκεκριμένες οδηγίες. Έμβρυα ζέβρα άγριου τύπου συλλέχθηκαν από το Zebrafish Core Facility του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Ταϊπέι. Η αξιολόγηση με βάση το φαινότυπο του εμβρύου ψαριού ζέβρα πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη με ελαφρά τροποποίηση [50]. Τα έμβρυα επωάστηκαν στους 28 ◦C με 1 τοις εκατό αιθανόλη ως έλεγχο και διαφορετική συγκέντρωση ενώσεων από 7 hpf (μετά τη γονιμοποίηση) έως 72 hpf. Να αξιολογήσει τοαντιμελανογένεσηεπιδράσεις των μελανογόνων ρυθμιστών στην αναπτυξιακή διαδικασία του zebrafish, η μελάγχρωση του zebrafish αναλύθηκε στα 72 hpf. Τα έμβρυα τοποθετήθηκαν σε αγαρόζη χαμηλής τήξης 1 τοις εκατό (Bioshop Canada, Burlington, ON, Καναδάς) και καταγράφηκαν εικόνες με στερεομικροσκόπιο ZEISS Stemi508 (ZEISS, Oberkochen, Γερμανία). Η ανάλυση μέτρησης εικονοστοιχείων εικόνων πραγματοποιήθηκε από το πακέτο Fiji της ImageJ. Η ποσοτικοποίηση των δεδομένων μελάγχρωσης αναλύθηκε (η περιοχή κάτω από τα μάτια του ψαριού ζέβρα) και συγκρίθηκε με την ομάδα ελέγχου.

3.10. Δοκιμασία βιωσιμότητας σε φυσιολογικά ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα

Όλα τα πρωτογενή κύτταρα ανθρώπινου δέρματος από υγιείς δότες που χρησιμοποιούνται από το Τμήμα Δερματολογίας του Πανεπιστημιακού Ιατρικού Κέντρου του Leiden απομονώνονται από πλεονάζοντα ιστό που συλλέγεται σύμφωνα με το άρθρο 467 της Ολλανδικής Συμφωνίας περί Ιατρικής Θεραπείας και τον Κώδικα για την Ορθή Χρήση Ανθρώπινου Ιστού της Ολλανδικής Ομοσπονδίας Βιοϊατρικής Επιστημονικές Εταιρείες. Σύμφωνα με το άρθρο 467, οι πλεονάζοντες ιστοί μπορούν να χρησιμοποιηθούν εάν δεν υπάρξει αντίρρηση από τον ασθενή. Αυτό σημαίνει ότι ο ασθενής που θα υποβληθεί σε πλαστική χειρουργική είναι καλά ενημερωμένος για την έρευνα. Κανένας από τους συγγραφείς δεν συμμετείχε στη δειγματοληψία ιστών. Οι αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι τηρήθηκαν κατά την εργασία με ανθρώπινους ιστούς.

Το πλεονάζον δέρμα μείωσης του φρέσκου μαστού ενός μεμονωμένου θηλυκού ατόμου χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση φυσιολογικών ανθρώπινων επιδερμικών κερατινοκυττάρων (NHEKs) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [59]. Τα NHEKs σε μοντέλα Leidenepidermal (LEMs) επωάστηκαν όλη τη νύχτα υπό συνθήκες βύθισης σε μέσο κερατινοκυττάρων. Μέσα σε τέσσερις ημέρες, ο εμβρυϊκός βόειος ορός παραλείφθηκε σταδιακά και τα NHEKs στα LEM καλλιεργήθηκαν χωρίς ορό στη διεπιφάνεια αέρα-υγρού για επτά ημέρες, ενώ το μέσο καλλιέργειας ανανεωνόταν δύο φορές την εβδομάδα. Οι δοκιμασίες βιωσιμότητας πραγματοποιήθηκαν προσθέτοντας 0.5 mL 1 mg/mL MTT σε καθένα από τα NHEK σε LEM για 3 ώρες, μετά από 24 ώρες έκθεση στις υπό δοκιμή ενώσεις 1, 8 και DMSO (αρνητικός έλεγχος). Το προϊόν μπλε φορμαζάνης που καταβυθίστηκε εκχυλίστηκε από τα κύτταρα εντός 2 ωρών με 0.5 mL φρεάτιο ισοπροπανόλης. Η συγκέντρωση φορμαζάνης μετρήθηκε με προσδιορισμό της OD στα 570 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών aTecan Infinite F50.

3.11. Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα στη μελέτη μας ελήφθησαν ως μέσοι όροι πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον εις τριπλούν και εκφράστηκαν ως μέσοι όροι ± SD (Τυπική απόκλιση). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη δοκιμή t-test. Η στατιστική σημασία των αποτελεσμάτων ορίστηκε σε p < 0.05="" (*)="" και="" p=""><0,01>

3.12. Μελέτη μοριακής σύνδεσης της B16-Mus Musculus Tyrosinase

3.12.1. Μοντελοποίηση Ομολογίας

Καθώς δεν υπάρχουν πλέον διαθέσιμες τρισδιάστατες δομές για την τυροσινάση Mus musculus, το Homologymodeling είναι η πιο σίγουρη μέθοδος για την πρόβλεψη τρισδιάστατων δομών άγνωστης πρωτεΐνης με βάση την υπόθεση ότι η δομή της άγνωστης πρωτεΐνης είναι παρόμοια με τις γνωστές δομές κάποιας ομόλογης αναφοράς πρωτεΐνες. Αποκτήσαμε την αλληλουχία αμινοξέων της τυροσινάσης Mus musculus από το Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας. βάση δεδομένων αλληλουχίας πρωτεϊνών. Ένα ομόλογο πρότυπο πρωτεΐνης της ερωτηματικής πρωτεΐνης Mus musculustyrosinase ταυτοποιήθηκε από το Phyre2 (Protein Homology/analog Y Recognition Engine V 2.0) [60]. Τα 446 υπολείμματα (81 τοις εκατό της αλληλουχίας Mus musculus ) έχουν μοντελοποιηθεί με 100,0 τοις εκατό εμπιστοσύνη από το μοναδικό πρότυπο υψηλότερης βαθμολογίας ως κωδικός PDB: ο c5m8pA επιλέχθηκε ως υποδοχέας για τις μελέτες υπολογισμού σύνδεσης.

3.12.2. Ανάλυση Αλληλεπίδρασης Προσδέματος-Πρωτεΐνης

Η θέση δέσμευσης της τυροσινάσης Mus musculus προσδιορίστηκε με βάση τα έξι υπολείμματα αμινοξέων αναφοράς ουμαντυροσινάσης (PDB 5M8M) και ο θύλακας δέσμευσης έχει δύο χαλκού. Ως εκ τούτου, ορίστηκε η σφαίρα της θέσης δέσμευσης. Στη συνέχεια, η τρισδιάστατη δομή της ένωσης 8 παρασκευάστηκε και βελτιστοποιήθηκε με ελαχιστοποίηση ενέργειας που αγκυροβολήθηκε στον συνδετικό θύλακα της Mus musculus tyrosinase χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα CDOCKER και ο αριθμός των δοκιμών σύνδεσης ορίστηκε σε 50 για τον αναστολέα. Όλες οι άλλες παράμετροι ορίστηκαν ως προεπιλογή για την ανάλυση της αλληλεπίδρασης συνδετήρα-πρωτεΐνης μέσω της χρήσης BioviaDiscovery Studio v.4.0 (Accelrys Software Inc., San Diego, CA, USA). Τέλος, από τις 50 διαμορφώσεις σύνδεσης, επιλέχθηκε η κορυφαία με την υψηλότερη ενεργειακή βαθμολογία CDOCKER για τη διερεύνηση του τρόπου σύνδεσης της συνδεδεμένης ένωσης στη δραστική θέση τυροσινάσης Mus musculus.

4. Συμπεράσματα

Στην παρούσα μελέτη, υιοθετήσαμε μια καθοδηγούμενη από βιοδοκιμή μέθοδο χρησιμοποιώντας κύτταρα Β16-F10 για την απομόνωση των συστατικών αντιμελανογένεσης από εκχυλίσματα ριζώματος L. sinense. Τα ενεργά συστατικά προσδιορίστηκαν ότι είναι 5-[3-(4-υδροξυ-3-μεθοξυφαινυλ)αλλυλ]φερουλικό οξύ (1) και (3S,3aR)-νεοκνιδιλίδιο (8). Σύμφωνα με την ανάλυση HPLC, το περιεχόμενο της ένωσης 8 αντιπροσωπεύει το 0,15 τοις εκατό του ακατέργαστου εκχυλίσματος. οαντιμελανογένεσηΗ δραστηριότητα του 8 επαληθεύτηκε τόσο με in vitro κύτταρα B16-F10 όσο και με in vivo δοκιμασίες zebrafish. Όλα αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το 8 μπορεί, τουλάχιστον, να παρέχει μια λογική για τη δυνατότητα του L. sinense για την υψηλή του ισχύ και ποσότητα . Τα δεδομένα βιωσιμότητας των κυττάρων σε κύτταρα B16-F10 και NHEKSimply that 8 θα μπορούσαν να αναπτυχθούν δυνητικά ως παράγοντας κατά της μελανογένεσης. Ο τρόπος δράσης του8 στην αντιμελανογένεση εικάστηκε ότι είναι η αναστολή της δραστικότητας της τυροσινάσης με βάση τα αποτελέσματα της μοριακής πρόσδεσης. Ωστόσο, αυτό μένει να επιβεβαιωθεί περαιτέρω. Το εύρημα μας αποκάλυψε ότι η ένωση 8 παρουσίαζεαντιμελανογένεσηεπιδράσεις και ασφάλεια μέσω μελετών in vitro, in vivo και ex vivo, ωστόσο, η αποτελεσματικότητα της αποχρωματισμού και η βιοασφάλεια στο ανθρώπινο δέρμα πρέπει να αξιολογηθούν και να επικυρωθούν από κλινικές δοκιμές στο μέλλον.