Επικοινωνία:jerry.he@wecistanche.com

LP Arantes1, ML Machado1, DC Zamberlan1, TL da Silveira1, TC da Silva1, IBM da Cruz1, EE Ribeiro2, M. Aschner3 και FAA Soares1

1Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil 2Universidade Aberta da Terceira Idade, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM, Brasil

3 Τμήμα Μοριακής Φαρμακολογίας, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY, Η.Π.Α.

Το Cistanche έχει αντιγηραντική δράση

Αφηρημένη

Το Guarana (Paullinia cupana) καταπίνεται συνήθως από ανθρώπους στην περιοχή του Αμαζονίου και είναι βασικό συστατικό σε διάφορα ενεργειακά ποτά που καταναλώνονται παγκοσμίως. Η παράταση της μακροζωίας και ο χαμηλός επιπολασμός των χρόνιων ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία έχουν συσχετιστεί με τη συνήθη λήψη γκουαράνα.Η αντιγήρανσηΗ δυνατότητα του guarana αποδείχθηκε επίσης στο Caenorhabditis elegans. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στις επιπτώσεις του δεν είναι ξεκάθαροι. Εδώ, διερευνήσαμε τις πιθανές οδούς που ρυθμίζουν τις επιδράσεις του αιθανολικού εκχυλίσματος γκουαράνα (GEE) στη διάρκεια ζωής χρησιμοποιώντας το C. elegans. Οι κύριες γνωστές οδοί μακροζωίας αναλύθηκαν μέσω μεταλλαγμένων σκουληκιών και ανάλυσης RT-qPCR (DAF-2, DAF-16, SKN-1, SIR-2.1, HSF{{{6 }}). Διερευνήθηκε επίσης η πιθανή εμπλοκή της πουρινεργικής σηματοδότησης. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι το GEE ενεργεί μέσωαντιοξειδωτικόδραστηριότητα, τα μονοπάτια DAF-16, HSF-1 και SKN-1 και το ορθολόγιο ανθρώπινου υποδοχέα αδενοσίνης (ADOR-1) για παράταση της διάρκειας ζωής. Το GEE υπορρύθμισε επίσης το skn-1, το daf-16, τον κύριο-2.1 και το hsp-16.2 στο 9-ημέρα C. elegans, κάτι που μπορεί να αντικατοπτρίζει λιγότερη ανάγκη για ενεργοποίηση αυτών των προστατευτικών γονιδίων λόγω άμεσηςαντιοξειδωτικόυπάρχοντα. Τα αποτελέσματά μας συμβάλλουν στην κατανόηση των επιδράσεων του guarana in vivo, που μπορεί να είναι χρήσιμα για την πρόληψη ή τη θεραπεία διαταραχών που σχετίζονται με τη γήρανση, και επίσης προτείνουν την πουρινεργική σηματοδότηση ως εύλογο θεραπευτικό στόχο για μελέτες μακροζωίας.

Λέξεις-κλειδιά: Γήρανση; Αντιοξειδωτικό; Guarana; Διάρκεια ζωής; Φυσικά προϊόντα; Ξανθίνες

Εισαγωγή

Η Paullinia cupana, που αναφέρεται επίσης ως guarana, είναι ένα εγγενές φυτό στη λεκάνη του Αμαζονίου και ιδιαίτερα κοινό στη Βραζιλία. Η σκόνη των σπόρων του καταπίνεται συνήθως από ανθρώπους όλων των ηλικιών στην περιοχή του Αμαζονίου κυρίως για τις τονωτικές και διεγερτικές της ιδιότητες (1). Επιπλέον, η γκουαράνα είναι βασικό συστατικό σε διάφορα ενεργειακά ποτά που καταναλώνονται σε πολλές χώρες (2). Άλλες αναφερόμενες φαρμακολογικές επιδράσεις του guarana περιλαμβάνουν απώλεια βάρους, μείωση της σύνθεσης θρομβοξάνης των αιμοπεταλίων, προστασία από γαστρικές βλάβες, αντιοξειδωτική δράση και αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις [για ανασκόπηση βλέπε: (1)]. Ωστόσο, όταν καταναλώνεται σε υπερβολική ποσότητα, το guarana μπορεί επίσης να επηρεάσει αρνητικά την ανθρώπινη υγεία, προκαλώντας άγχος, διαταραχή του ύπνου και ταχυκαρδία, για παράδειγμα, λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς του σε καφεΐνη (2,3).

Η επέκταση της μακροζωίας σε άτομα που ζουν στο Maués, μια περιοχή του Αμαζονίου στη Βραζιλία, έχει συσχετιστεί με τη διατροφή του Αμαζονίου, συμπεριλαμβανομένης της συνήθους πρόσληψης γκουαράνα (4). Επιπλέον, μια επιδημιολογική μελέτη συσχέτισε την κατάποση guarana με χαμηλό επιπολασμό χρόνιων ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία στον πληθυσμό του Αμαζονίου (5). Πρόσφατα, μια μελέτη έδειξε επίσης ότιαντι γήρανσηδυνατότητες του εκχυλίσματος σπόρων guarana στο Caenorhabditis elegans (6). Ωστόσο, οι μηχανισμοί που διέπουν τις επιδράσεις του guarana στη γήρανση δεν προσδιορίστηκαν.

Το C. elegans ήταν ένα κατάλληλο μοντέλο για την κατανόηση των αντιδράσεων του οργανισμού σε διάφορες συνθετικές και φυσικές ενώσεις και την επιρροή τους στη γήρανση και τη διάρκεια ζωής. Οι ζωτικές βιολογικές οδοί και οι πολυάριθμες πτυχές της γήρανσης είναι ανάλογες στα νηματώδη και τα θηλαστικά, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων (7).

Δεδομένου ότι το ποσοστό των ηλικιωμένων αυξάνεται παγκοσμίως, συνοδευόμενο από αυξημένη συχνότητα ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία, είναι σημαντικό να εντοπιστούν αποτελεσματικές θεραπείες και θεραπευτικοί στόχοι που θα μπορούσαν να βελτιώσουν την ποιότητα ζωής (8). Εδώ, διερευνήσαμε τις πιθανές οδούς που ρυθμίζουν τις επιδράσεις του guarana στη διάρκεια ζωής χρησιμοποιώντας το C. elegans.

Υλικό και μέθοδοι

Χημικά

Άγαρ, αιθανόλη (96 τοις εκατό), χλωροφόρμιο, χοληστερόλη, FUDR (5-uoro-20-δεοξυουριδίνη), αναστολέας πρωτεάσης, κοκτέιλ αναστολέων φωσφατάσης, εκκινητές αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) αγοράστηκαν από τη Sigma (ΗΠΑ). Οι εκκινητές TaqMans που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση qRT-PCR και το Trizol αγοράστηκαν από την Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific Corporation (ΗΠΑ). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Synth (Βραζιλία).

Στελέχη και συντήρηση

Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν Bristol N2 (άγριου τύπου). CB1370, daf-2 (e1370) III; CF1038, daf-16 (mu86) I; EU1, skn-1(zu67); PS3551, hsf-1(sy441) I; TK22, mev-1(kn1); και VC199, κύριε-2.1(ok434), που ελήφθη από το Caenor-habditis Genetics Center (CGC), το Πανεπιστήμιο της Μινεσότα, ΗΠΑ, καθώς και το Escherichia coli OP50. Το στέλεχος EG6890, ador-1 (ox489), παρασχέθηκε ευγενικά από το εργαστήριο Dr. Erik Jorgensen (Πανεπιστήμιο της Γιούτα, ΗΠΑ). Αυτό το στέλεχος έχει μια διαγραφή από 1 kb ανάντη και τα πρώτα τρία εξόνια του γονιδίου ador-1 και διασταυρώθηκε 6 φορές. Το γονίδιο ador-1 κωδικοποιεί έναν ορθολογικό υποδοχέα ανθρώπινης αδενοσίνης (9).

Τα νηματώδη διατηρήθηκαν και προσδιορίστηκαν στους 20 βαθμούς σε πλάκες άγαρ μέσου ανάπτυξης νηματωδών (NGM) που έφεραν ένα γρασίδι Ε. coli OP50 (10). Ο συγχρονισμός των καλλιεργειών νηματωδών επιτεύχθηκε με λεύκανση ερμαφρόδιτων και τα αυγά αφέθηκαν να εκκολαφθούν όλη τη νύχτα σε ρυθμιστικό διάλυμα Μ9 (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl και 1 mM MgS04) (10).

Παρασκευή φυτικού υλικού και εκχυλίσματος

Η σκόνη φρυγανισμένων σπόρων Paullinia cupana Kunth var. sorbilis (Μαρτ.), η γκουαράνα, απομονώθηκε και προμηθεύτηκε από την EMBRAPA Oriental (Agropecuary Research Brazilian Enterprise) που βρίσκεται στο Δυτικό Αμαζόνιο στο Maués, Amazonas, Βραζιλία. Το υδρο-αλκοολικό εκχύλισμα ελήφθη όπως περιγράφεται αλλού (11). Εν συντομία, το εκχύλισμα παρήχθη χρησιμοποιώντας 70 τοις εκατό αιθανόλη. Μετά από 24 ώρες, το προκύπτον διάλυμα διηθήθηκε, η αιθανόλη αφαιρέθηκε και το εκχύλισμα λυοφιλίστηκε. Οι κυρίαρχες ξανθίνες και κατεχίνες που παρουσιάζονται στο εκχύλισμα guarana αναλύθηκαν με HPLC, δείχνοντας τις ακόλουθες συγκεντρώσεις: καφεΐνη=12.240 mg/g, θεοβρωμίνη=6.733 mg/g και ολικές κατεχίνες{{ 9}}.336 mg/g (11).

Θεραπεία των σκουληκιών

Πλάκες NGM που έφεραν γκαζόν Ε. coli OP50 (ως πηγή τροφής) προηγουμένως επωάστηκαν στους 37 βαθμούς όλη τη νύχτα. Το λυοφιλοποιημένο αιθανολικό εκχύλισμα γκουαράνα (GEE) διαλύθηκε σε κρύο αποσταγμένο νερό σε αυτόκλειστο (121 βαθμοί, 30 λεπτά) και απλώθηκε στις πλάκες σε τελικές συγκεντρώσεις 100, 500 και 1, 000 mg/mL άγαρ. Οι συγχρονισμένες προνύμφες L1 (10) μεταφέρθηκαν με μια πιπέτα στην επιφάνεια των πλακών επεξεργασίας και καλλιεργήθηκαν μέχρι την ενηλικίωση στους 20 βαθμούς.

Διάρκεια ζωής

Οι αναλύσεις διάρκειας ζωής ξεκίνησαν στις προνύμφες L4 σε τρυβλία NGM που είχαν σπαρθεί με E. coli OP50 απουσία ή παρουσία GEE (ημέρα 0). Τα ζώα μεταφέρονταν σε φρέσκα πιάτα με ή χωρίς GEE κάθε δεύτερη μέρα για να αποφευχθεί η σύγχυση των γενεών και βαθμολογήθηκαν ταυτόχρονα μέχρι το θάνατο. Η απουσία απόκρισης σε μηχανικό ερέθισμα βαθμολογήθηκε ως θάνατος. Τα σκουλήκια λογοκρίνονταν εάν σύρονταν από την πλάκα, έδειχναν εξωθημένα εσωτερικά όργανα ή πέθαιναν λόγω εκκόλαψης απογόνων μέσα στη μήτρα. Οι δοκιμές διάρκειας ζωής επαναλήφθηκαν τρεις φορές με 60–120 σκουλήκια ανά δοκιμασία. Μέσω μεταλλαγμένων στελεχών, αναλύθηκαν οι κύριες γνωστές διαδρομές μακροζωίας (12,13): i) daf-2 και daf-16, ο αυξητικός παράγοντας ινσουλίνης/όμοιος με ινσουλίνη (IGF){{11} } σηματοδότηση (IIS), την οποία ο υποδοχέας DAF-2 σηματοδοτεί μέσω μιας διατηρημένης οδού PI3-κινάσης/ΑΚΤ και ρυθμίζει προς τα κάτω το DAF-16/FOXO, υπεύθυνο για την προώθηση της έκφρασης γονιδίων που προσφέρουν παρατεταμένη μακροζωία και ενισχυμένη αντοχή στο στρες. ii) skn-1, που σχετίζεται με πρωτεΐνες της οικογένειας Nrf σπονδυλωτών και προάγει την έκφραση των ενζύμων αποτοξίνωσης ως απόκριση στο οξειδωτικό στρες, όπως η γλουταθειόνη-S-τρανσφεράση. iii) κύριε-2.1, η οποία κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που μοιάζει με αποακετυλάση ιστόνης που ενσωματώνει τη μεταβολική κατάσταση με τη διάρκεια ζωής και συνδέεται με τον θερμιδικό περιορισμό. και iv) hsf-1, που κωδικοποιεί τον παράγοντα μεταγραφής θερμικού σοκ-1 (HSF{-1) και επάγει την ενεργοποίηση διαφόρων γονιδίων θερμικού σοκ ή συνοδών που εμπλέκονται στη διατήρηση της διαμορφωτικής ομοιόστασης του πρωτεΐνες μεταξύ άλλων σημαντικών λειτουργιών. Μια πιθανή σχέση μεταξύ της μακροζωίας και της πουρινεργικής σηματοδότησης διερευνήθηκε επίσης μέσω του μεταλλαγμένου στελέχους ador-1.

Καθώς τα βακτήρια παίζουν ρόλο στη θνησιμότητα του C. elegans, η ανάπτυξη του E.coli OP50 αξιολογήθηκε παρουσία ή απουσία GEE για να διερευνηθεί εάν τα ευεργετικά αποτελέσματα θα μπορούσαν να είναι απόκριση σε μια αντιμικροβιακή ιδιότητα. Η απορρόφηση των βακτηρίων μετρήθηκε κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 12- ωρών σε υγρό μέσο (14).

Διάρκεια υγείας

Αξιολογήθηκαν οι παράμετροι συμπεριφοράς που σχετίζονται με το διάστημα υγείας (15). Η φαρυγγική άντληση αξιολογήθηκε με μικροσκόπιο Nikon E200 παρατηρώντας τον αριθμό των φαρυγγικών συσπάσεων κατά τη διάρκεια ενός διαστήματος 60- σε νεαρούς ενήλικες άγριου τύπου.

Η συχνότητα Thrash επιλέχθηκε για ανάλυση της κίνησης. Οι νεαροί ενήλικες άγριου τύπου από θεραπείες ελέγχου ή GEE επιλέχθηκαν ξεχωριστά και τοποθετήθηκαν σε μια σταγόνα M9. Τα σκουλήκια αφέθηκαν να προσαρμοστούν για 1 λεπτό και στη συνέχεια ο αριθμός των thrashes μετρήθηκε με ένα μικροσκόπιο Nikon E200 κατά τη διάρκεια ενός διαστήματος 20- δευτερολέπτων. Το thrash ορίστηκε ως μια αλλαγή στην κατεύθυνση της κάμψης στο μέσο του σώματος.

Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε τρεις ανεξάρτητες αναλύσεις. Εξετάστηκαν 30 νηματώδεις ανά ομάδα.

Απομόνωση RNA και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR)

Τα σκουλήκια άγριου τύπου σε ενήλικα σκουλήκια 9-ημέρας αναλύθηκαν για γονιδιακή έκφραση που σχετίζεται με αποκρίσεις μακροζωίας και οξειδωτικού στρες. Μετά την ενηλικίωση, τα σκουλήκια μεταφέρονταν κάθε δεύτερη μέρα σε πλάκες που περιείχαν 150 mM FUDR (5-uoro-20-δεοξυουριδίνη) για την αναστολή της αναπαραγωγής, παρουσία ή απουσία GEE. RNA από 20,000 σκουλήκια ανά συνθήκη απομονώθηκε χρησιμοποιώντας Trizol ακολουθούμενη από εκχύλιση χλωροφορμίου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (16) και 1 mg εισερχόμενου RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA από το κιτ αντίστροφης μεταγραφής cDNA υψηλής χωρητικότητας Applied Biosystems (Applied Biosystems , ΗΠΑ). Η ανάλυση έκφρασης διεξήχθη με ανάλυση προσαρμοσμένης συστοιχίας TaqMans χρησιμοποιώντας τις αντίστοιχες αναλύσεις έκφρασης γονιδίου TaqMans για μιτοχονδριακή υπεροξειδική δισμουτάση sod-3 (Ce02404515_g1), γλουταθειόνη-S-τρανσφεράση gst-4 (Ce{ {16}}g1), συνθετάση γ-γλουταμυλοκυστεΐνης gcs-1 (Ce02436726_g1), daf-16 (Ce{02422835_g1), κύριε-2.1 (Ce02 459018_g1), hsf-1 (Ce02423758_m1), πρωτεΐνη θερμικού σοκ hsp-16.2 (Ce02506738_s1) και skn{ {35}} (Ce02407445_g1) (Applied Biosystems). Η έκφραση του γονιδίου στόχου κανονικοποιήθηκε στις τιμές έκφρασης της ακτίνης afd-1 (Ce02414 573_m1). Η σχετική έκφραση κάθε γονιδίου προσδιορίστηκε με τη μέθοδο 2 DDCt (17) και τα δεδομένα αναφέρονται ως πολλαπλάσια αλλαγή στα επίπεδα mRNA σε σχέση με το afd-1. Αυτό το πείραμα διεξήχθη σε τρία ανεξάρτητα παρασκευάσματα σκουληκιών, το καθένα εις τριπλούν.

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism έκδοση 5 για Windows (GraphPad Software, USA). Τα αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσοι όροι ± SD τουλάχιστον τριών μεμονωμένων πειραμάτων. Το Student's t-test χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση ζευγών ομάδων, ενώ ένα μονόδρομο ή αμφίδρομο ANOVA ακολουθούμενο από το post hoc test του Bonferroni χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση τριών ή περισσότερων ομάδων. Όλες οι καμπύλες επιβίωσης αναλύθηκαν με τη δοκιμή log-rank (Mantel-Cox). Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε ως Po0.05.

Αποτελέσματα

Στη μελέτη μας, ο μάρτυρας άγριου τύπου C. elegans είχε μέση διάρκεια ζωής 11 ημέρες και μέγιστη διάρκεια ζωής 14 ημέρες. Σε μέσα που περιέχουν GEE, η μέση διάρκεια ζωής των σκουληκιών άγριου τύπου επεκτάθηκε σε 13 ημέρες στα 100 mg/mL (18 τοις εκατό ) και σε 15 ημέρες στα 500 και 1,000 mg/mL (36 τοις εκατό ). Η μέγιστη διάρκεια ζωής παρατάθηκε κατά μέσο όρο 28 τοις εκατό στις τρεις δοκιμασμένες συγκεντρώσεις (Πίνακας 1). Δεν υπήρχε διαφορά στην ανάπτυξη του E. coli παρουσία ή απουσία 1,000 mg/mL GEE (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η διάρκεια της υγείας των σκουληκιών παρατάθηκε επίσης μετά τη θεραπεία με GEE. Το εκχύλισμα καθυστέρησε την σχετιζόμενη με την ηλικία μείωση της φαρυγγικής άντλησης (100, 500 και 1,000 mg/mL) και των ακρωτηριασμών (1,000 mg/mL) ξεκινώντας την 9η ημέρα της ενηλικίωσης ( Εικόνα 1 Α και Β). Αντίστοιχα, επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση η συγκέντρωση 1,000 mg/mL GEE και δείγματα ενηλίκων σκουληκιών 9-ημέρας.

Το εκχύλισμα GEE (1,000 mg/mL) επέκτεινε τη μέση διάρκεια ζωής των μεταλλαγμένων mev-1 κατά 44 τοις εκατό και τη μέγιστη διάρκεια ζωής κατά 77,8 τοις εκατό (Πίνακας 1), που δείχνει μια σύνδεση μεταξύαντιοξειδωτικό

Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές διάρκειας ζωής στους 20 βαθμούς . Η μέγιστη διάρκεια ζωής αντιπροσωπεύεται ως η μέση διάρκεια ζωής του μακροβιότερου 10 τοις εκατό του πληθυσμού των σκουληκιών. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές ξεκινώντας με τουλάχιστον 60 νηματώδεις ανά ομάδα. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος±SD. *Po0,05 σε σύγκριση με την ομάδα που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία (δοκιμή log-rank Mantel-Cox).

Σχήμα 1. Επιδράσεις αιθανολικού εκχυλίσματος γκουαράνα (GEE) σε παραμέτρους συμπεριφοράς που σχετίζονται με τη διάρκεια της υγείας. Ρυθμός άντλησης του φάρυγγα (Α) και

συχνότητα thrash (Β) κατά τη γήρανση σε σκουλήκια άγριου τύπου. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ±SD (n=30 σκουλήκια ανά ομάδα). *P o0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο (μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης Bonferroni.

καιαντι γήρανσηδραστηριότητες. Το εκχύλισμα επέκτεινε επίσης τη μέση διάρκεια ζωής των μεταλλαγμάτων daf-2 και sir 2.1, αποδεικνύοντας ότι το εκχύλισμα δεν ενεργούσε μέσω αυτών των οδών για να προωθήσει την επέκταση της διάρκειας ζωής. Αντίθετα, η θεραπεία δεν παρέτεινε τη διάρκεια ζωής των μεταλλαγμένων daf-16, skn-1, hsf-1 και ador-1 (Πίνακας 1).

Οι αναλύσεις PCR αξιολόγησαν τη γονιδιακή διαμόρφωση από το GEE (Πίνακας 2). GEE σε 1,000 mg/mL ρυθμισμένο προς τα κάτω skn-1, daf-16, κύριε-2.1 και hsp-16.2 σε {{9 }}ενήλικες μιας ημέρας. Δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση στην έκφραση hsf{-1, gst-4, gcs-1 και sod-3.

Συζήτηση

Όπως αποδείχθηκε προηγουμένως (1), στη μελέτη μας, το εκχύλισμα γκουαράνα παρέτεινε επίσης τη διάρκεια ζωής και την υγεία του άγριου τύπου C. elegans. Έτσι, υποτιθέμενες πορείες που μπορεί να εμπλέκονται σε αυτόαντι γήρανσηδιερευνήθηκαν οι επιπτώσεις. Εν τούτω,αντι γήρανσηφάνηκαν επιδράσεις σε υψηλότερη συγκέντρωση του εκχυλίσματος (1,000 έναντι 300 mg/mL όπως αποδείχθηκε προηγουμένως). Αυτή η απόκλιση μπορεί να οφείλεται σε διαφορές στην προετοιμασία του εκχυλίσματος (υδροαλκοολικό έναντι υδατικού εκχυλίσματος)

Πίνακας 2. Διπλώστε την έκφραση mRNA αλλαγής των γονιδίων που σχετίζονται με τη μακροζωία και το οξειδωτικό στρες σε ενήλικα σκουλήκια άγριου τύπου 9-ημέρας που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αιθανολικό εκχύλισμα guarana (GEE)

Αυτό το πείραμα αξιολογήθηκε με RT-qPCR και διεξήχθη σε τρία ανεξάρτητα παρασκευάσματα σκουληκιών, το καθένα εις τριπλούν. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσοι αλλαγής πτυχής στα επίπεδα mRNA σε σχέση με το afd-1 (ακτίνη) ±SD. *Po0.05 σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία (αμφίδρομη ANOVA ακολουθούμενη από τη δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης του Bonferroni).

και μέθοδο χορήγησης (άγαρ έναντι υγρού μέσου) και μπορεί να είναι αποτέλεσμα φυσικής μετατόπισης στη γενετική παραλλαγή στον πληθυσμό των σκουληκιών (18,19).

Το οξειδωτικό στρες φαίνεται να είναι ένας σημαντικός παράγοντας που περιορίζει τη διάρκεια ζωής τόσο στον C. elegans όσο και στον άνθρωπο και σχετίζεται με πολλές ασθένειες που σχετίζονται με την ηλικία (20,21), γεγονός που στρέφει την προσοχήαντιοξειδωτικόενώσεις με αποτελέσματα in vivo. Για να διερευνηθεί περαιτέρω εάν το GEE θα μπορούσε να παρατείνει τη διάρκεια ζωήςαντιοξειδωτικόδραστηριότητα, αξιολογήθηκε η επίδρασή της στα σκουλήκια mev-1. Αυτό το στέλεχος χαρακτηρίζεται από υπερπαραγωγή υπεροξειδίου και έχει μικρότερη διάρκεια ζωής σε σύγκριση με το στέλεχος άγριου τύπου (22). Συνάδει με προηγουμένωςαντιοξειδωτικότα αποτελέσματα του εκχυλίσματος γκουαράνα (6), η θεραπεία με GEE σημαντικά παρατεταμένη μέση και μέγιστη διάρκεια ζωής των σκουληκιών mev-1.

Επιπλέον, τα μονοπάτια DAF-16, HSF-1 και SKN-1, που εμπλέκονται στη σηματοδότηση ινσουλίνης/IGF (IIS), φάνηκαν απαραίτητα για την επέκταση της διάρκειας ζωής με τη μεσολάβηση GEE. Το μειωμένο IIS σχετίζεται με τη μακροζωία και την προσαρμογή σε δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες σε C. elegans, Drosophila, θηλαστικά και πιθανώς στον άνθρωπο (13). Το HSF-1 λειτουργεί σε συνεργασία με το DAF-16 για να ενεργοποιήσει την έκφραση κοινών γονιδίων-στόχων, συμπεριλαμβανομένης της οικογένειας των sHsp (γονίδια μικρών πρωτεϊνών θερμικού σοκ) (23). Το SKN-1/Nrf ενσωματώνει το IIS και ρυθμίζει την απόκριση στο οξειδωτικό στρες και την έκφραση των γονιδίων αποτοξίνωσης (24).

Το DAF-16, το HSF-1 και το SKN-1 ενδέχεται επίσης να διαμεσολαβούν την επέκταση του διαστήματος υγείας και την ομοιόσταση πρωτεϊνών (25). Το DAF-16 εμπλέκεται στο σχηματισμό λιγότερο τοξικών συσσωματωμάτων πρωτεϊνών υψηλού μοριακού βάρους (26) και παρόλο που το HSF-1 ρυθμίζει τη δραστηριότητα αποσύνθεσης πρωτεϊνών απελευθερώνοντας μικρά τοξικά συσσωματώματα, μπορεί να έχει ευεργετική επίδραση συμβάλλοντας στην κάθαρση πρωτεΐνης μέσω ενζυματικού μεταβολισμού (27,28). Το SKN-1 είναι περισσότερο γνωστό ως ρυθμιστής τουαντιοξειδωτικόκαι ξενοβιοτική άμυνα, αλλά έχει επίσης εμπλακεί σε πρόσθετες λειτουργίες που περιλαμβάνουν την πρωτεόσταση και τη μεταβολική ρύθμιση (24).

Οι μεθυλξανθίνες, ως καφεΐνη, είναι τα κύρια συστατικά του guarana και είναι ευρέως γνωστό ότι αυτές οι ενώσεις μπορούν να δράσουν μέσω των υποδοχέων αδενοσίνης στα θηλαστικά (29). Η καφεΐνη έχει συσχετιστεί με ευεργετικά αποτελέσματα, συμπεριλαμβανομένων των επιδράσεων που σχετίζονται με τη γήρανση (30,31) και τη βελτίωση των φαινοτύπων της γνωστικής εξασθένησης ανταγωνίζοντας τους υποδοχείς αδενοσίνης Α1 και Α2Α στα τρωκτικά (32). Έτσι, δοκιμάσαμε εάν η επέκταση της διάρκειας ζωής που προκαλείται από το GEE μπορεί επίσης να εξαρτάται από το ADOR-1, ένα ομόλογο υποδοχέα αδενοσίνης (33). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα σκουλήκια ador-1(ox489) απέτυχαν να παρουσιάσουν εκτεταμένη διάρκεια ζωής, αποδεικνύοντας, για πρώτη φορά, έναν πιθανό ρόλο του πουρινεργικού συστήματος στην παράταση της διάρκειας ζωής. Κατά συνέπεια, η πουρινεργική σηματοδότηση μπορεί να μελετηθεί επικερδώς στο μέλλον ως πιθανός στόχος για τη διαμόρφωση μακροζωίας.

Αν και το GEE έχει υψηλά επίπεδα καφεΐνης και προηγούμενες μελέτες περιέγραψαν τις επιδράσεις της καφεΐνης στα σκουλήκια (34–36),αντι γήρανσηεπιδράσεις του GEE μπορεί να σχετίζονται με συνεργικές επιδράσεις διαφορετικών ενώσεων. Η συγκέντρωση της καφεΐνης στο εκχύλισμα είναι πολύ χαμηλότερη από την αποτελεσματική συγκέντρωση που αποδείχθηκε προηγουμένως και αποδείχθηκε ότι το αλκαλοειδές εκχύλισμα από γκουαράνα δεν είχε τα ίδια ευεργετικά αποτελέσματα (6). Επιπλέον, δεδομένα από τη βιβλιογραφία δείχνουν ότι τα εκχυλίσματα θα μπορούσαν να έχουν μεγαλύτερες φαρμακολογικές δράσεις από τις απομονωμένες ενώσεις (37,38).

Κατάρρευση του skn-1, του daf-16, του κυρίου-2.1 και του hsp-16.2 σε 9-ημέρας C. elegans που υποβλήθηκε σε θεραπεία με GEE ενδέχεται να αντανακλούν λιγότερη ανάγκη για ενεργοποίηση αυτών των γονιδίων για την αποκατάσταση της κυτταρικής βλάβης κατά τη γήρανση σε σύγκριση με τα σκουλήκια που δεν έχουν υποβληθεί σε θεραπεία, πιθανή λόγω άμεσηςαντιοξειδωτικόαποτελέσματα που ασκούνται από το εκχύλισμα (39,40).

Έτσι, αυτή η μελέτη έδειξε ότι ηαντι γήρανσητα αποτελέσματα του guarana μεσολαβούνται απόαντιοξειδωτικόδραστηριότητα και μονοπάτια DAF-16, HSF-1 και SKN-1. Επιπλέον, το ADOR-1 ήταν επίσης απαραίτητο για τις επιδράσεις του GEE στη διάρκεια ζωής, υποδεικνύοντας πιθανή συμμετοχή του πουρινεργικού συστήματος στη μακροζωία. Τα αποτελέσματά μας συμβάλλουν στην κατανόηση των επιδράσεων του guarana in vivo, που μπορεί να είναι χρήσιμα για την πρόληψη ή τη θεραπεία διαταραχών που σχετίζονται με τη γήρανση και προτείνουν την πουρινεργική σηματοδότηση ως εύλογο θεραπευτικό στόχο για μελέτες μακροζωίας.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς είναι ευγνώμονες στην Caenorhabditis Genetics

Κέντρο (CGC) στο Πανεπιστήμιο της Μινεσότα, ΗΠΑ για την παροχή στελεχών σκουληκιών και στο εργαστήριο του Δρ. Erik Jorgensen (Πανεπιστήμιο της Γιούτα, ΗΠΑ) για την ευγενική προμήθεια του στελέχους EG6890. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Βραζιλία (CNPq), Coordenac¸ão de Aperfeic¸oamento de Pessoal a Nível Superior, Βραζιλία (CAPES), PRONEM/FAPERGS/ CNPq και 694/CNP694 3}} και #475896/ 2012-2. Ο Michael Aschner υποστηρίχθηκε εν μέρει από την επιχορήγηση του NIH R01 ES10563. Οι πηγές χρηματοδότησης δεν συμμετείχαν

στο σχεδιασμό μελέτης ή στην ερμηνεία δεδομένων.