Η υπεροξείδωση των λυσοσωμικών λιπιδίων ρυθμίζει την ανοσία του όγκου
Sep 19, 2023
Η λυσοσωμική αναστολή που προκαλείται από αναστολείς θειοεστεράσης παλμιτοϋλ-πρωτεΐνης 1 (PPT1) όπως το DC661 μπορεί να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο, αλλά ο μηχανισμός για αυτό δεν είναι πλήρως κατανοητός. Δεν απαιτήθηκαν προγραμματισμένες οδοί κυτταρικού θανάτου (αυτοφαγία, απόπτωση, νεκρόπτωση, φερρόπτωση και πυρόπτωση) για την επίτευξη της κυτταροτοξικής δράσης του DC661. Η αναστολή των καθεψινών ή η χηλίωση του σιδήρου ή του ασβεστίου δεν διέσωσε την επαγόμενη από DC661-κυτταροτοξικότητα. Η αναστολή PPT1 προκάλεσε υπεροξείδωση λυσοσωμικών λιπιδίων (LLP), η οποία οδήγησε σε διαπερατότητα της λυσοσωματικής μεμβράνης και κυτταρικό θάνατο που θα μπορούσε να αντιστραφεί από το αντιοξειδωτικό Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) αλλά όχι από άλλα αντιοξειδωτικά υπεροξείδωσης λιπιδίων. Ο λυσοσωμικός μεταφορέας κυστεΐνης MFSD12 απαιτήθηκε για την ενδολυσοσωματική μεταφορά του NAC και τη διάσωση του LLP. Η αναστολή της PPT1 παρήγαγε ενδοκυτταρική ανοσογονικότητα με επιφανειακή έκφραση της καλρετικουλίνης που μπορούσε να αναστραφεί μόνο με NAC. Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με DC{11}}πρωταγωνίστησαν τα απλά Τ κύτταρα και ενίσχυσαν την τοξικότητα που προκαλείται από τα Τ κύτταρα. Τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με κύτταρα που έλαβαν DC{12}}προκάλεσαν προσαρμοστική ανοσία και απόρριψη όγκου σε "άνοσο θερμούς" όγκους αλλά όχι σε όγκους "άνοσο ψυχρούς". Αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι το LLP οδηγεί τον λυσοσωμικό κυτταρικό θάνατο, μια μοναδική ανοσογονική μορφή κυτταρικού θανάτου, υποδεικνύοντας τον δρόμο για ορθολογικούς συνδυασμούς ανοσοθεραπείας και λυσοσωμικής αναστολής που μπορούν να δοκιμαστούν σε κλινικές δοκιμές.
Οφέλη από σωληνοειδές σωληνίσκο-αντικαρκινικό
Εισαγωγή
Με ενθαρρυντική δραστηριότητα σε κλινικές δοκιμές που περιλαμβάνουν τον λυσοσωμικό αναστολέα υδροξυχλωροκίνη (HCQ) (1), την αναγνώριση της παλμιτοϋλο-πρωτεΐνης θειοεστεράσης 1 (PPT1) ως μοριακού στόχου των παραγώγων χλωροκίνης (2) και την εκτόξευση νέων κλινικών αναστολέων PPT1 δοκιμές (3, 4), υπάρχει ανάγκη να κατανοηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο οι λυσοσωμικοί αναστολείς προκαλούν κυτταρικό θάνατο και η επίδραση της λυσοσωμικής αναστολής στην ανοσία του όγκου. Ο κανονικός μηχανισμός θανάτου λυσοσωμικών κυττάρων που περιγράφεται για το HCQ περιλαμβάνει διαπερατότητα λυσοσωμικής μεμβράνης (LMP), διαρροή καθεψινών και ενεργοποίηση απόπτωσης που προκαλείται από κασπάση (5, 6). Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι ο λυσοσωμικός αναστολέας DC661 διεισδύει στα κύτταρα στο όξινο μικροπεριβάλλον του όγκου και εντοπίζεται στο λυσόσωμα πιο αποτελεσματικά από το HCQ (2, 7). Το DC661 παράγει ισχυρό κυτταρικό θάνατο σε πολλές καρκινικές κυτταρικές σειρές (2). Το DC661 δεσμεύει και αναστέλλει την PPT1, αποοξινίζει το λυσόσωμα και αναστέλλει την αυτοφαγία. Το DC661 επάγει επίσης LMP και αυξάνει τα επίπεδα της σχισμένης κασπάσης 3 (2, 7). Τα τελευταία χρόνια, έχουν οριστεί νέοι μηχανισμοί κυτταρικού θανάτου που έχουν ανοσογονικές συνέπειες και περιλαμβάνουν νεκρόπτωση, φερρόπτωση και πυρόπτωση (8). Η αυτοφαγία που εξαρτάται από το λυσόσωμα έχει αποδειχθεί ότι αποικοδομεί το MHC κατηγορίας Ι (9), καθώς και συστατικά του ανοσοπρωτεασώματος (10), υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της αυτοφαγίας μπορεί να ενισχύσει την επεξεργασία του αντιγόνου. Ωστόσο, οι ανοσογονικές επιδράσεις της λυσοσωμικής αναστολής και του επακόλουθου κυτταρικού θανάτου δεν έχουν πλήρως χαρακτηριστεί. Για να αντιμετωπίσουμε αυτό το κενό γνώσης, διερευνήσαμε τις επιδράσεις του DC661 στους κανονικούς μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου για να προσδιορίσουμε εάν ο λυσοσωμικός κυτταρικός θάνατος είναι η μορφή του κυτταρικού θανάτου ή απλώς ένας πρόδρομος ενός από τους άλλους καθιερωμένους μηχανισμούς. Βρήκαμε ότι το HCQ και το DC661 προκάλεσαν σημαντική αύξηση μόνο σε μικρό αριθμό πρωτεϊνών στο πρωτεϊνικό μελάνωμα και οι περισσότερες από αυτές ήταν πρωτεΐνες που σχετίζονται με την αυτοφαγία και την απόπτωση. Οι αναστολείς του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (απόπτωση, νεκρόπτωση, φερρόπτωση και πυρόπτωση) δεν μετριάζουν τις κυτταροτοξικές επιδράσεις μετά από λυσοσωμική βλάβη από το DC661. Η λυσοσωμική υπεροξείδωση λιπιδίων (LLP) είναι ο κύριος οδηγός του επαγόμενου από LMP κυτταρικού θανάτου που σχετίζεται με την έκφραση της καλρετικουλίνης (CALR) στην κυτταρική επιφάνεια. Αυτή η μορφή κυτταρικού θανάτου μπορεί να αντιστραφεί μόνο με τη χρήση του αντιοξειδωτικού Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC). Η δραστηριότητα του NAC επηρεάστηκε από την αναστολή του εισαγωγέα λυσοσωμικής κυστεΐνης MFSD12. Το LLP προκάλεσε ανοσογονικούς φαινοτύπους που προάγουν τη θανάτωση που προκαλείται από Τ κύτταρα. Αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι ο θάνατος των λυσοσωμικών κυττάρων είναι μια δυνητικά μοναδική μορφή ανοσογονικού κυτταρικού θανάτου.
φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα
Αποτελέσματα
Η λυσοσωμική αναστολή προκαλεί σημαντικές αλλαγές στο πρωτείωμα που σχετίζεται με την αυτοφαγία και την απόπτωση. Για να καθορίσουμε τις κυτταροτοξικές επιδράσεις των λυσοσωμικών αναστολέων, αξιολογήσαμε τη βιωσιμότητα του μελανώματος A375P, του καρκινώματος του παχέος εντέρου RKO και των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του παγκρέατος MIA PaCa-2 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τον αναστολέα κενοτοπίου H+-ATPase bafilomycin-A1 (1 00 nM); Αναστολείς PPT1 DC661 (3 μΜ) ή HCQ (10 μΜ ή 30 μΜ). Μιμητικό παλμιτικό δεκαεξυλοσουλφονυλοφθορίδιο (HDSF; 60 μΜ). αναστολείς καθεψίνης πεπστατίνη Α (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL) ή PepA+E64; και υδροβρωμιούχος μεθυλεστέρας Leu-Leu διασπαστής λυσοσωμικής μεμβράνης (20 μΜ) για 48 ώρες. Μόνο η βαφιλομυκίνη-A1 και η DC661 προκάλεσαν σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων στις καρκινικές κυτταρικές σειρές (Εικόνα 1Α και Συμπληρωματικό Σχήμα 1Α, συμπληρωματικό υλικό διαθέσιμο στο διαδίκτυο με αυτό το άρθρο; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), με το DC661 να παράγει βαθύτερη μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας από τη βαφιλομυκίνη-Α1. Με βάση αυτά τα δεδομένα και τις φαρμακολογικές ιδιότητες των παραγώγων χλωροκίνης που μοιάζουν με φάρμακα, εστιάσαμε τη μελέτη μας στα παράγωγα χλωροκίνης ως εργαλεία για την κατανόηση του θανάτου των λυσοσωμικών κυττάρων. Μια αμερόληπτη συνολική ανάλυση πρωτεώματος εφαρμόστηκε σε κύτταρα μελανώματος A375P που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DC661 (3 μM) ή το λιγότερο ισχυρό HCQ (10 μΜ ή 30 μΜ) για 24 ώρες. Από τις 4.264 ποσοτικοποιημένες πρωτεΐνες υψηλής εμπιστοσύνης, μόνο 87 και 55 πρωτεΐνες αυξήθηκαν σημαντικά με DC661 (3 μΜ) και HCQ (30 μΜ), αντίστοιχα. Επιπλέον, 14 και 15 πρωτεΐνες μειώθηκαν σημαντικά με το DC661 (3 μM) και το HCQ (30 μΜ), αντίστοιχα (απόλυτη αλλαγή φορές μεγαλύτερη από 2, q < 0,05) με DC661 (3 μM) ή HCQ (30 μΜ), αντίστοιχα , σε σύγκριση με τον έλεγχο οχήματος. Η χαμηλότερη δόση HCQ (10 μΜ) δεν έδειξε σημαντικές αλλαγές πρωτεΐνης σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα. Οι κορυφαίες 50 πρωτεΐνες που αυξήθηκαν σημαντικά μετά τη θεραπεία με DC661 συσχετίστηκαν κυρίως με αυτοφαγία και απόπτωση και παρόμοιες αλλαγές παρατηρήθηκαν για την υψηλότερη δόση του HCQ (Εικόνα 1Β). Για αυτούς τους λόγους, επιλέξαμε να επικεντρώσουμε περαιτέρω μελέτες στο πιο ισχυρό DC661. Παραδείγματα μερικών από τις μεγαλύτερες πρωτεϊνικές αλλαγές που σχετίζονται με την αυτοφαγία και την απόπτωση ήταν η φορολογική1-δεσμευτική πρωτεΐνη 1 (TAX1BP1· αυξημένη 15-πλάσια). BCL2-αλληλεπιδρούσα πρωτεΐνη 3 (BNIP3, αυξημένη 6-πλάσια). γείτονας της πρωτεΐνης γονιδίου 1 BRCA1 (NBR1, αυξημένη 12-πλάσια). σεκουστοσώμα-1 (SQSTM1/p62, αυξημένο 5-πλάσιο); συνενεργοποιητής πυρηνικού υποδοχέα 4 (NCOA4, αυξημένο 3-πλάσιο). και LC3B (MAP1LC3B, αυξήθηκε 3-πλάσιο). Η απολιποπρωτεΐνη Β-100 (APOB, αυξημένη 66-πλάσια) προήλθε από ορό εμβρύου μόσχου και δεν μελετήθηκε περαιτέρω. Η ανοσοστύπωση επιβεβαίωσε ότι η θεραπεία με DC661 ή υψηλότερες συγκεντρώσεις HCQ προκάλεσε αξιοσημείωτες αυξήσεις στην έκφραση των υποδοχέων φορτίου αυτοφαγίας NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 και NCOA4 με τρόπο που εξαρτάται από τη δόση και το χρόνο (Συμπληρωματικό Σχήμα 1, Β και Γ). Το CRISPR/Cas9 KO του PPT1 σε κύτταρα A375P φαινοτυπεί τα αποτελέσματα του DC661 σε αυτές τις πρωτεΐνες σε σύγκριση με τα αντίστοιχα WT (Συμπληρωματικό Σχήμα 1D). Ωστόσο, η έκφραση των υποδοχέων φορτίου αυτοφαγίας και οι σχετικές αυξήσεις που προκλήθηκαν από τη θεραπεία με DC661 ήταν μεταβλητές μεταξύ του καρκίνου του παχέος εντέρου, του καρκίνου του παγκρέατος και άλλων κυτταρικών σειρών μελανώματος στις οποίες το DC661 επιδεικνύει κυτταροτοξικότητα (Συμπληρωματικό Σχήμα 1Ε). Αυτό υποδηλώνει ότι οι ίδιοι οι υποδοχείς φορτίου αυτοφαγίας, αν και αυξημένοι σε επίπεδο πρωτεΐνης, είναι απίθανο να είναι υπεύθυνοι για τον κυτταρικό θάνατο μετά από θεραπεία με DC661. Για να το επιβεβαιώσουμε, εστιάσαμε στους υποδοχείς φορτίου αυτοφαγίας TAX1BP1 και BNIP3 επειδή έχουν γνωστές προαποπτωτικές επιδράσεις σε καρκινικά κύτταρα (Εικόνα 1C). Το TAX1BP1 είναι ένας προσαρμογέας φορτίου αυτοφαγίας (11) και ρυθμίζει επίσης την απόπτωση που προκαλείται από αναστολείς πρωτεϊνοσύνθεσης ή παράγοντες που καταστρέφουν το DNA σε καρκινικά κύτταρα (12). Η καταστροφή του TAX1BP1 από το siRNA (Εικόνα 1D) δεν επηρέασε την επαγόμενη από DC{119}}κυτταροτοξικότητα σε βραχυπρόθεσμους (Εικόνα 1Ε) και μακροπρόθεσμους προσδιορισμούς βιωσιμότητας (Εικόνα 1ΣΤ). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το TAX1BP1 δεν παίζει ουσιαστικό ρόλο στη διαμεσολαβούμενη από DC661-κυτταροτοξικότητα. Η BNIP3 είναι μια προαποπτωτική πρωτεΐνη που βλάπτει τη μιτοχονδριακή βιοενεργητική και ρυθμίζει τη μιτοφαγία (13). Η αποτελεσματική καταστροφή του BNIP3 (Εικόνα 1G) δεν επηρέασε την επαγόμενη από DC{{131} κυτταροτοξικότητα (Εικόνες 1, Η και Ι). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι κυτταροτοξικές επιδράσεις του DC661 είναι ανεξάρτητες από την έκφραση BNIP3. Στη συνέχεια, μελετήσαμε τα αποτελέσματα της εξάντλησης των κυττάρων των κανονικών γονιδίων αυτοφαγίας που απαιτούνται για την παραγωγή αυτοφαγοσώματος στην αποτελεσματικότητα του DC661 καταρρίπτοντας το unc-51 όπως η κινάση ενεργοποίησης της αυτοφαγίας 1 (ULK1) και το γονίδιο 7 που σχετίζεται με την αυτοφαγία (ATG7). Η αποτελεσματική καταστροφή του ULK1 ή του ATG7 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2, Α και Β) ανέστειλε την αυτοφαγική ροή (Συμπληρωματικό Σχήμα 2C) αλλά δεν επηρέασε την επαγόμενη από DC661-κυτταροτοξικότητα (Εικόνα 1, J–M). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απουσία του βασικού μηχανισμού αυτοφαγίας του πυρήνα δεν καταργεί τις κυτταροτοξικές επιδράσεις του DC661. Η λυσοσωμική αναστολή από το DC661 επάγει πολλαπλά προγραμματισμένα μονοπάτια κυτταρικού θανάτου. Η κανονική άποψη είναι ότι ο θάνατος των λυσοσωμικών κυττάρων οφείλεται σε απόπτωση (5). Η ανοσοστύπωση αποκάλυψε ότι η θεραπεία με DC661 είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κασπάσης-3, -7 και -9 και διάσπαση της PARP-1, επιβεβαιώνοντας ότι το DC661 ενεργοποίησε την απόπτωση (Εικόνα 2Α). Ο αναστολέας παν-κασπάσης Z-VAD-FMK εμπόδισε την ενεργοποίηση της κασπάσης από το DC661 αλλά δεν ανέστειλε τη συσσώρευση LC3B και p62, αποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση της απόπτωσης και ο αποκλεισμός της αυτοφαγίας μπορούν να διαχωριστούν μετά από λυσοσωμική αναστολή (Εικόνα 2Β). Ο αποκλεισμός της απόπτωσης με ZVAD-FMK δεν ενίσχυσε ούτε περιόρισε την κυτταροτοξικότητα του DC661, υποδηλώνοντας ότι η απόπτωση είναι απαραίτητη για τον θάνατο των λυσοσωμικών κυττάρων (Εικόνα 2, C και D). Οι κυτταροτοξικές επιδράσεις του DC661 ήταν παρόμοιες στα πρωτεύοντα κύτταρα μυελού των οστών διπλού ΚΟ Bax/Bak που δεν ήταν ικανά να υποστούν απόπτωση και κύτταρα WT (Εικόνα 2Ε). Ο αποκλεισμός της απόπτωσης δεν επηρέασε επίσης την επαγόμενη από DC{{171} κυτταροτοξικότητα στον καρκίνο του παχέος εντέρου και στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος (Συμπληρωματικό Σχήμα 2, D-F). Επειδή διαπιστώσαμε ότι η απόπτωση είναι απαραίτητη για τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από DC{{173}, ερευνήσαμε εάν το DC661 επάγει νεκρόπτωση, μια άλλη μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που ρυθμίζεται από αλληλεπιδρώντα με τον υποδοχέα πρωτεϊνική κινάση (RIPK) και πρωτεΐνη παρόμοια με τον τομέα της κινάσης μεικτής γενεαλογίας ( MLKL). Τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων και ενεργοποιημένων μορφών RIPK και MLKL αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία με DC661 από 0,1–1 μM (Εικόνα 2F). Στα 3 μΜ DC661 υπήρχε απουσία φωσφορυλιωμένου RIPK1 αλλά επίμονης φωσφορυλιωμένης MLKL, υποδηλώνοντας ότι, σε αυτή την υψηλότερη συγκέντρωση, θα μπορούσαν να εμπλέκονται πρόσθετες μορφές κυτταρικού θανάτου. Η προεπεξεργασία με τους αναστολείς RIPK1 νεκροστατίνη-1 ή τη νεκροστατίνη-1 ή τον αναστολέα MLKL νεκροσουλφοναμίδη απέτρεψε τη φωσφορυλίωση του RIPK1 μετά από θεραπεία με DC661 (1 μΜ) σε κύτταρα μελανώματος (Εικόνα 2G) αλλά απέτυχε να ανακάμψει }}προκαλούμενη κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα μελανώματος (Εικόνα 2Η) ή καρκίνου του παχέος εντέρου ή καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος (Συμπληρωματικό Σχήμα 2G). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η νεκρόπτωση είναι ενεργοποιημένη αλλά απαραίτητη για τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από DC{195}.
Εικόνα 1. Η αναστολή της λυσοσωμικής αυτοφαγίας προκαλεί σημαντικές αλλαγές στην απόπτωση και τις πρωτεΐνες αυτοφαγίας. (ΕΝΑ)
Τα λυσοσώματα είναι ένας από τους κύριους χώρους αποθήκευσης σιδήρου. Ο δυσρυθμισμένος ενδοκυτταρικός μεταβολισμός του σιδήρου σε συνδυασμό με τη μειωμένη αναγωγική ικανότητα μπορεί να προκαλέσει έναν μη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο γνωστό ως φερρόπτωση. Ένα χαρακτηριστικό της φερρόπτωσης είναι η ανοδική ρύθμιση της προσταγλανδίνης-ενδοϋπεροξειδίου της συνθάσης 2 (PTGS2), του ομολόγου 1 του ρυθμιστή μεταφοράς κατιόντων (CHAC1) και της συνθετάσης κυστεϊνυλ-tRNA (CARS) (14). Και οι 3 από αυτούς τους δείκτες φερρόπτωσης ρυθμίστηκαν μεταγραφικά προς τα πάνω με θεραπεία με DC661 (Εικόνα 3Α), υποδηλώνοντας ότι η λυσοσωμική αναστολή προκαλεί φερρόπτωση. Το DC661 προκάλεσε μια μετατόπιση φθορισμού σε κύτταρα A375P που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με C11-BODIPY, υποδεικνύοντας υπεροξείδωση λιπιδίων, χαρακτηριστικό της φερρόπτωσης. Αυτή η μετατόπιση που προκλήθηκε από DC661-αντιστράφηκε σημαντικά παρουσία αναστολέων φερροπτώσεως φερροστατίνη{-1 ή ροξστατίνης χειλιών-1 που χορηγήθηκαν σε αποτελεσματική συγκέντρωση (Εικόνα 3Β και Συμπληρωματικό Σχήμα 3Α), υποδεικνύοντας περαιτέρω ότι το DC661 προκληθείσα φερρόπτωση. Ωστόσο, η αναστολή της φερρόπτωσης δεν διέσωσε την κυτταροτοξικότητα που σχετίζεται με το DC661 (Εικόνα 3, Γ και Δ). Η ταυτόχρονη θεραπεία καρκινικών κυττάρων με τον χηλικό παράγοντα σιδήρου δεφεροξαμίνη (DFO) και το DC661 δεν διέσωσε την κυτταροτοξικότητα του DC661 (Εικόνα 3Ε). Η θεραπεία με φερροστατίνη-1, ροξστατίνη χειλιών-1 ή DFO δεν έσωσε την αναστολή της βραχυπρόθεσμης βιωσιμότητας του DC661 ή τη μακροπρόθεσμη κλωνογονική ανάπτυξη σε καρκινικά κύτταρα μελανώματος, παχέος εντέρου και παγκρέατος (Συμπληρωματικό Σχήμα 3, Β –Ε, και Συμπληρωματικό Σχήμα 4, Α–Δ). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η φερρόπτωση είναι ενεργοποιημένη αλλά απαραίτητη για τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από DC661-. Η πυρόπτωση είναι μια μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου που σχετίζεται με μια φλεγμονώδη απόκριση που περιλαμβάνει την ενεργοποίηση κασπασών που επεξεργάζονται τη γαστρίνη (GSDM), επιτρέποντας το σχηματισμό πόρων στην πλασματική μεμβράνη και την επακόλουθη απελευθέρωση μοριακών μοτίβων που σχετίζονται με βλάβη, όπως η υψηλή κινητικότητα κιβώτιο ομάδας 1 (HMGB1). Η θεραπεία με DC661 σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές μελανώματος (A375P, A375, WM35 και WM793) είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κασπάσης εκκινητή-8 και -9 και της κασπάσης εκτελεστής-7, τυπικής για την πυρόπτωση και παρήχθη διάσπαση πλήρους μήκους GSDME, παρόμοια σε έκταση με τον γνωστό επαγωγέα πυρόπτωσης PLX4720 και PD0325901 (Συμπληρωματικό Σχήμα 5Α). Το DC661 παρήγαγε ισχυρότερη εξωκυτταρική απελευθέρωση HMGB1 από τον γνωστό επαγωγέα πυρόπτωσης, BRAF και αναστολή ΜΕΚ σε 1% FBS (15), αντανακλώντας τη λειτουργική συνέπεια της ενεργοποιημένης πυρόπτωσης. Στη συνέχεια, δοκιμάσαμε εάν η αναστολή της πυρόπτωσης από το GSDME KO θα βελτιώσει τις κυτταροτοξικές επιδράσεις του DC661. Η θεραπεία με DC661 προκάλεσε συσσώρευση LC3II και SQSTM1/p62 και ενεργοποίηση κασπάσης, αλλά η απελευθέρωση HMGB1 σχεδόν καταργήθηκε πλήρως στα ανθρώπινα κύτταρα GSDME-KO WM35, αποδεικνύοντας ότι επιτεύχθηκε η λειτουργική συνέπεια της αναστολής της πυρόπτωσης (Εικόνα 3F). Ωστόσο, η θεραπεία με DC661 παρήγαγε ίση κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα YUMM1.7 WT, κενού φορέα (EV) και Gsdme KO1 και KO2 σε συνθήκες FBS 10% και 1% (Εικόνα 3G και Συμπληρωματικό Σχήμα 5Β). Ένα κοινό αποτέλεσμα πολλαπλών μορφών κυτταρικού θανάτου είναι η απελευθέρωση της LDH. Το DC661 προκάλεσε σημαντική αύξηση στην απελευθέρωση LDH και αυτό δεν μπορούσε να αντιστραφεί με απόπτωση, νεκρόπτωση ή αναστολή φερρόπτωσης (Συμπληρωματικό Σχήμα 5C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το DC661 προκαλεί πολλαπλούς τρόπους κυτταρικού θανάτου, συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης και της πυρόπτωσης, καθώς και της νεκρόπτωσης και της φερρόπτωσης, αλλά κανένας από αυτούς τους τρόπους κυτταρικού θανάτου δεν απαιτείται για τον επαγόμενο από DC661- κυτταρικό θάνατο. Η αναστολή της καθεψίνης ή η χηλοποίηση του ασβεστίου δεν εμποδίζει τον κυτταρικό θάνατο από τη διαπερατότητα της λυσοσωμικής μεμβράνης. Έχοντας αποδείξει ότι η ενεργοποίηση της κασπάσης (η οποία απαιτείται για την απόπτωση και την πυρόπτωση) είναι απαραίτητη για τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από DC, υποθέσαμε ότι η απελευθέρωση καθεψίνης από τα λυσοσώματα θα μπορούσε να προκαλέσει εξαρτώμενο από την κασπάση κυτταρικό θάνατο. Η χημική (DC661) ή η γενετική (PPT1 siRNA [siPPT1]) αναστολή της PPT1 παρήγαγε διαπερατότητα λυσοσωμικής μεμβράνης (LMP), ενώ το HDSF, ένας λιγότερο ισχυρός μη αναστρέψιμος αναστολέας της PPT1 που εξαντλείται ταχέως στην κυτταρική καλλιέργεια, δεν μπορούσε να προκαλέσει LMP. από γαλακτίνη-3–θετικά σημεία (Εικόνα 4Α). Η LMP έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση καθεψινών και άλλων περιεχομένων λυσοσωμάτων στο κυτταρόπλασμα και πιστεύεται ότι είναι ένα βασικό εγγύς χαρακτηριστικό του κυτταρικού θανάτου που βασίζεται σε λυσόσωμα. Η LMP που προκλήθηκε από το DC661 συσχετίστηκε με μια σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα της κυτταροπλασματικής καθεψίνης-L, η οποία αποκλείστηκε σημαντικά με έναν αναστολέα πρωτεάσης κυστεΐνης Ε64 (Εικόνα 4Β). Προηγούμενες αναφορές έχουν προτείνει ότι η απελευθέρωση καθεψίνης από σπασμένα λυσοσώματα προάγει την ενεργοποίηση της κασπάσης, οδηγώντας σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο (16-18). Η πλήρης αναστολή της καθεψίνης δεν απέτρεψε τη διάσπαση της κασπάσης (Εικόνα 4Γ) και δεν διέσωσε την επαγόμενη από DC661-κυτταροτοξικότητα σε βραχυπρόθεσμους και μακροπρόθεσμους προσδιορισμούς βιωσιμότητας στο μελάνωμα (Εικόνα 4, Δ και Ε), στον καρκίνο του παχέος εντέρου και στο πάγκρεας καρκινικά κύτταρα (Συμπληρωματικό Σχήμα 6, A–C). Αυτά τα αποτελέσματα αντικρούουν την κανονική άποψη του λυσοσωμικού κυτταρικού θανάτου όπως οδηγείται από τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από καθεψίνη. Εκτός από την απελευθέρωση καθεψίνης από διαρρέοντα λυσοσώματα, η απελευθέρωση ασβεστίου από τα λυσοσώματα έχει εμπλακεί στην κυτταρική δυσλειτουργία όταν η PPT1 είναι εξασθενημένη (19). Η θεραπεία με DC661 οδήγησε σε εκτεταμένη απελευθέρωση ασβεστίου, η οποία καταργήθηκε με την προεπεξεργασία του κυτταρικού χηλικού παράγοντα μόνιμου ασβεστίου (Ca{101}}), BAPTA-AM. (Εικόνα 4ΣΤ). Συγκεκριμένα, το BAPTA-AM δεν απέτρεψε την επαγόμενη από DC661-σχάση LMP (Εικόνα 4G) ή κασπάση (Συμπληρωματικό Σχήμα 6, D και E) και, το πιο σημαντικό, δεν διέσωσε την επαγόμενη από DC{108}}κυτταροτοξικότητα ( Εικόνα 4Η). Αυτά τα ευρήματα παρατηρήθηκαν επίσης και στις κυτταρικές σειρές RKO και MIA PaCa-2, στις οποίες δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στις τιμές IC50 με το BAPTA-AM και το DC661 (Συμπληρωματικό Σχήμα 6F), το οποίο υποδηλώνει ότι ο κυτταρικός θάνατος που σχετίζεται με LMP είναι δεν εξαρτάται από ασβέστιο ή καθεψίνες.
Εικόνα 2. DC661-επαγόμενη απόπτωση και νεκρόπτωση. (ΕΝΑ)
Εικόνα 3. DC661-επαγόμενη φερρόπτωση και πυρόπτωση. (ΕΝΑ)
Το LLP οδηγεί το LMP. Έχοντας διαπιστώσει ότι οι αναστολείς των κύριων οδών κυτταρικού θανάτου (απόπτωση, νεκρόπτωση, φερρόπτωση και πυρόπτωση), οι καθεψίνες (PepA και E64) και οι χηλικές ουσίες ιόντων (BAPTA-AM [Ca2+] και DFO [Fe{{3} }]) δεν απέτρεψε τον κυτταρικό θάνατο από το DC661 και βρίσκοντας ενδείξεις υπεροξείδωσης λιπιδίων από το C-11-BODIPY, πραγματοποιήσαμε συνολική ανάλυση λιπιδίων στις 2 και 4 ώρες μετά τη θεραπεία με DC661. Το DC661 προκάλεσε πρώιμες και διατήρησε 3- έως 10-πλάσιες αυξήσεις σε κάθε κατηγορία λυσοφωσφολιπιδίων (Εικόνα 5Α). Αντίθετα, ελάχιστες ή καθόλου αλλαγές παρατηρήθηκαν στις κατηγορίες φωσφολιπιδίων, συμπεριλαμβανομένης της φωσφατιδυλοχολίνης, της φωσφατιδυλαιθανολαμίνης, της φωσφατιδυλοσερίνης, της φωσφατιδυλινοσιτόλης, της φωσφατιδυλογλυκερόλης και του φωσφατιδικού οξέος (Συμπληρωματικό Σχήμα 7Α). Τα είδη λυσοφωσφολιπιδίων μπορούν να δημιουργηθούν από το ROS, το οποίο οξειδώνει την αλυσίδα κορεσμένων λιπαρών οξέων που στη συνέχεια αποκόπτεται από τις φωσφολιπάσες (20). Για να προσδιορίσουμε εάν τα αντιοξειδωτικά θα μπορούσαν να αποτρέψουν τη λιπιδική βλάβη που προκαλείται από το ROS, διερευνήσαμε την επαγόμενη από DC661-κυτταροτοξικότητα παρουσία της N-ακετυλοκυστεΐνης (NAC) σαρωτής pan-ROS (21, 22) και των πιθανών αναστολέων υπεροξείδωσης λιπιδίων Trolox (23 ) και βιταμίνη C (ασκορβικό οξύ) (24, 25). Σε αντίθεση με οποιονδήποτε από τους άλλους παράγοντες που έχουν δοκιμαστεί μέχρι στιγμής, η συν-θεραπεία με NAC διέσωσε το DC661-συσχέτισε κυτταροτοξικότητα σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές (Εικόνα 5Β και Συμπληρωματικό Σχήμα 7Β). Οι μακροπρόθεσμες αναλύσεις CFU έδειξαν ότι το NAC, σε αντίθεση με όλους τους αναστολείς κυτταρικού θανάτου, τα χηλικά ιόντα και τους αναστολείς καθεψίνης που δοκιμάστηκαν εδώ, απέτρεψαν τις κυτταροτοξικές επιδράσεις του DC661 στα κύτταρα A375P, RKO, MIA PaCa{30}}, B16F10 και MC38 ( Εικόνα 5Γ και Συμπληρωματικό Σχήμα 7Γ). Είναι ενδιαφέρον ότι το Trolox και η βιταμίνη C δεν διέσωσαν την κυτταροτοξικότητα του DC661 στο ανθρώπινο μελάνωμα, τον καρκίνο του παχέος εντέρου, τα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος και το μελάνωμα ποντικού και τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου (Εικόνα 5D και Συμπληρωματικό Σχήμα 7, D-H). Αυτή η διαφορά μας ώθησε να ελέγξουμε εάν το NAC, το Trolox και η βιταμίνη C επηρέασαν το LMP. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το NAC ήταν το μόνο αντιοξειδωτικό που μείωσε σημαντικά την επαγόμενη από το DC{39}LMP (Εικόνα 5Ε). Υποθέσαμε ότι το LLP οδηγεί την παραγωγή LMP από το DC661, το οποίο μπορεί να αναστραφεί από το NAC αλλά όχι από το Trolox και τη βιταμίνη C. Για να μελετήσουμε τη διαδικασία του LLP χρησιμοποιήσαμε τον ανιχνευτή φθορισμού FOAM-LPO (26), ο οποίος εντοπίζεται ειδικά στο λυσόσωμα και παράγει μια φασματική μετατόπιση από 586 σε 512 nm (κόκκινο σε πράσινο) όταν εκτίθεται σε υπεροξείδια λιπιδίων. Βρήκαμε ότι το DC661 προκάλεσε LLP σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικόνα 5ΣΤ). Το NAC μείωσε την υπεροξείδωση των λιπιδίων στα λυσοσώματα των κυττάρων μελανώματος που έλαβαν DC661-, ενώ το Trolox και η βιταμίνη C απέτυχαν να μειώσουν το LLP (Εικόνα 5F). Το NAC, το Trolox και η βιταμίνη C από μόνα τους δεν είχαν σημαντική επίδραση στην υπεροξείδωση των λιπιδίων. Η καταστροφή του PPT1 (Συμπληρωματικό Σχήμα 8Α) ή η θεραπεία με υψηλές συγκεντρώσεις HCQ (Συμπληρωματικό Σχήμα 8Β) προκάλεσε επίσης LMP που θα μπορούσε να αναστραφεί από το NAC, ενώ η χημική αναστολή του ULK1 δεν προκάλεσε LMP (Συμπληρωματικό Σχήμα 8C). Σημαντικά, το nockdown του siPPT1 περιελάμβανε επίσης LLP που θα μπορούσε να αντιστραφεί με NAC (Συμπληρωματικό Σχήμα 8D) Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αναστολή PPT1 προκαλεί LLP που μπορεί να διασωθεί από το NAC και είναι πιθανόν η αιτία του LMP που προκαλείται από την αναστολή PPT1-. Περαιτέρω, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το LLP είναι κρίσιμο για τον θάνατο των λυσοσωμικών κυττάρων.
Φυτό κινέζικου βότανο cistanche-Antitor
Η εισαγωγή κυστεΐνης στα λυσοσώματα από το MFSD12 μειώνει τον θάνατο των λυσοσωμικών κυττάρων. Από τους 3 αναστολείς υπεροξείδωσης λιπιδίων, μόνο το NAC εμπόδισε την LLP. Μια πρόσφατη αναφορά έδειξε ότι ο κύριος τομέας της υπεροικογένειας διευκολυντή που περιέχει το 12 (MFSD12) είναι βασικό συστατικό του εισαγωγέα κυστεΐνης για λυσοσώματα και μελανοσώματα (27). Σκεφτήκαμε ότι το NAC, ή ο μεταβολίτης του κυστεΐνη, μεταφέρεται στο λυσόσωμα μέσω του MFSD12, όπου η κυστεΐνη οξειδώνεται στο δισουλφίδιο της, την κυστεΐνη. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, συγκρίναμε την ικανότητα του NAC να διασώζει την κυτταροτοξικότητα του DC661 σε κύτταρα siNT και siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το NAC διέσωσε το DC{11}}προκάλεσε LMP σε κύτταρα siNT αλλά δεν διέσωσε το LMP σε κύτταρα siMFSD12 (Εικόνα 6Α). Το NAC μείωσε το LLP των κυττάρων siNT-A375P με DC{14}}αλλά όχι των κυττάρων siMFSD12. Τα κύτταρα siMFSD12 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή NAC είχαν αυξημένη βασική LLP (Εικόνα 6Β) σε σύγκριση με κύτταρα siNT. Ενώ το NAC διέσωσε την κυτταροτοξικότητα του DC661 σε κύτταρα siNT, η ικανότητα του NAC να διασώζει την κυτταροτοξικότητα του DC661 καταργήθηκε πλήρως στα κύτταρα siMSFD12 (Εικόνα 6C). Αυτό έδειξε ότι το knockdown MFSD12 μπλοκάρει τις κυτταροπροστατευτικές επιδράσεις του NAC έναντι του DC661. Το NAC αποακετυλιώνεται από την ακυλάση στο κυτοσόλιο (28). Για να προσδιορίσουμε εάν η θεραπεία με NAC παράγει συσσώρευση κυστεΐνης ή κυστίνης μέσα στα λυσοσώματα, χρησιμοποιήσαμε την τεχνική λυσοσωμικής ανοσοκατακρήμνισης (Lyso-IP) (29) για να καθαρίσουμε τα λυσοσώματα από κύτταρα A375P που έχουν υποστεί αγωγή με DMSO και NAC (Εικόνα 6D και Σχήμα 6D και Σχήμα 9A και Συμπληρωματικό) στοχευμένη μεταβολομική για τον ποσοτικό προσδιορισμό του NAC και των σχετικών μεταβολιτών. Όπως αναμενόταν, το NAC ανιχνεύθηκε σε κυτταρόλυμα ολόκληρων κυττάρων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με NAC και σε σχετικά μη δεσμευμένα κλάσματα. Τα επίπεδα L-κυστεΐνης αυξήθηκαν σημαντικά στα λυσοσώματα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με NAC. Η L-κυστίνη ήταν ανιχνεύσιμη μόνο σε λυσοσώματα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με NAC. Εντυπωσιακά, δεν βρήκαμε σημαντική αύξηση στη γλουταθειόνη (μειωμένη) στις ομάδες που έλαβαν NAC (Εικόνα 6Ε). Αυτό ήταν εκπληκτικό γιατί πιστεύεται κοινώς ότι η θεραπεία με NAC προκαλεί αυξημένη παραγωγή γλουταθειόνης, διορθώνοντας την ισορροπία οξειδοαναγωγής. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η κυστεΐνη που εισάγεται στα λυσοσώματα μέσω του εισαγωγέα MFSD12 είναι κρίσιμη για τη διάσωση του LLP, του LMP και του λυσοσωμικού κυτταρικού θανάτου. Το LLP είναι ανοσογονικό. Ορισμένες μορφές ρυθμισμένου κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από το DC661 (πυρόπτωση, νεκρόπτωση, φερρόπτωση) έχουν αναγνωριστεί ως ανοσογόνες. Προηγουμένως, ο ανοσογονικός κυτταρικός θάνατος έχει περιγραφεί για φάρμακα χημειοθεραπείας με βάση χαρακτηριστικά γνωρίσματα, τα οποία περιλαμβάνουν την εμφάνιση μοριακών μοτίβων που σχετίζονται με βλάβη, συμπεριλαμβανομένης της έκφρασης της κυτταρικής επιφάνειας του CALR και της απελευθέρωσης πρωτεΐνης HMGB1 και τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) (30). Το CALR δρα ως σήμα "eat-me" όταν εκτίθεται σε κυτταρικές επιφάνειες κατά τη διάρκεια του στρες των κυττάρων. Η εξωκυτταρική απελευθέρωση του HMGB1 και του ATP δρα ως σήμα "βρες με" που αναγνωρίζεται από τα φαγοκυτταρικά κύτταρα. Συγκρίναμε δύο μοντέλα: τα κύτταρα B16F10, τα οποία σε μοντέλα συγγενών όγκων στερούνται σχεδόν τελείως λεμφοκυττάρων που διεισδύουν στον όγκο και τα κύτταρα MC38, τα οποία σε μοντέλα συγγενών όγκων έχουν όντως λεμφοκύτταρα διείσδυσης όγκου. Πρώτον, δείξαμε ότι η θεραπεία με DC661 ή siPpt1 επάγει σημαντικά την επιφανειακή έκφραση CALR που μπορεί να ακυρωθεί πλήρως με τη συμθεραπεία NAC σε κύτταρα MC38 (Εικόνες 7, Α και Β). Παρόμοια ευρήματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα B16F10 (Εικόνα 7C). Οι αναστολείς των κύριων οδών κυτταρικού θανάτου (απόπτωση, νεκρόπτωση, φερρόπτωση και πυρόπτωση) απέτυχαν να αποτρέψουν την επιφανειακή έκφραση του CALR (Εικόνα 7D). Για να προσδιοριστεί εάν ο ανοσογονικός κυτταρικός θάνατος που προκαλείται από το DC661 οφείλεται σε ανοδική ρύθμιση MHC τάξης Ι, τα κύτταρα B16F10 και MC38 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DC661 (3 μΜ) ή DMSO για 24 ώρες. Βρήκαμε ότι η θεραπεία με DC661 δεν αύξησε την έκφραση της MHC τάξης Ι και την ανοδική ρύθμιση του ανοσοπρωτεασώματος (Εικόνα 7Ε και Συμπληρωματικό Σχήμα 9, Β και Γ).
Σχήμα 4. Η αναστολή της καθεψίνης ή η χηλίωσή του ασβεστίου δεν αποτρέπει τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από DC661-. (ΕΝΑ)
Για να κατανοήσουμε τα αποτελέσματα της αναστολής της αυτοφαγίας στην εκκίνηση των Τ κυττάρων, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα εκκίνησης και συγκαλλιέργειας in vitro χρησιμοποιώντας σπληνοκύτταρα C57BL6/J όπως περιγράφηκε προηγουμένως (31). Για εκκίνηση, εκθέσαμε σπληνοκύτταρα σε κύτταρα B16F10 ή MC38 που έχουν υποστεί επεξεργασία με DC661- ή DMSO. Στη συνέχεια, αυτά τα εκκινημένα σπληνοκύτταρα καλλιεργήθηκαν με ζωντανά κύτταρα B16F10 ή MC38 και μετρήθηκε η κυτταροτοξικότητα (Εικόνα 8Α). Σπληνοκύτταρα που εκκινήθηκαν με κύτταρα B16F10 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με DC661-παρήγαγαν σημαντική αύξηση στην IFN- σε σύγκριση με τα σπληνοκύτταρα που εκτέθηκαν σε κύτταρα B16F10 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO. Η θανάτωση πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων B16F10 με τη μεσολάβηση Τ-λεμφοκυττάρων αυξήθηκε σημαντικά σε σπληνοκύτταρα με DC661- σε σύγκριση με σπληνοκύτταρα που έχουν εκκινήσει με DMSO (Εικόνα 8, B και C). Κύτταρα MC38 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με DC661 παρήγαγαν ακόμη περισσότερη κυτταροτοξικότητα Τ-λεμφοκυττάρων με IFN και εκκίνηση σε σύγκριση με κύτταρα B16F10 (Εικόνα 8, D και Ε). Η συν-θεραπεία NAC με DC661 μπόρεσε να ακυρώσει πλήρως την απελευθέρωση IFN από τα σπληνοκύτταρα και να αμβλύνει την κυτταροτοξικότητα των Τ κυττάρων με εκκίνηση (Εικόνα 8, F και G). Η καταστροφή της καλρετικουλίνης από το siCalr σε κύτταρα MC38 (Συμπληρωματικό Σχήμα 9D) ακύρωσε την αποτελεσματικότητα εκκίνησης της θεραπείας με DC661 και μείωσε σημαντικά την κυτταροτοξικότητα των αρχικών Τ-κυττάρων (Εικόνα 8, Η και Ι). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν έναν μηχανιστικό ρόλο της σχετιζόμενης με το LLP ανοδικής ρύθμισης του CALR στην προώθηση της ανοσίας των Τ κυττάρων κατά των όγκων. Στη συνέχεια, επεκτείναμε αυτά τα in vitro ευρήματα σε μια in vivo μελέτη αντικαρκινικού εμβολιασμού σε μοντέλα ποντικών με ανοσοεπαρκή και ανοσοανεπάρκεια. Για αυτόν τον προσδιορισμό, in vitro κύτταρα B16F10 ή MC38 που είχαν αποψυχθεί με κατάψυξη ή DC{40}}με αγωγή με DC{40}}ενέθηκαν υποδορίως στο αριστερό πλευρό για να προστατεύσουν τα ανοσοεπαρκή ποντίκια C57BL/6 ή NOD/SCID έναντι εκ νέου πρόκλησης με ζωντανά κύτταρα όγκου του ίδιου είδους που ενέθηκαν 7 ημέρες αργότερα στη δεξιά πλευρά (Εικόνα 9Α). Τα κύτταρα B16F10 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με DC661-δεν κατάφεραν να αποτρέψουν την απόρριψη όγκου παρά τις in vitro δοκιμασίες, υποδηλώνοντας ότι το DC661 προκάλεσε ανοσογονικό κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 9Β και Συμπληρωματικό Σχήμα 9Ε). Αντίθετα, ο εμβολιασμός ενός πλευρού με κύτταρα MC38 που έχουν υποστεί αγωγή με DC661-προήγαγε την πλήρη απόρριψη ζωντανών κυττάρων MC38 που εμφυτεύτηκαν στην απέναντι πλευρά (Εικόνα 9C και Συμπληρωματικό Σχήμα 9F). Για να προσδιορίσουμε εάν η προσαρμοστική ανοσία ήταν κρίσιμη για την επίδραση του εμβολίου που φαινόταν να έχει το DC661 με τους όγκους MC38, επαναλάβαμε το πείραμα σε ποντικούς NOD/SCID. Εντυπωσιακά, διαπιστώσαμε ότι τα κύτταρα MC38 που έλαβαν DC661-δεν προκάλεσαν απόρριψη όγκων εκ νέου πρόκλησης σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς NOD/SCID (Εικόνα 9D και Συμπληρωματικό Σχήμα 9G), υποδεικνύοντας ότι απαιτείται προσαρμοστική ανοσία για το παρατηρούμενο αποτέλεσμα του εμβολίου. Για να ελέγξουμε την ευρωστία αυτού του ευρήματος, επιλέξαμε μια άλλη πολύ γνωστή ανοσογονική κυτταρική σειρά καρκίνου ποντικού, την CT26, και πραγματοποιήσαμε το πείραμα εμβολιασμού όπως παραπάνω. Όπως ήταν αναμενόμενο, η εμφύτευση των κυττάρων CT26 που έλαβαν DC661-στο ένα πλευρό του ποντικού παρήγαγε ένα αποτέλεσμα που μοιάζει με εμβόλιο και απέτρεψε την ανάπτυξη ζωντανών κυττάρων CT26 που εμφυτεύτηκαν στο άλλο πλευρό (Εικόνα 9Ε και Συμπληρωματικό Σχήμα 9Η). Τα ευρήματά μας πρότειναν ότι η επαγόμενη από DC661-LLP είναι κρίσιμη για τον ανοσογόνο κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από LMP, ο οποίος αναστρέφεται από την εισαγωγή κυστεΐνης στο λυσόσωμα από τον λυσοσωμικό μεταφορέα MFSD12 (Εικόνα 9F).
Συζήτηση
Η λυσοσωμική αναστολή φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση σε προκλινικές μελέτες και οι κλινικές δοκιμές HCQ έχουν δώσει ενθαρρυντικά αλλά ανάμεικτα αποτελέσματα (1, 32). Το PPT1 είναι ο μοριακός στόχος του HCQ και πιο ισχυροί αναστολείς PPT1, όπως ο DC661 (2) και ο GNS561 (3), επάγουν τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από LMP in vitro. Ο ακριβής μηχανισμός του θανάτου των λυσοσωμικών κυττάρων και ο ρόλος του στην ανοσογονικότητα του όγκου δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Η αντικαρκινική ανοσία ενισχύεται όταν η αναστολή της αυτοφαγίας συνδυάζεται με ανοσοθεραπεία (9, 10, 31). Οι προτεινόμενοι μηχανισμοί για την ενδοκυτταρική ανοσογονικότητα μετά την αναστολή της αυτοφαγίας περιλαμβάνουν την MHC τάξης Ι και την ανοδική ρύθμιση του ανοσοπρωτεασώματος, που αμφότερα υποστηρίζουν βελτιωμένη επεξεργασία και παρουσίαση αντιγόνου. Επιπλέον, απώλεια πρωτεϊνών αυτοφαγίας ή αναστολή αυτοφαγίας από την χλωροκίνη επαυξημένη απόκριση των CD{13}} Τ κυττάρων αυξάνοντας τα επιφανειακά επίπεδα MHC κατηγορίας Ι σε δενδριτικά κύτταρα (33). Δείξαμε προηγουμένως ότι η συστημική αναστολή PPT1 μπορεί να επαναπολώσει τα μακροφάγα από έναν φαινότυπο Μ2 σε Μ1. Οι αναστολείς PPT1 μπορούν να ενισχύσουν τα επίπεδα STING, οδηγώντας σε απελευθέρωση IFN και αύξηση της θανάτωσης που προκαλείται από Τ κύτταρα σε μοντέλα μελανώματος (31). Εδώ, δείξαμε ότι το ίδιο το LLP παράγει μια ενδογενή ανοσογονική μορφή κυτταρικού θανάτου από κύτταρα όγκου. Βρήκαμε ότι η λυσοσωμική αναστολή προκάλεσε πολύ λίγες πρωτεϊνικές αλλαγές στα καρκινικά κύτταρα και οι πιο σημαντικά αυξημένες πρωτεΐνες περιελάμβαναν υποδοχείς φορτίου αυτοφαγίας και ρυθμιστές απόπτωσης. Η προσέγγισή μας που στοχεύει ορισμένα από αυτά τα γονίδια σε όλες τις λειτουργίες έδειξε ότι οι πρωτεΐνες που προκαλούνται από φάρμακα δεν ήταν πιθανώς οι κύριοι ρυθμιστές του κυτταρικού θανάτου. Η γενετική αναστολή του ULK1 ή του ATG7 επίσης δεν διέσωσε την κυτταροτοξικότητα του DC661. Δείξαμε ότι η λυσοσωμική αναστολή ενεργοποιεί πολλαπλές μορφές προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, συμπεριλαμβανομένης της απόπτωσης, της νεκρόπτωσης, της φερρόπτωσης και της πυρόπτωσης, αλλά καθεμία από αυτές ήταν απαραίτητη για την επαγόμενη από φάρμακα κυτταροτοξικότητα. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι προγραμματισμένοι μηχανισμοί κυτταρικού θανάτου μπορούν να επικαλύπτονται και η συν-στόχευση μηχανισμών πολλαπλών κυτταρικού θανάτου θα μπορούσε να παρέχει κυτταροπροστασία έναντι του κυτταρικού θανάτου μετά από διαπερατότητα της λυσοσωμικής μεμβράνης. Η εργασία μας έχει αποκλείσει τους μηχανισμούς που εξαρτώνται από την καθεψίνη και το ασβέστιο για τον θάνατο των λυσοσωμικών κυττάρων και τονίζει τη σημασία του LLP ως κρίσιμου καθοριστικού παράγοντα του κυτταρικού θανάτου. Βρήκαμε στοιχεία LLP που ήταν αναστρέψιμη από ένα αντιοξειδωτικό που μεταφέρθηκε στο λυσόσωμα, το NAC και ήταν κρίσιμο για τη διαπερατότητα της λυσοσωμικής μεμβράνης και την κυτταροτοξικότητα. Το NAC ήταν ο μόνος παράγοντας ικανός να μετριάσει ή να αναστρέψει τον επαγόμενο από DC661-θάνατο των κυττάρων και αυτή η ικανότητα εξαρτιόταν από την παρουσία του λυσοσωμικού μεταφορέα κυστεΐνης MFSD12. Η έλλειψη λυσοσωμικής διείσδυσης είναι πιθανός γιατί άλλοι υποτιθέμενοι αναστολείς υπεροξείδωσης λιπιδίων, το Trolox και η βιταμίνη C, δεν μπόρεσαν να αποτρέψουν την κυτταροτοξικότητα του DC661. Το NAC μετατρέπεται σε κυστεΐνη, η οποία εισάγεται στα λυσοσώματα και οξειδώνεται στη δισουλφιδική της μορφή, την κυστίνη. Η κυστίνη εξάγεται στο κυτταρόπλασμα από έναν άλλο λυσοσωμικό μεταφορέα, την κυστίνωση, όπου ανάγεται σε κυστεΐνη που επανακινητοποιεί τις εσωτερικές πηγές θρεπτικών συστατικών, επανενεργοποιεί τον στόχο του συμπλέγματος ραπαμυκίνης 1 και προάγει την αυτοφαγία (34). Αυτός ο κύκλος μείωσης της οξείδωσης της κυστεΐνης σε κυστίνη (λυσοσώματα) και πίσω στην κυστεΐνη (κυτοσόλιο) θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός μηχανισμός διάσωσης του NAC έναντι της κυτταροτοξικότητας του DC661 ή γενικότερου λυσοσωμικού τραυματισμού σε άλλα πλαίσια ασθένειας όπου το NAC έχει αποδειχθεί χρήσιμο θεραπευτικά (35). . Το NAC όχι μόνο ανέστρεψε τα επαγόμενα από DC661-LLP και LMP, αλλά και μια επιφανειακή έκφραση του ανοσογονικού δείκτη κυτταρικού θανάτου καλρετικουλίνη. Η έκφραση της κυτταρικής επιφάνειας της πρωτεΐνης CALR απαιτήθηκε για την ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα με τη μεσολάβηση Τ-λεμφοκυττάρων που προκαλείται από σπληνοκύτταρα που έχουν εκκινήσει με DC, αποδεικνύοντας ότι η λυσοσωμική αναστολή παράγει μια συγκεκριμένη μορφή ενδοκυτταρικής ανοσογονικότητας.
Ενώ προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η λυσοσωμική αναστολή μπορεί να ενισχύσει την αντινεοπλασματική δραστηριότητα της αναστολής του ανοσοποιητικού σημείου ελέγχου σε εγκατεστημένους όγκους πλευρών (9, 31), η μελέτη μας είναι η πρώτη εν γνώσει μας που επιδεικνύει μια δράση παρόμοια με το εμβόλιο για όγκους MC38 αλλά όχι όγκους Β16 σε καρκινικά κύτταρα προεπεξεργασμένα με DC661 πριν από την εμφύτευση. Αυτό καταδεικνύει ότι ο θάνατος των λυσοσωμικών κυττάρων μπορεί να προκαλέσει ενδοκυτταρική ανοσογονικότητα, αλλά αυτές οι αλλαγές από μόνες τους δεν είναι αρκετές για να αντιστρέψουν ένα «άνοσο ψυχρό» μικροπεριβάλλον όγκου σε ένα «άνοσο θερμό» μικροπεριβάλλον όγκου. Οι προηγούμενες μελέτες μας σε μοντέλα μικροπεριβάλλοντος όγκου "άνοσο ψυχρού" B16 και BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 γενετικά τροποποιημένα μοντέλα ποντικιών (31) έδειξαν ότι η συστημική λυσοσωμική αναστολή παρήγαγε επιδράσεις σε μακροφάγα που σχετίζονται με όγκο και προερχόμενα από μυελοειδή κύτταρα ήταν επαρκή για να ενισχύσουν τα κύτταρα καταστολής την αποτελεσματικότητα της ανοσοθεραπείας. Μπορεί να συμβαίνει ότι η ενδοκυτταρική ανοσογονικότητα παίζει επίσης ρόλο σε αυτούς τους ανοσοψυχικούς όγκους που ανταποκρίνονται περισσότερο στο ICD μετά από λυσοσωμική αναστολή. Η επίδραση του εμβολίου της λυσοσωμικής αναστολής που παρατηρείται σε ένα ελεγχόμενο εργαστηριακό περιβάλλον μπορεί να μεταφραστεί ή να μην μεταφραστεί στην κλινική, αλλά θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί ορισμένοι ασθενείς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με dabrafenib, trametinib και HCQ στο μεταλλαγμένο μελάνωμα BRAF είχαν τόσο βαθύ και ανθεκτικό ανταποκρίνεται σε αυτό το σχήμα (32). Απαιτείται περαιτέρω μελέτη για να κατανοηθεί πώς η αναστολή PPT1 παράγει λυσοσωμικό ROS και υπεροξείδωση λιπιδίων. Η εξαρτώμενη από PPT{15}}ρύθμιση της V-ATPase και η λυσοσωμική οξίνιση δεν είναι επαρκής εξήγηση επειδή η βαφιλομυκίνη αναστέλλει την λυσοσωμική οξίνιση αλλά δεν παράγει LMP (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Οι συνέπειες αυτών των ευρημάτων υποδηλώνουν ότι οι λυσοσωμικοί αναστολείς που ενισχύουν την ενδογενή ανοσογονικότητα των κυττάρων όγκου μπορούν να συνδυαστούν ορθολογικά με θεραπείες που ενισχύουν την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων ή τη διήθηση στο μικροπεριβάλλον του όγκου, δίνοντας δυνητικά συνεργιστικά αποτελέσματα.
Εικόνα 5. Η Ν-ακετυλοκυστεΐνη αποτρέπει τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από DC661-. (ΕΝΑ)
Μέθοδοι
Κυτταρικής καλλιέργειας. Human A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185) και κυτταρικές γραμμές B16F10 (CRL-6475) ποντικιού αγοράστηκαν από την ATCC. Οι σειρές ανθρώπινων A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 και YUMM1.7 ποντικιού (WT, Gsdme EV και Gsdme KO1 και KO2) ελήφθησαν εσωτερικά. Τα κύτταρα MC38 και CT26 ποντικού παρέχονται από τον Andy Minn, University of Pennsylvania. FL5.12 και IL-3-εξαρτώμενα από Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) πρωτογενή κύτταρα μυελού των οστών ελήφθησαν από την Kathryn E. Wellen, Πανεπιστήμιο της Πενσυλβάνια. Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά Panc-1 (CRL{-1469, ATCC) παρασχέθηκε από τον Ben Z. Stanger, Πανεπιστήμιο της Πενσυλβάνια. Η κυτταρική σειρά YUMMER 1.7 ποντικού ελήφθη από το Xiaowei (George) Xu, Πανεπιστήμιο της Πενσυλβάνια. Όλες οι κυτταρικές σειρές ελέγχονταν για Mycoplasma ανά διετία από τις εγκαταστάσεις Core του Πανεπιστημίου της Πενσυλβάνια και επαληθεύτηκαν με τη χρήση επαναλαμβανόμενων δακτυλικών αποτυπωμάτων βραχείας σειράς από τον πυρήνα του Wistar Institute Genomics. Οι κυτταρικές σειρές A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 και Bax/Bak DKO καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, 11875). Οι κυτταρικές σειρές A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 και MC38 καλλιεργήθηκαν σε DMEM (Invitrogen, 11995). και YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV, και Gsdme ΚΟ1 και ΚΟ2) κύτταρα (15) καλλιεργήθηκαν σε DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Τα μέσα καλλιέργειας συμπληρώθηκαν με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (12306C, MilliporeSigma) και 1x αντιβιοτικό αντιμυκητιασικό διάλυμα (Gibco, 15140-122). Οι κυτταρικές σειρές FL5.12 και Bax/Bak DKO διατηρήθηκαν σε πλήρη μέσα RPMI συμπληρωμένα με 50 μΜ-μερκαπτοαιθανόλη (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) και 0,35 ng/mL και 3,5 ng /mL IL-3, αντίστοιχα. Οι κυτταρικές σειρές YUMMER1.7 και YUMM1.7 (WT, Gsdme EV και Gsdme KO) διατηρήθηκαν σε πλήρη μέσα συμπληρωμένα με 1× ΜΕΜ NEAA (Gibco, 11140-050). Τα κύτταρα WM35 και WM793 καλλιεργήθηκαν σε μέσο MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), που περιείχε 10% FBS σε μέσο 1× Leibovitz L-15 (Corning, 10-045-CV), 7,5% w/v διττανθρακικό νάτριο ( Corning, 25-035-CI), 1× αντιβιοτικό αντιμυκητιασικό διάλυμα (Gibco, 15140-122) και 5 ug/mL ινσουλίνης (MilliporeSigma, I0516). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 βαθμούς παρουσία 5% CO2. Χημικά και αντιδραστήρια. Τα χημικά προϊόντα που αγοράστηκαν περιελάμβαναν HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) και DC661 (Selleckchem, S8808). Το Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των κυττάρων για ασβέστιο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένας κατάλογος αντισωμάτων και αναστολέων παρέχεται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1 και στον Συμπληρωματικό Πίνακα 2.
Εικόνα 6. Το NAC αντιστρέφει το LLP με τρόπο εξαρτώμενο από το MFSD12-. (ΜΕΤΑ ΧΡΙΣΤΟΝ)
Εκχύλιση και πέψη πρωτεΐνης για ανάλυση υγρής χρωματογραφίας-διαδοχικής φασματομετρίας μάζας για πρωτεϊνική. {{0}}.7 × 106 κύτταρα μελανώματος A375P καλλιεργήθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας 60 mm. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO (μάρτυρας), DC661 (3 μM), HCQ (10 μΜ) ή HCQ (3{{7{{0}} μΜ) για 24 ώρες σε περίπου 5{{ 112}}% συρροή. Τα κατεψυγμένα κυτταρικά σφαιρίδια λύθηκαν με 50 mM Tris pH 7,4, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.15 mM PMSF, 1 μg/mL πεψστατίνης, και 1 ug/mL λευπεπτίνης. Τα διαυγασμένα λύματα (10 ug έκαστο) ηλεκτροφορήθηκαν 0,5 cm σε ένα πήκτωμα bis-tris που ακολουθήθηκε από στερέωση και χρώση με κολλοειδές Coomassie. Κάθε λωρίδα γέλης 0,5 cm αποκόπηκε, αποχρωματίστηκε, ανήχθηκε με τρις (2-καρβοξυαιθυλ) φωσφίνη, αλκυλιώθηκε με ιωδοακεταμίδιο και χωνεύτηκε με θρυψίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως (36). Τα προϊόντα πέψης (1 μg) αναλύθηκαν με υγρή χρωματογραφία-διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS) σε φασματόμετρο μάζας Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) σύμφωνα με ένα nanoAQUITY UPLC (Waters). Ο αναλυτικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε στήλη πεπτιδίου BEH C18 1,7 μm × 250 mm (Waters, 186003546) χρησιμοποιώντας μια 245-λεπτή βαθμίδα με 0,1% μυρμηκικό οξύ σε νερό (κινητή φάση Α) και ακετονιτρίλιο (κινητή φάση Β) ως εξής : 5%–30% B σε 225 λεπτά, 30%–80% B σε 5 λεπτά, 15-παραμονή λεπτών στο 80% B και επιστροφή στις αρχικές συνθήκες. Τα πλήρη φάσματα MS αποκτήθηκαν σε ανάλυση 70,000, με εύρος σάρωσης 400–2,000 m/z, στόχο αυτόματου ελέγχου κέρδους 3 × 106 ιόντα και μέγιστο χρόνο έγχυσης 50 χιλιοστά του δευτερολέπτου. Τα εξαρτώμενα από δεδομένα φάσματα MS2 αποκτήθηκαν για τα κορυφαία 20 πιο άφθονα ιόντα σε ανάλυση 17.500, με πλάτος απομόνωσης 1,5 m/z, στόχο αυτόματου ελέγχου κέρδους 5 × 104 ιόντα και μέγιστο χρόνο έγχυσης 50 χιλιοστά του δευτερολέπτου. Το ταίριασμα πεπτιδίου ορίστηκε ως προτιμώμενο, και τα μη εκχωρημένα και μεμονωμένα φορτισμένα ιόντα απορρίφθηκαν (37). Τα ακατέργαστα δεδομένα MS αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) με βάση δεδομένων ανθρώπινης αλληλουχίας Uniprot (πρόσβαση στις 10 Οκτωβρίου 2019) και μια βάση δεδομένων κοινών ρύπων, συμπεριλαμβανομένων θρυψίνης, κερατινών, πρωτεϊνών βοοειδών, και μυκόπλασμα (38). Στην αναζήτηση χρησιμοποιήθηκαν εξειδίκευση τρυπτικού πεπτιδίου με μέγιστο 2 χαμένες διασπάσεις, σταθερή τροποποίηση στην κυστεΐνη (καρβαμιδομεθυλίωση) και μεταβλητή οξείδωση μεθειονίνης ή Ν-τελική ακετυλίωση (39). Χρησιμοποιήθηκε αποκοπή 1% FDR για πεπτίδια και πρωτεΐνες. Η αντιστοίχιση μεταξύ διαδρομών ενεργοποιήθηκε. Οι πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτικοποίηση χωρίς επισήμανση (40). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Perseus 1.6.2.3 (https:// maxquant.net/perseus/) (41, 42). Οι πρωτεΐνες απαιτούνταν να ταυτοποιούνται από τουλάχιστον 3 μοναδικά πεπτίδια και να έχουν 3 έγκυρες τιμές (μη μηδενική ποσοτικοποίηση) σε μια ομάδα δειγμάτων και οι προσμείξεις και οι αντίστροφες πρωτεΐνες φιλτράρονταν από το σύνολο δεδομένων. Οι τιμές που λείπουν καταλογίστηκαν από μια κανονική κατανομή. Διεξήχθησαν κατά ζεύγη συγκρίσεις μεταξύ των συνθηκών σε επίπεδο πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας ένα 2-τεστ Student's t-test με βάση μετάθεσης FDR με s0=0.1 και 250 τυχαιοποιήσεις. Οι σημαντικές αλλαγές ορίστηκαν ως FDR μικρότερη από 5% και μια αλλαγή απόλυτης πτυχής μεγαλύτερη από 1,5 ή 2,0, όπως καθορίζεται. Lyso-IP. Τα κύτταρα A375P μολύνθηκαν με φακοϊό pLJC{5-Tmem192-3xHA και επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 1 mg/mL πουρομυκίνης (MilliporeSigma, P4512). Περίπου 3 χ 106 σημασμένα με ΗΑ κύτταρα A375P υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 10 mM NAC είτε με υδατικό έλεγχο φορέα για 24 ώρες σε συνθήκες καλλιέργειας που περιγράφηκαν προηγουμένως. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS, συλλέχθηκαν σε 0,5 mL ψυχρό KPBS και ομογενοποιήθηκαν ήπια χρησιμοποιώντας 20 κινήσεις σε ομογενοποιητή Dounce 2 mL. Περίπου το 2,5% του ομογενοποιήματος φυλάχθηκε για ανάλυση προϊόντος λύσης ολόκληρων κυττάρων και το υπόλοιπο φυγοκεντρήθηκε στα 3,000g για 2 λεπτά στους 4 βαθμούς για να αφαιρεθούν τα υπολείμματα της κυτταρικής μεμβράνης. Το ομογενοποιημένο υπερκείμενο στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε καθαρό σωληνάριο 1,5 mL και επωάστηκε με σφαιρίδια αντι-ΗΑ 50 μL (Pierce, 88836) ή σφαιρίδια αντι-DDK/Flag (OriGene, TA150042) για 15 λεπτά στους 4 βαθμούς. Στη συνέχεια, τα δείγματα κατακρημνίστηκαν με την τοποθέτηση σωλήνων σε DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) και ανακινήθηκαν απαλά για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπερκείμενο φυλάχθηκε για ανάλυση μη δεσμευμένου κλάσματος. Το IP πλύθηκε 3 φορές με KPBS που περιείχε 8 mM CaCl2. Το Lyso-IP εκχυλίστηκε σε 80% MeOH για μεταβολομική ανάλυση. Εκχύλιση και ανάλυση λιπιδίων με χρήση LC-MS/MS για σφαιρικό λιπίδιο. Κύτταρα μελανώματος Α375Ρ σπάρθηκαν σε δίσκους 60 mm σε 0,7 χ 106 κύτταρα ανά τρυβλίο. Όταν τα κύτταρα ήταν σε περίπου 50% συρροή, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (μάρτυρας), DC661 (3 μΜ) ή HCQ (30 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν 2 φορές με HBSS, ξύστηκαν σε παγωμένη μεθανόλη και μεταφέρθηκαν σε γυάλινους σωλήνες για εκχύλιση λιπιδίων με χλωροφόρμιο/μεθανόλη/0,88% NaCl (2:1:1) που περιείχε ένα εσωτερικό πρότυπο λιπιδίου EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Τα δείγματα στροβιλίστηκαν και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε υδατόλουτρο για 5 λεπτά σε πάγο. Μετά από φυγοκέντρηση στα 500 g για 15 λεπτά στους 40 βαθμούς, η κατώτερη φάση μεταφέρθηκε σε άλλο γυάλινο σωλήνα. Η ανώτερη φάση επανεκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας μια συνθετική κατώτερη φάση. Μετά την υπερήχηση και τη φυγοκέντρηση, η κατώτερη φάση συνδυάστηκε με την πρώτη συλλογή κατώτερης φάσης. Τα δείγματα ξηράνθηκαν υπό άζωτο, επαναιωρήθηκαν σε 10% χλωροφόρμιο/90% μεθανόλη και μεταφέρθηκαν σε γυάλινα φιαλίδια LTQ. Τα δείγματα λιπιδίων αναλύθηκαν σε φασματόμετρο μάζας Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X και σύστημα Vanquish Horizon UHPLC. Ο αναλυτικός διαχωρισμός χρησιμοποίησε στήλη Accucore C30 (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) με 50:50 ακετονιτρίλιο/νερό και 88:10:2 ισοπροπανόλη/ακετονιτρίλιο/νερό, που το καθένα περιείχε 5 mM μυρμηκικό αμμώνιο και 0,1% μυρμηκικό οξύ. Τα δεδομένα LC-MS/MS ελήφθησαν ξεχωριστά σε θετική και αρνητική πολικότητα με τις ακόλουθες παραμέτρους οργάνου: MS1 scan 120,000 ανάλυση. MS2 που εξαρτάται από δεδομένα στα κορυφαία 20 πιο άφθονα ιόντα σε ανάλυση 15,000. Πλάτος απομόνωσης 0,4 m/z. και μια κλιμακωτή κανονικοποιημένη ενέργεια σύγκρουσης 20:30:40 (43).
Εικόνα 7. Η Ν-ακετυλοκυστεΐνη αποτρέπει την επαγόμενη από DC661-επιφανειακή έκφραση της καλρετικουλίνης. (ΕΝΑ Δ)
Τα λιπίδια ταυτοποιήθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Τα ταυτοποιημένα είδη λιπιδίων διηθήθηκαν με αναμενόμενα προϊόντα προσθήκης και βαθμό ταυτοποίησης με βάση την κατηγορία. Οι περιοχές αιχμής κανονικοποιήθηκαν στα πρότυπα EquiSPLASH για υποστηριζόμενες κατηγορίες και κανονικοποιήθηκαν περαιτέρω με βάση τη συνολική επιφάνεια για κάθε δείγμα για διόρθωση για διακύμανση στον αριθμό των κυττάρων. Πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση σε δεδομένα μετασχηματισμένα με λογαριθμικό έλεγχο χρησιμοποιώντας το Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Εκχύλιση και ανάλυση μεταβολίτη με χρήση LC-MS/MS για το metabalone. Οι πολικοί μεταβολίτες εξήχθησαν από ολόκληρα κύτταρα, κλάσματα που δεν δεσμεύτηκαν με Lyso-IP και δείγματα δεσμευμένα με Lyso-IP χρησιμοποιώντας 80% μεθανόλη και αποθηκεύτηκαν στους -8{{30}} βαθμούς πριν από την υγρή χρωματογραφία –ανάλυση φασματομετρίας μάζας (LC-MS). Τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν με LC-MS χρησιμοποιώντας φασματόμετρο μάζας Thermo Scientific Q-Exactive HF-X με ανιχνευτή HESI II σε ευθυγράμμιση με σύστημα Thermo Vanquish Horizon UHPLC. Ο διαχωρισμός LC πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας στήλη ZIC-HILIC (2,1 mm × 150 mm, μέγεθος σωματιδίων 5 μm, EMD Millipore) με προστατευτική στήλη ZIC-HILIC (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore) που κρατήθηκε στις 45 μοίρες με ρυθμό ροής 0,2 mL/min. Η χρωματογραφία πραγματοποιήθηκε υπό όξινες συνθήκες για να μειωθεί η αντιδραστικότητα των ομάδων θειόλης. Η κινητή φάση Α ήταν νερό και το Β ήταν ακετονιτρίλιο, και τα δύο περιείχαν 0,1% μυρμηκικό οξύ. Η βαθμίδα LC ήταν 85% Β για 2 λεπτά, 85% Β έως 20% Β για 15 λεπτά, 20% Β έως 85% Β για 0,1 λεπτά και 85% Β για 8,9 λεπτά. Η αυτόματη δειγματοληψία διατηρήθηκε στους 4 βαθμούς και 4 μL από κάθε δείγμα εγχύθηκαν ανά ανάλυση. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες παράμετροι MS: ρυθμός ροής αερίου περιβλήματος, 40 AU; βοηθητικός ρυθμός ροής αερίου, 10 AU; Ρυθμός ροής αερίου σάρωσης, 2 AU; Θερμοκρασία βοηθητικού θερμαντήρα αερίου, 350 μοίρες ; Τάση ψεκασμού, 3,75 kV για θετική λειτουργία και 3,5 kV για αρνητική λειτουργία. τριχοειδική θερμοκρασία, 375 βαθμοί ; και επίπεδο RF χοάνης, 40%. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν με πλήρη MS με εναλλαγή πολικότητας. Ελήφθησαν σαρώσεις πλήρους MS από 65 έως 975 m/z σε ανάλυση 120000 με στόχο αυτόματου ελέγχου κέρδους 1 × 106 ιόντα και μέγιστο χρόνο έγχυσης 100 χιλιοστά του δευτερολέπτου. Τα ακατέργαστα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Οι στοχευόμενοι μεταβολίτες αναγνωρίστηκαν με ακριβή μάζα και χρόνο κατακράτησης στην προτιμώμενη πολικότητα τους με βάση αναλυτικά πρότυπα. Η ανίχνευση αιχμής χρησιμοποίησε τον αλγόριθμο ICIS με εξομάλυνση 1. Πραγματοποιήθηκε σχετική ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας μια ολοκληρωμένη περιοχή κορυφής και αυτές οι τιμές διορθώθηκαν στο συνολικό ποσό ανά δείγμα (που ορίζεται ως το συνολικό εμβαδόν κορυφής). PPT{66}}Επεξεργασία CRISPR/Cas9. Α375P PPT1-μη-στόχοι και ΚΟ κύτταρα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (44). Το pSpCas9(BB)-2Το A-Puro (PX459) ήταν ένα δώρο από τον Feng Zhang (πλασμίδιο Addgene, 48139). Τα ολιγονουκλεοτίδια οδηγού RNA (IDT) συγκολλήθηκαν, φωσφορυλιώθηκαν και στη συνέχεια απολινώθηκαν σε χωνεμένο και αποφωσφορυλιωμένο με BbsI πλασμίδιο pX459 ακολουθώντας τα εργαστηριακά πρωτόκολλα Zhang, διαθέσιμα μέσω του Addgene. Τα συνδεδεμένα πλασμίδια μετασχηματίστηκαν σε κύτταρα Stbl3 (Invitrogen). Ο προσδιορισμός αλληλουχίας των παρασκευασμάτων πλασμιδίου επιβεβαίωσε την παρουσία των επιθυμητών αλληλουχιών οδηγών RNA. Τα κύτταρα A375P επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), ακολουθούμενη από επιλογή πουρομυκίνης. Οι δοκιμές επιθεωρητή επιβεβαίωσαν την επεξεργασία του γονιδίου PPT1 από το CRISPR/Cas9 και η μείωση της PPT1 επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western με αντίσωμα PPT1 (Origene). Οι αλληλουχίες για τα ολιγονουκλεοτίδια οδηγού RNA είναι οι εξής: μη στοχευόμενος οδηγός RNA προς τα εμπρός (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGGCGT), μη στοχευόμενος οδηγός RNA αντίστροφα (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), ανθρώπινος οδηγός PPT1 RNA 1 προς τα εμπρός (CACCGTTTGGACTCCTCGATGATGAGTCGTCGT, ανθρώπινος PPT1 οδηγός RNA 3 προς τα εμπρός (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC), και το ανθρώπινο PPT1 οδηγό RNA 3 αντίστροφα (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Οι κλώνοι που αναπτύχθηκαν από μεμονωμένα κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτό το έγγραφο περιλαμβάνουν τα ακόλουθα: ο κλώνος C8 είναι ο ανθρώπινος οδηγός 1 και ο κλώνος Β5 είναι ο ανθρώπινος οδηγός 3. Ανοσοκηλίδωση. Ένα εκατομμύριο κύτταρα επιστρώθηκαν σε ένα τρυβλίο 10 cm και οι θεραπείες δόθηκαν την επόμενη μέρα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με απόξεση. Τα προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό λύσης SDS. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30-50 ug πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκαν για SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Bio-Rad, 1620177). Η μεμβράνη αποκλείστηκε χρησιμοποιώντας 5% BSA ή 5% αποβουτυρωμένο γάλα, σύμφωνα με βελτιστοποιημένες συνθήκες, και επωάστηκε με πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Οι μεμβράνες PVDF πλύθηκαν με 1× TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS{111}}) και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με HRP ειδικού είδους. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν και αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας υπόστρωμα Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) και μεμβράνες αυτοραδιογραφίας (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Για μελέτες πυρόπτωσης, τα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Μετά τον αποκλεισμό σε 5% BSA, οι μεμβράνες PVDF επωάστηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς, πλύθηκαν σε PBS/Tween και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση. Η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με HRP (CalBioTech), ένα υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (Thermo Fisher Scientific) και ένα σύστημα απεικόνισης ChemicDoc MP (Bio-Rad). Για πειράματα που περιλαμβάνουν υπερκείμενο, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο χωρίς FBS για να αποφευχθεί η παραμόρφωση του SDS-PAGE. Τα υπερκείμενα των κυττάρων συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα 500 g στους 4 βαθμούς για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα. Τα προκύπτοντα υπερκείμενα συμπυκνώθηκαν 10 χ χρησιμοποιώντας Amicon Ultra 10Κ (MilliporeSigma) με φυγοκέντρηση για 30 λεπτά στα 4.500 g στους 4 βαθμούς. Τα συμπυκνώματα αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος και αναλύθηκαν με στύπωμα Western όπως περιγράφεται παραπάνω. Η χρώση με πρωτεϊνική γέλη πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας χρώση ερυθρού Ponceau. Δοκιμασία δραστικότητας LMP και καθεψίνης L. Το ανθρώπινο πλασμίδιο pEGFP-hGal3 ήταν δώρο από την Tamotsu Yoshimori (πλασμίδιο Addgene, 73080) και χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία της σειράς A375P-Galectin-3. Η ραχοκοκαλιά του πλασμιδικού φορέα ελέγχου pEGFP-C1 αγοράστηκε (novo prolabs, V012024). Τα πλασμίδια επιμολύνθηκαν (1 μg/mL) σε κύτταρα Α375Ρ χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν σταθερά χρησιμοποιώντας G418 (Gibco, 10131035). Για το LMP, μετρήθηκαν συνολικά 25 κελιά A375P-galectin-3 σε πολλαπλά πεδία εικόνας. Το ποσοστό των θετικών κυττάρων υπολογίστηκε σε κάθε πεδίο ξεχωριστά και ένα μέσο ποσοστό υπολογίστηκε για κάθε ομάδα. Το κιτ δοκιμασίας Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα απεικονίστηκαν κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο Zeiss Axio Observer 7. Η ολοκληρωμένη ακατέργαστη ένταση του Magic Red υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Fiji - ImageJ (NIH). Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων ΜΤΤ (3-[4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ]{-2, βρωμιούχο 5 διφαινυλ τετραζόλιο). 2.000 κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας φρεατίου 96-και πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις MTT 3-ημέρας χρησιμοποιώντας το κιτ βιωσιμότητας κυττάρων (Roche, 11465007001) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Δόθηκε προκατεργασία με αναστολέα για 1 ώρα, ακολουθούμενη από συνεπεξεργασία των κυττάρων με αναστολείς με ή χωρίς DC661. Για τον υπολογισμό του IC50 χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος μη γραμμικής παλινδρόμησης (καμπύλη προσαρμογής).
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity
【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Δοκιμασία σχηματισμού αποικιών. 2,000 κύτταρα ανά φρεάτιο σπάρθηκαν σε 6-πλάκα φρεατίου και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία την επόμενη μέρα. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν υπό την αγωγή για συνολικά 8 ημέρες. Οι αποικίες που σχηματίστηκαν σε κάθε φρεάτιο πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή μεθανόλη στους -20 βαθμούς για 20 λεπτά και χρωματίστηκαν με υδατικό διάλυμα Crystal violet 0,5% (V5265, MilliporeSigma).
Δοκιμασία αποκλεισμού βαφής μπλε τρυπανίου. Το μίγμα αντίδρασης για τη δοκιμασία Trypan blue παρασκευάστηκε με ανάμειξη 1 μέρους 0.4% Trypan blue (25- 900-CI, Corning) και 1 μέρους δειγμάτων αραιωμένων κυττάρων. Το μίγμα επωάστηκε για 1 λεπτό και τα κύτταρα μετρήθηκαν στο Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).
Εικόνα 8. Η επαγόμενη από DC661-επιφανειακή έκφραση της καλρετικουλίνης εκκινεί τα Τ κύτταρα έναντι των καρκινικών κυττάρων. (ΕΝΑ)
Εικόνα 9. Ο ενοφθαλμισμός κυττάρων που έχουν υποστεί αγωγή με DC661- προκαλεί απόρριψη όγκου σε συγκεκριμένα πλαίσια. (ΕΝΑ)
FOAM-LPO. Το LLP μελετήθηκε χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή φθορισμού, FOAMLPO. Ο FOAM-LPO συντέθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (26). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μSlide 8 φρεατίων (ibid, 80807) και υποβλήθηκαν σε αγωγή με αναστολείς και με ή χωρίς DC661. Τα κύτταρα επωάστηκαν με μέσα που περιείχαν FOAM-LPO (1 Μ) σε ατμόσφαιρα 5% CO2 και 95% αέρα για 5 λεπτά στους 37 βαθμούς. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με μέσο και στη συνέχεια τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο (ανεστραμμένο μικροσκόπιο Zeiss Axio Observer 7) για την ανίχνευση μετατόπισης φθορισμού από 586 σε 512 nm σε απόκριση στο LLP. qRT-PCR και εκκινητές. Τα κύτταρα A375P (3 × 105) καλλιεργήθηκαν σε δίσκους 60 mm και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή DC661 (3 μΜ) για 24 ώρες. Το ολικό RNA απομονώθηκε με κιτ απομόνωσης RNA (QIAGEN, 74134) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας κιτ Αντίστροφης Μεταγραφάσης iScript με 500 ng καθαρισμένου RNA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Thermo Scientific, Κ1642). Η αντίδραση qPCR ρυθμίστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) που περιέχει 1 μL cDNA. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και το BACTIN χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο για τους υπολογισμούς ΔCT. Η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης έγινε χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: PTGS2/COX-2 προς τα εμπρός (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 αντίστροφα (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS προς τα εμπρός (CTGGACTACTACCAGCAACACGA), CARSACGACTAGAGAGAGATG, CACTACGAGAGAGATG, ανάστροφα, CARS (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 ανάποδα (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN προς τα εμπρός (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) και BACTIN αντίστροφα (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).
επιμόλυνση siRNA. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες γενετικής εξουδετέρωσης για ανθρώπινες ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 και MFSD12 σε κυτταρικές σειρές A375P. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες γενετικής αναστολής για Ppt1 και Calreticulin ποντικού σε κύτταρα MC38. Μη στοχευόμενο siRNA (sc{{1{0}}), ανθρώπινο ULK1 (sc{-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{2{0}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc{-97888), ποντίκι Ppt1/Cln1 (sc{-142398) και Calreticulin Τα /Calregulin (sc-29895) siRNA αγοράστηκαν από τη Santa Cruz Biotechnology. Αυτά τα siRNA αποτελούνται από δεξαμενές 3-5 siRNA ειδικά για στόχους. Κυτταρομετρία ροής. Η επαγωγή φερρόπτωσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Τα κύτταρα A375P σπάρθηκαν σε 6-πλάκα φρεατίου και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, φερροστατίνη{{40}} (10 μΜ), ροξστατίνη χειλιών-1 (2 μΜ), ελαστίνη (5 μΜ ), DC661 (3 μΜ), ή συνδυασμός για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 300 g για 5 λεπτά. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) που περιείχε 1 μM C11-BODIPY και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 15 λεπτά. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 500 μL 1X HBSS και η ένταση φθορισμού μετρήθηκε σε κυτταρόμετρο BD LSRII χρησιμοποιώντας 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης της καλρετικουλίνης στην κυτταρική επιφάνεια για ανοσογονικό κυτταρικό θάνατο πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως (45) με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα B16F10 ή MC38 καλλιεργήθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με NAC (10 mM) ή DC661 (3 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα MC38 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siPpt1 ή siNT για 48 ώρες παρουσία ή απουσία 10 mM NAC για 24 ώρες. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντίσωμα CALR (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 κατσικίσιο κατά κουνελιού δεύτερο αντίσωμα (Invitrogen) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (Biolegend, 421301). Τα χρωματισμένα δείγματα ελήφθησαν σε ένα κυτταρόμετρο ροής BD LSRII χρησιμοποιώντας 710/50 Μπλε και 670/30 Κόκκινο για τη σύλληψη του φθορισμού PI και CALR, αντίστοιχα (εγκατάσταση Flow Core του Πανεπιστημίου της Πενσυλβάνια) και η ανάλυση περιορίστηκε σε κύτταρα θετικά σε CALR και PI-αρνητικά για την αποφυγή ψευδώς θετικών γεγονότων. Εκκίνηση Τ κυττάρων και ποσοστό κυτταροτοξικότητας. Τα καρκινικά κύτταρα B16 ή MC38 (5 × 104) καλλιεργήθηκαν και υποβλήθηκαν σε αγωγή με NAC (10 mM) ή DC661 (1 μΜ ή 3 μΜ), αντίστοιχα, για 24 ώρες. Για τη γενετική αναστολή Calr, τα κύτταρα MC38 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Calr siRNA ή μη στόχο siRNA (siNT) για 48 ώρες, ακολουθούμενη από θεραπεία είτε με DMSO είτε με 3 μΜ DC661 για 24 ώρες. Τα σπληνοκύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν με DC661 με ή χωρίς κύτταρα Β16 ή MC38 παρουσία IL{102}} (5 IU/mL) και συγκαλλιεργήθηκαν για 72 ώρες. Η εκκίνηση επιβεβαιώθηκε με IFN-ELISA (Biolegen, 430815) του υπερκειμένου. Τα εκκινημένα σπληνοκύτταρα στη συνέχεια συγκαλλιεργήθηκαν με πρόσφατα καλλιεργημένα κύτταρα Β16 ή MC38 με αναλογίες στόχου προς δράστη (Β16 ή MC38 προς σπληνοκύτταρα) 1:20 και 1:50 για κύτταρα Β16 και MC38, αντίστοιχα. Η απελευθέρωση LDH που σχετίζεται με τον θάνατο των κυττάρων B16 ή MC38 και στη συνέχεια η ποσοστιαία κυτταροτοξικότητα μετρήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (MiliporeSigma, 4744926001) (31). Δοκιμασίες αντικαρκινικού εμβολιασμού και μελέτες χημειοθεραπείας με καθιερωμένα μοντέλα καρκίνου. Θηλυκά ποντίκια WT C57BL/6, NOD/SCID και BALB/c ηλικίας έξι έως οκτώ εβδομάδων λήφθηκαν από το The Jackson Laboratory. Για πειράματα αντικαρκινικού εμβολιασμού, τα κύτταρα WT B16F10, MC38 και CT26 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DC661 (3 μΜ) για 36 ώρες σε φιάλες των 175 cm2. Στη συνέχεια, τα υπερκείμενα και τα αποκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ένα σωληνάριο Falcon 50 mL. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και πλύθηκαν με παγωμένο PBS. Για εμβολιασμό, 150 μL κυτταρικό εναιώρημα εγχύθηκε στο αριστερό πλευρό ανοσοεπαρκών ποντικών C57BL/6, ποντικών με ανοσοανεπάρκεια NOD/SCID (1,8 × 104 κύτταρα B16F10, 1,5 × 106 MC38 κύτταρα ανά ποντίκι (AL3.B0) ή συγγενικά × 106 κύτταρα CT26 ανά ποντίκι). Κύτταρα που έχουν αποψυχθεί με κατάψυξη που επαναιωρήθηκαν σε PBS εγχύθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Μία εβδομάδα αργότερα, ζωντανά καρκινικά κύτταρα των ίδιων τύπων (3 × 104 κύτταρα B16F10, 2 × 105 κύτταρα MC38 ή 5 × 105 κύτταρα CT26 ανά ποντίκι) με ίσο όγκο Matrigel (Corning, 354248) εγχύθηκαν στη δεξιά πλευρά εμβολιασμένων ποντικών. Οι όγκοι μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικά παχύμετρα και ο όγκος υπολογίστηκε ως L × W2 × 0,5. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθούνταν τακτικά για τις επόμενες ημέρες και η απουσία όγκων θεωρήθηκε ως ένδειξη αποτελεσματικού αντικαρκινικού εμβολιασμού. Επανελήφθησαν μελέτες εμβολιασμού DC661-MC38 σε ποντικούς NOD/SCID. Στατιστική. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με τη χρήση του Student's unpaired, 2-τεστ ουράς t κατά τη σύγκριση 2 ομάδων. Το τεστ ANOVA 1-τρόπου χρησιμοποιήθηκε όταν συγκρίθηκαν περισσότερες από 2 ομάδες. Μια μηδενική υπόθεση απορρίφθηκε σημαντικά εάν η τιμή P ήταν μικρότερη από 0,05. Τα δεδομένα εμφανίζονται ως μέσος όρος ± SEM. Έγκριση μελέτης. Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου της Πενσυλβάνια.
Φυτό κινέζικου βότανο cistanche-Antitor
βιβλιογραφικές αναφορές
1. Zeh HJ, et αϊ. Μια τυχαιοποιημένη προεγχειρητική μελέτη φάσης ΙΙ της αναστολής της αυτοφαγίας με υψηλή δόση υδροξυχλωροκίνης και γεμσιταβίνης/Nab-πακλιταξέλης σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.
2. Rebecca VW, et al. Το PPT1 προάγει την ανάπτυξη του όγκου και είναι ο μοριακός στόχος των παραγώγων χλωροκίνης στον καρκίνο. Cancer Discov. 2019; 9 (2): 220–229.
3. Brun S, et al. GNS561, ένας νέος αναστολέας αυτοφαγίας ενεργός κατά των καρκινικών βλαστοκυττάρων στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και ηπατική μετάσταση από καρκίνο του παχέος εντέρου. J Καρκίνος. 2021; 12(18):5432–5438.
4. Brun S, et al. Το GNS561, ένας αναστολέας PPT1 κλινικού σταδίου, είναι αποτελεσματικός κατά του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος μέσω της τροποποίησης των λυσοσωμικών λειτουργιών. Αυτοφαγία. 2022;18(3):678–694.
5. Oberle C, et αϊ. Η διαπερατότητα της λυσοσωμικής μεμβράνης και η απελευθέρωση καθεψίνης είναι ένα εξαρτώμενο από το Bax/Bak, ενισχυτικό συμβάν απόπτωσης σε ινοβλάστες και μονοκύτταρα. Διαφέρει ο κυτταρικός θάνατος. 2010, 17(7):1167–1178.
6. Boya P, Kroemer G. Lysosomal membrane permeabilization in cell death. Ογκογόνο. 2008;27(50):6434–6451.
7. Rebecca VW, et al. Μια ενοποιημένη προσέγγιση για τη στόχευση των ρόλων αποδόμησης και σηματοδότησης ανάπτυξης του λυσοσώματος. Cancer Discov. 2017;7(11):1266–1283.
8. Tang R, et αϊ. Ferroptosis, necroptosis και pyroptosis στην αντικαρκινική ανοσία. J Hematol Oncol. 2020; 13(1):110.
9. Yamamoto K, et al. Η αυτοφαγία προάγει την ανοσολογική διαφυγή του καρκίνου του παγκρέατος με την υποβάθμιση του MHCI. Φύση. 2020;581(7806):100–105.
10. Deng J, et al. Η αναστολή του ULK1 υπερνικά τη διακυβευμένη παρουσίαση αντιγόνου και αποκαθιστά την αντικαρκινική ανοσία στον μεταλλαγμένο καρκίνο του πνεύμονα LKB1. Nat Cancer. 2021; 2 (5): 503-514.
11. Λαζάρου Μ, κ.ά. Η κινάση ουβικιτίνης PINK1 στρατολογεί υποδοχείς αυτοφαγίας για να προκαλέσει μιτοφαγία. Φύση. 2015;524(7565):309–314.
12. Choi YB, et al. Το TAX1BP1 περιορίζει την απόπτωση που προκαλείται από τον ιό διευκολύνοντας την υποβάθμιση του μιτοχονδριακού προσαρμογέα MAVS που προκαλείται από κνησμό. ΜοΙ Cell ΒίοΙ. 2017;37(1):e00422-16.
13. Rikka S, et al. Το Bnip3 βλάπτει τη βιοενέργεια των μιτοχονδρίων και διεγείρει τον κύκλο εργασιών των μιτοχονδρίων. Διαφέρει ο κυτταρικός θάνατος. 2011; 18 (4): 721–731.
14. Leu JI, et αϊ. Μηχανιστική βάση για εξασθενημένη φερρόπτωση σε κύτταρα που εκφράζουν την αφρικανοκεντρική παραλλαγή S47 του p53. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.
15. Erkes DA, et al. Οι μεταλλαγμένοι αναστολείς BRAF και MEK ρυθμίζουν το ανοσοποιητικό μικροπεριβάλλον του όγκου μέσω πυρόπτωσης. Cancer Discov. 2020; 10 (2): 254–269.
16. Serrano-Puebla A, Boya P. Διαπερατότητα λυσοσωμικής μεμβράνης στον κυτταρικό θάνατο: νέα στοιχεία και επιπτώσεις για την υγεία και τις ασθένειες. Ann NY Acad Sci. 2016; 1371 (1): 30–44.
17. Thirusangu P, et al. Η επαγόμενη από κινακρίνη αυτοφαγία στον καρκίνο των ωοθηκών πυροδοτεί τη διαπερατότητα της λυσοσωμικής/μιτοχονδριακής μεμβράνης που προκαλείται από την καθεψίνη L και τον κυτταρικό θάνατο. Καρκίνοι (Βασιλεία). 2021;13(9):2004.
18. Michallet MC, et αϊ. Η εξαρτώμενη από την καθεψίνη απόπτωση που προκαλείται από την υπερβέλτιστη ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων: ένας πιθανός μηχανισμός ανοχής υψηλής δόσης. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.
19. Mondal Α, et al. Η ανεπάρκεια Ppt1-δυσρυθμίζει την ομοιόσταση του λυσοσωμικού Ca++ συμβάλλοντας στην παθογένεση σε ένα μοντέλο ποντικού της νόσου CLN1. J Inherit Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM, et al. Οι φωσφολιπάσες και τα δραστικά είδη οξυγόνου προέρχονται από λιπιδικούς βιοδείκτες σε υγιείς και άρρωστους ανθρώπους και ζώα – εστίαση στη λυσοφωσφατιδυλοχολίνη. Front Physiol. 2021; 12:732319.
21. Fu R, et αϊ. Αποτελεσματικότητα της Ν-ακετυλοκυστεΐνης στη φαινοτυπική καταστολή μοντέλων ποντικών της νόσου Niemann-Pick, τύπου C1. Hum Mol Genet. 2013; 22(17):3508–3523.
22. Boz Z, et al. Η Ν-ακετυλοκυστεΐνη αποτρέπει το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από την ολανζαπίνη σε mHypoA-59 υποθαλαμικούς νευρώνες. Sci Rep. 2020; 10(1):19185.
23. Khare S, et al. Τα ASS1 και ASL καταστέλλουν την ανάπτυξη σε καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων διαυγών κυττάρων μέσω αλλοιωμένου μεταβολισμού αζώτου. Καρκίνος Metab. 2021; 9 (1): 40.
24. Gęgotek A, et al. Σύγκριση της προστατευτικής επίδρασης του ασκορβικού οξέος στις αλληλεπιδράσεις οξειδοαναγωγικών και ενδοκανναβινοειδών συστημάτων in vitro καλλιεργημένων ινοβλαστών ανθρώπινου δέρματος που εκτίθενται σε υπεριώδη ακτινοβολία και υπεροξείδιο του υδρογόνου. Arch Dermatol Res. 2017; 309 (4): 285–303.
25. De Raedt Τ, et al. Εκμετάλλευση ευπάθειας των καρκινικών κυττάρων για την ανάπτυξη συνδυαστικής θεραπείας για όγκους που προκαλούνται από ras. Καρκινικό Κύτταρο. 2011; 20 (3): 400–413.
26. Zhang X, et al. Παρακολούθηση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων σε αφρώδη κύτταρα με στοχευόμενο σε λυσόσωμα και αναλογικό ανιχνευτή. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.
27. Wei CY, et al. Η ανάλυση που βασίζεται στη βιοπληροφορική αποκαλύπτει αυξημένο MFSD12 ως βασικό προαγωγέα του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και πιθανό θεραπευτικό στόχο στο μελάνωμα. Ογκογόνο. 2019;38(11):1876–1891.
28. Aldini G, et al. Ν-ακετυλοκυστεΐνη ως αντιοξειδωτικό και δισουλφιδικό παράγοντα θραύσης: οι λόγοι για τους οποίους. Free Radic Res. 2018, 52 (7): 751–762. 29. Abu-Remaileh M, et al. Η λυσοσωμική μεταβολομική αποκαλύπτει ρύθμιση της εκροής αμινοξέων από τα λυσοσώματα εξαρτώμενη από τη V-ATPase και mTOR. Επιστήμη. 2017;358(6364):807–813.
30. Zhou J, et al. Ανοσογόνος κυτταρικός θάνατος στη θεραπεία του καρκίνου: παρόντες και αναδυόμενοι επαγωγείς. J Cell ΜοΙ Med. 2019; 23(8): 4854–4865. 31. Sharma G, et αϊ. Η αναστολή της PPT1 ενισχύει την αντικαρκινική δραστηριότητα του αντισώματος αντι-PD-1 στο μελάνωμα. JCI Insight. 2020; 5(17): e133225.
32. Mehnert JM, et al. BAMM (Αυτοφαγία BRAF και αναστολή ΜΕΚ στο μελάνωμα): μια δοκιμή φάσης Ι/ΙΙ του dabrafenib, του trametinib και της υδροξυχλωροκίνης σε προχωρημένο BRAFV600-μεταλλαγμένο μελάνωμα. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, et al. Οι πρωτεΐνες μακροαυτοφαγίας ελέγχουν τα επίπεδα MHC τάξης Ι στα δενδριτικά κύτταρα και διαμορφώνουν τις αντιϊκές αποκρίσεις των CD8(+) Τ κυττάρων. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.
34. Jouandin P, et al. Η κινητοποίηση της λυσοσωμικής κυστεΐνης διαμορφώνει την απόκριση του TORC1 και της ανάπτυξης των ιστών στη νηστεία. Επιστήμη. 2022;375(6582):eabc4203.
35. Schwalfenberg GK. Ν-ακετυλοκυστεΐνη: μια ανασκόπηση της κλινικής χρησιμότητας (ένα παλιό φάρμακο με νέα κόλπα). J Nutr Metab. 2021; 2021: 9949453.
36. Beer LA, et al. Συστηματική ανακάλυψη βιοδεικτών ορού έκτοπης εγκυμοσύνης χρησιμοποιώντας 3-προφίλ της πρωτεΐνης D σε συνδυασμό με ποσοτικοποίηση χωρίς ετικέτα. J Proteome Res. 2011, 10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et al. Η πρωταρχική επίδραση στο πρωτέωμα του μεταλλαγμένου από ARID1A καρκινώματος των ωοθηκών διαυγών κυττάρων είναι η προς τα κάτω ρύθμιση της οδού μεβαλονικού σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Mol Cell Proteomics. 2016; 15(11):3348–3360.
38. Cox J, Mann M. MaxQuant επιτρέπει υψηλούς ρυθμούς αναγνώρισης πεπτιδίων, εξατομικευμένες ακρίβειες μάζας εύρους ppb και ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών σε επίπεδο πρωτεϊνών. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.
39. Cox J, et al. Andromeda: μια μηχανή αναζήτησης πεπτιδίων ενσωματωμένη στο περιβάλλον MaxQuant. J Proteome Res. 2011, 10(4):1794–1805.
40. Cox J, et αϊ. Ακριβής ποσοτικοποίηση χωρίς επισήμανση σε επίπεδο πρωτεώματος με καθυστερημένη κανονικοποίηση και εκχύλιση μέγιστου λόγου πεπτιδίου, που ονομάζεται MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014;13(9):2513–2526.
41. Tyanova S, et al. Η υπολογιστική πλατφόρμα Perseus για ολοκληρωμένη ανάλυση δεδομένων (prote)omics. Μέθοδοι Nat. 2016; 13(9):731–740.
42. Tyanova S, Cox J. Perseus: μια πλατφόρμα βιοπληροφορικής για ολοκληρωμένη ανάλυση δεδομένων πρωτεϊνικής στην έρευνα για τον καρκίνο. Μέθοδοι ΜοΙ ΒίοΙ. 2018; 1711: 133-148.
43. Alicea GM, et al. Οι αλλαγές στον γερασμένο μεταβολισμό των λιπιδίων των ινοβλαστών επάγουν την εξαρτώμενη από την ηλικία αντίσταση των κυττάρων του μελανώματος σε στοχευμένη θεραπεία μέσω του μεταφορέα λιπαρών οξέων FATP2. Cancer Discov. 2020;10(9):1282–1295.
44. Ran FA, et αϊ. Μηχανική γονιδιώματος με χρήση του συστήματος CRISPR-Cas9. Nat Protoc. 2013; 8(11):2281–2308.
45. Liu P, et al. Ποσοτικοποίηση της έκθεσης στην καλρετικουλίνη που σχετίζεται με ανοσογονικό κυτταρικό θάνατο. Μέθοδοι Enzymol. 2020; 632:1–13.
