Το Lipidomics αποκαλύπτει μεταβολές των νεφρικών λιπιδίων που προκαλούνται από σισπλατίνη κατά τη διάρκεια οξείας νεφρικής βλάβης και την εξασθένησή τους από τη σιλαστατίνη

edmund.chen@wecistanche.com

Αφηρημένη:  Η νεφροτοξικότητα είναι μια σημαντική επιπλοκή της χημειοθεραπείας με βάση τη σισπλατίνη, που οδηγεί σε οξείανεφρική βλάβησε περίπου. 30 τοις εκατό των ασθενών, χωρίς προληπτική παρέμβαση ή θεραπεία διαθέσιμη για κλινική χρήση. Η σιλαστατίνη έχει αποδειχθεί ότι ασκεί νεφροπροστατευτική δράση για θεραπείες με σισπλατίνη σε μοντέλα in vitro και in vivo, έχοντας εισέλθει πρόσφατα σε κλινικές δοκιμές. Μια βαθύτερη κατανόηση σε μοριακό επίπεδο της σισπλατίνης που προκαλείταινεφρική βλάβηκαι η επίδραση των πιθανών προστατευτικών παραγόντων θα μπορούσε να είναι το κλειδί για την ανάπτυξη επιτυχημένων νεφροπροστατευτικών θεραπειών και για τη δημιουργία νέων βιοδεικτώννεφρική βλάβηκαινεφροπροστασία. Μια στοχευμένη λιπιδομική προσέγγιση, χρησιμοποιώντας LC-MS/MS, χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό 108 ειδών λιπιδίων (που περιλαμβάνουν φωσφολιπίδια, σφιγγολιπίδια και ελεύθερη και εστεροποιημένη χοληστερόλη)νεφρόεκχυλίσματα φλοιού και μυελού από αρουραίους που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη και/ή σιλαστατίνη. Έως και 56 και 63 είδη λιπιδίων βρέθηκαν να έχουν αλλοιωθεί στον φλοιό και το μυελό, αντίστοιχα, μετά από θεραπεία με σισπλατίνη. Η ταυτόχρονη θεραπεία με σιλαστατίνη εξασθένησε πολλές από αυτές τις λιπιδικές αλλαγές, είτε πλήρως είτε εν μέρει σε σχέση με τα επίπεδα ελέγχου. Η πολυπαραγοντική ανάλυση αποκάλυψε ότι τα είδη λιπιδίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διάκρισηνεφρική βλάβηκαινεφροπροστασία, με τους εστέρες της χοληστερόλης να είναι τα πιο διακριτικά είδη, μαζί με τα σουλφατίδια και τα φωσφολιπίδια. Πιθανοί διαγνωστικοί βιοδείκτες επαγόμενων από σισπλατίνη νεφρική βλάβηκαι σιλαστατίνηνεφροπροστασίαβρέθηκαν επίσης.

Λέξεις-κλειδιά:Λιπιδομική; σισπλατίνη; οξεία νεφρική βλάβη? σιλαστατίνη; Νεφροπροστασία? βιοδείκτες; εστέρες χοληστερόλης; σφιγγολιπίδια; φωσφολιπίδια; χημειοθεραπεία

Εισαγωγή Η νεφροτοξικότητα είναι μια σοβαρή παρενέργεια της χημειοθεραπείας με σισπλατίνη [1], με οξείανεφρική βλάβη(AKI) που αναπτύσσεται περίπου. 30 τοις εκατό των ασθενών που έλαβαν θεραπεία [2]. Αυτός είναι επίσης ο κύριος περιοριστικός παράγοντας της δόσης και ένα σημαντικό μειονέκτημα των θεραπειών που βασίζονται στη σισπλατίνη, μιας από τις πιο σχετικές θεραπείες για συμπαγείς όγκους [2]. Η σισπλατίνη συσσωρεύεται και προκαλεί τραυματισμό σενεφρώνεπιθηλιακά κύτταρα εγγύς σωληναρίου (RPTECs) και η βλάβη εντοπίζεται ιδιαίτερα στο τμήμα S3 του εγγύς σωληνίσκου, που κατέρχεται από τονεφρώνφλοιό προς τη φλοιομυελική συμβολή και τον έξω μυελό [3]. Ωστόσο, έχει επίσης προταθεί άμεση βλάβη στον βρόχο του μυελού Henle [4,5]. Μια σειρά από κυτταρικά συμβάντα λαμβάνουν χώρα σε σχέση μενεφρώντραυματισμός των κυττάρων των σωληναρίων, μετά από πρόσληψη σισπλατίνης, συμπεριλαμβανομένου οξειδωτικού στρες, νιτροδικού στρες, αγγειακής βλάβης, φλεγμονής, μιτοχονδριακής βλάβης ή αναστολής Na plus, K συν - ΑΤΡάσης στην κυτταρική μεμβράνη και στρες στο ενδοπλασματικό δίκτυο, ακολουθούμενο από εγγύς κυτταρικό θάνατο των σωληναρίων κυρίως από απόπτωση (που περιλαμβάνει ενδογενείς και εξωγενείς οδούς) ή νέκρωση, που οδηγεί σε απώλειανεφρική λειτουργία[2,6,7]. Αυτό εκδηλώνεται με τη μείωση του ρυθμού σπειραματικής διήθησης (GFR) και των επιπέδων μαγνησίου και καλίου στον ορό, με αυξημένο άζωτο ουρίας αίματος (BUN) και κρεατινίνη ορού [2].

Έχουν διερευνηθεί διάφορες προσεγγίσεις γιανεφροπροστασίακατά τη διάρκεια θεραπειών με σισπλατίνη τόσο in vitro όσο και in vivo, με βάση έναν αριθμό μοριακών στόχων [7-9]. Ωστόσο, η πιθανή διαταραχή της κυτταροτοξικής δράσης της σισπλατίνης στα καρκινικά κύτταρα και η συχνά ατελής προστατευτική δράση έχουν περιορίσει την ανάπτυξη νενοπροστατευτών [9]. Ως αποτέλεσμα, δεν υπάρχει καμία παρέμβαση για κλινική χρήση που να προλαμβάνει ή να αντιμετωπίζει επιτυχώς την επαγόμενη από τη σισπλατίνη AKI [7]. Μια βαθύτερη κατανόηση των μοριακών οδών που σχετίζονται με την επαγόμενη από σισπλατίνη AKI και πιθανούς στόχους γιανεφροπροστασίαφαίνεται κρίσιμη από αυτή την άποψη.

Η σιλαστατίνη έχει αποδειχθεί ότι προστατεύει αποτελεσματικάνεφρόαπό τη βλάβη που προκαλείται από διάφορους παράγοντες, όπως η σισπλατίνη [10,11], η γενταμυκίνη [12], η βανκομυκίνη [13], η κυκλοσπορίνη Α και η τακρόλιμους [14], τόσο σε μοντέλα in vitro όσο και in vivo. Η σιλαστατίνη ασκεί την προστατευτική της δράση αναστέλλοντας επιλεκτικάνεφρώνη αφυδροπεπτιδάση I (DHP-I) που βρίσκεται στις λιπιδικές σχεδίες στο όριο της βούρτσας των RPTECs [11]. Ως αποτέλεσμα, διεργασίες που περιλαμβάνουν εξωτερίκευση της μεμβράνης, όπως η μεσολαβούμενη από Fas εξωγενής απόπτωση, επηρεάζονται από τη σιλαστατίνη και η εξέλιξη τηςνεφρική βλάβηαφού κρατηθεί μια τοξική προσβολή [11]. Εκτός από την εξωγενή εξασθένιση της απόπτωσης από τη σιλαστατίνη, το οξειδωτικό στρες, η φλεγμονή και η συσσώρευση νεφροτοξικών ενώσεων βρέθηκαν όλα μειωμένα [10-13,15,16]. Ετσι,νεφρική λειτουργίαπαραμένει συντηρημένο υπό ταυτόχρονη θεραπεία με σισπλατίνη και σιλαστατίνη [11]. Πρόσφατα, η σιλαστατίνη ολοκλήρωσε επιτυχώς τις κλινικές δοκιμές φάσης Ι για τη χρήση της ως νεφροπροστάτη και πρόκειται να εισέλθει σε δοκιμές φάσης ΙΙ. Μια πολλά υποσχόμενη πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε επίσης ότι η σιλαστατίνη (που χορηγείται ως ιμιπενέμη συν σιλαστατίνη) μπορεί να επιτύχει μια αντιπροστατευτική δράση σε ασθενείς με περιτοναϊκή καρκινωμάτωση κατά τη διάρκεια της υπερθερμικής ενδοπεριτοναϊκής θεραπείας με σισπλατίνη [17].

Τα τελευταία χρόνια, οι τεχνολογίες ωμικής, ειδικά η πρωτεομική [18,19] και η μεταβολομική [20-23], έχουν αποδειχθεί χρήσιμες για την ανακάλυψη νέων πρώιμων διαγνωστικών βιοδεικτών του AKI, εκτός από το BUN ή την κρεατινίνη στον ορό [18,20]. Επιπλέον, η μεταβολομική ανάλυση μπορεί να προσφέρει πολύτιμες πληροφορίες για την κατανόηση των μηχανισμών νεφροτοξικότητας της σισπλατίνης [5,24] και της θεραπευτικής επίδρασης των πιθανών νεφροπροστατευτών [25-27].

Ειδικότερα, τα λιπιδομικά μπορούν επίσης να παρέχουν σχετικές πληροφορίες σχετικά μεΝεφρική Νόσος[28], λαμβάνοντας υπόψη ότι τα λιπίδια παρουσιάζουν βασικούς δομικούς, κυτταρικούς σηματοδοτικούς και μεταβολικούς ρόλους και μπορούν να μεταβληθούν σε κύτταρα, ιστούς και βιορευστά υπόνεφρώνπαθολογικές καταστάσεις [29,30]. Από αυτή την άποψη, αυξημένα επίπεδα τριγλυκεριδίων και μη εστεροποιημένων λιπαρών οξέων βρέθηκαν στονεφρόκατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη [31], επιπλέον των ουδέτερων λιπιδίων tal [32]. Αυξημένα επίπεδα σφιγγολιπιδίων -κεραμίδια (Cer) και εξοσυλκεραμίδια (HexCer)- παρατηρήθηκαν επίσης στονεφρώνφλοιού κατά τη διάρκεια της επαγόμενης από σισπλατίνη AKI [33]. Από την άλλη πλευρά, τα είδη φωσφολιπιδίων, συμπεριλαμβανομένης της φωσφατιδυλοχολίνης (PC), της φωσφατιδυλαιθανολαμίνης (PE) και της λυσοφωσφατιδυλοχολίνης (LPC), βρέθηκαν επίσης να αλλοιώνονται σενεφρικό ιστόή κύτταρα κατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη [26]. Τα επίπεδα διαφορετικών ειδών LPC βρέθηκαν επίσης να μεταβάλλονται στον ορό αρουραίων μετά τη χορήγηση σισπλατίνης [23]. Επιπλέον, μια μη στοχευμένη ημι-ποσοτική προσέγγιση απεικόνισης φασματομετρίας μάζας επέτρεψε τη σύγκριση της κατανομής λιπιδίων στον αρουραίονεφρότμημάτων και πρότεινε ότι η cis πλατίνη οδήγησε σε αλλαγές σε διάφορα φωσφολιπίδια (PC, PE, φωσφατιδυλογλυκερόλες (PG), φωσφατιδυλινοσυτόλες (PI), φωσφατιδυλοσερίνες (PS), φωσφατιδικά οξέα (PA)), σουλφατίδια (Sulf) ή καρδιολιπίνες) (δείχνοντας διαφορετική συμπεριφορά στον φλοιό και τον μυελό), ενώ η συγχορήγηση με σιλαστατίνη έτεινε να μετριάσει ορισμένες από αυτές τις αλλαγές [4].

Σε αυτή την εργασία, προχωρήσαμε ένα βήμα παραπέρα και ρίξαμε μια πιο προσεκτική ματιά σε σημαντικά δομικά λιπίδια στονεφρό, όπως φωσφολιπίδια (PC, LPC και PE), σφιγγολιπίδια (Sulf, σφιγγομυελίνες (SM), διϋδροσφιγγομυελίνες (dhSM), Cer, διυδροκεραμίδια (dhCer), HexCer, διυδροεξοξυλοκεραμίδια (dhHexCer)) και ελεύθερη χοληστερόλη (FC) μορφές (εστέρες χοληστερόλης (CE)), καλύπτοντας νέες κατηγορίες και είδη λιπιδίων και χρησιμοποιώντας μια πιο αξιόπιστη στοχευμένη ποσοτική προσέγγιση που βασίζεται σε υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με ανάλυση φασματομετρίας μάζας σε συνδυασμό (LC-MS/MS). Συνολικά 108 είδη λιπιδίων ποσοτικοποιήθηκαν και στα δύονεφρώνεκχυλίσματα φλοιού και μυελού από αρουραίους που έλαβαν θεραπεία, προκειμένου να κατανοηθεί καλύτερα η νεφροτοξική δράση της σισπλατίνης και η νεφροπροστατευτική δράση της σιλαστατίνης. Νέες πληροφορίες σχετικά με τον αντίκτυπο της σισπλατίνης που σχετίζεται με το AKIνεφρώνλήφθηκαν είδη λιπιδίων και αποκτήθηκαν πρόσθετες γνώσεις σχετικά με την προστατευτική δράση της σιλαστατίνης, η οποία οδήγησε σε εξασθένηση ορισμένων από τις συγκεκριμένες μεταβολές λιπιδίων που προκαλούνται από τη σισπλατίνη είτε στονεφρώνφλοιός ή μυελός. Διάφοροι πιθανοί βιοδείκτες που προκαλούνται από σισπλατίνηνεφρική βλάβηκαινεφροπροστασίαμε σιλαστατίνη βρέθηκαν επίσης.

Αποτελέσματα

Προστατευτική δράση της σιλαστατίνης έναντι της νεφρικής βλάβης που προκαλείται από τη σισπλατίνη

Αξιολόγηση τουνεφρική λειτουργίαΣε αρουραίους που έλαβαν σισπλατίνη και/ή σιλαστατίνη πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά χρησιμοποιώντας αρκετούς βιοχημικούς δείκτες στον ορό και τα ούρα. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, η κρεατινίνη ορού, το BUN, οι πρωτεΐνες ούρων, ο όγκος ούρων και η κλασματική απέκκριση νατρίου και καλίου αυξήθηκαν σημαντικά λόγω της θεραπείας με σισπλατίνη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, ενώ η ταυτόχρονη θεραπεία με σιλαστατίνη και σισπλατίνη οδήγησε στη μείωση τους σε σύγκριση με με επίπεδα ελέγχου. Από την άλλη πλευρά, ο GFR μειώθηκε σε αρουραίους που έλαβαν σισπλατίνη σε σχέση με τα δείγματα ελέγχου, ενώ η συγχορήγηση σιλαστατίνης μείωσε αυτό το αποτέλεσμα. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνονταινεφρική βλάβηπου προκαλείται από τη σισπλατίνη και την προστασία από τη σιλαστατίνη. Η σιλαστατίνη από μόνη της δεν έδειξε καμία επίδραση στονεφρική λειτουργίαΠαράμετροι.

Πραγματοποιήθηκε επίσης ιστοπαθολογική ανάλυση σε τομές χρωματισμένες με αιματοξυλίνη/ηωσίνη για τη μελέτη μορφολογικών αλλοιώσεων που σχετίζονται μενεφρική βλάβη. Το Σχήμα 1 δείχνει σημάδια βλάβης που προκαλούνται από σισπλατίνη στο εγγύς τμήμανεφρώνσωληνάρια, συμπεριλαμβανομένης της διόγκωσης των σωληναρίων, της αποκόλλησης των κυτταρικών υπολειμμάτων ή της απώλειας της μεμβράνης του ορίου της βούρτσας (Εικόνα 1C,G,I). Η συσσώρευση πρωτεϊνικών εκμαγείων παρατηρήθηκε επίσης σε σωληνάρια φλοιού και μυελού (Εικόνα 1C, G, αντίστοιχα). Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τη φυσιολογική μορφολογία που παρατηρείται σε ομάδες ελέγχου ή σιλαστατίνης στον φλοιό (Εικόνα 1Α, Β, αντίστοιχα) και στο μυελό (Εικόνα 1Ε, ΣΤ, αντίστοιχα). Η ταυτόχρονη θεραπεία με σισπλατίνη με σισπλατίνη είχε ως αποτέλεσμα τη σαφή μείωση όλων αυτών των αλλοιώσεων που προκαλούνται από τη σισπλατίνη στον φλοιό και τον μυελό (Εικόνα 1D,H,J).

Αλλαγή σισπλατίνης των σφαιρικών κατηγοριών νεφρικών λιπιδίων στο φλοιό και το μυελό. Προστατευτική δράση της Σιλαστατίνης

Τα συνολικά επίπεδα διαφορετικών κατηγοριών λιπιδίων, συμπεριλαμβανομένων των στερολών (CE, FC), των φωσφολιπιδίων (LPC, PC, PE) και των σφιγγολιπιδίων (Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, Sulf, SM, dhSM) καθορίστηκαν στονεφρώνφλοιού και μυελού, προκειμένου να αξιολογηθεί η συνολική επίδραση της σισπλατίνης στα λιπίδια κατά τη διάρκεια της ΑΚΙ. Τα πλήρη αποτελέσματα για την ανάλυση λιπιδίων βρίσκονται στον Πίνακα S1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, Β, αρκετά παρόμοιες τάσεις παρατηρήθηκαν στον φλοιό και το μυελό για όλες τις ομάδες. Τα CE και Cer αυξήθηκαν σημαντικά, ενώ τα SM, dhSM και PE μειώθηκαν, τόσο στον φλοιό όσο και στο μυελό κατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη, σε σχέση με τις ομάδες ελέγχου. Μεταξύ αυτών, το Cer και το CE υφίστανται τις πιο εμφανείς αλλαγές που προκαλούνται από σισπλατίνη που παρατηρήθηκαν. Επιπλέον, τα dhCer και HexCer αυξήθηκαν σημαντικά στον μυελό, ενώ στον φλοιό, το dhHexCer αυξήθηκε και το LPC και το Sulf μειώθηκαν κατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη.

Εικόνα 1. Ιστοπαθολογική ανάλυση χρωματισμένων με αιματοξυλίνη/ηωσίνηνεφρώνΟι ενότητες δείχνει την προστασία της σισπλατίνης έναντι της βλάβης που προκαλείται από τη σισπλατίνη. Οι εικόνες εμφανίζονται σε μεγέθυνση 20× για τον φλοιό ελέγχου (Α). (Β) φλοιός σιλαστατίνης. (Γ) φλοιός σισπλατίνης. (Δ) σισπλατίνη συν φλοιός σιλαστατίνης. (Ε) έλεγχος του μυελού. (ΣΤ) μυελός σιλαστατίνης. (Ζ) μυελός σισπλατίνης. και (Η) σισπλατίνη συν σιλαστατίνη μυελό. Η γραμμή κλίμακας από το Α έως το Η αντιπροσωπεύει 100 μm. Αναλυτικές εικόνες τουνεφρώνΤα σωληνάρια σε μεγέθυνση 60× εμφανίζονται για (Ι) σισπλατίνη και (J) σισπλατίνη συν σιλαστατίνη. Η γραμμή κλίμακας για τα I και J αντιπροσωπεύει 25 μm.Νεφρώναντιπροσωπεύονται οι δείκτες βλάβης: →: συσσώρευση πρωτεϊνικών εκμαγείων στονεφρώνσωληνάρια. & περιοχή: διόγκωση σωληναρίων. *: απώλεια μεμβράνης περιγράμματος βούρτσας. #: αποκόλληση κυτταρικών υπολειμμάτων.

Η συγχορήγηση σιλαστατίνης και σισπλατίνης έτεινε να μειώνει ορισμένες από αυτές τις αλλαγές λιπιδίων που προκαλούνται από τη σισπλατίνη, χωρίς να υπάρχει διαφορά σε σχέση με τις ομάδες ελέγχου στην περίπτωση των επιπέδων Cer και dhHexCer στον φλοιό ή dhCer, HexCer, SM, dhSM και PE επίπεδα στο μυελό. Επιπλέον, στην περίπτωση της επαγόμενης από τη σισπλατίνη αύξησης του CE στον φλοιό, η σισπλατίνη συγχορηγούμενη με σισπλατίνη οδήγησε σε σημαντικά μειωμένα επίπεδα σε σύγκριση με την ομάδα της σισπλατίνης, αν και η ανάκτηση ήταν μερική σε σχέση με τις ομάδες κοιατρόλης. Οι υπόλοιπες κατηγορίες λιπιδίων που μεταβλήθηκαν από τη σισπλατίνη παρέμειναν ακάλυπτες κατά τη διάρκεια της συν-θεραπείας με σιλστατίνη. Από την άλλη πλευρά, η ίδια η σιλαστατίνη δεν είχε καμία επίδραση στα λιπίδια του φλοιού και του μυελού, εκτός από τα LPC και dhCer στον φλοιό, τα οποία φάνηκαν να μειώνονται και να αυξάνονται αντίστοιχα, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα συνολικά επίπεδα FC, PC και dhHexCer δεν έδειξαν σημαντική αλλαγή στον φλοιό και τον μυελό μετά από θεραπεία με σισπλατίνη.

Το σχήμα 2C,D εμφανίζει τους χάρτες θερμότητας συσχέτισης για τις κατηγορίες λιπιδίων στον φλοιό και το μυελό, αντίστοιχα, προσφέροντας παρόμοιες τάσεις.

Μεμονωμένη Αλίτρωση Νεφρικών Λιπιδίων με Θεραπεία Σισπλατίνης. Σιλαστατίνη Ασθενές Egect

Εστέρες χοληστερόληςΑνάλυση πέντε μεμονωμένων ειδών CE (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 και CE 22:6) που πραγματοποιήθηκε στονεφρώνο φλοιός και ο μυελός αποκάλυψαν ότι η σισπλατίνη αύξησε σημαντικά το καθένα από αυτά σε σύγκριση με τα επίπεδα ελέγχου (Εικόνα 3). Από την άλλη πλευρά, η συγχορήγηση σιλαστατίνης και σισπλατίνης οδήγησε σε γενική μείωση των επιπέδων μεμονωμένων ειδών CE σε σχέση με τη θεραπεία με σισπλατίνη, η οποία ήταν στατιστικά σημαντική για όλα τα είδη CE στον φλοιό και CE 18:2 στο μυελό, όπως μπορεί να είναι φαίνεται στο Σχήμα 3. Αυτή η ανάκτηση στα είδη CE φλοιού λόγω της συγχορήγησης σιλαστατίνης ήταν μερική σε σύγκριση με τα επίπεδα της ομάδας ελέγχου, ενώ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική ανάκτηση στα περισσότερα είδη CE medella (εκτός από το CE 18:2) για τη συγχορήγηση σιλαστατίνης σε σύγκριση με τη σισπλατίνη. Τα πλήρη αποτελέσματα στατιστικής ανάλυσης για τα είδη λιπιδίων του φλοιού και του μυελού φαίνονται στους Πίνακες S2 και S3, αντίστοιχα.

Σφιγγολιπίδια: Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, SM, dhSM και SulfΣυνολικά 43 είδη σφιγγολιπιδίων ποσοτικοποιήθηκαν στονεφρώνφλοιός και μυελός για την αξιολόγηση της επίδρασης της θεραπείας με σισπλατίνη και σιλαστατίνη στα επίπεδά τους, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4. Όσον αφορά τα είδη Cer (Εικόνα 4Α), dhCer (Εικόνα 4Β), HexCer (Εικόνα 4Γ) και dhHexCer (Εικόνα 4Δ), όπως φαίνεται ότι η θεραπεία με σισπλατίνη οδήγησε σε σημαντική αύξηση σε 19 είδη από τέσσερις κατηγορίεςνεφρώνφλοιός και μυελός. Και πάλι, η ταυτόχρονη θεραπεία με σισπλατίνη και σισπλατίνη δείχνει μια τάση να αμβλύνει τη δράση της σισπλατίνης, με μια γενική μείωση των αλλαγμένων από τη σισπλατίνη επίπεδα λιπιδίων στον φλοιό και στο μυελό. Πράγματι, για τα είδη dhCer (Εικόνα 4Β) και dhHexCer (Εικόνα 4Δ), δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των ομάδων που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη συν σιλαστατίνη και των ομάδων ελέγχου για αυτά τα είδη που έχουν τροποποιηθεί με σισπλατίνη, υποδεικνύοντας πλήρη ανάκαμψη. Στην περίπτωση του Cer (Εικόνα 4Α) και του HexCer (Εικόνα 4Γ), αυτή η ανάκαμψη συνέβη και για ορισμένα αλλοιωμένα είδη, όπως το HexCer 34:1 (φλοιός και μυελός) και HexCer 38:1 και HexCer 42:1 (μυελός ) Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 και Cer 42:2 στον φλοιό. και Cer 34:1 και Cer 42:2 στο μυελό, είτε πλήρως είτε μερικώς ανάκτηση. Αντίθετα, η θεραπεία με σισπλατίνη συν σιλαστατίνη εξακολουθούσε να παρουσιάζει σημαντικές διαφορές σε σχέση με τις ομάδες ελέγχου για Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 και HexCer 36:1 στο μυελό, χωρίς ανάκτηση, δείχνοντας σε πολύ καλύτερο αποτέλεσμα ανάκτησης που ασκεί η σιλαστατίνη στον φλοιό παρά στον μυελό για το Cer και το HexCer.

Στην περίπτωση των ειδών SM (Εικόνα 4Ε) και dhSMt (Εικόνα 4F), η σισπλατίνη οδήγησε σε μείωση του φλοιού και του μυελού για τα είδη της μικρότερης και μακρύτερης αλυσίδας, η οποία ήταν στατιστικά σημαντική για τα είδη SM 34:1, dhSM 34:{{{ 5}}, SM 42:2, SM 42:1 και dhSM 42:1. Αντίθετα, η επίδραση που παρατηρήθηκε για τη θεραπεία με σισπλατίνη στα είδη SM και dhSM ενδιάμεσης αλυσίδας στον φλοιό και το μυελό ήταν μια αύξηση, η οποία ήταν στατιστικά σημαντική για το dhSM 36:0 (τόσο στον φλοιό όσο και στο μυελό) και το dhSM 4{{ 15}}:0, SM 36:1, SM 38:1 και SM 40:1 στον μυελό. Η συγχορήγηση σισπλατίνης και σιλαστατίνης έτεινε να ομαλοποιεί τα επίπεδα των ειδών SM και dhSM σε πολλές περιπτώσεις, με SM 34:1, SM 36:1, SM 38:1, SM 40:1, SM 42:2, SM 42:1, dhSM 36:0, dhSM 40:0 και dhSM 42:1 που δεν δείχνουν καμία διαφορά σε σχέση με τις ομάδες ελέγχου στο μυελό. Τέλος, ορισμένα είδη Sulf τροποποιήθηκαν επίσης με επεξεργασία σισπλατίνης στονεφρώνφλοιός και μυελός, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4G. Ενώ το Sulf 40:1 βρέθηκε να είναι σημαντικά αυξημένο τόσο στον φλοιό όσο και στον μυελό μετά από θεραπεία με σισπλατίνη, άλλα είδη όπως το Sulf-OH 40:1 ή το Sulf-OH 42:2 μακράς αλυσίδας, το Sulf-OH 42:2 μειώθηκαν στον φλοιό, με το Sulf 42:0 και το Sulf-OH 42:1 να είναι επίσης μειωμένα τόσο στον φλοιό όσο και στον μυελό. Η σιλαστατίνη συγχορηγούμενη με σισπλατίνη οδήγησε και πάλι σε ένα ήπιο αποτέλεσμα ανάκτησης, ειδικά για τα Sulf 40:1 (φλοιός και μυελός) και Sulf 40:2 και Sulf-OH 42:1 (μυελός), χωρίς να παρουσιάζουν διαφορά σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου.

Φωσφολιπίδια: PC, PE και LPCΗ ποσοτικοποίηση 60 ειδών φωσφολιπιδίων (28 PC, 20 PE και 12 LPC) πραγματοποιήθηκε στονεφρώνφλοιού και μυελού για την αξιολόγηση πιθανών αλλοιώσεων που προκαλούνται από σισπλατίνη και νενοπροστατευτικής δράσης της σιλαστατίνης. Τα αποτελέσματα για είδη PC φαίνονται στο Σχήμα 5Α, Β, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται, η σισπλατίνη άλλαξε σημαντικά έως και 19 είδη PC είτε στον φλοιό είτε στον μυελό. Τα περισσότερα από αυτά τα είδη PC μειώθηκαν από τη σισπλατίνη, με εξαίρεση τα PC 40:2, PC 40:4 και PC 34:2, τα οποία αυξήθηκαν στον φλοιό. Το κλάσμα των πολύ μη κορεσμένων ειδών PC μειώθηκε σημαντικά τόσο στον μυελό όσο και στον φλοιό, ενώ το κλάσμα των ειδών που περιείχαν δύο διπλούς δεσμούς αυξήθηκε σημαντικά, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C,D. Η θεραπεία τόσο με σισπλατίνη όσο και με σιλαστίνη έδειξε παρόμοια αποτελέσματα με αυτά που παρατηρήθηκαν προηγουμένως, με κάποια εξασθενητική επίδραση που παρατηρήθηκε, σε ορισμένες περιπτώσεις που οδήγησε σε πλήρη ανάκτηση των επιπέδων PC, χωρίς σημαντικές διαφορές με την ομάδα ελέγχου ή σε μερική ανάκτηση. Αυτή η ανάκτηση παρατηρήθηκε κυρίως στο Τα αποτελέσματα για τον προσδιορισμό των ειδών ΡΕ στον φλοιό και το μυελό φαίνονται στο Σχήμα 6Α, Β, αντίστοιχα. Συνολικά 16 είδη PE αλλοιώθηκαν σημαντικά από τη σισπλατίνη είτε στον φλοιό είτε στον μυελό, με τον υψηλότερο αριθμό αλλαγμένων ειδών που βρέθηκαν στον μυελό. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα είδη PE μειώθηκαν με θεραπεία με σισπλατίνη, εκτός από τα PE 38:2, PE 40:6 και PE 40:4, τα οποία αυξήθηκαν είτε στον φλοιό, στο μυελό είτε στον φλοιό και στο μυελό, αντίστοιχα. Αντίστοιχα, λαμβάνοντας υπόψη το συνολικό μήκος των αλυσίδων λιπαρών οξέων στα είδη PE στο μυελό, η συνολική ποσότητα PE με 34, 36 και 38 C μειώθηκε σημαντικά με τη σισπλατίνη, ενώ τα είδη των 40 C αυξήθηκαν, όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 6C. . Η ταυτόχρονη θεραπεία με σισπλατίνη με σισπλατίνη εξασθένησε τις περισσότερες από τις επαγόμενες από τη σισπλατίνη αλλαγές σε μεμονωμένα είδη PE που βρέθηκαν στο μυελό, προσφέροντας επίπεδα χωρίς σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου σε 11 από 15 αλλοιωμένα είδη σισπλατίνης στο μυελό, με 2 περισσότερα είδη PE εν μέρει ανακτήθηκε. Ωστόσο, στον φλοιό, μόνο 2 από τα 11 είδη που είχαν τροποποιηθεί με σισπλατίνη ανακτήθηκαν με σιλαστατίνη σε επίπεδα ελέγχου, με 2 επιπλέον είδη PE να ανακτώνται εν μέρει. Παρόμοια με τις παρατηρήσεις για τα είδη PC, το κλάσμα των πολύ ακόρεστων ειδών PE μειώθηκε σημαντικά στον μυελό, ενώ το κλάσμα των ειδών που περιέχουν διπλούς δεσμούς 1-3 αυξήθηκε σημαντικά, όπως φαίνεται στο Σχήμα 6D.

Όσον αφορά την ανάλυση ειδών LPC, οι περισσότερες από τις επαγόμενες από τη σισπλατίνη αλλαγές που παρατηρήθηκαν βρέθηκαν στονεφρώνφλοιός, όπου LPC 16:1, LPC 16:0, LPC 18:1, LPC 18:0 , LPC 20:3, LPC 22:6 και LPC 22:5 μειώθηκαν σημαντικά με σε σχέση με τα δείγματα ελέγχου, όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Α. Από την άλλη πλευρά, το LPC 17:1 και το LPC 18:2 βρέθηκαν να αυξάνονται στον μυελό κατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη (Εικόνα 7Β). Η ταυτόχρονη θεραπεία με σισπλατίνη και σιλαστατίνη δεν είχε αποτέλεσμα ανάκτησης στα είδη LPC του φλοιού. Αντίστροφα, τα LPC 17:1 και LPC 18:2 ανακτήθηκαν στο μυελό, χωρίς σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου.

Νεφρικά λιπίδια ως μεταβλητές ταξινόμησης γιαΒλάβη στα νεφράκαι Προστασία 

Πραγματοποιήθηκε πολυμεταβλητή ανάλυση χρησιμοποιώντας όλες τις μεταβλητές λιπιδίων που μετρήθηκαν στον φλοιό και το μυελό για να εκτιμηθεί εάν αυτά τα είδη θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν για ταξινόμηση ομάδας και διακρίνοντας την επαγόμενη από σισπλατίνηνεφρική βλάβηκαινεφροπροστασίααπό σιλαστατίνη. Η ανάλυση κύριου συστατικού (PCA) και η ανάλυση διάκρισης ορθογώνιων προβολών σε λανθάνουσες δομές (OPLS-DA) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας χωριστά λιπίδια είτε του φλοιού είτε του μυελού, όπως φαίνεται στο Σχήμα 8. Ανάλυση PCA του φλοιού (Εικόνα 8Α) και του μυελού (Εικόνα 8Β) Τα λιπίδια πρόσφεραν στα μοντέλα την ικανότητα να δείχνουν έναν σαφή διαχωρισμό της ομάδας σισπλατίνης σε σχέση με τις ομάδες ελέγχου και σιλαστατίνης, με τις δύο τελευταίες να συγκεντρώνονται στενά. Από την άλλη πλευρά, η ομάδα που έλαβε θεραπεία με σισπλατίνη και σισπλατίνη έτεινε να διαχωρίζεται από την ομάδα σισπλατίνης και να βρίσκεται μεταξύ των ομάδων ελέγχου και σισπλατίνης, υποδηλώνοντας διαφορές μεταξύ των ομάδων. Όλα τα μοντέλα PCA παρουσίασαν τιμές R2 υψηλότερες από 0.7 και Q2 τιμές υψηλότερες από 0.5.

Η ανάλυση πολλαπλών ομάδων OPLS-DA έδειξε επίσης σαφώς διαχωρισμένη ομαδοποίηση των διαφορετικών ομάδων χρησιμοποιώντας μεταβλητές λιπιδίων τόσο του φλοιού (Εικόνα 8C) όσο και του μυελού (Εικόνα 8D). Τα μοντέλα OPLS-DA παρουσίασαν αποδεκτές τιμές Q2 και τιμές R2 υψηλότερες από 0.7 και αποδείχθηκαν έγκυρα κατά τη δοκιμή μετάθεσης για 100 επαναλήψεις, όπως φαίνεται στο Σχήμα 8E,F. Χαρακτηριστικά με μεταβλητή σημασία στις βαθμολογίες προβολής (VIP) υψηλότερες από 1 μπορούν να βρεθούν στο Σχήμα 8G, H, υποδεικνύοντας λιπίδια του φλοιού ή του μυελού, αντίστοιχα, τα οποία έχουν υψηλότερο αντίκτυπο στον διαχωρισμό των ομάδων. Αυτά περιελάμβαναν διάφορα είδη λιπιδίων από τις κατηγορίες CE, σφιγγολιπιδίων και φωσφολιπιδίων. Για τον προσδιορισμό των ειδικών λιπιδικών διαφορών μεταξύ μεμονωμένων ομάδων που σχετίζονται με τη θεραπεία με σισπλατίνη καινεφροπροστασία, περαιτέρω ανάλυση OPLS-DA πραγματοποιήθηκε χωριστά με λιπίδια φλοιού και μυελού, όπως φαίνεται στα Σχήματα 9 και 10, αντίστοιχα. Τα μοντέλα OPLS-DA κατασκευάστηκαν για σισπλατίνη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, σισπλατίνη συν σιλαστατίνη σε σύγκριση με σισπλατίνη, καθώς και σισπλατίνη συν σιλαστατίνη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα πιο διακριτικά μοντέλα OPLS-DA ήταν αυτά μεταξύ του μάρτυρα και των ομάδων που έλαβαν σισπλατίνη ή σισπλατίνη συν κιλαστατίνη, λαμβάνοντας υπόψη τις υψηλότερες τιμές R2 και Q2, με σωστή επικύρωση με βάση τα αποτελέσματα των δοκιμών μετάθεσης με 100 κύκλους (Εικόνα 9A,B,D, Ε και Εικόνα 10Α,Β,Δ,Ε).

Από την άλλη πλευρά, τα μοντέλα OPLS-DA για ομάδες σισπλατίνης συν σιλαστατίνης και σισπλατίνης, και τα δύο χρησιμοποιώντας λιπίδια φλοιού (Εικόνα 9C) ή μυελού (Εικόνα 10}Γ), επέτρεψαν επίσης ομαδική διάκριση, με λογικές τιμές R2 και Q2 και κατάλληλα αποτελέσματα επικύρωσης από 100-δοκιμές μετάθεσης κύκλου (Εικόνες 9F και 10F), με τα λιπίδια του μυελού να είναι αυτά που παρουσιάζουν καλύτερη προβλεψιμότητα. Τα γραφικά S για τα διαφορετικά μοντέλα OPLS-DA περιλαμβάνονται στο Σχήμα 9G,H,I και Εικόνα 10G,H,I, είτε για χαρακτηριστικά λιπιδίου του φλοιού είτε του μυελού. Είδος με |p(corr)| υψηλότερες από 0,5 και βαθμολογίες VIP υψηλότερες από 1 έχουν επισημανθεί στα S-plots ως τα πιο σχετικά χαρακτηριστικά για τη διάκριση των ομάδων. Πλήρη δεδομένα, συμπεριλαμβανομένων των τιμών p(corr) και VIP από τα μοντέλα OPLS-DA, μαζί με τα μονομεταβλητά στατιστικά στοιχεία για κάθε είδος λιπιδίου, βρίσκονται στους Συμπληρωματικούς Πίνακες S2 (λιπίδια φλοιού) και S3 (λιπίδια μυελού). Φαίνεται ξεκάθαρο ότινεφρώντα λιπίδια του φλοιού και του μυελού μπορούν να χρησιμεύσουν ως κριτήρια διάκρισης για τα επαγόμενα από σισπλατίνηνεφρική βλάβηκαι για τη σιλαστατίνηνεφροπροστασίακατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη.

Νεφρικά λιπίδια ως δυνητικοί βιοδείκτες νεφρικής βλάβης που προκαλείται από σισπλατίνη Προκειμένου να επιλεγούν πιθανοί λιπιδικοί βιοδείκτες νεφρικής βλάβης

που προκαλείται από τη σισπλατίνη, χρησιμοποιήθηκε ένας συνδυασμός πολλαπλών κριτηρίων στατιστικά σημαντικών τιμών p από μονομεταβλητή ανάλυση της σισπλατίνης έναντι των ομάδων ελέγχου, καθώς και των τιμών p(corr) και VIP που βρέθηκαν στο αντίστοιχο μοντέλο OPLS-DA. Επιλεγμένα λιπίδια με τιμές p < 0.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(corr)|=""> 0,5 και VIP > 1 μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα 2 (λιπίδια φλοιού) και στον Πίνακα 3 (λιπίδια μυελού), όπου περιλαμβάνονται επίσης η αλλαγή πτυχής (FC) και οι περιοχές κάτω από την καμπύλη (AUC) για τις καμπύλες χαρακτηριστικών λειτουργίας δέκτη (ROC).

Όπως φαίνεται, στους Πίνακες 2 και 3, επιλέγονται έως και 40 λιπίδια από το μυελό και 27 λιπίδια από τον φλοιό, που περιλαμβάνουν είδη CE, σφιγγολιπίδια και φωσφολιπίδια. Οι τιμές AUC για τις καμπύλες ROC που λήφθηκαν για κάθε λιπίδιο ήταν υψηλότερες από 0.85 και, στις περισσότερες περιπτώσεις, κοντά στο 1, υποδεικνύοντας καλές ικανότητες διάκρισης του είδους μεταξύ της σισπλατίνης και των ομάδων ελέγχου. Αξιοσημείωτο είναι ότι τα είδη CE με αυξημένη σισπλατίνη (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 2{0:4 και CE 22:6) φαίνεται να είναι τα πιο διακριτικά χαρακτηριστικά τόσο στον μυελό όσο και στον φλοιό, εμφανίζοντας τις υψηλότερες τιμές FC, VIP, p(corr) και AUC. Το dhHexCer 34:0 είναι ένα άλλο αυξημένο λιπίδιο στον φλοιό με υψηλό FC και σχετικές βαθμολογίες. Από την άλλη πλευρά, τα σουλφατίδια όπως το Sulf 42:0, το Sulf-OH 40:1 ή το Sulf-OH 42:1 είναι επίσης αρκετά σχετικά με τον φλοιό, ενώ τα PE 36:5, PE 38:6, PE 38:5 Το PC 36:5 ή το PC 36:6 ​​είναι επίσης πολύ σημαντικά στον μυελό, όλα αυτά μειώνονται κατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη.

Τα νεφρικά λιπίδια ως δυνητικοί βιοδείκτες της νεφροπροστασίας της σιλαστατίνης

Για την επιλογή πιθανών λιπιδικών βιοδεικτών προστασίας της σισπλατίνης έναντι της νεφροτοξικότητας της σισπλατίνης, εφαρμόστηκε η ίδια προσέγγιση πολλαπλών κριτηρίων όπως στην Ενότητα 2.5, χρησιμοποιώντας μονομεταβλητή ανάλυση σισπλατίνης συν σιλαστατίνης έναντι ομάδων σισπλατίνης και τιμές p(corr) και VIP που βρέθηκαν στο αντίστοιχο OPLS- μοντέλο DA. Επιλεγμένα λιπίδια με τιμές p < 0.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(corr)|=""> 0,5 και VIP > 1 μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα 4 (λιπίδια φλοιού) και στον Πίνακα 5 (λιπίδια μυελού), όπου υπολογίστηκαν επίσης οι καμπύλες FC και AUC για ROC.

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 4, όλα τα είδη CE (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4, και CE 22:6) στο ο φλοιός θα μπορούσε να θεωρηθεί ως οι πιο ισχυροί δείκτες της προστασίας που ασκεί η σιλαστατίνη, μειώνοντας σημαντικά, ταυτόχρονα, τις αλλοιώσεις που προκαλούνται από τη σισπλατίνη. PE 36:5 και dhHexCer 34:0 στον φλοιό είναι επίσης σημαντικοί δυνητικοί βιοδείκτες προστασίας της σιλαστατίνης, ειδικά η τελευταία, η οποία υφίσταται πλήρη ανάκτηση λόγω της σιλαστατίνης προς τα επίπεδα ελέγχου. Όσον αφορά τα λιπίδια του μυελού, όπως φαίνεται στον Πίνακα 5, βρέθηκε υψηλότερος αριθμός δυνητικών βιοδεικτών προστασίας της σιλαστατίνης σε σχέση με τον φλοιό. Συγκεκριμένα, το Sulf 40:2 φαίνεται να είναι το πιο διακριτικό είδος στον μυελό, λαμβάνοντας υπόψη τις υψηλότερες βαθμολογίες FC και VIP. Βρέθηκαν επίσης διάφορα είδη PC και PE, συμπεριλαμβανομένων PE 36:5, PE 38:5, PE 38:6, PE 36:4, PE 34:3 και PC 36:6, για να αναφέρουμε μερικά, εκτός από το Cer 42:2, dhHexCer 36:0 και HexCer 34:1, ως σημαντικοί βιοδείκτες προστασίας της σιλαστατίνης στον μυελό. Σε όλες τις περιπτώσεις, αυτά τα λιπίδια συσχετίστηκαν είτε με μερική είτε με ολική ανάκτηση των επιπέδων ελέγχου που προκαλείται από τη σιλαστατίνη σε σύγκριση με τα τροποποιημένα επίπεδά τους από τη σισπλατίνη. Για όλα τα είδη, οι τιμές AUC για τις καμπύλες ROC που λήφθηκαν ήταν υψηλότερες από 0,85, αποδεικνύοντας τις καλές ικανότητές τους διάκρισης

ΣυζήτησηΣε αυτή την εργασία, έχουμε ποσοτικοποιήσει συνολικά 108 είδη λιπιδίων που περιλαμβάνουν σημαντικά δομικά λιπίδια όπως φωσφολιπίδια, σφιγγολιπίδια και χοληστερόλη μαζί με τις εστεροποιημένες μορφές τους,νεφρόφλοιό και μυελό από αρουραίους που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη και/ή σιλαστατίνη. Αυτό πραγματοποιήθηκε προκειμένου να κατανοηθεί καλύτερα η νεφροτοξική δράση της σισπλατίνης και η προστατευτική δράση της σιλαστατίνης. Έως και 63 είδη λιπιδίων βρέθηκαν να έχουν αλλοιωθεί σημαντικά στον μυελό με θεραπεία με σισπλατίνη, ενώ 56 είδη λιπιδίων επηρεάστηκαν στον φλοιό, αντανακλώνταςνεφρική βλάβηκαι στις δύο περιοχές. Αν και, παραδοσιακά, οι περισσότερες μελέτες AKI που προκαλούνται από σισπλατίνη επικεντρώνονται σε κύτταρα εγγύς σωληναρίου καινεφρώνβλάβη του φλοιού, όπου επικεντρώνεται κυρίως η συσσώρευση του φαρμάκου, πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν το γεγονός ότι ο τραυματισμός στο μυελό μπορεί ακόμη και να είναι τόσο σοβαρός όσο στον φλοιό, με βάση τις δοκιμασίες απόπτωσης TUNEL [5]. Αυτό μπορεί να σχετίζεται με τη συσσώρευση σισπλατίνης στο τμήμα S3 των εγγύς σωληναρίων [3,5], που κατέρχεται προς τον έξω μυελό, εκτός από την πιθανή άμεση και δευτερογενή βλάβη του βρόχου του Henle [4]. Επιπλέον, ο μυελός επισημάνθηκε ως ο πιο ευαίσθητοςνεφρώνπεριοχή για να παρατηρηθούν παγκόσμιες μεταβολές του μεταβολίτη που σχετίζονται με τη σισπλατίνη σε σύγκριση με τον φλοιό [5]. Τα προηγούμενα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης μια άμεση βλάβη των κυττάρων του μυελού (εκτός από τη δευτερογενή βλάβη) από τη σισπλατίνη, η οποία αντανακλάται σε διάφορες φωσφολιπιδικές και καρδιολιπίνες αλλοιώσεις [4]. Αυτά τα νέα αποτελέσματα επεκτείνουν αυτές τις παρατηρήσεις με επιπρόσθετα είδη και κατηγορίες λιπιδίων που έχουν αλλοιωθεί από τη σισπλατίνη και ενισχύουν τη σημασία της βλάβης του μυελού στο AKI που προκαλείται από σισπλατίνη.

Αν και το FC σενεφρόδεν μεταβλήθηκε σημαντικά από τη θεραπεία με σισπλατίνη, τόσο η συνολική CE όσο και όλα τα μεμονωμένα είδη CE αυξήθηκαν σημαντικά τόσο στον φλοιό (οκταπλάσια αύξηση για το συνολικό CE) όσο και στο μυελό (τετραπλάσια αύξηση για το συνολικό CE) σε συνδυασμό με την επαγόμενη από σισπλατίνηνεφρική βλάβη.Η χοληστερόλη είναι ένα βασικό συστατικό των μεμβρανών του πλάσματος, αλληλεπιδρώντας μεταξύ των φωσφολιπιδίων και επηρεάζει τη ρευστότητα, το επιφανειακό φορτίο και τις αλληλεπιδράσεις των ομάδων πολικών κεφαλών [35,36]. Η παρουσία του είναι επίσης θεμελιώδης στις λιπιδικές σχεδίες, καθιερώνοντας υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με το SM και είναι απαραίτητη για τον διαχωρισμό των μορίων και τον έλεγχο της αλληλεπίδρασής τους με άλλα συστατικά της μεμβράνης [37]. Τα κύτταρα διατηρούν μια ισορροπία χοληστερόλης μεταξύ της de novo σύνθεσης στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) και της πρόσληψης που προκαλείται από την LDL. Το μεγαλύτερο μέρος της χοληστερόλης βρίσκεται στη μεμβράνη του πλάσματος, αλλά μπορεί επίσης να επιστρέψει στο ER όπου το FC μπορεί να μετατραπεί (μέσω της εστεροποίησης με τη μεσολάβηση ACAT) σε CE, το οποίο θεωρείται ως κυτταροπλασματική μορφή αποθήκευσης χοληστερόλης [36]. Το CE μπορεί επίσης να υδρολυθεί ξανά σε FC, αποτελώντας τον κύκλο του εστέρα της χοληστερόλης [36]. Το γεγονός ότι η FC ήταν αναλλοίωτη κατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη, αλλά η CE ήταν αυξημένη τόσο στον φλοιό όσο και στο μυελό, υποδηλώνει μια αλλοιωμένηνεφρώνμεταβολισμός της χοληστερόλης που σχετίζεται με την επαγόμενη από σισπλατίνη AKI. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν αρκετά παρόμοιες παρατηρήσεις τόσο σε κύτταρα HK-2 εγγύς σωληναρίου όσο και στον νεφρικό φλοιό από ποντίκια, κατά τη διάρκεια οξείας ισχαιμίαςνεφρική βλάβη, με αμετάβλητο FC και αυξημένα επίπεδα CE [36]. Σε αυτή την περίπτωση, ο τραυματισμός της πλασματικής μεμβράνης, που προκαλεί αυξημένη διακίνηση FC από τη μεμβράνη στο ER, φαινόταν να είναι η πιο εύλογη εξήγηση, με αποτέλεσμα μια κλιμακούμενη γενιά CE. Από αυτή την άποψη, η βλάβη σε λιπιδικές σχεδίες πλούσιες σε χοληστερόλη αντί της πλασματικής μεμβράνης φάνηκε να είναι πιο αποτελεσματική στην αυξημένη διακίνηση χοληστερόλης στο ER [36]. Ένας κυτταροπροστατευτικός ρόλος του CE έχει επίσης υπονοηθεί σε τέτοιες προηγούμενες μελέτες. Αύξηση στα επίπεδα CE αναφέρθηκε επίσης στον αρουραίονεφρώνφλοιού κατά τη διάρκεια της διαβητικής νεφροπάθειας πρώιμου σταδίου [29]. Τα αποτελέσματα συμφωνούν επίσης με μια παγκόσμια αύξηση των ουδέτερων λιπιδίωννεφρώνεγγύς σωληνάρια που αναφέρθηκαν κατά τη θεραπεία με σισπλατίνη [32]. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν για πρώτη φορά μια παγκόσμια αύξηση του συνολικού CE εκτός από μεμονωμένα είδη CE, τόσο στονεφρώνφλοιού και μυελού, κατά τη διάρκεια της επαγόμενης από σισπλατίνη AKI. Η ίδια η σιλαστατίνη, από την άλλη πλευρά, φαινόταν να αυξάνει ελαφρώς το CE 18:0 και το CE 22:6 μόνο στον φλοιό, αν και τα συνολικά επίπεδα του FC ή του CE ήταν αμετάβλητα. Αυτό το ελαφρύ αποτέλεσμα θα μπορούσε να οφείλεται στο γεγονός ότι ο στόχος του, το DHP-I, βρίσκεται στις λιπιδικές σχεδίες στο εγγύς σωληνάριο (κυρίως στον φλοιό) και μπορεί να υπονοηθεί κάποια μικρή διαταραχή της μεμβράνης κατά την αλληλεπίδρασή της. Η συγχορήγηση σισπλατίνης και σιλαστατίνης, από την άλλη πλευρά, οδήγησε σε μείωση όλων των αυξημένων με σισπλατίνη ειδών CE στον φλοιό, ενώ στον μυελό, σχεδόν κανένα αποτέλεσμα ανάκτησης δεν παρατηρήθηκε, με μόνο μερική ανάκτηση του CE18:2 . Αυτό δείχνει την ειδική δράση της σιλαστατίνης στα εγγύς σωληνάρια, ασκώντας σημαντική προστασία από την επέκταση του κυτταρικού θανάτου που σχετίζεται με την άμεση βλάβη της σισπλατίνης στη μεμβράνη του πλάσματος και τις λιπιδικές σχεδίες στον φλοιό, ενώ η κυτταρική βλάβη που σχετίζεται με την ανισορροπία της χοληστερόλης σε ολόκληρο τον μυελό φαίνεται να παραμείνει σε μεγάλο βαθμό απροστάτευτη.

Τα σφιγγολιπίδια είναι ενεργά λιπίδια που βρίσκονται κυρίως στις κυτταρικές μεμβράνες και είναι αρκετά πλούσια σε λιπιδικές σχεδίες [37]. Τα κεραμίδια είναι οι κεντρικοί μεταβολίτες του μεταβολισμού των σφιγγολιπιδίων, που περιλαμβάνουν διάφορα μόρια και ένζυμα με σημαντικούς ρόλους στις κυτταρικές διεργασίες, στη συγκράτηση της κυτταρικής ανάπτυξης, της απόπτωσης, της διαφοροποίησης, της αντοχής στα φάρμακα και της γήρανσης [38,39]. Επιπλέον, τα σφιγγολιπίδια συμμετέχουν στις οδούς που σχετίζονται με τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων της σισπλατίνης και το AKI [33]. Τα κεραμίδια μπορούν να δημιουργηθούν από διάφορες οδούς, συμπεριλαμβανομένης της de novo σύνθεσης, της υδρόλυσης της σφιγγομυελίνης ή της ανακύκλωσης πολύπλοκων σφιγγολιπιδίων [38]. Η de novo σύνθεση είναι η κύρια οδός και λαμβάνει χώρα στο ER, από παλμιτοϋλ-CoA και σερίνη, μέσω μιας σειράς ενζυματικών οδών για την παραγωγή σφιγγανίνης, η οποία οδηγεί σε διυδροκεραμίδια μέσω της διυδροκεραμιδικής συνθάσης (CerS). Τέλος, ο αποκορεσμός του dhCer δημιουργεί Cer [40]. Το SM μπορεί επίσης να υδρολυθεί από σφιγγομυελινάσες, παράγοντας Cer. Το Cer μπορεί να μετατραπεί σε πιο πολύπλοκα σφιγγολιπίδια στη συσκευή Golgi: φωσφορυλιωμένο για να δημιουργήσει Cer-1-P, ένα μόριο σηματοδότησης. μετατρέπεται σε SM με τη δράση της συνθετάσης SM. ή γλυκοζυλιώνεται για να παράγει εσοξυλοκεραμίδια (γλυκοσυλ- ή γαλακτοσυλ-κεραμίδια), πρόδρομες ενώσεις σουλφατιδίων [38]. Το Cer μπορεί επίσης να αποικοδομηθεί σε σφιγγοσίνη, έναν πρόδρομο της φωσφορικής σφιγγοσίνης (S1P), με σημαντικό ρόλο στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη φλεγμονή και την αντίσταση στα φάρμακα [39]. Τέλος, η αποδόμηση του S1P σε αιθανολαμίνη και δεκαεξαδική είναι η οδός εξόδου αυτής της διαδρομής [38].

Κατά τη διάρκεια του ποσοτικού προσδιορισμού των σφιγγολιπιδικών ειδών, παρατηρήθηκε συνολική αύξηση στα συνολικά επίπεδα Cer, dhCer, HexCer και dhHexCer κατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη, η οποία ήταν ιδιαίτερα σημαντική για το Cer. Διαφορές ως προς τον έλεγχονεφρόήταν πιο εμφανείς όταν ποσοτικοποιήθηκαν μεμονωμένα υποείδη, με 19 από τα 22 είδη να αυξάνονται είτε στον φλοιό (11 είδη) και/ή στο μυελό (18 είδη) με θεραπεία με σισπλατίνη. Αυτό συμφωνεί με προηγούμενες παρατηρήσεις που δείχνουν αύξηση των Cer και HexCer στο ποντίκινεφρώνφλοιός που σχετίζεται με τη θεραπεία με σισπλατίνη [33], αλλά εδώ, βρήκαμε ότι ο μυελός επηρεάζεται επίσης από αυτό το αποτέλεσμα.

Αυτές οι παρατηρήσεις μπορεί να αντανακλούν μια αυξημένη μεταβολική παραγωγή Cer/dhCer και HexCer/dhHexCer. Από τη μία πλευρά, αυτό θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί μέσω της αυξημένης δραστηριότητας του CerS, υπό το φως προηγούμενων παρατηρήσεων στονεφρώνφλοιός, όπου η δραστηριότητα του CerS μακράς αλυσίδας μετρήθηκε κατά τη διάρκεια της θεραπείας με σισπλατίνη και η αναστολή του CerS οδήγησε σε μείωση της παρατηρούμενης συσσώρευσης Cer/HexCer [33]. Επιπλέον, μια επαγόμενη από τη σισπλατίνη μείωση των επιπέδων SM/dhSM που βρέθηκε στον φλοιό και το μυελό υποδηλώνει μια επιπλέον αυξημένη παραγωγή Cer/dhCer με υδρόλυση του SM/dhSM μέσω της οδού σφιγγομυελινάσης (SMase) [38], με ιδιαίτερη επίδραση στην μακράς αλυσίδας Cer/dhCer, όλα είναι επιζήμια σε μοντέλα AKI [40]. Αυτό θα συμφωνούσε επίσης με το γεγονός ότι τα είδη Cer μακράς αλυσίδας φαίνεται να είναι σχετικά κατά τη διάρκεια του AKI [40] και με προηγούμενες παρατηρήσεις για αυξημένη δραστηριότητα SMase στηννεφρώνφλοιού κατά τη θεραπεία με σισπλατίνη [33]. Το Cer εμπλέκεται στην απόπτωση που προκαλείται από τη σισπλατίνη μέσω σηματοδότησης τόσο σε εγγενείς όσο και σε εξωγενείς οδούς [39]. Στην εγγενή μιτοχονδριακή οδό, η σισπλατίνη προκαλεί διαπερατότητα της μιτοχονδριακής εξωτερικής μεμβράνης. Η αύξηση του Cer, μαζί με τους κατάντη μεταβολίτες του, μπορεί να συμβάλει σε αυτή τη διαπερατότητα και ο σχηματισμός των καναλιών από το Cer διευκολύνει την απόπτωση στη μιτοχονδριακή μεμβράνη, επιτρέποντας την είσοδο του Bax στο μιτοχονδριακό εξωτερικό μεμβράνη, καθώς και την εκροή κυτόχρωμα C [39]. Επιπλέον, η εξωγενής απόπτωση με τη μεσολάβηση Fas χρησιμοποιεί υποδοχέα Fas που βρίσκεται στις λιπιδικές σχεδίες, με τη συσσώρευσή του να προκαλείται από την ενεργοποίηση της SMase που προκαλείται από τη σισπλατίνη και την ανύψωση Cer [39]. Επομένως, το Cer καθορίζει την απόπτωση σε AKI που προκαλείται από σισπλατίνη, ενώ η ισοπέδωσή τους μέσω της μετατροπής τους σε HexCer φαίνεται να είναι προστατευτική [33] και σχετίζεται με αντοχή στη σισπλατίνη [39]. Το Cer που παράγεται σε μεγάλες ποσότητες μπορεί επίσης να επηρεάσει τις φυσικές ιδιότητες των μεμβρανών και μπορεί να εκτοπίσει τη χοληστερόλη και να οδηγήσει την εστεροποίησή της [35]. Από την άλλη πλευρά, η SM είναι κυρίως παρούσα στις πλασματικές μεμβράνες και έχει άμεση σχέση με τα μόρια της χοληστερόλης, ιδιαίτερα σημαντική στις λιπιδικές σχεδίες [41]. Η έλλειψη αναγέννησης SM θα μπορούσε να είναι αρνητική για τη σωστή λειτουργία της μεμβράνης [41].

Θειούχα είναι άφθονα στονεφρό,ειδικά στην κορυφαία μεμβράνη των περιφερικών σωληναρίων [42]. Αν και δεν είναι απαραίτητα για το φυσιολογικόνεφρική λειτουργία, μια ανεπάρκεια θείου έχει βρεθεί ότι αντισταθμίζεται από την αυξημένη παραγωγή θειικών γλυκολιπιδίων και χολητερόλης [42]. Το σουλφατίδιο είναι ένας βασικός συνδέτης L-σελεκτίνης στονεφρό,με ζωτικό ρόλο στη διήθηση μονοκυττάρων στονεφρόδιάμεσο [42]. Από την άλλη πλευρά, η μυελίνη και η λεμφοκυτταρική πρωτεΐνη (MAL) που σχετίζεται με τη σχεδία λιπιδίων σχηματίζει σύμπλοκα με σουλφατίδια και γλυκοσφιγγολιπίδια σενεφρώνμεμβράνες, συμβάλλοντας στη σταθεροποίηση και τη διαλογή μικροτομέων εμπλουτισμένων με γλυκοσφιγγολιπίδια [42]. Τα αποτελέσματά μας σχετικά με τις αλλοιώσεις του θείου στον φλοιό και το μυελό επιβεβαιώνουν προηγούμενες μελέτες όπου πιστεύεται ότι διάφορα είδη σουλφατιδίων μεταβάλλονται από τη σισπλατίνη στους νεφρούς [34].

Όλα τα είδη Cer, dhCer, HexCer και dhHexCer που αλλοιώθηκαν στον φλοιό από σισπλατίνη ανακτήθηκαν εν μέρει ή πλήρως με τη συγχορήγηση σιλαστατίνης, ενώ στον μυελό, μεγάλη ποσότητα ειδών Cer δεν ανακτήθηκε, με σχεδόν πλήρη ανάκτηση του dhCer , HexCer και dhHexCer. Λαμβάνοντας υπόψη τη συμμετοχή των ειδών Cer στην εξωγενή απόπτωση που προκαλείται από Fas και την απόφραξή της από τη δέσμευση της σιλαστατίνης στο DHP-I σε λιπιδικές σχεδίες στο εγγύς σωληνάριο, αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει το προστατευτικό αποτέλεσμα και την ανάκτηση Cer που λαμβάνει χώρα κυρίως στα κύτταρα του φλοιού. Όσον αφορά τα SM, dhSM και Sulf, η ανάκτηση της σιλαστατίνης φάνηκε να είναι πιο σχετική στον μυελό παρά στον φλοιό, υποδηλώνοντας ότι η δευτερογενής βλάβη επηρεάζεται από τη δράση της σιλαστατίνης στα εγγύς σωληνάρια που φτάνουν στον έξω μυελό, όπου τα περισσότερανεφρική βλάβησυγκεντρώνεται [4].

Τα φωσφολιπίδια είναι τα πιο άφθονα είδη στις κυτταρικές μεμβράνες, όπου κυριαρχεί το PC και, σε μικρότερο βαθμό, το PE, με υψηλότερη παρουσία PC στην πλευρά του αυλού και το PE να είναι πιο άφθονο στο φυλλάδιο του κυτοσολίου [35,43]. Τα λυσοφωσφολιπίδια είναι, από την άλλη πλευρά, είδη σηματοδότησης που μπορούν να δημιουργηθούν από την υδρόλυση γλυκεροφωσφολιπιδίων συμπεριλαμβανομένου του LPC [35]. Τα περισσότερα από τα 60 είδη PC, PE και LPC που προσδιορίστηκαν ποσοτικά βρέθηκαν να αλλοιώνονται από τη θεραπεία με σισπλατίνη, είτε στον φλοιό είτε στο μυελό, με το PC και το LPC να παρουσιάζουν μεγαλύτερο αριθμό αλλαγών στον φλοιό, ενώ οι αλλαγές που σχετίζονται με το PE ήταν πιο πολλές και προεξέχον στο μυελό. Μεταβολές τωννεφρώνΤα είδη PC, PE ή LPC ως αποτέλεσμα της θεραπείας με σισπλατίνη είναι σύμφωνα με προηγούμενες αναφερόμενες παρατηρήσεις στονεφρόκατά την ΑΚΗ [4,5,26,34,44]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα περισσότερα αλλαγμένα είδη PE, PC και LPC μειώθηκαν από τη σισπλατίνη τόσο στον φλοιό όσο και στο μυελό. Όσον αφορά τη νεφροπροστατευτική δράση της σιλαστατίνης, εντυπωσιακά, παρατηρήθηκε υψηλότερος βαθμός δράσης μερικής ή ολικής ανάκτησης στον μυελό για λιπίδια που έχουν αλλοιωθεί από τη σισπλατίνη απ' ό,τι στον φλοιό. Ένα άλλο ενδιαφέρον γεγονός είναι ότι όλα αυτά τα αυξημένα με σισπλατίνη είδη PC, PE και LPC στον φλοιό και τον μυελό ανακτήθηκαν από τη σιλαστατίνη, ενώ τα περισσότερα είδη με μειωμένη σισπλατίνη στον φλοιό εξακολουθούσαν να αλλοιώνονται κατά τη διάρκεια της συν-θεραπείας με σιλαστατίνη. Αυτό μπορεί να υποδηλώνει υψηλότερο βαθμό άμεσης βλάβης που προκαλείται από τη συσσώρευση της σισπλατίνης στον φλοιό, που παραμένει απροστάτευτη από τη σιλαστατίνη και οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο και σχετιζόμενο PC, PE (τα κύρια συστατικά της κυτταρικής μεμβράνης) και απελευθέρωση LPC σε αποπτωτικά σώματα και επομένως η μείωση των επιπέδων τους. Αντίθετα, η δευτερογενής βλάβη που σχετίζεται με την εξωγενή απόπτωση και την επακόλουθη συσσώρευση πρωτεϊνικού χυτού στα εγγύς σωληνάρια μπορεί να προστατευθεί από τη σιλαστατίνη. Αυτό θα σήμαινε ότι τα είδη PC, PE και LPC μειώθηκαν στον μυελό και σχετίζονται περισσότερο με δευτερογενή κυτταρική βλάβη που προκαλείται από σισπλατίνη. Από την άλλη πλευρά, τα αυξημένα είδη PC, PE και LPC μπορεί να σχετίζονται είτε με την αναγέννηση της κυτταρικής μεμβράνης είτε με διεργασίες σηματοδότησης, οι οποίες, σύμφωνα με αυτά τα αποτελέσματα, μπορεί να σχετίζονται περισσότερο με δευτερογενή εξωγενή απόπτωση βλάβη που προκαλείται από τη σισπλατίνη που προστατεύεται από τη σιλαστατίνη.

Επιπλέον, παρατηρήθηκε επίσης μια μείωση που προκαλείται από τη σισπλατίνη στο ποσοστό των ειδών PC και PE με πολύ ακόρεστες λιπαρές αλυσίδες, η οποία μπορεί να σχετίζεται με διαδικασίες υπεροξείδωσης λιπιδίων και θα μειωνόταν από τη σιλαστατίνη [4,10,11].

Σε παγκόσμιο επίπεδο, εντός των λιπιδικών ειδών που ποσοτικοποιούνται εδώ, το αποτέλεσμα ανάκτησης της σιλαστατίνης παρατηρήθηκε σε 26 από τα 56 αλλαγμένα με σισπλατίνη λιπίδια στον φλοιό και σε 50 από τα 63 αλλαγμένα με σισπλατίνη λιπίδια στον μυελό. Ίσως, αυτό αντανακλά υψηλό βαθμό λιπιδικών αλλαγών που σχετίζονται με απροστάτευτη άμεση μιτοχονδριακή βλάβη που ασκείται από τη σισπλατίνη κυρίως στον φλοιό σε σύγκριση με το μυελό, με περισσότερες αλλαγές λιπιδίων που σχετίζονται με δευτερογενή προστασία από βλάβη που ανιχνεύονται σε ολόκληρο το μυελό. Επιπλέον, η πολυπαραγοντική ανάλυση επέτρεψε τον εντοπισμό πιθανών νέων βιοδεικτών λιπιδίων τόσο για το AKI που προκαλείται από σισπλατίνη όσο και για την σιλαστατίνηνεφροπροστασία, συμπεριλαμβανομένων των ειδών CE, Sulf, PE, PC, Cer ή HexCer, όπως περιγράφεται στις Ενότητες 2.5 και 2.6. Από τα ευρήματά μας, το CE 18:2 και το PE 36:5 είναι πιθανοί υποψήφιοι βιοδείκτες ικανοί να διακρίνουν ταυτόχρονα τη βλάβη της σισπλατίνης και της σιλαστατίνηςνεφροπροστασίατόσο στον φλοιό όσο και στον μυελό. Ωστόσο, καθώς η ανάκτηση αυτών των δύο ειδών με σιλαστατίνη είναι μερική, πιο κατάλληλα είδη ως βιοδείκτες θα ήταν το dhHexCer 34:0 στον φλοιό και το Sulf 42:0 στο μυελό, με δυνατότητα διάκρισης και των δύονεφρική βλάβηκαι προστασία, με τη σιλαστατίνη να ανακτά πλήρως τα μεταβαλλόμενα από τη σισπλατίνη επίπεδα σε αυτά της ομάδας ελέγχου. Αυτό θα μπορούσε να επεκταθεί σε οποιαδήποτε νεφρική βλάβη με τη μεσολάβηση του συνδέτη Fas/Fas, αλλά θα πρέπει να επιβεβαιωθεί σε μελλοντικές μελέτες. Τα τελευταία χρόνια έχουν προταθεί αρκετοί νέοι βιοδείκτες της ΑΚΙ, κυρίως πρωτεΐνες (π.χ. KIM-1 [45] ή NGAL [46]). Το γεγονός ότι βρήκαμε πιθανούς νέους βιοδείκτες της επαγόμενης από σισπλατίνη AKI και της σχετικής προστασίας από σιλαστατίνη, λιπιδικής φύσηςνεφρόιστού, επεκτείνει την υπάρχουσα γνώση και παρέχει συμπληρωματικές επιλογές για καλύτερη διάγνωση, πρόγνωση και παρακολούθηση. Στην πραγματικότητα, ένας συνδυασμός ανίχνευσης βιοδεικτών μπορεί να χρησιμοποιηθεί ακόμη και ως ένδειξη μιας συγκεκριμένης AKI που προκαλείται είτε από ένα συγκεκριμένο νεφροτοξικό (όπως η σισπλατίνη) είτε από άλλη αιτία, και ακόμη και να διακρίνει την κατάσταση/εξέλιξη της νόσου. Ένα άλλο βήμα παραπέρα θα ήταν να καθορίσουμε εάν τα αποτελέσματά μας θα αλλάξουννεφρώνΤα πρότυπα λιπιδίων αντανακλώνται επίσης στα κυκλοφορούντα λιπίδια στο αίμα ή στα ούρα. Αυτό θα έκανε την ανίχνευση βιοδεικτών για AKI και σιλαστατίνη που προκαλείται από σισπλατίνηνεφροπροστασίαπιο εφικτό στους ασθενείς.

Οι επαγόμενες από τη σισπλατίνη αλλαγές στα επίπεδα λιπιδίων που σχετίζονται με το AKI είναι πολυάριθμες και ποικίλες, και περιλαμβάνουν σημαντικά δομικά λιπίδια στο σύνολο τηςνεφρώνδομή: ο φλοιός και ο μυελός. Η εξασθένιση πολλών από αυτές τις αλλαγές από τη σιλαστατίνη δείχνει τις μεγάλες δυνατότητες βελτίωσης τηςνεφρική λειτουργίακαι μείωση των δομικών αλλαγών που σχετίζονται με τα λιπίδια, σε συσχέτιση με ένα κανονικοποιημένονεφρώνμορφολογία. Και πάλι, η σιλαστατίνη έχει αποδειχθεί χρήσιμη για τη διάκριση απροστάτευτης άμεσης κυτταρικής βλάβης που προκαλείται από σισπλατίνη και δευτερογενών αλλαγών που σχετίζονται με πρωτογενή βλάβη, η οποία μπορεί να επηρεαστεί στα εγγύς σωληνάρια από την απόφραξη της σιλαστατίνης της αποπτωτικής οδού με τη μεσολάβηση Fas

Υλικά και μέθοδοι

ΑντιδραστήριαΗ σιλαστατίνη (που παρέχεται ευγενικά από τη Merck Sharp και την Dohme SA, Μαδρίτη, Ισπανία) και σισπλατίνη (Pharmacia Nostrum (Μαδρίτη, Ισπανία) χρησιμοποιήθηκαν. Ένα διάλυμα NaCl {{{0},9 τοις εκατό (Braun Medical SA, Βαρκελώνη, Ισπανία) χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή φαρμακευτικών διαλυμάτων για χορήγηση. ß-1,10-N-δωδεκανοϋλ-D-ερυθρο-σφιγγοσίνη [HexCer 30:1 (d18:1/12:0)], N-δωδεκανοϋλ D -ερυθρο σφιγγανυλοφωσφορυλοχολίνη [dhSM 3{{50}}:0 (d18:0/12:0)], 1,2-διμυριστολεοϋλ-sn γλυκερό-3- φωσφοχολίνη [PC 28:2 (14:1/14:1)], 1-επταδεκανοϋλ-2-υδροξυ-sn-γλυκερό-3- φωσφοχολίνη [LPC (17:0)] και 1, 2- διπαλμιτελέλαιο-sn-γλυκερό-3-φωσφοαιθανολαμίνη [PE 32:2 (16:1/16:1)] αγοράστηκαν από την Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, ΗΠΑ). Δευτεροιωμένο Ν-τετρακοσανοϋλ- D-ερυθρο-σφιγγοσίνη [Cer 42:1-d7 (d18:1/24:0)], Ν-στεαροϋλ D-ερυθρο-διυδροσφιγγοσίνη [dhCer (36:0-d3)] και C16-30-σουλφογαλακτοσυλκεραμίδιο [Sulf 34:1(d18:1/16:0)] αποκτήθηκαν από την Matreya LLC (State College, PA, USA). Η χοληστερόλη-d7 (FC-d7) και η παλμιτική χοληστερόλη-d7 [CE (16:0-d7)] ήταν από τη Sigma-Aldrich.

Χρησιμοποιήθηκαν αποκλειστικά διαλύτες και αντιδραστήρια ποιότητας HPLC ή LC-MS, συμπεριλαμβανομένων μεθανόλης (MeOH), ακετονιτριλίου (ACN) και ισοπροπανόλης (iPrOH) (VWR International Eurolab, Βαρκελώνη, Ισπανία), καθώς και χλωροφόρμιο, διχλωρομεθάνιο και αμμώνιο για το mate (NH4COOH) (Sigma-Aldrich, Merck Life Science SL, Μαδρίτη, Ισπανία). Το υπερκαθαρό νερό ελήφθη από ένα σύστημα καθαρισμού Milli-Q (Millipore, Merck Life Science SL, Μαδρίτη, Ισπανία).

Ζωικό μοντέλοΕνήλικοι αρσενικοί αρουραίοι Wistar (WKY, Criffa, Barcelona, ​​Ισπανία) εκτράφηκαν στο Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón (IiSGM, Μαδρίτη, Ισπανία). Αυτά διατηρήθηκαν υπό ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας, φωτός και υγρασίας με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Οι θεραπείες χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4,11] σε τέσσερις ομάδες αρουραίων (n=6 ζώα ανά ομάδα): Ομάδα 1: Έλεγχος (CNT) - 0. 9 τοις εκατό NaCl εγχύθηκε στο αρουραίους με τον ίδιο τρόπο όπως οι θεραπείες για τις ομάδες 3 και 4· Ομάδα 2: Σιλαστατίνη (CIL) με ένεση (150 mg kg 1 σωματικού βάρους (BW) την ημέρα). Ομάδα 3: Σισπλατίνη (CISPL) με ένεση (μοναδική δόση 5 mg kg 1 σωματικού βάρους την ημέρα 0). και Ομάδα 4: σισπλατίνη συν σιλαστατίνη (CISCIL)- με ένεση 5 mg kg 1 σ.β. την ημέρα 0 και ένεση με σιλαστατίνη (150 mg kg 1 σ.β. την ημέρα). Τα ζώα θυσιάστηκαν πέντε ημέρες μετά την έναρξη της θεραπείας. Πριν από αυτό, συλλέχθηκαν ούρα 24 ωρών σε μεταβολικούς κλωβούς από κάθε αρουραίο. Ορός αίματος απομονώθηκε επίσης με φυγοκέντρηση. Οι νεφροί αφαιρέθηκαν μετά από έγχυση με αλατούχο διάλυμα 0,9 τοις εκατό στους 4 ◦C, και ακολούθησε αφαίρεση κάψουλας. Ο φλοιός και ο μυελός του αριστερούνεφρόκαι το εγκάρσια τομή μισό του δεξιούνεφρόαποκόπηκαν, καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό Ν2 και τελικά αποθηκεύτηκαν στους t 80 ◦C. Το άλλο μισό της δεξιάςνεφρόσταθεροποιήθηκε σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη και ενσωματώθηκε σε παραφίνη για ιστολογικές μελέτες.

Ιστολογικές ΜελέτεςΠραγματοποιήθηκε χρώση αιματοξίνης/ηωσίνης (Sigma-Aldrich, Steinhem, Γερμανία) σε οβελιαίο αρουραίο 5 μmνεφρόενότητες. Ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο IX70 (Όλυμπος, Αμβούργο, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για τη λήψη μικροφωτογραφιών σε μεγέθυνση 20× και 60×, για ιστολογική εξέταση.

Δείκτες νεφρικής λειτουργίαςΈνας AutoAnalyzer Cobas 711 (Roche, Basel, Switzerland) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό BUN, κρεατινίνης, νατρίου και καλίου σε δείγματα ορού. Ο ρυθμός κάθαρσης κρεατινίνης χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του GFR. Η ολική πρωτεΐνη προσδιορίστηκε στα ούρα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σουλφοσαλικυλικού οξέος [47].

Ομογενοποίηση ιστού  Νεφρόιστοί φλοιού και μυελού (περίπου 50 mg ο καθένας) προστέθηκαν σε πλαστικούς σωλήνες με βιδωτό καπάκι 1,5 mL που περιείχαν 800 μL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης: 50 mM Tris–HCl pH 7,5, 125 mM NaCl, 5 mM NaF, 1,4 mM NaF, 1,4 mM Na4O4 mM και αναστολέα πρωτεάσης (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA) και σφαιρίδια ζιρκονίου 1,5 mm. Οι ιστοί διαχωρίστηκαν σε ένα BeadBug-6 Ομογενοποιητή (Benchmark D1036-E, Bechmark Scientifific, Sayreville, NY, ΗΠΑ) στις 4500 rpm, σε τρεις κύκλους των 90 δευτερολέπτων. Το ομογενοποίημα υποβλήθηκε περαιτέρω σε υπερήχους για 40 δευτερόλεπτα στο 10 τοις εκατό του πλάτους και φυγοκεντρήθηκε στα 600 x g για 1 λεπτό στους 4 °C. Ένα κλάσμα του προκύπτοντος υπερκειμένου αραιώθηκε 1:10 για τον προσδιορισμό της ολικής πρωτεΐνης με τη δοκιμασία πρωτεΐνης δικινχονικού οξέος (BCA) (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA). Το υπόλοιπο του εκχυλίσματος πρωτεΐνης αποθηκεύτηκε στους t 80 ◦C μέχρι τη λιπιδομική ανάλυση.

Λιπιδομική Ανάλυση με LC-MS/MSΤα λιπίδια εκχυλίστηκαν από τους ιστούς (που ισοδυναμούν με 250 μg ολικής πρωτεΐνης) σύμφωνα με τη μέθοδο του Folch [48]. Δέκα μικρολίτρα μίγματος εσωτερικού προτύπου (IS) προστέθηκαν πριν από την εκχύλιση λιπιδίων για να ληφθεί η σχετική μοριακή ποσοτικοποίηση των ειδών λιπιδίων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [49]. Το μείγμα IS αποτελούνταν από τα εξής: CE (16:0-d7), FC-d7, Cer (42:{{{{0}} d7), HexCer (30 :1), LPC (17:0), PC (28:2), PE (32:2), SM (30:1), dhSM (30:0), dhCer (35:0) και Sulf (34 :1), στις συγκεντρώσεις που δίνονται στον Πίνακα S4. Τα λιπιδικά εκχυλίσματα ξηράνθηκαν υπό ρεύμα αζώτου και ανασυστάθηκαν σε 250 μL ακετονιτριλίου/ισοπροπανόλης (1:1, όγκος: όγκος), υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 10 λεπτά, και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε ένα φιαλίδιο ένεσης.

Πέντε μικρολίτρα του λιπιδικού εκχυλίσματος εγχύθηκαν σε σύστημα LC Eksigent UltraLC{{0}} (AB-Sciex LLP, Framingham, ΜΑ, ΗΠΑ). Τα είδη διαχωρίστηκαν σε στήλη Kinetex C18 (100 χ 2,1 mm, 1,7 μm· Phenomenex, Macclesfifield, UK) που λειτουργεί στους 55°C. Η έκλουση εφαρμόστηκε χρησιμοποιώντας ένα δυαδικό μείγμα διαλύτη Α (60 τοις εκατό ακετονιτρίλιο σε νερό, 10 mM NH4COOH) και διαλύτη Β (90 τοις εκατό ισοπροπυλική αλκοόλη σε ακετονιτρίλιο, 10 mM NH4COOH) και μια γραμμική βαθμίδα από 60 τοις εκατό Α έως 100 τοις εκατό Β σε 12 min και 100 τοις εκατό Β έως 60 τοις εκατό Α σε 8 λεπτά, με ρυθμό ροής 0,4 mL min悆 1 . Ένα όργανο QTrap 4000 (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση λιπιδίων, με λογισμικό Analyst 1.6.2. Το άζωτο χρησιμοποιήθηκε τόσο ως αέριο ξήρανσης (Τ: 500 ◦C, πίεση: 30 psi) όσο και ως αέριο νεφοποίησης (50 psi). Η ανίχνευση τέθηκε σε θετική λειτουργία ηλεκτροψεκασμού (ESI) για όλες τις κατηγορίες λιπιδίων με εξαίρεση το Sulf, το οποίο αναλύθηκε σε αρνητικό τρόπο λειτουργίας ESI. Τα CE και FC αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την πηγή χημικού ιονισμού ατμοσφαιρικής πίεσης (APCI) στη λειτουργία θετικού ιόντος. Χρησιμοποιήθηκε μια στοχευμένη προσέγγιση για την ανίχνευση λιπιδίων που ρυθμίζει τις μεταβάσεις παρακολούθησης πολλαπλών αντιδράσεων (MRM) για κάθε είδος λιπιδίου στους χρόνους κατακράτησης τους (Πίνακας S5). Τα χρωματογραφήματα κορυφής LC-MS/MS υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό Skyline έκδοση 4.1 (MacCoss Lab, Seattle, WA, ΗΠΑ) [50]. Τα είδη λιπιδίων ποσοτικοποιήθηκαν με άμεση σύγκριση της περιοχής για κάθε είδος με την περιοχή του IS για την κατηγορία λιπιδίων τους, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [49]. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως nmol/mg πρωτεΐνης. Τα επίπεδα ολικής κατηγορίας λιπιδίων προσδιορίστηκαν ως το άθροισμα των μεμονωμένων ειδών κατηγορίας λιπιδίων που ποσοτικοποιήθηκαν. Τα είδη λιπιδίων χαρακτηρίστηκαν σύμφωνα με τη συνιστώμενη σημείωση [51].

Στατιστική ανάλυσηΟι τιμές εκφράστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση. Το SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε για περιγραφική στατιστική και αξιολόγηση στατιστικών διαφορών στις μεταβλητές μεταξύ των ομάδων με ανάλυση διακύμανσης. Για τη σύγκριση δύο μη ζευγαρωμένων ομάδων μεταβλητών λιπιδίων, πραγματοποιήθηκαν παραμετρικές (δύο ουρές μη ζευγαρωμένο Student's t) ή μη παραμετρικές (Mann–Whitney) δοκιμές μετά από έλεγχο κανονικότητας (Shapiro–Wilk). Η μέθοδος Benjamini–Hochberg χρησιμοποιήθηκε για τη διόρθωση του ρυθμού ψευδούς ανακάλυψης (FDR) των τιμών p κατά τη σύγκριση πολλαπλών μεμονωμένων ειδών λιπιδίων. Μια αμφίπλευρη τιμή p < 0.05="" και="" fdr="">< 0,1="" λήφθηκαν="" υπόψη="" για="" τον="" προσδιορισμό="" στατιστικά="" σημαντικών="" διαφορών="" για="" να="" αποφευχθεί="" η="" απώλεια="" πιθανών="" υποψηφίων="" βιοδεικτών.="" η="" αλλαγή="" στο="" διπλάσιο="" της="" ομάδας="" χ="" έναντι="" της="" ομάδας="" υ="" υπολογίστηκε="" ως="" ο="" λόγος="" των="" μέσων="" τιμών="" για="" τις="" μεταβλητές="" των="" αντίστοιχων="" ομάδων="">

Η ανάλυση δεδομένων πολλαπλών μεταβλητών (MVDA) πραγματοποιήθηκε με χρήση SIMCA έκδοσης 14.1 (MKS Umetrics, Uppsala, Sweden) και MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca (πρόσβαση στις 30 2 Σεπτεμβρίου {{20}}21)) [52], συμπεριλαμβανομένου του μη εποπτευόμενου PCA και του εποπτευόμενου OPLSDA. Οι τιμές που λείπουν αντικαταστάθηκαν με τη μέθοδο k-πλησιέστερων γειτόνων. Οι μεταβλητές μετασχηματίστηκαν log-μετασχηματίστηκαν και κλιμακώθηκαν σε pareto πριν από το MVDA. Τα μοντέλα αξιολογήθηκαν σύμφωνα με τις τιμές R2 και Q2 τους. Το OPLS-DA επικυρώθηκε με δοκιμή μετάθεσης (100 κύκλοι). Οι βαθμολογίες VIP και τα S-plots από μοντέλα OPLS-DA χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των σχετικών μεταβλητών σε ομαδικές διακρίσεις CISPL έναντι CNT, CISCIL έναντι CNT και CISCIL έναντι CISPL. Ταυτόχρονη συμμόρφωση με το VIP > 1, οι φορτίσεις κλιμακώνονται ως συντελεστής συσχέτισης |p(corr)| > 0,5 και τιμή p δύο όψεων < 0,05="" και="" fdr="">< 0,1="" για="" σύγκριση="" δύο="" ομάδων="" ήταν="" τα="" κριτήρια="" που="" χρησιμοποιήθηκαν="" για="" την="" πιθανή="" επιλογή="" βιοδεικτών.="" οι="" τιμές="" auc="" ελήφθησαν="" από="" τα="" διαγράμματα="" καμπύλης="">

Διπλώματα ευρεσιτεχνίαςΤα ακόλουθα διπλώματα ευρεσιτεχνίας σχετίζονται εν μέρει με την εργασία που παρουσιάζεται σε αυτό το χειρόγραφο: "Χρήση σιλαστατίνης για μείωση της νεφροτοξικότητας διαφόρων ενώσεων" (αριθμοί ευρεσιτεχνίας EP2,143,429 B1, US 9,216,185 B2, US 9,522,128 B2, και US9,757,349 B). Αυτά εκχωρούνται στο Fundación para la Investigación Biomédica Hospital Gregorio Marañón (FIBHGM) και αδειοδοτούνται από την FIBHGM στην Telara Pharma SL Η Telara Pharma SL έχει συνάψει συμφωνία αδειοδότησης με την Arch Biopartners.