Παραγωγή λιπάσης από Yarrowia Lipolytica σε ζύμωση στερεάς κατάστασης χρησιμοποιώντας υποπροϊόντα φρούτων Amazon και άλευρα σόγιας ως υπόστρωμα Μέρος 1

Αφηρημένη: Η παραγωγή πολυακόρεστων λιπαρών οξέων από ιχθυέλαιο, τα οποία σχετίζονται με διάφορα οφέλη για την υγεία, συμπεριλαμβανομένων των επιδράσεων κατά των καρδιαγγειακών παθήσεων, των αντιυπερτασικών, αντικαρκινικών, αντιοξειδωτικών, αντικαταθλιπτικών, αντιγηραντικών και αντιαρθριτικών επιδράσεων, μεταξύ άλλων, μπορεί να πραγματοποιηθεί πλεονεκτικά μέσω την εφαρμογή λιπάσης. Ωστόσο, το υψηλό κόστος που σχετίζεται με την παραγωγή ενζύμων μπορεί να καταστήσει τη διαδικασία ανέφικτη και επομένως θα πρέπει να διερευνηθούν εναλλακτικά υποστρώματα για την επίλυση αυτών των προβλημάτων. Αυτή η έρευνα στόχευε στην παραγωγή λιπάσης από το Yarrowia lipolytica IMUFRJ50682 σε ζύμωση στερεάς κατάστασης χρησιμοποιώντας υποπροϊόντα της βιομηχανίας επεξεργασίας τροφίμων (κέικ ελαίου andiroba και σογιάλευρο) και να επαληθεύσει την πιθανή εφαρμογή στην αρχική υδρόλυση ιχθυελαίου για περαιτέρω παραγωγή πολυακόρεστων λιπαρών οξέων σε κατάλληλη διεργασία. Πραγματοποιήθηκε έλεγχος για την ανάλυση συνδυασμών κέικ ελαίου andiroba και σογιάλευρου σε διαφορετικές αναλογίες (0:1{{2{{0}}0 έως 100:0, αντίστοιχα) στις 48 ώρες του διαδικασία ζύμωσης. Στη συνέχεια, η στερεά μήτρα που αποτελείται από σογιάλευρο και κέικ ελαίου andiroba συμπληρώθηκε με σογιέλαιο και Tween 80 για τη βελτίωση της δραστηριότητας της λιπάσης. Το ενζυματικό εκχύλισμα χαρακτηρίστηκε από το προφίλ πρωτεΐνης με ηλεκτροφόρηση. Τέλος, το ενζυματικό εκχύλισμα και ο στερεός βιοκαταλύτης που παρήχθη εφαρμόστηκαν για την αξιολόγηση της πιθανής υδρόλυσης του ιχθυελαίου σε μια αρχική μελέτη. Η μέγιστη λιπολυτική δραστηριότητα (63,7 U·g −1) επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας κέικ ελαίου andiroba και σογιάλευρο (50:50) μετά από 24 ώρες ζύμωσης. Το σογιέλαιο 1,5 τοις εκατό και το Tween 80 (0,001 τοις εκατό ) σε ένα γαλάκτωμα παρείχαν αύξηση κατά 1,{23}} φορές (82,52 U·g −1) στη δραστηριότητα του ενζύμου. Η ηλεκτροφορητική ανάλυση έδειξε μια ζώνη μεταξύ 37 και 40 kDa που μπορεί να σχετίζεται με τη λιπάση και μια ζώνη 75 kDa που αναφέρεται στην υπομονάδα της -κονγλυκινίνης που υπάρχει στο σογιάλευρο. Μετά από 48 ώρες, ο στερεός βιοκαταλύτης έδειξε υψηλότερο βαθμό υδρόλυσης (DH) (71,0 τοις εκατό) από το ενζυματικό εκχύλισμα (61,5 τοις εκατό). Ο στερεός βιοκαταλύτης ήταν σταθερός κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου για 7 μήνες. Η παραγωγή λιπασών με χρήση υποπροϊόντος φρούτων Amazon και άλευρα σόγιας σε ζύμωση στερεάς κατάστασης είναι βιώσιμη, καθώς και η εφαρμογή του εκχυλίσματος και του στερεού βιοκαταλύτη στην αρχική εφαρμογή για την υδρόλυση ιχθυελαίου για περαιτέρω παραγωγή πολυακόρεστων λιπαρών οξέων σε βιομηχανικά κατάλληλη διαδικασία.

Το γλυκοσίδιο του cistanche μπορεί επίσης να αυξήσει τη δραστηριότητα του SOD στους ιστούς της καρδιάς και του ήπατος και να μειώσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε λιποφουσκίνη και MDA σε κάθε ιστό, καθαρίζοντας αποτελεσματικά διάφορες δραστικές ρίζες οξυγόνου (OH-, H2O2, κ.λπ.) και προστατεύοντας από βλάβη του DNA που προκαλείται από ρίζες ΟΗ. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistanche έχουν ισχυρή ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών, υψηλότερη αναγωγική ικανότητα από τη βιταμίνη C, βελτιώνουν τη δραστηριότητα του SOD στο εναιώρημα σπέρματος, μειώνουν την περιεκτικότητα σε MDA και έχουν μια ορισμένη προστατευτική δράση στη λειτουργία της σπερματικής μεμβράνης. Οι πολυσακχαρίτες Cistanche μπορούν να ενισχύσουν τη δραστηριότητα των SOD και GSH-Px σε ερυθροκύτταρα και ιστούς πνευμόνων πειραματικά γηρασμένων ποντικών που προκαλούνται από D-γαλακτόζη, καθώς και να μειώσουν την περιεκτικότητα σε MDA και κολλαγόνο στους πνεύμονες και στο πλάσμα και να αυξήσουν την περιεκτικότητα σε ελαστίνη. ένα καλό αποτέλεσμα σάρωσης στο DPPH, παρατείνει το χρόνο της υποξίας σε γηρασμένα ποντίκια, βελτιώνει τη δραστηριότητα του SOD στον ορό και καθυστερεί τον φυσιολογικό εκφυλισμό του πνεύμονα σε πειραματικά γηρασμένα ποντίκια Με τον κυτταρικό μορφολογικό εκφυλισμό, τα πειράματα έχουν δείξει ότι το Cistanche έχει την καλή αντιοξειδωτική ικανότητα και έχει τη δυνατότητα να είναι φάρμακο για την πρόληψη και τη θεραπεία ασθενειών της γήρανσης του δέρματος. Ταυτόχρονα, η εχινακοσίδη στο Cistanche έχει σημαντική ικανότητα να καθαρίζει τις ελεύθερες ρίζες DPPH και μπορεί να καθαρίζει δραστικά είδη οξυγόνου, να αποτρέπει την αποικοδόμηση του κολλαγόνου που προκαλείται από ελεύθερες ρίζες και επίσης έχει μια καλή επίδραση επιδιόρθωσης στη βλάβη των ανιόντων από τις ελεύθερες ρίζες θυμίνης.

Κάντε κλικ στο Συμπλήρωμα Cistanche Tubulosa

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Λέξεις-κλειδιά: Carapa guianensis Aublet; παραγωγή λιπάσης; ζύμωση σε στερεά κατάσταση; βιωσιμότητα; Yarrowia lipolytica

1. Εισαγωγή

Τα φρούτα του Αμαζονίου έχουν υψηλές βιοτεχνολογικές δυνατότητες για έρευνα και εφαρμογή σε διάφορους τομείς της οικονομίας, όπως η φαρμακευτική βιομηχανία και η βιομηχανία τροφίμων, λόγω της παρουσίας μακροθρεπτικών και μικροθρεπτικών συστατικών, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών, υδατανθράκων, ινών, καροτενοειδών, πολυακόρεστων λιπαρών οξέων και βιταμινών, μεταξύ άλλων. [1].

Το Andiroba (Carapa guianensis Aublet) είναι ένα φυτό του Αμαζονίου που παράγει καρπούς ελαιούχων σπόρων με εμπορική δυνατότητα για εκχύλιση λαδιού με φαρμακευτικές ιδιότητες ως αναλγητική, αντιοιδηματογόνο και αντιφλεγμονώδη δράση [2,3]. Επιπλέον, παρουσιάζει ενδιαφέρουσες τεχνολογικές ιδιότητες για τη βιομηχανία καλλυντικών, επειδή είναι πλούσιο σε μαλακτικές ενώσεις, που παρέχεται ως εισροή για τις βιομηχανίες καλλυντικών σε όλο τον κόσμο [4]. Ο καρπός andiroba είναι μια κάψουλα που ζυγίζει μεταξύ 90 και 540 g και αποτελείται από 1 έως 16 καφέ σπόρους, βάρους μεταξύ 1 και 70 g. Για να ληφθεί το λάδι, οι σπόροι κόβονται σε μικρά κομμάτια και ξηραίνονται σε φούρνο μέχρι να φτάσουν το 8 τοις εκατό υγρασίας. Στη συνέχεια, συμπιέζονται σε πρέσες μεταλλικού τύπου expeller [5], παράγοντας το λάδι andiroba που παρουσιάζει μεγάλο βιομηχανικό ενδιαφέρον και υψηλή εμπορική αξία αφού το προϊόν αυτό μπορεί να ξεπεράσει τα 50 δολάρια ανά λίτρο, ανάλογα με τα χαρακτηριστικά του [6].

Η ετήσια παραγωγή του andiroba είναι περίπου 122,16 τόνοι [7] και η παραγωγή λαδιού δεν ξεπερνούσε το 30 τοις εκατό του βάρους του καρπού [8]. Αυτοί οι αριθμοί σημαίνουν ότι παράγονται περίπου 36.648 τόνοι λάδι και 85.512 τόνοι κέικ ετησίως. Το υποπροϊόν που λαμβάνεται μετά την εξερεύνηση αυτών των φρούτων μπορεί ακόμα να περιέχει λιπίδια (20 τοις εκατό), τέφρα (4,2 τοις εκατό), πρωτεΐνες (7,3 τοις εκατό) και υδατάνθρακες (17 τοις εκατό) και λόγω αυτής της σύνθεσης, η χρήση του σε βιοτεχνολογικές διεργασίες είναι ενδιαφέρον [9]. Ένας τρόπος εφαρμογής αυτών των παραπροϊόντων είναι μέσω της ζύμωσης στερεάς κατάστασης (SSF) για την παραγωγή ενώσεων υψηλής προστιθέμενης αξίας όπως τα ένζυμα.

Η ζύμωση σε στερεά κατάσταση πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας μια στερεή μήτρα απουσία ελεύθερου νερού, αλλά το στερεό πρέπει να έχει αρκετή υγρασία για μικροβιακή ανάπτυξη [10]. Η χρήση SSF έχει αναφερθεί ότι παράγει αρωματικές ενώσεις [11], αντιβιοτικά [12], οργανικά οξέα [13], βιοπαρασιτοκτόνα [14], βιοεπιφανειοδραστικά [15], ένζυμα [16] και άλλες ενώσεις. Η παραγωγή ενζύμων σε SSF απαιτεί τη χρήση μικροοργανισμών όπως μύκητες και βακτήρια που αναπτύσσονται υπό συνθήκες που χρησιμοποιούνται συνήθως σε SSF. Μεταξύ των μικροοργανισμών που χρησιμοποιούνται βιοτεχνολογικά, η ζύμη ξεχωρίζει, ιδιαίτερα η Yarrowia lipolytica, λόγω της δυνατότητάς της να παράγει λιπάσες [10].

Η Yarrowia lipolytica είναι μια μη συμβατική ζύμη που έχει μέγιστη θερμοκρασία ανάπτυξης 32–34 ◦C και δεν μπορεί να επιβιώσει σε αναερόβιες συνθήκες. Το Y. lipolytica ταξινομείται ως γενικά αναγνωρισμένο ως ασφαλές (GRAS) από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) και αυτό επιτρέπει την ασφαλή χρήση του σε διαδικασίες/προϊόντα τροφίμων και φαρμακευτικών προϊόντων [9]. Αυτή η ζύμη αναγνωρίζεται ότι παράγει ενδοκυτταρικές, εξωκυτταρικές και σχετιζόμενες με το κυτταρικό τοίχωμα λιπάσες. Το Yarrowia lipolytica μπορεί να παράγει λιπάσες χρησιμοποιώντας μια ποικιλία πηγών άνθρακα, συμπεριλαμβανομένων ελαίων, μεθυλεστέρων και λιπαρών οξέων [17]. Τα αναφερθέντα χαρακτηριστικά καθιστούν το Y. lipolytic ευέλικτο για εφαρμογές βιοτεχνολογίας, ειδικά στην παραγωγή λιπασών.

Οι λιπάσες (τριακυλογλυκερολακυλουδρολάσες EC 3.1.1.3) είναι ένζυμα που καταλύουν την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων σε ελεύθερα λιπαρά οξέα και γλυκερόλη παρουσία νερού [18]. Οι λιπάσες μπορούν να εφαρμοστούν σε πολλούς τομείς συμπεριλαμβανομένης της βιομηχανίας τροφίμων, μεταξύ άλλων. Η χρήση λιπασών έχει αναφερθεί στην υδρόλυση γάλακτος, λίπους και τυριού κατά την ωρίμανση, στην τροποποίηση των λιπών βουτύρου, στη βελτίωση του αρώματος των ποτών και της αρτοποιίας, στο dressing τροφίμων και στην ανάπτυξη γεύσης κρέατος και ψαριού [19]. Επιπλέον, οι λιπάσες έχουν ήδη εφαρμοστεί στην υδρόλυση ελαίου στη συγκέντρωση πολυακόρεστων λιπαρών οξέων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη βιομηχανία τροφίμων ως εμπλουτισμένο συμπλήρωμα [20].

Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει τη χρήση αποβλήτων και παραπροϊόντων στην παραγωγή λιπάσης, μεταξύ των οποίων φλούδες σόγιας, φλούδες καρπουζιού, βαμβακάλευρο, σογιάλευρο και κέικ με λάδι andiroba [9,21-26]. Ωστόσο, ο συνδυασμός κέικ με λάδι andiroba και σογιάλευρου σε διαφορετικές αναλογίες για την παραγωγή λιπάσης από την Yarrowia lipolytica δεν έχει ακόμη αναφερθεί. Αυτή η έρευνα στόχευε στην παραγωγή λιπάσης Yarrowia lipolytica με ζύμωση στερεάς κατάστασης (SSF) χρησιμοποιώντας υποπροϊόντα της βιομηχανίας επεξεργασίας τροφίμων (κέικ ελαίου andiroba και σογιάλευρο) για εφαρμογή στην υδρόλυση ιχθυελαίου για περαιτέρω παραγωγή πολυακόρεστων λιπαρών οξέων.

2. Αποτελέσματα και Συζήτηση

Η στρατηγική που υιοθετήθηκε για την παραγωγή λιπάσης από το Yarrowia lipolytica σε SSF χρησιμοποιώντας το συνδυασμό κέικ ελαίου andiroba και σογιάλευρου σε διαφορετικές αναλογίες βασίστηκε σύμφωνα με το διάγραμμα ροής που φαίνεται στο Σχήμα 1.

2.1. Χαρακτηρισμός Αγροβιομηχανικού Υποπροϊόντος

Η φυσικοχημική σύνθεση του κέικ λαδιού andiroba φαίνεται στον Πίνακα 1. Το κέικ με λάδι andiroba περιείχε 13,7 τοις εκατό πρωτεϊνών, 26,9 τοις εκατό αιθερικό εκχύλισμα, 0,4 τοις εκατό υδατάνθρακες και 45,6 τοις εκατό αδιάλυτες ίνες. Από την άλλη πλευρά, το σογιάλευρο περιείχε 48,3 τοις εκατό πρωτεϊνών, 2,4 τοις εκατό αιθερικό εκχύλισμα, 14,0 τοις εκατό υδατανθράκων και 18,0 τοις εκατό αδιάλυτων ινών. Κάθε θρεπτικό συστατικό που υπάρχει στο κέικ παίζει ρόλο στον μικροβιακό μεταβολισμό. Η περιεκτικότητα σε άζωτο είναι απαραίτητη για τη σύνθεση πρωτεϊνών, νουκλεοτιδίων και δευτερογενών μεταβολιτών για την ανάπτυξη και το μεταβολισμό των μικροοργανισμών καθώς και για τη βιοσύνθεση των ενζύμων [25]. Η περιεκτικότητα σε υπολειμματικό λάδι (εκχύλισμα αιθέρα) που υπάρχει στο κέικ λαδιού andiroba δρα ως πηγή άνθρακα, συμμετέχοντας στο σχηματισμό βιομάζας και στην παραγωγή ενέργειας για την απόδοση της κυτταρικής λειτουργίας [26]. Επιπλέον, το λάδι που υπάρχει στο κέικ andiroba είναι ένα υδρόφοβο υπόστρωμα και μπορεί να λειτουργήσει ως επαγωγέας στην παραγωγή λιπάσης, όπως αναφέρεται από τους Brígida et al. [17]. Αρχικά, η λιπάση που συνδέεται με το κύτταρο του μικροοργανισμού υδρολύει το λιπίδιο που υπάρχει στο μέσο και ξεκινά την κυτταρική ανάπτυξη. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, η διαθεσιμότητα του υποστρώματος μειώνεται, έτσι ο οργανισμός εκκρίνει εξωκυτταρικές λιπάσες [27].

Η τέφρα που προσδιορίζεται ποσοτικά στο κέικ με λάδι andiroba (4,5 τοις εκατό ) και το σογιάλευρο (6,3 τοις εκατό ) αντιπροσωπεύει την περιεκτικότητα σε διάφορα μέταλλα και μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο μεταβολισμό του μικροοργανισμού. Ωστόσο, ορισμένα μέταλλα όπως τα ιόντα νατρίου και μαγγανίου μπορούν να αναστείλουν την ανάπτυξη Yarrowia lipolytica [17], και επομένως είναι απαραίτητο να αξιολογηθούν σωστά τα υποπροϊόντα.

Η περιεκτικότητα σε υδατάνθρακες και φυτικές ίνες στις πρώτες ύλες μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη μικροβιακή διατροφή με περιορισμένο τρόπο, καθώς το Yarrowia lipolytica δεν παράγει αμυλάσες ή κυτταρινάσες και ημικυτταράσες [28,29], καθιστώντας δύσκολη τη διάσπαση αυτών των πολυσακχαριτών και την απελευθέρωση ενώσεων πλούσιων σε άνθρακα σε να χρησιμοποιηθεί στον μεταβολισμό της ζύμης. Έτσι, προτείνεται ότι η ανάπτυξη της μαγιάς οφείλεται κυρίως στην παρουσία των υδρόφοβων υποστρωμάτων στο κέικ.

Οι τιμές πορώδους του κέικ με λάδι andiroba και του σογιάλευρου φαίνονται στον Πίνακα 1. Σύμφωνα με τον Πίνακα 1, το πορώδες του κέικ andiroba και του σογιάλευρου ήταν 0.425 και 0.412 m3 αέρα m−3 κλίνης, αντίστοιχα. Οι υψηλότερες τιμές πορώδους συνδέονται με βελτιωμένη μεταφορά μάζας και θερμότητας κατά τη ζύμωση, οδηγώντας σε βελτιωμένη παραγωγή ενζύμων. Επιπλέον, το πορώδες είναι μια σημαντική παράμετρος για την κατανόηση της υγρασίας του μέσου: οι υψηλές τιμές υγρασίας μπορεί να σχετίζονται με τιμές χαμηλού πορώδους και αυτό επηρεάζει τον αερισμό του μέσου και κατά συνέπεια την παραγωγή λιπάσης [22].

2.2. Lipase Production by SSF

Η χρήση παραπροϊόντων για παραγωγή λιπάσης με ζύμωση σε στερεά κατάσταση και η παραγωγή σταθερών στερεών βιοκαταλυτών επιτρέπει την εφαρμογή του ενζύμου απευθείας στο μέσο αντίδρασης, μειώνοντας το κόστος που σχετίζεται με την εκχύλιση και τον καθαρισμό του ενζύμου για επακόλουθη εφαρμογή. Επιπλέον, η χρήση υποπροϊόντων παρέχει θρεπτικά συστατικά για την ανάπτυξη και ανάπτυξη των μικροβίων, λειτουργεί ως φυσική υποστήριξη για τον μικροοργανισμό και μειώνει το κόστος του μέσου καλλιέργειας στη διαδικασία. Επιπλέον, η ζύμωση σε στερεά κατάσταση επιτρέπει τη χρήση υπολειμμάτων και αγροβιομηχανικών υποπροϊόντων, ως εναλλακτική λύση στη μείωση των περιβαλλοντικών προβλημάτων που σχετίζονται με την ακατάλληλη διάθεση απορριμμάτων [30].

Μετά τον χαρακτηρισμό, τα παραπροϊόντα χρησιμοποιήθηκαν ως υπόστρωμα στερεάς μήτρας για την παραγωγή λιπάσης με χρήση SSF, υπό παρακολούθηση για λιπολυτικές και πρωτεολυτικές δραστηριότητες, υγρασία και pH κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ζύμωσης. Το Σχήμα 2 δείχνει τα μετρούμενα προφίλ μεταβλητής απόκρισης για 48 ώρες ζύμωσης χρησιμοποιώντας το Y. lipolytica και τον συνδυασμό κέικ ελαίου andiroba και σογιάλευρου σε διαφορετικές αναλογίες ως υποστρώματα.

Όσον αφορά τη χρήση των υποστρωμάτων μεμονωμένα, η μέγιστη λιπολυτική δραστηριότητα των 4,36 U·g −1 βρέθηκε για το σογιάλευρο (0:100· Εικόνα 2A) και 13,48 U·g −1 για κέικ λαδιού andiroba (100:0; Εικόνα 2Β), μετά από 12 και 24 ώρες, αντίστοιχα. Μετά την επίτευξη του σημείου της μέγιστης δραστικότητας της λιπάσης, παρατηρήθηκε μείωση των τιμών της, η οποία μπορεί να σχετίζεται με την αύξηση της δραστηριότητας της πρωτεάσης. Αυτό το ένζυμο έχει μια συγγένεια με τις πρωτεϊνικές δομές, και λόγω αυτού, μπορεί να δράσει για να υποβαθμίσει τη δομή της λιπάσης, μειώνοντας τη δραστηριότητά της [24,31,32].

Το κέικ Andiroba και το άλευρο σόγιας που χρησιμοποιήθηκαν σε διαφορετικές αναλογίες (25:75), (50:50) και (75:25) παρήγαγαν τις μέγιστες τιμές δραστικότητας λιπάσης 57,21 U·g -1 μετά από 12 ώρες (Εικόνα 2C), 63,70 U·g −1 (Εικόνα 2D) και 40,13 U·g −1 (Εικόνα 2Ε) μετά από 24 ώρες ζύμωσης, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι το μείγμα των μητρών μπορεί να βελτιώσει τη δραστηριότητα της λιπάσης. Η βελτίωση της ενζυμικής δραστηριότητας μετά από συνδυασμό κέικ ελαίου andiroba και σογιάλευρου μπορεί να εξηγηθεί με την παρατήρηση των φυσικοχημικών συνθέσεων και των δύο πρώτων υλών, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1. Το σογιάλευρο έχει υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη ενώ το κέικ με λάδι andiroba έχει υψηλότερη περιεκτικότητα σε λάδι . Έτσι, το μείγμα κέικ με λάδι andiroba και σογιάλευρο για την παραγωγή λιπάσης αποδείχθηκε πιο ενδιαφέρον από τη χρήση του καθενός ξεχωριστά, και αυτό ευνοεί τη μη εξάρτηση ενός μόνο υποστρώματος καθώς και τη χρήση περισσότερων του ενός υποπροϊόντων.

Το αρχικό pH των μητρών είναι όξινο λόγω της παρουσίας ελεύθερων λιπαρών οξέων που υπάρχουν στην ελαιώδη μήτρα και αυτή η συνθήκη ευνοεί την ανάπτυξη Yarrowia lipolytica, καθώς αυτή η ζύμη χρειάζεται ένα ελαφρώς όξινο μέσο για καλή ανάπτυξη [33], αποφεύγοντας ένα μέσο ρυθμιστικό στάδιο. Υπάρχει επίσης μια σταδιακή αύξηση του pH κατά τη διάρκεια της διαδικασίας στις μήτρες που κυμαίνεται από 6,39 έως 7,32 (Εικόνα 2Α), 5,69 έως 6,82 (Εικόνα 2C), 5,64 έως 7,68 (Εικόνα 2D) και 5,21 έως 6,03 (Εικόνα 2Ε). Στη μήτρα που περιέχει μόνο κέικ λαδιού andiroba, παρατηρήθηκε σταδιακή μείωση του pH (4,8 έως 4,26, Σχήμα 2Β) λόγω της περιεκτικότητας σε υπολειμματικό λάδι στο στερεό μέσο, ​​καθώς το λάδι αρχικά υδρολύεται από τη λιπάση και δεν καταναλώνεται από τη μαγιά στο τις αρχικές ώρες, διατηρώντας έτσι ένα ελαφρώς όξινο pH.

Όσον αφορά την περιεκτικότητα σε υγρασία, δεν παρατηρήθηκαν διακυμάνσεις σε όλη τη διάρκεια της ζύμωσης, αποδεικνύοντας ότι το σύστημα επώασης με κορεσμένη υγρασία και τις μήτρες ήταν αποτελεσματικό στη διατήρηση της υγρασίας. Ένα μέσο ζύμωσης ικανό να διατηρεί τη βέλτιστη περιεκτικότητα σε υγρασία είναι απαραίτητο για την παραγωγή λιπάσης από την Yarrowia lipolytica [24], καθώς αυτή η παράμετρος μπορεί να επηρεάσει τον αερισμό του συστήματος. Επιπλέον, απαιτείται η ιδανική περιεκτικότητα σε υγρασία για την παροχή του νερού που είναι απαραίτητο για το μεταβολισμό του μικροοργανισμού και για τη διαλυτοποίηση των θρεπτικών συστατικών. Όταν η περιεκτικότητα σε υγρασία είναι πάνω από την ιδανική, μπορεί να συμβεί κακή διάχυση οξυγόνου στο σύστημα, που βρίσκεται εκτός του ιδανικού εύρους για τον μικροοργανισμό [34].

Ορισμένες μελέτες έχουν αναφέρει τη χρήση παραπροϊόντων ως υποστρωμάτων στη ζύμωση σε στερεά κατάσταση. Ωστόσο, σε αυτές τις μελέτες, υπάρχει μια ενσωμάτωση πηγών καθαρού άνθρακα και/ή αζώτου, όπως γλυκόζη, εκχύλισμα ζύμης, πεπτόνη και ουρία [35-37] σε ποσότητες που μπορούν να αυξήσουν το κόστος της διαδικασίας. Η ιδανική μήτρα πρέπει να παρουσιάζει ορισμένα χαρακτηριστικά για την εφαρμογή που περιλαμβάνει τη λειτουργία ως στήριγμα, την παροχή των απαραίτητων θρεπτικών συστατικών για την ανάπτυξη του μικροοργανισμού και την έκκριση του βιοτεχνολογικού προϊόντος που ενδιαφέρει. Η εύρεση όλων αυτών των χαρακτηριστικών σε ένα παραπροϊόν μπορεί να είναι επίπονη, γεγονός που καθιστά δύσκολη την εύρεση ενός κατάλληλου συστήματος για μια διαδικασία ζύμωσης. Συνεπώς, η αναζήτηση νέων πρώτων υλών και ο συνδυασμός τους πρέπει να είναι συνεχής [16].

Έτσι, η αναλογία 50:50 μεταξύ κέικ andiroba και σογιάλευρου επιλέχθηκε για περαιτέρω δοκιμές. Η επιλογή αυτής της συνθήκης σχετίζεται με την αξιοποίηση ανεξερεύνητων απορριμμάτων από την περιοχή του Αμαζονίου.

2.3. Συμπλήρωμα μήτρας ζύμωσης

Στο δεύτερο μέρος αυτής της εργασίας, το κέικ με λάδι andiroba και το σογιάλευρο σε αναλογία 50:50 συμπληρώθηκαν με 1,5 τοις εκατό σογιέλαιο, όπως φαίνεται στο σχήμα 3. Η συμπλήρωση πραγματοποιήθηκε για να επαληθευτεί εάν η διαθεσιμότητα μιας πιο εύκολα αφομοιώσιμης πηγής άνθρακα (σογιέλαιο) βελτίωσε την παραγωγή λιπάσης σχετικά με την περιεκτικότητα σε υπολειμματικό λάδι που υπάρχει στο κέικ λαδιού andiroba. Η μέγιστη δραστικότητα λιπάσης 56,32 U·g-1 ελήφθη μετά από 28 ώρες ζύμωσης και η δραστικότητα πρωτεάσης κυμαινόταν από 2,71 έως 7,60 U·g-1. Το pH κυμαινόταν από 5,63 έως 7,63 και η υγρασία παρέμεινε χωρίς μεγάλες διακυμάνσεις καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου (53 έως 58 τοις εκατό). Όπως παρουσιάστηκε προηγουμένως, η λιπολυτική δραστηριότητα που ελήφθη μετά τη συμπλήρωση ήταν χαμηλότερη από την τιμή που βρέθηκε χωρίς συμπλήρωμα. Η συμπλήρωση μήτρας για την παραγωγή λιπάσης μελετήθηκε από τους Farias et al. [38] και Souza et al. [24]. Οι συγγραφείς βρήκαν μια δραστηριότητα λιπάσης 139 U·g-1 και 93,9 U·g-1 χρησιμοποιώντας λάσπη και σογιέλαιο, αντίστοιχα. Ωστόσο, όταν οι Souza et al. [24] πραγματοποίησαν ζύμωση χρησιμοποιώντας μόνο άλευρο σόγιας (χωρίς συμπλήρωμα), οι συγγραφείς βρήκαν 9,4 ± 0,3 U·g-1 δραστικότητας λιπάσης μετά από 10 ώρες ζύμωσης, αποδεικνύοντας ότι η συμπλήρωση αύξησε τη δραστηριότητα λιπάσης στη μήτρα ζύμωσης που μελετήθηκε.

Ένα άλλο συστατικό που αναφέρεται συνήθως για συμπλήρωμα μέσου είναι το Tween 80. Αυτό αναφέρεται συνεχώς στη βιβλιογραφία, καθώς αυτό το συστατικό μπορεί να αυξήσει τη δραστηριότητα της λιπάσης όταν χρησιμοποιείται σε βυθισμένη ζύμωση [39], αλλά δεν υπάρχουν αναφορές για τη χρήση του Tween 80 σε ζύμωση στερεάς κατάστασης. Το Tween 80 μπορεί να αυξήσει την παραγωγή εξωκυτταρικής λιπάσης κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ζύμωσης λόγω της ικανότητας γαλακτωματοποίησης του υποστρώματος και επομένως να βελτιώσει την προσβασιμότητα του υποστρώματος για τον μικροοργανισμό καθώς και να αλλάξει τη διαπερατότητα των κυττάρων [40]. Έτσι, διεξήχθη μια μελέτη που συνδύαζε σογιέλαιο 1,5 (%) και Tween 80 0,001 τοις εκατό (w/v) σε ένα γαλάκτωμα για τη συμπλήρωση του στερεού μέσου ζύμωσης, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4.

Σχετικά με τη συμπλήρωση με Tween 80, επαληθεύτηκε ότι μετά από 14 ώρες ζύμωσης, η λιπολυτική δραστηριότητα ήταν 57,6 U·g -1. Η ίδια τιμή είχε προηγουμένως ληφθεί μόνο με συμπλήρωμα σογιέλαιου στις 28 ώρες ζύμωσης, η οποία παρατείνει τη διαδικασία ζύμωσης και επηρεάζει τη βιωσιμότητα. Η μέγιστη λιπολυτική δραστηριότητα μετά από 20 ώρες ζύμωσης ήταν 82,52 U·g −1, 1.46-πλάσια αύξηση σε σχέση με την παραγωγή λιπάσης χρησιμοποιώντας μόνο σογιέλαιο και μείωση 8- ωρών στη χρονική διαδικασία.

Οι μεγάλοι χρόνοι ζύμωσης αυξάνουν το κόστος της διαδικασίας, επομένως η αναζήτηση ενός ιδανικού διωνυμικού μικροοργανισμού—ένα μέσο που παράγει λιπάση σε συντομότερο χρόνο (υψηλή παραγωγικότητα) και που χρησιμοποιεί υποπροϊόντα ως μήτρες είναι ενδιαφέρουσα. Αρκετές μελέτες στη βιβλιογραφία έχουν αναφέρει την παραγωγή λιπάσης μέσω SSF για να επιτευχθούν οι κατάλληλες συνθήκες και να καταστεί εφικτή η λήψη λιπασών. Παρατηρήθηκε η χρήση διαφορετικών πρώτων υλών, όπως αλεύρι σόγιας, ελαιοκράμβη, φλούδες καρπουζιού και κέικ από φοινικοπυρηνέλαιο, με δραστηριότητες που κυμαίνονται από 9 έως 127 U·g −1[9,22,24].

Οι Sales, Castro, Ribeiro και Coelho [22] μελέτησαν την παραγωγή λιπάσης από το Y. lipolytica σε ζύμωση στερεάς κατάστασης χρησιμοποιώντας άλευρα σόγιας συμπληρωμένο με φλούδα καρπουζιού (5 τοις εκατό) πέτυχαν βελτίωση στη δραστηριότητα λιπάσης κατά 31 τοις εκατό, τιμή που αντιστοιχεί σε 75,22 U. ·g −1. Οι Souza et al. [41] παρήγαγε λιπάση από Y. lipolytica με ζύμωση σε στερεά κατάσταση για εφαρμογή στη σύνθεση εμπορικών εστέρων με αξία για τη βιομηχανία τροφίμων και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η καλύτερη συνθήκη ζύμωσης για την παραγωγή του βιοκαταλύτη ήταν η χρήση σογιάλευρου και σογιέλαιου ( 3 τοις εκατό w/w). Το ένζυμο που παρήχθη κάτω από αυτές τις συνθήκες επέτρεψε τη μετατροπή έως και 92,9 για τη σύνθεση των χρήσιμων εστέρων υψηλής προστιθέμενης αξίας που εφαρμόζονται στη βιομηχανία τροφίμων.

Εκτός από τις υψηλές ενζυματικές δραστηριότητες που αποκτήθηκαν στην παρούσα εργασία, μπορούμε να επισημάνουμε τα πρόσθετα πλεονεκτήματα: (i) τη δυνατότητα χρήσης υποπροϊόντων με χαμηλή εκμετάλλευση, με ελκυστική βιωσιμότητα για την περιοχή του Αμαζονίου. (ii) τη δυνατότητα συνδυασμού διαφορετικών υποπροϊόντων, που επιτρέπει τη διατροφική συμπλήρωση για τον μικροβιακό μεταβολισμό· (iii) τη μείωση της πίεσης σε συστατικά που χρησιμοποιούνται ήδη ευρέως στη βιομηχανία βιοεπεξεργασιών, όπως το σογιάλευρο· (iv) οικονομική αξιοποίηση των περιοχών παραγωγής υποπροϊόντων. (v) επέκταση των επιλογών υποστρώματος για την παραγωγή λιπασών και (vi) μείωση του λειτουργικού κόστους, μεταξύ άλλων πλεονεκτημάτων.

2.4. SDS-PAGE

Το ακατέργαστο ενζυματικό εκχύλισμα που λήφθηκε μετά τη ζύμωση χρησιμοποιώντας μια μήτρα που αποτελείται από κέικ ελαίου andiroba και σογιάλευρο (50:50) χωρίς συμπλήρωμα αναλύθηκε σε SDS-PAGE. Η ηλεκτροφορητική ανάλυση έδειξε τις πρωτεϊνικές ζώνες που περιέχονται στο ενζυματικό εκχύλισμα, όπως παρουσιάζονται στο Σχήμα 5.

Η λωρίδα 1 αναφέρεται σε τυπικούς δείκτες πρωτεϊνών και η λωρίδα 2 είναι το δείγμα που λαμβάνεται από τον συνδυασμό κέικ ελαίου andiroba και σογιάλευρου στην καλύτερη αναλογία που μελετήθηκε (50:50). Είναι δυνατό να απεικονιστεί μια ζώνη γύρω στα 37-40 kDa στο ακατέργαστο ενζυματικό εκχύλισμα που μπορεί να σχετίζεται με τη λιπάση και/ή την εστεράση που παράγεται από το Yarrowia lipolytica, όπως παρατηρείται από τους Souza et al. [41], η οποία μπορεί επίσης να είναι η κύρια εξωκυτταρική λιπάση του Y. lipolytica (Lip2), η οποία παρήχθη ευρέως σε όλες τις μελέτες μας. Επιπλέον, αναφέρεται ότι ακόμη και για ένζυμα που σχετίζονται κυρίως με το κυτταρικό τοίχωμα (Lip7 και Lip8) του Y. lipolytica, η ίδια μοριακή μάζα έχει παρατηρηθεί (37–41 kDa) [42].

Επιπλέον, σύμφωνα με αποτελέσματα που δημοσιεύθηκαν προηγουμένως από την ερευνητική μας ομάδα, οι ίδιες ζώνες που παρουσιάζονται εδώ σχετίζονταν με τη δραστηριότητα εστεράσης και λιπάσης από το ζυμόγραμμα που αποκαλύφθηκε από τον οξικό ναφθυλεστέρα ως υπόστρωμα [41], το οποίο μας επέτρεψε να τις συσχετίσουμε. Οι ζώνες των 75 kDa αναφέρονται στην υπομονάδα της -κονγλυκινίνης που υπάρχει στο σογιάλευρο όπως βρέθηκε από τους Sales et al. [22] και Cheng et al. [43] στη ζύμωση σογιάλευρου.

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】