Σύστημα Laccase-Mediator που χρησιμοποιεί φυσικό μεσολαβητή ως λευκαντικό παράγοντα για τον αποχρωματισμό της μελανίνης Μέρος 1

Αφηρημένη: Σε αυτή τη μελέτη, ένα σύστημα λακκάσης-μεσολαβητή (LMS) που χρησιμοποιεί έναν φυσικό μεσολαβητή αναπτύχθηκε ως λευκαντικός παράγοντας για τον αποχρωματισμό της μελανίνης. Επτά φυσικοί μεσολαβητές χρησιμοποιήθηκαν για να αντικαταστήσουν τους συνθετικούς μεσολαβητές και να ξεπεράσουν με επιτυχία το χαμηλό δυναμικό οξειδοαναγωγής της λακκάσης και την περιορισμένη πρόσβαση της μελανίνης στην ενεργό θέση της λακκάσης. Η δραστηριότητα αποχρωματισμού μελανίνης των λακασών από Trametes versicolor (lacT) και Myceliophthora thermophila (lacM) ενισχύθηκε σημαντικά με τη χρήση φυσικών μεσολαβητών όπως ακετοσυριγγόνη, συριγγαλδεΰδη και ακετοβανιλόνη, που έδειξαν χαμηλή κυτταροτοξικότητα. Οι ομάδες μεθόξυ και κετόνης των φυσικών μεσολαβητών παίζουν σημαντικό ρόλο στον αποχρωματισμό της μελανίνης. Οι σταθερές εξειδίκευσης των lacT και lacM για τον αποχρωματισμό της μελανίνης ενισχύθηκαν κατά 247 και 334, αντίστοιχα, όταν η ακετοσυριγγόνη χρησιμοποιήθηκε ως μεσολαβητής. Το LMS χρησιμοποιώντας δαντέλα και ακετοσυριγγόνη θα μπορούσε επίσης να αποχρωματίσει τη μελανίνη που υπάρχει στο φιλμ υδρογέλης κυτταρίνης, η οποία μιμείται την κατάσταση του δέρματος. Επιπλέον, το LMS θα μπορούσε να αποχρωματίσει όχι μόνο συνθετικά ανάλογα ευμελανίνης που παρασκευάζονται από την οξείδωση της τυροσίνης αλλά και τη φυσική μελανίνη που παράγεται από κύτταρα μελανώματος.

Σύμφωνα με σχετικές μελέτες,κιστανάκιείναι ένα κοινό βότανο που είναι γνωστό ως «το θαυματουργό βότανο που παρατείνει τη ζωή». Το κύριο συστατικό του είναισιστανοζίτη, που έχει διάφορα αποτελέσματα όπως π.χαντιοξειδωτικό, αντιφλεγμονώδη, καιπροαγωγή της ανοσοποιητικής λειτουργίας. Ο μηχανισμός μεταξύ cistanche καιλεύκανση δέρματοςέγκειται στην αντιοξειδωτική δράση του κιστάνιγλυκοσίδες. Μελανίνηστο ανθρώπινο δέρμα παράγεται από την οξείδωση της τυροσίνης που καταλύεται απότυροσινάσηκαι η αντίδραση οξείδωσης απαιτεί τη συμμετοχή οξυγόνου, έτσι οι ελεύθερες ρίζες στο σώμα γίνονται ένας σημαντικός παράγοντας που επηρεάζει την παραγωγή μελανίνης. Το Cistanche περιέχεισιστανοζίτη, το οποίο είναι αντιοξειδωτικό και μπορεί να μειώσει τη δημιουργία ελεύθερων ριζών στον οργανισμό, έτσιαναστέλλοντας την παραγωγή μελανίνης.

Κάντε κλικ στο Rou Cong Rong Benefits For Whitening

Για περισσότερες πληροφορίες:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Εισαγωγή

Οι λακάσες (EC 1.10.3.2, βενζολοδιόλη: οξειδοαναγωγάσες διοξειδίου του οξυγόνου) είναι πρωτεΐνες πολλαπλού χαλκού που καταλύουν την οξείδωση διαφόρων φαινολικών και μη φαινολικών ενώσεων μέσω ενός μηχανισμού αντίδρασης που καταλύεται από ρίζες μέσω της αναγωγής του μοριακού οξυγόνου [1,2]. Οι λακάσες έχουν χρησιμοποιηθεί ως βιοκαταλύτες για διαδικασίες βιοαποικοδόμησης, όπως η βιοαποκατάσταση χρωστικών [3,4], φαρμακευτικών προϊόντων [5,6], ζιζανιοκτόνων [7] και απολίνωσης [8-10]. Οι λακάσες έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί για να καταλύουν τον πολυμερισμό πρόδρομων ουσιών χρωστικών και οργανικών ενώσεων [11]. Ειδικότερα, οι ελκυστικές ιδιότητές τους, όπως η χαμηλή εξειδίκευση του υποστρώματος, η χρήση οξυγόνου ως τελικού δέκτη ηλεκτρονίων, η παραγωγή νερού ως υποπροϊόντος και η έλλειψη ζήτησης (ή μη παραγωγής) υπεροξειδίων, τα καθιστούν ενδιαφέροντα για τη βιοτεχνολογία και περιβαλλοντικά πεδία [1,11,12].

Τέσσερα ιόντα χαλκού στην ενεργό θέση εμπλέκονται στην καταλυτική δραστηριότητα της λακκάσης. Ο «μπλε» χαλκός (θέση Τ1) οξειδώνει το υπόστρωμα και το τριπύρηνο σύμπλεγμα χαλκού (Τ2/Τ3) δέχεται τα ηλεκτρόνια από τη θέση Τ1 για να μειώσει το μοριακό οξυγόνο [1,12,13]. Συγκεκριμένα, το δυναμικό οξειδοαναγωγής της θέσης Τ1 Cu θεωρείται σημαντικός παράγοντας για τον προσδιορισμό της καταλυτικής ικανότητας των λακασών [14]. Οι λακάσες διαθέτουν σχετικά χαμηλό δυναμικό οξειδοαναγωγής (0.4–0.8 V) σε σύγκριση με τις λιγνινολυτικές υπεροξειδάσες (πάνω από 1 V) όπως η υπεροξειδάση του μαγγανίου και η υπεροξειδάση της λιγνίνης. Οι λακάσες δεν μπορούν να οξειδώσουν άμεσα μη φαινολικά υποστρώματα με δυναμικό οξειδοαναγωγής πάνω από 1,3 V [13,14]. Επομένως, για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί της λακκάσης, τα συστήματα μεσολαβητή λακκάσης (LMS) που χρησιμοποιούν μικρές μοριακές ενώσεις, όπως 2,20 -azinobis(3- αιθυλβενζοθειαζολίνη-6-σουλφονική) (ABTS), { {24}}υδροξυ βενζοτριαζόλη (HOBt), ιουλουρικό οξύ (VLA), Ν-υδροξυ φθαλιμίδιο (HPI), Ν-υδροξυ ακετανιλίδιο (NHA) και TEMPO, που δρουν ως οξειδοαναγωγικοί μεσολαβητές, έχουν προταθεί [15-17].

Αυτοί οι μεσολαβητές επιτρέπουν την οξείδωση ογκωδών ενώσεων μέσω διαφορετικών οδών οξείδωσης. Το σύστημα λακκάσης-ABTS οξειδώνει τα υποστρώματα δημιουργώντας μια κατιονική ρίζα ABTS μέσω ενός μηχανισμού μεταφοράς ηλεκτρονίων (ET). Τα LMS με HOBt, VLA, HPI ή NHA παράγουν ρίζες νιτροξυλίου μέσω του μηχανισμού μεταφοράς ατόμων υδρογόνου (HAT) [1,12,17]. Επιπλέον, μεσολαβητές όπως το TEMPO και τα ανάλογα του αντιδρούν μέσω ιοντικών οδών για να δημιουργήσουν ιόντα οξοαμμωνίου [1,12,18]. Η χρήση αυτών των μεσολαβητών μπορεί να οξειδώσει ένα ευρύ φάσμα ενώσεων σε διάφορες εφαρμογές, όπως η αποικοδόμηση χρωστικών [3,4], η αποικοδόμηση φαρμάκων [5,6] και η αποδόμηση λιγνίνης [8-10]. Ωστόσο, οι εφαρμογές των συνθετικών μεσολαβητών σε βιομηχανικούς τομείς έχουν περιοριστεί λόγω της πιθανής τοξικότητάς τους, του υψηλού κόστους και της επίδρασης απενεργοποίησης ενζύμων. Πρόσφατα, φαινολικά μόρια που προέρχονται από λιγνίνη ως φυσικοί μεσολαβητές (π.χ. συριγαλδεΰδη, ακετοσυριγγόνη, βανιλίνη, ακετοβανιλόνη, βανιλικός μεθυλεστέρας, φερουλικό οξύ, σιναπικό οξύ, π-κουμαρικό οξύ, κ.λπ.) έχουν μελετηθεί για να αντικαταστήσουν τους συνθετικούς μεσολαβητές [1,12] . Τα πλεονεκτήματα των φυσικών μεσολαβητών είναι το χαμηλό κόστος και η χαμηλή τοξικότητα επειδή προέρχονται από φυσικές και ανανεώσιμες πηγές [19].

Η μελανίνη είναι μια ομάδα φυσικών χρωστικών που παράγονται από τη μελανογένεση μέσω του οξειδωτικού πολυμερισμού της τυροσίνης από τα μελανοκύτταρα. Η φυσική μελανίνη μπορεί να ταξινομηθεί σε πέντε κατηγορίες ευμελανίνης, φαιομελανίνης, όλης της μελανίνης, φαιομελανίνης και νευρομελανίνης [20]. Πρόσφατα, έχουν μελετηθεί διάφορες ιατρικές και ηλεκτροχημικές εφαρμογές που χρησιμοποιούν μελανίνη ή πρόδρομες ουσίες μελανίνης [20,21]. Το χρώμα του ανθρώπινου δέρματος καθορίζεται κυρίως από την παρουσία μελανίνης. Στη βιομηχανία καλλυντικών, η άμεση αποχρωματισμός της μελανίνης με χρήση ενζύμων έχει προταθεί για την ανάπτυξη παραγόντων λεύκανσης του δέρματος. Πολλές υπεροξειδάσες έχουν μελετηθεί για τον αποχρωματισμό της μελανίνης. Woo et al. έδειξε ότι η συνθετική μελανίνη μπορεί να αποχρωματιστεί απευθείας από την υπεροξειδάση της λιγνίνης από το P. chrysosporium [22]. Οι ομάδες Keneko και Mohorˇciˇc ανέφεραν επίσης τον ενζυματικό αποχρωματισμό της μελανίνης από υπεροξειδάση μαγγανίου που απομονώθηκε από μύκητες (Sporotrichum pruinose και Phlebia radiata) [23,24]. Οι Kim et al. ανέφερε ότι ακατέργαστα μείγματα ενζύμων που περιέχουν υπεροξειδάση μαγγανίου, υπεροξειδάση λιγνίνης και λακκάση έδειξαν δραστικότητα αποχρωματισμού μελανίνης [25]. Όταν οι υπεροξειδάσες αποχρωματίζουν τη μελανίνη, απαιτούν υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) ως συμπαράγοντα που μπορεί να ερεθίσει το δέρμα. Έτσι, για να μειωθεί η χρήση του H2O2, εισήχθη οξειδάση γλυκόζης ή λακκάση στο σύστημα συνδυασμού ενζύμων [26,27]. Οι λακάσες μπορούν να αποχρωματίσουν τη μελανίνη χωρίς τη χρήση υπεροξειδίου του υδρογόνου. Οι Khammuang και Sarnthima ανέφεραν ότι η λακκάση από το Lentinus polycarpous Lév έδειξε δραστηριότητα αποχρωματισμού μελανίνης χρησιμοποιώντας ABTS, βανιλίνη και βανιλικό οξύ ως μεσολαβητές [28].

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Υλικά

2.2. Αποχρωματισμός μελανίνης από LMS

Το κορεσμένο διάλυμα μελανίνης (1,4 mg/mL) παρασκευάστηκε με διάλυση 3 mg συνθετικής μελανίνης σε 1,3 mL 10 mM NaOH. Το διάλυμα φυγοκεντρήθηκε στις 8500 rpm για 5 λεπτά για να απομακρυνθεί η αδιάλυτη μελανίνη και το υπερκείμενο αραιώθηκε με 0.1 Μ ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού κιτρικού οξέος (pH 3, 4, 5, 5.5, 6 ή 7) και χρησιμοποιείται ως διάλυμα υποστρώματος για LMS. Η συγκέντρωση μελανίνης στο διάλυμα υποστρώματος ήταν 63 μg/mL και επιβεβαιώθηκε φασματοφωτομετρικά στα 475 nm. Το 0,8 mL διαλύματος υποστρώματος μελανίνης αναμίχτηκε με 0.1 mL διάλυμα μεσολαβητή (0–1 mM) σε σωληνάριο Eppendorf 1,5 mL. Η αντίδραση αποχρωματισμού μελανίνης ξεκίνησε με την προσθήκη 0,1 mL διαλύματος λακκάσης (15,8 μg (0,6 U) lacT ή 19,2 μg (1,8 U) lacM) σε ένα μείγμα μελανίνης και του μεσολαβητή στους 25 ◦C σε αναδευόμενο υδατόλουτρο στις 120 rpm . Μετά την αντίδραση, το μίγμα της αντίδρασης φυγοκεντρήθηκε και η απορρόφηση του υπερκειμένου μετρήθηκε στα 475 nm. Η απόδοση αποχρωματισμού ( ποσοστό ) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση:

Αποχρωματισμός ( τοις εκατό ) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. Kinetic Study of Melanin Decolorization by LMS

2.4. Κυτταροτοξικότητα Φυσικών Μεσολαβητών

Η κυτταρική σειρά μελανώματος B16F10 (Korea Cell Line Bank, Σεούλ, Κορέα) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της κυτταροτοξικότητας των φυσικών μεσολαβητών για το LMS. Πραγματοποιήθηκε μια δοκιμασία ουδέτερου κόκκινου (NR) για τη μέτρηση της κυτταροτοξικότητας των μεσολαβητών [29]. Το NR μετρά τη βιωσιμότητα των λυσοσωμάτων ζωντανών κυττάρων. Κύτταρα μελανώματος με συγκέντρωση 3 x 104 κύτταρα διανεμήθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96-πηγαδιού. Μετά από 24 ώρες καλλιέργειας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φυσικούς μεσολαβητές (1, 2, 5, 10, 22 και 46 mM). Μετά από επιπρόσθετη καλλιέργεια για 2 ημέρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μg/mL διαλύματος NR διαλυμένο σε DMEM και επωάστηκαν για 3 ώρες. Μετά την απομάκρυνση του υπερκειμένου μέσω αναρρόφησης, ένα διάλυμα εκροφητικού NR (1 τοις εκατό παγόμορφο οξικό οξύ, 49 τοις εκατό αιθανόλη και 50 τοις εκατό απεσταγμένο νερό) χρησιμοποιήθηκε για εκχύλιση χρώματος. Μετά τη διαδικασία εκχύλισης, η αλλαγή στην απορρόφηση μετρήθηκε στα 540 nm.

2.5. Προετοιμασία και αποχρωματισμός του φιλμ υδρογέλης μελανίνης/κυτταρίνης

Για να μετρηθεί η δραστηριότητα αποχρωματισμού του LMS για το φιλμ μελανίνης/κυτταρίνης, το παρασκευασμένο φιλμ υδρογέλης κόπηκε σε ένα φύλλο 1 × 2 cm. Η μεμβράνη υδρογέλης βυθίστηκε σε 4 mL ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού κιτρικού οξέος 1 Μ (ρΗ 5,5). Στη συνέχεια, 0.5 mL 1 mM ακετοσυριγγόνης και 0.5 mL διαλύματος δαντέλας (2,5 U) προστέθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα. Η αντίδραση αποχρωματισμού διεξήχθη σε λουτρό νερού με ανακίνηση στις 120 μ.μ. και στους 25°C για 3 ώρες. Μετά την αντίδραση, το φιλμ πλύθηκε με απεσταγμένο νερό και προσαρτήθηκε στην εσωτερική πλευρά της κυψελίδας για να μετρηθεί η αλλαγή στα φάσματα στην περιοχή των 400-800 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο UV/Vis. Οι αντιδράσεις ελέγχου χωρίς lacM ή μεσολαβητές διεξήχθησαν επίσης υπό τις ίδιες συνθήκες. Η απελευθέρωση της μελανίνης από το φιλμ ή η αλλαγή χρώματος του φιλμ μελανίνης/κυτταρίνης δεν ανιχνεύθηκε υπό τις συνθήκες αντίδρασης. Επιπλέον, η αλλαγή στις χρωματικές παραμέτρους (τιμές L*, a* και b*) του φιλμ μελανίνης/κυτταρίνης μετά την αντίδραση αποχρωματισμού με LMS καταγράφηκε επίσης χρησιμοποιώντας χρωματόμετρο (KONICA MI NOLTA, Τόκιο, Ιαπωνία). Οι τιμές ΔL (μετρική διαφορά ελαφρότητας), ΔE (ολική διαφορά χρώματος), YI (δείκτης κιτρινιάς) και WI (δείκτης λευκότητας) ελήφθησαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες εξισώσεις [30-32]:

2.6. Παρασκευή Φυσικής Μελανίνης

Η φυσική μελανίνη ελήφθη από κύτταρα μελανώματος B16F10. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ορμόνη διέγερσης α-μελανοκυττάρων για την παραγωγή μελανίνης. Μετά από 4 ημέρες επώασης, τα κύτταρα συνελήφθησαν χρησιμοποιώντας τρυψίνη-ΕϋΤΑ και υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο λήφθηκε με φυγοκέντρηση στις 8000 rpm για 10 λεπτά και στη συνέχεια ρυθμίστηκε σε ρΗ 1,5 χρησιμοποιώντας 6 Μ HCI. Το διάλυμα έβρασε στους 100 ◦C για 4 ώρες για να υδρολυθούν τα υπολειμματικά κλάσματα πρωτεΐνης. Το διάλυμα που περιείχε φυσική μελανίνη πλύθηκε με ακετόνη, ακολουθούμενο από χλωροφόρμιο και αιθανόλη, και στη συνέχεια πλύθηκε με απιονισμένο νερό για να εξαλειφθούν υπολείμματα, όπως κύτταρα, συστατικά μέσων και πρωτεϊνικά κλάσματα [33,34]. Όλες οι διαδικασίες πλύσης πραγματοποιήθηκαν περισσότερες από δύο φορές. Τέλος, η φυσική μελανίνη ελήφθη με λυοφιλοποίηση και χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα για το LMS.

3. Αποτελέσματα και συζήτηση

3.1. Η επίδραση των μεσολαβητών στον αποχρωματισμό της μελανίνης από το LMS

Η επίδραση διαφόρων μεσολαβητών στην αντίδραση αποχρωματισμού μελανίνης με LMS διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας δύο λακκάσες από T. versicolor (lacT) και M. thermophila (lacM) (Εικόνα 1).Όταν το lacT χρησιμοποιήθηκε χωρίς μεσολαβητή για αποχρωματισμό μελανίνης, η απόδοση αποχρωματισμού ήταν μόνο 1 τοις εκατό μετά από 5 ώρες αντίδρασης. Όταν το HOBt χρησιμοποιήθηκε ως μεσολαβητής για το lacT, η απόδοση αποχρωματισμού αυξήθηκε ελαφρώς στο 2 τοις εκατό μετά από 5 ώρες αντίδρασης. Η χρήση διαφόρων συνθετικών μεσολαβητών, όπως HOBt, ABTS, VLA και TEMPO, στην καταλυόμενη από λακκάση οξείδωση φαινολικών ή μη φαινολικών ενώσεων αύξησε σημαντικά τους ρυθμούς αντίδρασης [10,15]. Όταν η πρόσβαση των ενώσεων-στόχων στην ενεργό θέση της λακκάσης περιορίζεται από τη στερεοχημική τους παρεμπόδιση, οι μεσολαβητικές ρίζες που σχηματίζονται από τη λακκάση μπορούν να οξειδώσουν αποτελεσματικά τις ενώσεις-στόχους μέσω του μηχανισμού μεταφοράς ηλεκτρονίων ή ατόμου υδρογόνου [12]. Το HOBt είναι ένας από τους πιο συχνά χρησιμοποιούμενους συνθετικούς μεσολαβητές στο LMS λόγω του υψηλού οξειδοαναγωγικού δυναμικού του (1,1 V) [6]. Ωστόσο, το HOBt δεν είναι ένα καλό συστατικό καλλυντικών λόγω της πιθανής τοξικότητας των κυττάρων και της ικανότητάς του να αδρανοποιεί τη λακκάση. Έτσι, επιλέξαμε επτά φυσικούς μεσολαβητές, ακετοσυριγγόνη, συριγαλδεΰδη, π-κουμαρικό οξύ, βανιλίνη, βανιλικό οξύ, βανιλυλική αλκοόλη και ακετοβανιλόνη, για την αντίδραση αποχρωματισμού μελανίνης με LMS. Είναι ενδιαφέρον ότι όλοι οι φυσικοί μεσολαβητές δρουν ως πιο αποτελεσματικοί μεσολαβητές από το HOBt για τον αποχρωματισμό της μελανίνης λόγω έλλειψης. Όταν χρησιμοποιήθηκαν ακετοσυριγγόνη, συριγγαλδεΰδη και π-κουμαρικό οξύ, οι αποδόσεις αποχρωματισμού ήταν 28 τοις εκατό, 22 τοις εκατό και 18 τοις εκατό, αντίστοιχα, μετά από 5 ώρες αντίδρασης. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν τη χρησιμότητα των φυσικών μεσολαβητών για την αντίδραση αποχρωματισμού μελανίνης από το LMS. Οι μεσολαβητές στο LMS οξειδώνονται σε μεσολαβητικές ρίζες από τη λακκάση και οι ρίζες μεσολαβητών προκαλούν την οξείδωση και τον αποχρωματισμό της μελανίνης. Όταν η έλλειψη χρησιμοποιήθηκε χωρίς μεσολαβητή για τον αποχρωματισμό της μελανίνης κατά τη διάρκεια ενός επαρκούς χρόνου αντίδρασης, ο οποίος θα μπορούσε να φτάσει στην κατάσταση ισορροπίας, η απόδοση αποχρωματισμού ήταν 7 τοις εκατό μετά από 24 ώρες αντίδρασης. Οι φυσικοί μεσολαβητές, εκτός από το βανιλικό οξύ, δρουν ως πιο αποτελεσματικοί μεσολαβητές από το HOBt για τον αποχρωματισμό της μελανίνης με lacT μετά από 24 ώρες αντίδρασης. Η απόδοση αποχρωματισμού μετά από 24 ώρες αντίδρασης χρησιμοποιώντας βανιλικό οξύ ως μεσολαβητή ήταν χαμηλότερη από εκείνη μετά από 5 ώρες αντίδρασης. Αυτό μπορεί να οφείλεται στη χαμηλή σταθερότητα της οξειδωμένης ριζικής μορφής του βανιλικού οξέος. Όταν χρησιμοποιήθηκαν ακετοσυριγγόνη, συριγγαλδεΰδη και ακετοβανιλόνη, οι αποδόσεις αποχρωματισμού ήταν 34 τοις εκατό, 30 τοις εκατό και 31 τοις εκατό, αντίστοιχα, μετά από αντίδραση 24 ωρών. Το p-κουμαρικό οξύ ήταν πιο αποτελεσματικό στην ενίσχυση του αρχικού ρυθμού αντίδρασης από την ακετοβανιλόνη, ενώ η ακετοβανιλόνη προκάλεσε υψηλότερη απόδοση αποχρωματισμού στην κατάσταση ισορροπίας από το π-κουμαρικό οξύ.

Η επίδραση του μεσολαβητή στην αντίδραση αποχρωματισμού με LMS χρησιμοποιώντας lacM ήταν επίσης πολύ παρόμοια με εκείνη που ελήφθη από LMS χρησιμοποιώντας lacT. Όταν χρησιμοποιήθηκε δαντέλα χωρίς μεσολαβητή για αποχρωματισμό μελανίνης, η απόδοση αποχρωματισμού ήταν μόνο 2 τοις εκατό μετά από 5 ώρες αντίδρασης. Το HOBt ως μεσολαβητής για το lacM δεν ενίσχυσε την απόδοση αποχρωματισμού κατά τη διάρκεια της αντίδρασης 5 ωρών. Όλοι οι φυσικοί μεσολαβητές, εκτός από το π-κουμαρικό οξύ και τη βανιλίνη, έδρασαν ως αποτελεσματικοί μεσολαβητές αποχρωματισμού μελανίνης από το lacM. Όταν χρησιμοποιήθηκαν ακετοσυριγγόνη και συριγγαλδεΰδη, οι αποδόσεις αποχρωματισμού ήταν 25 τοις εκατό και 22 τοις εκατό, αντίστοιχα, μετά από 5 ώρες αντίδρασης. Το p-κουμαρικό οξύ και η βανιλίνη χρησιμοποιήθηκαν ως αποτελεσματικοί μεσολαβητές για το καθένα, αλλά δεν μπορούσαν να ενισχύσουν αποτελεσματικά το ρυθμό αποχρωματισμού στο LMS χρησιμοποιώντας δαντέλα. Αυτό μπορεί να προκαλείται από τη χαμηλότερη εξειδίκευση υποστρώματος του lacM για το π-κουμαρικό οξύ και τη βανιλίνη. Οι αποδόσεις αποχρωματισμού μετά από 24 ώρες αντίδρασης lacM με π-κουμαρικό οξύ και βανιλίνη ήταν παρόμοιες με αυτές που ελήφθησαν με lacT. Αυτό δείχνει ότι οι οξειδωμένες μορφές του π-κουμαρικού οξέος και της βανιλίνης μπορούν να αποχρωματίσουν αποτελεσματικά τη μελανίνη, αν και ο ρυθμός οξείδωσής τους από το lacM ήταν πολύ χαμηλότερος από εκείνον με το lacT. Όταν χρησιμοποιήθηκε lacM χωρίς μεσολαβητή για αποχρωματισμό μελανίνης κατά τη διάρκεια επαρκούς χρόνου αντίδρασης, η απόδοση αποχρωματισμού ήταν 5 τοις εκατό μετά από 24 ώρες αντίδρασης. Οι φυσικοί μεσολαβητές, εκτός από το βανιλικό οξύ, δρουν επίσης ως πιο αποτελεσματικοί μεσολαβητές από το HOBt για τον αποχρωματισμό της μελανίνης με lacM μετά από 24 ώρες αντίδρασης. Όταν η ακετοσυριγγόνη, η συριγγαλδεΰδη και η ακετοβανιλόνη χρησιμοποιήθηκαν ως μεσολαβητές για το lacM, οι αποδόσεις αποχρωματισμού ήταν 34 τοις εκατό, 28 τοις εκατό και 31 τοις εκατό, αντίστοιχα, μετά από 24 ώρες αντίδρασης. Όταν το βανιλικό οξύ χρησιμοποιήθηκε ως μεσολαβητής τόσο για το lacT όσο και για το lacM, έδειξε τη χαμηλότερη απόδοση αποχρωματισμού. Αυτό μπορεί να οφείλεται στη χαμηλή σταθερότητα της οξειδωμένης ριζικής μορφής του βανιλικού οξέος. Οι Khammuang και Sarnthima ανέφεραν ότι η βανιλίνη και το βανιλικό οξύ θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως μεσολαβητές για τον αποχρωματισμό της μελανίνης χρησιμοποιώντας λακκάση από το Lentinus polycarpous [28]. Ωστόσο, έδειξαν πολύ χαμηλότερη δραστηριότητα αποχρωματισμού για τη μελανίνη από την ακετοσυριγγόνη όταν χρησιμοποιήθηκαν ως μεσολαβητές για το lacT και τη δαντέλα.

Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι φυσικοί μεσολαβητές είναι πιο αποτελεσματικοί για τον αποχρωματισμό της μελανίνης με LMS από το HOBt. Το HOBt έχει θεωρηθεί ως ένας αποτελεσματικός συνθετικός μεσολαβητής για τη λακκάση λόγω του υψηλού οξειδοαναγωγικού δυναμικού του και του καταλυτικού ρόλου της ομάδας N OH του HOBt [5]. Η αποτελεσματικότητα των μεσολαβητών για την οξείδωση των υποστρωμάτων-στόχων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ικανότητα σχηματισμού σταθερών ριζών καθώς και από τη στερεοχημική παρεμπόδιση που προκαλείται από ογκώδεις αλκυλικούς υποκαταστάτες παρά από το δυναμικό οξειδοαναγωγής των μεσολαβητών [19,35]. Η χαμηλή σταθερότητα του οξειδωμένου ενδιάμεσου του HOBt έχει προσδιοριστεί μέσω κυκλικής βολταμετρίας [6]. Επομένως, η χαμηλή απόδοση αποχρωματισμού από το LMS που χρησιμοποιεί HOBt μπορεί να προκληθεί από τη χαμηλή σταθερότητα του HOBt υπό τις συνθήκες αντίδρασης της λακκάσης. Αν και το δυναμικό οξειδοαναγωγής της συριγγαλδεΰδης ήταν χαμηλότερο από αυτό της HOBt, η συριγαλδεΰδη έδειξε σχετικά υψηλότερη σταθερότητα από το HOBt [6].

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, οι φυσικοί μεσολαβητές που χρησιμοποιούνται σε αυτή την εργασία έχουν διάφορους υποκαταστάτες (π.χ. υδροξύλιο, μεθοξυ, καρβοξυλ, κετόνη ή αλδεΰδη) σε διαφορετικές θέσεις στον δακτύλιο βενζολίου [12,19]. Οι μεσολαβητές με δύο μεθοξυ ομάδες (ακετοσυριγγόνη και συριγγαλδεΰδη) εμφάνισαν υψηλότερα ποσοστά αποχρωματισμού από εκείνους με μία μεθοξυ ομάδα. Ο ρυθμός αποχρωματισμού που ελήφθη από το π-κουμαρικό οξύ χωρίς μεθοξυ ομάδα εξαρτιόταν από τον τύπο της λακκάσης. Το ρ-κουμαρικό οξύ με lacT έδειξε υψηλότερο ρυθμό αποχρωματισμού από εκείνα με μία ομάδα μεθοξυ, ενώ το ρ-κουμαρικό οξύ με lacM έδειξε τον χαμηλότερο ρυθμό αποχρωματισμού στην αντίδραση των 5 ωρών. Fillat et al. έδειξε επίσης παρόμοια αποτελέσματα για τον αποχρωματισμό φλεξογραφικών μελανιών από μυκητιακές λακάσες με φυσικούς μεσολαβητές [36]. Οι φαινολικοί φυσικοί μεσολαβητές (ακετοσυριγγόνη, μεθυλική σύριγγα και συριγαλδεΰδη) με δύο μεθοξυ υποκαταστάτες στον δακτύλιο οξειδώθηκαν με λακκάση ταχύτερα από το π-κουμαρικό οξύ χωρίς μεθοξυομάδα. Αυτό δείχνει ότι οι μεθοξυ ομάδες παίζουν πιο σημαντικό ρόλο ως δότες ηλεκτρονίων από τον διπλό δεσμό της πλευρικής αλυσίδας του π-κουμαρικού οξέος. Όταν συγκρίθηκαν οι μεσολαβητές με μία μεθοξυ ομάδα, η απόδοση αποχρωματισμού αυξήθηκε με την ακόλουθη σειρά: ακετοβανιλόνη > βανιλίνη > βανιλυλική αλκοόλη > βανιλικό οξύ. Η ακετοβανιλόνη, η οποία έχει μια ομάδα κετόνης, έδειξε υψηλότερο ρυθμό αποχρωματισμού και απόδοση από τους μεσολαβητές με ομάδες αλδεΰδης, υδροξυλίου και καρβοξυλίου. Η ακετοσυριγγόνη με μια ομάδα κετόνης έδειξε επίσης υψηλότερο ρυθμό αποχρωματισμού και απόδοση από τη συριγγαλδεΰδη με μια ομάδα αλδεΰδης.

Στα ακόλουθα πειράματα, η ακετοσυριγγόνη, η συριγγαλδεΰδη και η ακετοβανιλόνη, που έδειξαν υψηλή ικανότητα αποχρωματισμού μελανίνης, επιλέχθηκαν ως μεσολαβητές για το LMS για τον αποχρωματισμό της μελανίνης. Η επίδραση του μεσολαβητή στην αντίδραση αποχρωματισμού με LMS διερευνήθηκε με την πάροδο του χρόνου (Εικόνα S1). Η αντίδραση αποχρωματισμού χρησιμοποιώντας lacT με ακετοσυριγόνη, συριγαλδεΰδη και ακετοβανιλόνη είχε ως αποτέλεσμα 21 τοις εκατό, 18 τοις εκατό και 1 τοις εκατό αποχρωματισμό μετά από 1 ώρα αντίδρασης, αντίστοιχα. Η αντίδραση αποχρωματισμού χρησιμοποιώντας lacM με ακετοσυριγγόνη και συριγαλδεΰδη οδήγησε σε αποδόσεις αποχρωματισμού 19 τοις εκατό και 18 τοις εκατό μετά από 1 ώρα αντίδρασης, αντίστοιχα. Και οι δύο λακάσες έδειξαν παρόμοια προφίλ αντίδρασης όταν χρησιμοποιήθηκε ο ίδιος μεσολαβητής. Η ακετοσυριγγόνη και η συριγγαλδεΰδη αύξησαν σημαντικά τον ρυθμό αποχρωματισμού κατά την αρχική αντίδραση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι διμεθοξυ ομάδες που περιέχουν ακετοσυριγγόνη και συριγαλδεΰδη ήταν πιο αποτελεσματικές στην ενίσχυση του αρχικού ρυθμού αποχρωματισμού με LMS από ό,τι η ακετοβανιλόνη που περιέχει μία μεθοξυ ομάδα. Fillat et al. ανέφερε επίσης ότι οι μεθοξυ ομάδες στις δομές δακτυλίου των μεσολαβητών δρουν ως επιταχυντές για την οξείδωση των υποστρωμάτων [36]. Από την άλλη πλευρά, η απόδοση αποχρωματισμού μετά από 24 ώρες αντίδρασης από την ακετοβανιλόνη ήταν παρόμοια με εκείνη της συριγαλδεΰδης, αν και η ακετοβανιλόνη αύξησε μέτρια τον ρυθμό αντίδρασης.

Για περισσότερες πληροφορίες: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501