Πολυκυστική νεφρική νόσο

ali.ma@wecistanche.com

Μέρος Ⅱ: Οργανοειδή νεφρού που δημιουργούνται από ερυθροειδή προγονικά κύτταρα ασθενών με αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστική νόσο των νεφρών

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice & et al.

Ιστορικό:ΝεφρόΤα οργανοειδή έχουν ληφθεί ευρέως από εμπορικά διαθέσιμα επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs). Ωστόσο, ήταν μεγάλη πρόκληση η αποτελεσματική παραγωγή νεφρικών οργανοειδών μοντέλων από ασθενείς με αυτοσωμική επικρατούσα πολυκυστικήνεφρόασθένεια (ADPKD) που ανακεφαλαιώνει τόσο την εμβρυογένεση όσο και τους μηχανισμούς της κυστογένεσης.

Κάντε κλικ στο cistanche παρενέργειες και όφελος για τα νεφρά

Μέθοδοι: Ερυθροειδείς πρόγονοι αίματος (EPs) από δύο ADPKD (αυτοσωματικά κυρίαρχα πολυκυστικάνεφρόασθένεια) ασθενείς και ένας υγιής δότης (HC) χρησιμοποιήθηκε ως συγκριτικός έλεγχος για την ομαλοποίηση των πολλών τεχνικών βημάτων για επαναπρογραμματισμό EPs και για τη δημιουργία οργανοειδών. Τα EP επαναπρογραμματίστηκαν από έναν επισωματικό φορέα σε iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα), τα οποία διαφοροποιήθηκαν σε νεφρικά σωληναροειδή οργανοειδή και στη συνέχεια διεγέρθηκαν από φορσκολίνη για να προκαλέσουν σχηματισμό κύστεων.

Αποτελέσματα: Τα iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) που προέρχονται από EPs εμφάνισαν όλα τα χαρακτηριστικά πολυδύναμης και ήταν σε θέση να διαφοροποιηθούν και στα τρία βλαστικά στρώματα. Τα 3D σωληνοειδή οργανοειδή δημιουργήθηκαν από μεμονωμένα κύτταρα μετά από 28 ημέρες σε Matrigel. HC και ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστικήνεφρόασθένεια) τα οργανοειδή δεν σχημάτισαν αυθόρμητα κύστεις, αλλά κατά τη διέγερση με φορσκολίνη, παρατηρήθηκαν δομές που μοιάζουν με κύστεις στο ADPKD (αυτοσωματικό κυρίαρχο πολυκυστικόνεφρόασθένεια) οργανοειδή αλλά όχι στα οργανοειδή που προέρχονται από HC.

Συμπέρασμα: Τα ευρήματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότινεφρόοργανοειδή δημιουργήθηκαν επιτυχώς από τα κύτταρα EP του αίματος του ADPKD (αυτοσωματικό κυρίαρχο πολυκυστικόνεφρόασθένεια) ασθενείς και έναν υγιή δότη ελέγχου. Αυτή η προσέγγιση θα πρέπει να συμβάλει ως ισχυρό εργαλείο για το εμβρυϊκόνεφρόμοντέλο ανάπτυξης, το οποίο είναι σε θέση να ανακεφαλαιώσει τους πολύ πρώιμους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην κυτταρογένεση.

ΚΑΝΤΕ ΚΛΙΚ ΕΔΩ ΓΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗⅠ

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, περιγράψαμε λεπτομερώς μια διαδικασία δημιουργίας νεφρικών οργανοειδών από ανθρώπινα iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) που λαμβάνονται από τα προγονικά κύτταρα του ερυθροειδούς αίματος ασθενών με ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστική νεφρική νόσος). Πολλοί τύποι σωματικών κυττάρων έχουν επαναπρογραμματιστεί επιτυχώς σε iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα), συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων του αίματος [Z]. Εδώ, επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε τους προγονικούς ερυθροειδείς του αίματος ως αρχικό κυτταρικό τύπο για διάφορους λόγους, όπως η γονιδιωματική τους ακεραιότητα, η επιγενετική μνήμη και ο αποτελεσματικός επαναπρογραμματισμός [11,17,18]. Η αποτελεσματικότητα με την οποία οι ερυθροειδείς πρόγονοι είχαν μετατραπεί σε iPSC ήταν κατά δύο τάξεις μεγέθους καλύτερη (7 τοις εκατό -28 τοις εκατό ) από την αποτελεσματικότητα των διαφοροποιημένων τύπων αιμοσφαιρίων (0).0 2 τοις εκατό -0,60 τοις εκατό )ή ινοβλάστες (0,74 τοις εκατό )[Z]. Παρά τη χαμηλή αφθονία αυτών των κυττάρων στο περιφερικό αίμα, μπορούν εύκολα να απομονωθούν και να επεκταθούν in vitro για να παράγουν επαρκή αριθμό για επαναπρογραμματισμό. Μία από τις πιο σημαντικές προκλήσεις για τη δημιουργία κατάλληλων iPSC είναι ο γονότυπος και η φαινοτυπική τους μεταβλητότητα [6], αλλά υπάρχουν ορισμένες τεχνικές στρατηγικές που προτείνονται για την παράκαμψη ή τη μείωση αυτής της μεταβλητότητας. Στα παρόντα πειράματα, χρησιμοποιήσαμε ένα μη ενσωματωμένο επισωμικό σύστημα για επαναπρογραμματισμό που δεν απαιτεί ενσωμάτωση γονιδιώματος για την έκφραση των γονιδίων επαναπρογραμματισμού [10], επιτρέποντας λιγότερη ανοσογονικότητα και καθιστώντας πιο γενετικά σταθερά κύτταρα [19,20]. Επιπλέον, όλα τα δείγματα προήλθαν από την ίδια πηγή, γεγονός που βοηθά στην ελαχιστοποίηση της επιγενετικής μεταβλητότητας [12] με την προϋπόθεση ότι η διαφοροποίηση του αρχικού κυττάρου μπορεί να επηρεάσει την αποτελεσματικότητα των τελικών αποτελεσμάτων. Η ανάλυση των δεικτών πολυδύναμης και η ικανότητα των iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) να διαφοροποιούνται και στα τρία βλαστικά στρώματα συγκρίθηκαν δίπλα-δίπλα και συγκρίθηκαν επίσης με την εμβρυϊκή κυτταρική σειρά Η9, η οποία χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος . Όλες αυτές οι συγκρίσεις δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ ασθενών με ADPKD (αυτοσωματική κυρίαρχη πολυκυστική νεφρική νόσο), HCs και Η9 κύτταρα.

Έχουν αναπτυχθεί αρκετά πρωτόκολλα για την πρόκληση της διαφοροποίησης των iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) σε οργανοειδή νεφρού [13,21]. Με βάση τα πρωτόκολλα που περιγράφονται από τους Cruz et al. [6], λάβαμε δομές με τα χαρακτηριστικά των εγγύς σωληναρίων, συμπεριλαμβανομένης της έκφρασης των NHE3 και AOP1. Επιπλέον, τα οργανοειδή εξέφρασαν NPHS2, υποδεικνύοντας την παρουσία κυττάρων που μοιάζουν με ποδοκύτταρα.

Αντίθετα, το AQP2 δεν εκφράστηκε σε αυτά τα σωληνοειδή οργανοειδή. Αυτό το εύρημα συμφωνεί με προηγούμενες μελέτες που υποδεικνύουν αρκετούς περιορισμούς στην ανάπτυξη δομών που προέρχονται από τον ουρητηρικό οφθαλμό (UB) in vitro, με την ανάπτυξη του UB να απαιτεί συγκεκριμένα πρωτόκολλα, καθώς το χρονικό παράθυρο για την προσθήκη του συγκεκριμένου επαγωγέα είναι πολύ περιορισμένο [ 6,22,23].

Στη διαδικασία δημιουργίας νεφρικών οργανοειδών από iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα), όλη η νεφρική εμβρυογένεση ανακεφαλαιώνεται in vitro, περιλαμβάνοντας αρχικά τον σχηματισμό σφαιροειδών με σπηλαίους από μεμονωμένα κύτταρα [14]. Πράγματι, βρήκαμε ότι τα αδιαφοροποίητα iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) τόσο από ασθενείς με ADPKD (αυτοσωματική κυρίαρχη πολυκυστική νόσο των νεφρών) όσο και από υγιή μάρτυρα σχημάτισαν σφαιροειδείς δομές που μοιάζουν με επιβλάστες που ήταν μορφολογικά παρόμοιες. Αν και η αλληλουχία DNA των γονιδίων PKD1 και PKD2 δεν πραγματοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη, τα τρέχοντα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ο τύπος της μετάλλαξης που έφεραν οι ασθενείς δεν είχε καμία επίδραση στην τυπική μορφογένεση επιβλαστών. Απαιτούνται ακόμη περαιτέρω μελέτες για την ορθότερη αξιολόγηση της έκφρασης των βασικών μορίων που εμπλέκονται σε αυτή τη φάση της εμβρυϊκής ανάπτυξης.

Σύμφωνα με το πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε από τους Freedman et al. [14], παρατηρήσαμε ότι τα σφαιροειδή διαφοροποιήθηκαν σε σωληνοειδή οργανοειδή 26 ημέρες μετά την επαγωγή της διαφοροποίησης και ο συγχρονισμός ήταν παρόμοιος τόσο για τους ασθενείς με ADPKD (αυτοσωματική κυρίαρχη πολυκυστική νεφρική νόσο) όσο και για τους ασθενείς με HC(Εικ③). Ωστόσο, παρατηρήσαμε κάποια μεταβλητότητα όσον αφορά το χρονοδιάγραμμα έκφρασης και τα επίπεδα των δεικτών διαφοροποίησης. Από την άλλη πλευρά, η μορφολογία των σωληνοειδών δομών ήταν παρόμοια και συγκρίσιμη μεταξύ δειγμάτων από ασθενείς με ADPKD και HC. Αντίθετα, χρησιμοποιώντας iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) που προέρχονται από βιοψίες νεφρών ασθενών με ADPKD (αυτοσωματική κυρίαρχη πολυκυστική νεφρική νόσο), η ομάδα Cruz et al, βρήκε μεγαλύτερη μεταβλητότητα στην ικανότητα αυτών των κυττάρων να σχηματίζουν οργανοειδή[6]. Εκτός από την τεράστια ποικιλία μεταλλάξεων που είναι εγγενείς σε αυτή την ασθένεια, αυτές οι διαφορές στην αποτελεσματικότητα λήψης οργανοειδών μπορούν επίσης να εξηγηθούν από τους ετερογενείς κυτταρικούς τύπους που υπάρχουν στα δείγματα βιοψίας, σε αντίθεση με τους προγονικούς ερυθροειδείς, που αποτελούν έναν πιο ομοιογενή κυτταρικό πληθυσμό. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι παρά τη μεταβλητότητα και τις διαφορές στην αποτελεσματικότητα διαφορετικών κλώνων iPSC να σχηματίζουν οργανοειδή νεφρού, η λήψη των τελευταίων από ασθενείς με ADPKD (αυτοσωματική κυρίαρχη πολυκυστική νόσος των νεφρών) μπορεί να αποτελέσει ένα μοναδικό μοντέλο για τη μελέτη των πολλαπλών μορφών φαινοτυπικών εκδηλώσεων αυτής της ασθένειας. Επιπλέον, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι εάν υπάρχει σημαντική μεταβλητότητα μεταλλάξεων στον πληθυσμό που έχει προσβληθεί από ADPKD, τα ειδικά για τον ασθενή iPSCs (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα), όντας απολύτως συμβατά με το ανοσοποιητικό, ενδέχεται να χρησιμοποιηθούν για μεμονωμένες αναγεννητικές θεραπείες στο μέλλον , εκτός από το ότι επιτρέπει την ανάπτυξη ενός μοντέλου in vitro για να επαληθευτεί εάν οι πολύ πρώιμες φαινοτυπικές εκδηλώσεις είναι επίσης τόσο διαφορετικές όσο η κλινική εικόνα.

Μη διεγερμένα οργανοειδή που προέρχονται από ασθενείς με HCor ADPKD (αυτοσωματική κυρίαρχη πολυκυστική νεφρική νόσο) δεν σχημάτισαν αυθόρμητα κύστεις. Η τυπική μορφολογία των κύστεων και η έκφραση των δεικτών κυστεογένεσης δεν ήταν ανιχνεύσιμες σε κανένα δείγμα, ακόμη και επεκτείνοντας την οργανοειδή διαφοροποίηση στην καλλιέργεια μέχρι τη συμπλήρωση 35 ημερών. Έχει αποδειχθεί ότι ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός από μόνος του δεν παράγει κύστεις[24]. Επιπλέον, απαιτείται ένα τρίτο ανεξάρτητο συμβάν (γνωστό ως τρίτο χτύπημα) για την επιτάχυνση του σχηματισμού κύστεων και της ανάπτυξης in vivo [23]. Αντίθετα, ο σχηματισμός κύστης που προκλήθηκε από τη φορσκολίνη συνέβη στα οργανοειδή από ασθενείς με ADPKD αλλά όχι σε εκείνους από HC. Αξίζει να σημειωθεί, αν και υπάρχουν, κύστεις παρατηρήθηκαν σε χαμηλό ποσοστό στα δείγματα ADPKD ακόμη και παρουσία φορσκολίνης, όπως έχει επίσης παρατηρηθεί από τους Freedman et al. [14] σε οργανοειδή που σχηματίζονται από το μοντέλο CRISPR/Cas9 της νόσου ADPKD. Μπορούν να διατυπωθούν ορισμένες υποθέσεις για να εξηγηθεί η χαμηλή συχνότητα των κύστεων που βρίσκονται στο παρόν μοντέλο. 1)Οργανοειδή που καλλιεργήθηκαν σε περιβάλλον 3D εναιωρήματος έδειξαν πολύ υψηλότερη απόδοση κυστογένεσης σε σύγκριση με προσκολλημένα οργανοειδή [6], υποδεικνύοντας ότι το μικροπεριβάλλον εμπλέκεται άμεσα στην κυστογένεση. άπω τμήματα του νεφρώνα [23]. Αν και όλα τα τμήματα νεφρώνα μπορούν να προέρχονται από κύστεις συμπεριλαμβανομένων των εγγύς σωληνίσκων [25], προφανώς αυτά που προέρχονται από συλλεκτικούς πόρους φαίνεται να είναι μεγαλύτερα και σε μεγαλύτερους αριθμούς από αυτά από άλλα τμήματα [26], 3) Τέλος, πρόσφατα αποδείχθηκε ότι η προέλευση των κύστεων μπορεί να σχετίζεται με την παρουσία πολλαπλών μεταλλάξεων PKD1 που καθορίζουν τη σοβαρότητα της νόσου και ότι ο σχηματισμός κύστεων στους αγωγούς συλλογής συσχετίστηκε με τη σοβαρότητα της νόσου [27, 28].

Συμπερασματικά, τα παρόντα ευρήματα έδειξαν ότι είναι εφικτή η δημιουργία οργανοειδών με τρισδιάστατες δομές παρόμοιες με την αρχιτεκτονική των προγονικών νεφρών χρησιμοποιώντας iPSC (επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα) επαναπρογραμματισμένα από ερυθροειδείς προγονικούς που απομονώθηκαν εύκολα από την ADPKD (αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστική νεφρική νόσος). ασθενείς και ότι αυτά τα οργανοειδή είναι ικανά να σχηματίσουν κύστεις υπό διέγερση με φορσκολίνη. Αυτή η πολλά υποσχόμενη μεθοδολογία αποκαλύπτει μια μέθοδο για την αύξηση της κατανόησης των πολύ πρώιμων γενετικών, φαινοτυπικών και φυσιολογικών σταδίων στο σχηματισμό κύστεων στο πλαίσιο της ADPKD (αυτοσωματική κυρίαρχη πολυκυστική νόσος των νεφρών).

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Chebib FT, Torres VE: Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease: Core Curriculum 2016.AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.201537PM206:07.

2. WatnickTJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW, et al: Η σωματική μετάλλαξη σε μεμονωμένες κύστεις ήπατος υποστηρίζει ένα μοντέλο κυστεογένεσης δύο επιτυχιών στην αυτοσωμική επικρατούσα πολυκυστική νόσο των νεφρών. Mol Cell,2:{{{ 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P, et al.: Οι σωματικές μεταλλάξεις PKD2 σε μεμονωμένες κύστεις νεφρού και ήπατος υποστηρίζουν ένα μοντέλο κυστεογένεσης "δύο χτυπημάτων" στην αυτοσωματική επικρατούσα πολυκυστική νόσο των νεφρών τύπου 2.JAm Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: Ένας κρίσιμος αναπτυξιακός διακόπτης ορίζει την κινητική του σχηματισμού κύστης νεφρού μετά την απώλεια του Pkd1.Nat Med, 13: 1490-1495,2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD, et al: Η νεφρική βλάβη είναι ένα τρίτο χτύπημα που προάγει την ταχεία ανάπτυξη της πολυκυστικής νόσου των ενηλίκων. Hum Mol Genet,18:2523-2531,2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. Κρουζ ΝΜ. Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK, et al: Η οργανοειδής κυστογένεση αποκαλύπτει έναν κρίσιμο ρόλο του μικροπεριβάλλοντος στην ανθρώπινη πολυκυστική νόσο των νεφρών. Nat Mater,16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: Επαγωγή πολυδύναμων βλαστοκυττάρων από καλλιέργειες ινοβλαστών. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707

8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ, et al: Μειωμένη ακτινωτή πολυκυστίνη-2 σε επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα από ασθενείς με πολυκυστική νεφρική νόσο με μεταλλάξεις PKD1. J Am Soc Nephrol,24:1571-1586,2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Παραγωγή επαγόμενων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων χωρίς διαγονίδια από μια μοναδική σταγόνα αίματος. Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.1-4A.9.10,2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818

10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il, et al.: Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.Science, 324:797-801,2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 PMID:19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G, et al: Το στάδιο διαφοροποίησης καθορίζει τη δυνατότητα των αιμοποιητικών κυττάρων για επαναπρογραμματισμό σε επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM, et al.: Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood κύτταρα με μοναδικές επιγενετικές και γονιδιακές υπογραφές έκφρασης. Cel/Res,21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: Πολυδύναμα οργανοειδή νεφρού που προέρχονται από βλαστοκύτταρα: Μια in vivo-like in vitro τεχνολογία. Eur J Pharmacol,790:12-20, 2016 https://ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081

14. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V, et al: Μοντελοποίηση νεφρικής νόσου με CRISPR-mutant νεφρικά οργανοειδή που προέρχονται από ανθρώπινα πολυδύναμα επιβλαστικά σφαιροειδή. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Paterson AD. Magistroni R. Dicks E, et al; Ενιαία κριτήρια για την υπερηχογραφική διάγνωση της ADPKD (αυτοσωματική κυρίαρχη πολυκυστική νόσος των νεφρών). JAm Soc Nephrol, 20:205-212, 2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, Nishiyama A, Matsumura M, Wataya T, et al: Ένας αναστολέας ROCK επιτρέπει την επιβίωση των διαχωρισμένων ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων. Nat Biotechnol, 25:681-686,2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Nuclear reprogramming and pluripotency.Nature,441:1061-1067,2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, UtikalJ, Cowan C, Hochedlinger K: Ένα σύστημα υψηλής απόδοσης για τη δημιουργία και τη μελέτη πολυδύναμων βλαστοκυττάρων που προκαλούνται από τον άνθρωπο. Cel/ Βλαστοκύτταρο. 3:340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420