Η Kaempferol ανακουφίζει τη βλάβη του LD-μιτοχονδρίου προάγοντας την αυτοφαγία: Επιπτώσεις στη νόσο του Πάρκινσον Μέρος 1

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη:Τα αναδυόμενα στοιχεία δείχνουν ότι η απροσδόκητη εναπόθεση και υπεροξείδωση σταγονιδίων λιπιδίων (LD) μπορεί να επιταχύνει το στρες των οργανιδίων και διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην παθογένεση των νευροεκφυλιστικών ασθενειών (NDDs).Στην προηγούμενη μελέτη μας, επιβεβαιώσαμε ότι η καμπφερόλη (Ka), ένα φυσικό φλαβονοειδές μικρό μόριο , εμφάνισε νευροπροστατευτικά αποτελέσματα σε ποντίκια με νόσο του Parkinson που προκαλείται από LPS (PD). Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η αυτοφαγία παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής εναπόθεσης LD. Στην τρέχουσα μελέτη, δείξαμε ότι το Ka προστατεύει από την ΤΗ συν την απώλεια νευρώνων και τα ελλείμματα συμπεριφοράς σε ποντίκια PD που προκαλούνται από MPTP/p, συνοδευόμενα από μειωμένο οξειδωτικό στρες λιπιδίων στη συμπαγή ουσία μέλαινα ουσία (SNpc). Σε καλλιεργημένα νευρωνικά κύτταρα, το Ka εμφάνισε ένα σχετικά ασφαλές εύρος συγκέντρωσης και σημαντικά καταστέλλεται η συσσώρευση LD και η κυτταρική απόπτωση που προκαλείται από το MPP plus. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι η προστατευτική δράση του Ka εξαρτάται από την αυτοφαγία, συγκεκριμένα τη λιποφαγία. Σημαντικά, το Ka προώθησε την αυτοφαγία για να μεσολαβήσει στην αποικοδόμηση της LD στα λυσοσώματα, η οποία στη συνέχεια ανακούφισε την εναπόθεση λιπιδίων και την υπεροξείδωση και την προκύπτουσα μιτοχονδριακή βλάβη, μειώνοντας κατά συνέπεια τον νευρωνικό θάνατο. Περαιτέρω, το AAV-shAtg5-μεσολάβηση του Atg5 knockdown κατάργησε τις νευροπροστατευτικές επιδράσεις του Ka έναντι της οξείδωσης των λιπιδίων σε ποντικούς PD. Αυτή η εργασία καταδεικνύει ότι το Ka αποτρέπει τον ντοπαμινεργικό νευρωνικό εκφυλισμό σε PD μέσω της αναστολής της μιτοχονδριακής βλάβης που προκαλείται από υπεροξείδωση λιπιδίων προάγοντας την αυτοφαγία των χειλιών και παρέχει μια πιθανή νέα θεραπευτική στρατηγική για PD και σχετικές NDDs.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

1. Εισαγωγή

Η νόσος του Πάρκινσον (PD) είναι μια κοινή νευροεκφυλιστική νόσος (NDD) που χαρακτηρίζεται παθολογικά από την προοδευτική απώλεια ντοπαμινεργικών (DA) νευρώνων στη μέλαινα ουσία συμπαγή (SNpc)[]. Αν και η ακριβής αιτιολογία και η φυσική πορεία αυτής της νόσου δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί πλήρως, πολυάριθμες διεργασίες και δυσλειτουργίες σε επίπεδο συστήματος, συμπεριλαμβανομένων των μιτοχονδριακών λειτουργιών, της ομοιόστασης της ντοπαμίνης, της νευροφλεγμονής και της αυτοφαγίας, έχουν εμπλακεί στην παθογένεση της PD [1. 2]. Πρόσφατες αναφορές αποκάλυψαν ότι η λιποτοξικότητα που σχετίζεται με τα σταγονίδια λιπιδίων (LD) μπορεί να συμμετέχει στην παθολογία της PD [3,4]. Τα LDs είναι εξαιρετικά δυναμικά οργανίδια που αναδύονται από τη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) και συνήθως χρησιμεύουν ως ενδοκυτταρικές θέσεις αποθήκευσης ουδέτερων λιπιδίων [5]. Οι LDs πρόσφατα αποδείχθηκε ότι παίζουν πολύ ευρύτερο ρόλο από την αποθήκευση λιπαρών οξέων (FA) και συμμετέχουν σε πολλές ασθένειες. Για παράδειγμα, τα μυελοειδή κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων, των λευκοκυττάρων και των ηωσινόφιλων, σχηματίζουν LDs ως απόκριση στη φλεγμονή και το στρες, και τα LDs είναι θέσεις παραγωγής και αποθήκευσης φλεγμονωδών κυτοκινών και εμπλέκονται περαιτέρω στην παρουσίαση αντιγόνου και την κάθαρση του παθογόνου [6]. Είναι σημαντικό ότι στην αθηροσκλήρωση, τα αφρώδη κύτταρα πλούσια σε LD έχουν αποδειχθεί ότι είναι επιβλαβή σε όλα τα στάδια της νόσου [7].

Το Cistanche μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της ανοσίας

Ωστόσο, οι LDs δεν έχουν μελετηθεί εκτενώς στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ), με λίγες εργασίες που αναφέρουν την ιστολογική παρουσία των LDs στον ανθρώπινο εγκεφαλικό ιστό [8,9]. Ακόμα κι έτσι, οι LDs μπορεί να έχουν σημαντικές λειτουργίες στον εγκέφαλο, καθώς πρόσφατες μελέτες επιβεβαίωσαν ότι οι συσσωρευμένες LDs στη γλοία επιτάχυναν τον νευροεκφυλισμό σε ένα μοντέλο Drosophila [10]. Έχει αναφερθεί πρόσφατα ότι σε ποντίκια, ελαιούχα ερυθρά Ο-θετικά φορτωμένα με λιπίδια κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των νευρώνων, της γλοιακής ινιδιακής όξινης πρωτεΐνης (GFAP) συν αστροκυττάρων και του ιονισμένου μορίου προσαρμογέα που δεσμεύει ασβέστιο-1 (IBA-1 ) τα μικρογλοία, υπάρχουν σε πολλές περιοχές του εγκεφάλου και έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχουν σε διαδικασίες που σχετίζονται με την ηλικία [11]. Η προηγούμενη εργασία μας έδειξε επίσης αυξημένη συσσώρευση LD στον εγκέφαλο σε ένα μοντέλο ποντικού PD [12]. Συνολικά, αυτές οι μελέτες υποδηλώνουν ότι οι LDs μπορεί να εμπλέκονται στην παθογένεση της PD, καθώς και σε άλλες NDDs.

Κανονικά, οι ενδοκυτταρικές LDs αποικοδομούνται στα λυσοσώματα και παραδίδουν FA στα μιτοχόνδρια για την κατανάλωσή τους ως εναλλακτική πηγή ενέργειας κατά τη διάρκεια περιόδων εξάντλησης θρεπτικών ουσιών [13]. Ωστόσο, οι νευρώνες έχουν χαμηλή ικανότητα για κατανάλωση μιτοχονδριακών FA για παραγωγή ενέργειας [14]. Αυτό το χαρακτηριστικό κάνει τους νευρώνες ιδιαίτερα ευαίσθητους στη συσσώρευση LD και την υπεροξείδωση. Επιπλέον, η συσσώρευση LDs ενισχύει τον ρυθμό οξείδωσης FA και επιβάλλει επίμονη πίεση στη μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων, η οποία αυξάνει την παραγωγή ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS) από σύμπλοκα αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων Iand II[15] για να ενισχύσει το οξειδωτικό στρες. Η υπερφόρτωση λιπιδίων οδηγεί επίσης σε παραγωγή ROS από εξωμιτοχονδριακές πηγές όπως οι οξειδάσες νικοτιναμιδικής αδενίνης δινουκλεοτιδικής φωσφορικής (NADPH) και άλλα οξειδωτικά ένζυμα. Σε συνδυασμό με τη μειωμένη έκφραση των αντιοξειδωτικών ενζύμων και τη χαμηλή ικανότητα κατανάλωσης FA στους νευρώνες, η συσσώρευση LD προκαλεί οξειδωτικό στρες και μπορεί περαιτέρω να οδηγήσει σε μιτοχονδριακή βλάβη, λυσοσωμική δυσλειτουργία, ελαττωματική αυτοφαγία και ενεργοποίηση φλεγμονωδών αποκρίσεων [16,17]. Εκτός εάν τα συσσωρευμένα LDs μπορούν να ανασταλούν ή να αφαιρεθούν, οι εξαιρετικά ενεργοί νευρώνες υποβάλλονται σε παθοφυσιολογία, προκαλώντας νευροεκφυλισμό [17]. Τα στοιχεία δείχνουν ότι η μεσολαβούμενη από το λυσόσωμα καταβολική διαδικασία που ονομάζεται αυτοφαγία παίζει καθοριστικό ρόλο στη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης της LD σε πολλαπλούς ιστούς [17,18]. Αναλυτικά, οι LDs μπορούν να απομονωθούν επιλεκτικά σε αυτοφαγοσώματα και να παραδοθούν στα λυσοσώματα για αποικοδόμηση από λιπάσες λυσοσωμικού οξέος, μια διαδικασία που είναι ειδικά γνωστή ως λιποφαγία [19]. Επομένως, η στόχευση των LD και η αυτοφαγική οδός αφαίρεσής τους θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει μια νέα προσέγγιση για τη διαχείριση του νευροεκφυλισμού.

Η μελέτη των φυσικών προϊόντων και των διαιτητικών παραγόντων ως πηγών για πιθανές θεραπείες και στρατηγικές NDD έχει κερδίσει τεράστιο ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια [20]. Η καεμπφερόλη (Ka) είναι ένα φυσικό πολυφαινολικό μικρό μόριο που μπορεί να βρεθεί σε μια σειρά από κινεζικά φαρμακευτικά βότανα και διαιτητικές πηγές [21]. Το Ka έχει αναφερθεί ότι ασκεί αντιβακτηριακά, αντιγηραντικά και ανοσοτροποποιητικά αποτελέσματα, καθώς και αντιοξειδωτικές και νευροπροστατευτικές δραστηριότητες [20,22,23]. Προηγουμένως, αναφέρθηκε ότι το Ka αναστέλλει τη φλεγμονή στα μικρογλοιακά κύτταρα BV2 in vitro [24] και αυξάνει την αντίσταση των νευρώνων DA στη νευροφλεγμονή in vivo [25]. Ωστόσο, η επίδραση του Ka σε LDs σε PD δεν έχει ακόμη διερευνηθεί.

Δεδομένης της σημασίας των LDs και της στενής σύνδεσης μεταξύ των LD, των μιτοχονδρίων και της αυτοφαγίας [16], που εμπλέκονται όλα στην PD, υποθέτουμε ότι το Ka αναστέλλει την υπεροξείδωση της LD και αποτρέπει τον νευροεκφυλισμό DA στην PD. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι το Ka προστατεύει σημαντικά από τον νευροεκφυλισμό σε ένα μοντέλο PD ποντικού αναστέλλοντας τη συσσώρευση LD. Περαιτέρω μελέτη αποκάλυψε ότι το Ka πυροδότησε την αυτοφαγία και μείωσε τη συσσώρευση οξειδωμένων LDs για να ανακουφίσει τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και την παραγωγή μιτοχονδριακών ROS (mtROS), αποτρέποντας έτσι τον αποπτωτικό θάνατο των νευρώνων. Τα ευρήματα που προέκυψαν σε αυτή τη μελέτη μπορεί να βοηθήσουν σε άμεσες κλινικές αποφάσεις σχετικά με τη χρήση του φυσικού μορίου Ka σε NDDs όπως η PD.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. πειραματόζωα

Τα ποντίκια C57BL/6J (αρσενικά, 4-μηνών) ελήφθησαν από το Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν και εκτράφηκαν στο Κέντρο Ζωικών Πόρων της Ιατρικής Σχολής, στο Ιατρικό Πανεπιστήμιο του Ναντζίνγκ και στις εγκαταστάσεις ζώων στο Νοσοκομείο Ντραμ Τάουερ του Ναντζίνγκ. Τα ποντίκια είναι ελεύθερα να έχουν πρόσβαση σε τροφή και νερό σε ένα δωμάτιο με θερμοκρασία περιβάλλοντος 22 βαθμούς ± 2 βαθμούς και κύκλο φωτός/σκότους 12:12 ώρες. Όλες οι διαδικασίες σε ζώα διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις οδηγίες του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας Οδηγός για τη Φροντίδα και τη Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου.

2.2. Αντιδραστήρια

MPTP (M0896),3-MA (M9281), penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%)for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol(HPLC>99.0 τοις εκατό, 96.353) για πειράματα in vitro ελήφθη από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ΗΠΑ). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861), DHE (D11347) αγοράστηκαν από την Thermo Fisher Scientific. Για πειράματα σε ζώα, το Ka διαλύθηκε σε διάλυμα 10 τοις εκατό DMSO σε 16 τοις εκατό SBE- -CD σε στείρο αλατούχο διάλυμα. Για πειράματα κυττάρων, το Ka παρασκευάστηκε σε DMSO (Sigma-Aldrich) και PBS (η τελική συγκέντρωση DMSO είναι 0,01 τοις εκατό), ρΗ 7,4.

2.3. Επαγωγή και θεραπεία μοντέλου PD ποντικού που προκαλείται από μεθυλ-4-φαινυλ-1,2,3,6-τετραϋδροπυριδίνη (MPTP)

Για να αξιολογηθούν οι επιδράσεις του Ka στο μοντέλο PD της τοξικότητας MPTP/p, ποντίκια (αρσενικά, ηλικίας 4-5 μηνών) χωρίστηκαν τυχαία στην ομάδα που έλαβε αγωγή με αλατούχο διάλυμα, στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με MPTP, στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με MPTP συν Ka ομάδα, και μόνο ομάδα που έλαβε θεραπεία με Ka. Στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με MPTP, τα ποντίκια έλαβαν χρόνια χορήγηση MPTP με ένα πρωτόκολλο παρόμοιο με αυτό που περιγράφηκε προηγουμένως [26]: Το MPTP διαλύθηκε σε αλατούχο διάλυμα και εγχύθηκε υποδορίως στα 25 mg/kg ακολουθούμενο από 250 mg/kg προβενεσίδης (διαλυμένο σε διμεθυλοσουλφοξείδιο). ενδοπεριτοναϊκή (ip)ένεση σε διαστήματα 1 ώρας κάθε 3,5 ημέρες σε περίοδο 5 εβδομάδων. Τα ποντίκια ελέγχου έλαβαν ένεση φυσιολογικού ορού και προβενεσίδης. Στην ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με MPTP συν Ka, τα ποντίκια έλαβαν Ka (50 mg/kg, μία εφάπαξ ένεση/ημέρα κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Κίνα) ενδοπεριτοναϊκά (.p.) καθημερινά 3 ημέρες πριν από τη θεραπεία με MPTP και πάνω από τις 5 Εβδομάδες ένεσης MPTP. Μία εβδομάδα μετά την τελευταία ένεση MPTP, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε τεστ συμπεριφοράς τυφλωμένα σε ομάδες. Στη συνέχεια, όλα τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με 40 mg/kg πεντοβαρβιτάλη νατρίου και θυσιάστηκαν για ανίχνευση πρωτεϊνών εγκεφάλου και ανοσοϊστοχημεία ή ανάλυση qPCR.

2.4. In vivo στερεοταξική χειρουργική και πειραματικές θεραπείες

Η στερεοταξική χειρουργική επέμβαση υπό αναισθησία με πεντοβαρβιτάλη νατρίου (40 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκή) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται [25]. Το Atg5 ποντικού και το shRNA ελέγχου επιμολύνθηκαν με φορείς συσκευασίας (AAV-U6-CMV-shR-NA-EGFP) για τη δημιουργία AAV. Για μικροένεση, τα αναισθητοποιημένα ποντίκια τοποθετούνται σε στερεοταξική συσκευή. Τους εγχύθηκε το 1μLAAV με γυάλινο ηλεκτρόδιο με στόχο το DG(AP:-0.3 mm; ML:±{0.13 mm; DV:-0}.45 mm) με ρυθμό 0,25 μL/λεπτό Στη συνέχεια η βελόνα διατηρήθηκε για επιπλέον 2-λεπτά. 2 εβδομάδες μετά τη μικροένεση του ιού, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε επαγόμενη από MPTP αγωγιμότητα μοντέλου PD και (ή) θεραπεία με Ka.

Το Atg5 shRNA ελήφθη από την Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. Για τη σιωπή Atg5, οι εκκινητές φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1.

2.5. Ανάλυση συμπεριφοράς

Μία εβδομάδα μετά την τελική έγχυση MPTP ή φυσιολογικού ορού, η δοκιμή rotarod και η δοκιμή πόλων πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Για τη δοκιμή rotarod, τα ποντίκια εγκλιματίστηκαν στο rotarod σε δύο δοκιμές (6 λεπτά με επιταχυνόμενη ταχύτητα 12-20 rpm) την ημέρα για 2 διαδοχικές ημέρες πριν από την έναρξη του πειράματος. Στη συνέχεια, τα ποντίκια δοκιμάστηκαν στις 20 rpm για 300 δευτερόλεπτα για άλλες 3 συνεχόμενες ημέρες. Η καθυστέρηση στην πτώση καταγράφηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ανάλυσης Rotarod (Jiliang, Shanghai, Κίνα). Για τη δοκιμή πόλων, τα ποντίκια τοποθετήθηκαν με το κεφάλι προς τα πάνω στην κορυφή ενός κατακόρυφου ξύλινου στύλου (με τραχιά επιφάνεια, ύψος 50 cm, διάμετρος 1 cm). Όλα τα ποντίκια είχαν συνηθίσει τη συσκευή 2 ημέρες πριν από τη δοκιμή και στη συνέχεια δοκιμάστηκαν τρεις φορές την τρίτη ημέρα. Καταγράφηκε ο συνολικός χρόνος (T-total, έως ότου το ποντίκι φτάσει στο πάτωμα με τα τέσσερα πόδια του) και ο χρόνος στροφής (T-turn, για να γυρίσει το ποντίκι τελείως το κεφάλι προς τα κάτω). Το πείραμα τυφλώθηκε σε ομάδες ποντικιών για κάθε δοκιμή συμπεριφοράς και η δοκιμή πραγματοποιήθηκε τρεις φορές.

2.6. Συλλογή δειγμάτων εγκεφάλου

Μετά τις τελικές δοκιμές συμπεριφοράς, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με πεντοβαρβιτάλη νατρίου (40 mg/kg, ενδοπεριτοναϊκή). Οι ιστοί του ραβδωτού σώματος ανατέμνονται γρήγορα, προκαταψύχονται με υγρό άζωτο. Όλα τα δείγματα αποθηκεύτηκαν σε -80 βαθμό μέχρι την ανάλυση.

Για ανοσοϊστοχημική ανάλυση, τα ποντίκια εγχύθηκαν διακαρδιακά με 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη (PFA). Οι εγκέφαλοι εξήχθησαν, μεταμονιμοποιήθηκαν, αφυδατώθηκαν, ενσωματώθηκαν σε OCT (Tissue-Tek) και σειριακές τομές του εγκεφάλου κρυοτομήθηκαν (30 um ανά φέτα) σε κάθε ολόκληρο στρώμα και μεσεγκέφαλο χρησιμοποιώντας έναν μικροτόμο κατάψυξης (Leica CM1950, Nussloch, Γερμανία ). Όλες οι τομές συλλέχθηκαν σε έξι ξεχωριστές σειρές και οι φέτες εγκεφάλου αποθηκεύτηκαν σε 50 τοις εκατό γλυκερίνη και καταψύχθηκαν σε-20 βαθμό μέχρι την ανάλυση.

Για το TEM, τα ποντίκια εγχύθηκαν με 2,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη και 2 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη όπως περιγράφεται 【12】. μια μικρή μερίδα (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4°c.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Οι φέτες του εγκεφάλου ξεπλύθηκαν σε PBS και στη συνέχεια 3 τοις εκατό H2O2 για 10 λεπτό και στη συνέχεια επωάστηκαν με 0.3 τοις εκατό Triton X-100 σε PBS συμπληρωμένο με 5 τοις εκατό BSA για 1 ώρα. Μετά από αυτό, τα πλακίδια επωάστηκαν με τα πρωτεύοντα αντισώματα στους 4 βαθμούς όλη τη νύχτα σε PBS που περιείχε 5 τοις εκατό BSA στους 4 βαθμούς όλη τη νύχτα, στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν σε δευτερεύοντα αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, ακολουθούμενη από επώαση με διαμινοβενζιδίνη (DAB) ή τοποθέτηση σε DAPI (Life Technologies, Cat P36931) ως χρώση ανοσοφθορισμού για 5 λεπτά. Για τη χρώση Nissls, οι αντικειμενοφόρες πλάκες συγχωνεύτηκαν σε διάλυμα cresyl violet (CV) (0,1 g cresyl violet, 99 ml H2O και 1% οξικό οξύ 1 ml) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια αφυδατώθηκαν με αλκοόλη και ξυλόλιο. Παρατηρήθηκαν εικόνες και ελήφθησαν φωτογραφίες με μικροσκόπιο Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, Νέα Υόρκη, Ηνωμένες Πολιτείες). Ο συνολικός αριθμός θετικών σε ΤΗ και Nissl's νευρώνων στο SNpc λήφθηκε ορολογικά χρησιμοποιώντας τη μέθοδο οπτικού κλασματοποιητή με λογισμικό MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7. Ανάλυση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC).

Δείγματα ραβδωτού σώματος ποντικών ομογενοποιήθηκαν με {{0}}.1 Μ υπερχλωρικό οξύ (ιστοί 1 mg σε 100 μL υπερχλωρικό οξύ) και 0,1 mM EDTA, που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με

2.17. Κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη και ξεπλύθηκαν με D-hank's και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Annexin V-FITC (5 ul αραιωμένα σε 500 ul PBS)/PI (0,1 ul) αραιωμένα σε κιτ απόπτωσης 500 ul PBS (CA1020, Solarbio, Beijing, Beijing). Χιώτικη) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, τα αποπτωτικά κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (guava easyCyteTM 8, Millipore, USA). Οι μετρήσεις του μιτοχονδριακού ROS και του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης πραγματοποιήθηκαν όπως δημοσιεύτηκαν 【12】. Τα κύτταρα SH-SY5Y χρωματίστηκαν με MitoSOX (2,5 μM, Invitrogen, ΗΠΑ) ή με JCl (10 ug/ml, T{15}}, USA, Invitrogen, ） στους 37 ·C για 30 λεπτά. Μετά από πλύση με PBS δύο φορές, τα κύτταρα στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε ψυχρό PBS που περιείχε 1 τοις εκατό FBS για κυτταρομετρική ανάλυση ροής. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το λογισμικό FCS Express (Guava Easy CyteTM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2.18. Δοκιμασίες αναπνοής ιππόκαμπου

Η μιτοχονδριακή αναπνευστική λειτουργία σε ζωντανά κύτταρα SH-SY5Y μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον αναλυτή εξωκυτταρικής ροής Seahorse (XFe96) (Agi-lent, Santa Clara, ΗΠΑ) μέσω αλλαγών στον ρυθμό κατανάλωσης οξυγόνου (OCR). Κύτταρα SH-SY5Y που σπάρθηκαν σε 3×103 κύτταρα/φρεάτιο αφέθηκαν να προσκολληθούν στις πλάκες κυτταροκαλλιέργειας Seahorse και να φτάσουν περίπου το 80 τοις εκατό συρροή τη στιγμή του πειράματος. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με Ka και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε MPP plus για άλλες 24 ώρες. Το OCR ανιχνεύθηκε υπό βασικές συνθήκες ακολουθούμενη από διαδοχική προσθήκη 1 μΜ ολιγομυκίνης, 1 μΜ FCCP, καθώς και 1 μΜ ροτενόνης και αντιμυκίνης Α.

2.19. Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SEM. Η σημασία της διαφοράς προσδιορίστηκε με το Student's t-test, αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης ή μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από το post hoc test Tukey. Η διαφορά θεωρήθηκε σημαντική στο P<>

3. Αποτελέσματα

Αποτέλεσμα 1. Το Ka αποκαθιστά την κινητική δυσλειτουργία και αυξάνει τα επίπεδα ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα ποντικών μοντέλου MPTP/p PD

Για να διερευνηθεί το νευροπροστατευτικό αποτέλεσμα της παθογένεσης του Kaon PD, 4-αρσενικά ποντίκια C57BL/6 μηνών εγχύθηκαν με τη νευροτοξίνη MPTP για να καθιερωθεί το μοντέλο MPTP/p PD και έλαβαν θεραπεία με Ka (Εικ. la). Μετά την επαγωγή του μοντέλου, η δοκιμή rotarod και η δοκιμή πόλων χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της απόδοσης κινητήρα και συμπεριφοράς των ποντικών στις διαφορετικές ομάδες. Όπως φαίνεται, ο χρόνος απόδοσης του rotarod μειώθηκε σημαντικά σε ποντίκια που έλαβαν MPTP και αυτό το αποτέλεσμα αποφεύχθηκε από το Ka (Εικ. 1b). Ο Ka αποκατέστησε επίσης τα ελλείμματα συμπεριφοράς που προκλήθηκαν από το MPTP, όπως υποδεικνύεται από τις μειώσεις του χρόνου περιστροφής και του συνολικού χρόνου στη δοκιμή πόλου (Εικ.lc και d), χωρίς να επηρεάσει τα σωματικά βάρη των ποντικών (Εικ.1ε). Επιπλέον, η ανάλυση HPLC έδειξε ότι το επίπεδο της ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα μειώθηκε σημαντικά σε ποντίκια με πρόκληση MPTP/p και αυτό το επίπεδο αποκαταστάθηκε με θεραπεία με Ka (Εικ. 1στ). Η θεραπεία με Ka μείωσε επίσης την προκαλούμενη από MPTP/p μείωση των επιπέδων διυδροξυ-φαινυλοοξικού οξέος (DOPAC, μεταβολίτης της ντοπαμίνης) στο ραβδωτό σώμα (Εικ. 1g). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το Ka αποκαθιστά την κινητική δυσλειτουργία και αυξάνει τα επίπεδα ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα σε ποντίκια PD που προκαλούνται από MPTP.

Αποτέλεσμα 2. Το Ka ανακουφίζει την απώλεια νευρώνων DA στο SNpc ποντικών μοντέλου MPTP/p PD

Στη συνέχεια, για να αξιολογήσουμε περαιτέρω το νευροπροστατευτικό αποτέλεσμα της νευρωνικής βλάβης DA που προκαλείται από Kaon MPTP/p, εξετάσαμε την υδροξυλάση τυροσίνης (THD συν νευρώνες στο SNpc ποντικού με ανοσοχρώση. Όπως φαίνεται στα Σχ. 2α και β, το MPTP/p προκάλεσε σημαντική μείωση στον αριθμό των TH συν νευρώνων, ο οποίος μετριάστηκε με τη θεραπεία Ka. Επιπλέον, οι στερεολογικές μετρήσεις των συνολικών νευρώνων στο SNpc, όπως ορίζονται από τον Nissl

Εικ. 1. Η θεραπεία με Ka ανακουφίζει την κινητική δυσλειτουργία και αυξάνει τα επίπεδα ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα ποντικών μοντέλου MPTP/p PD.

(α) Σχηματικό διάγραμμα του πειραματικού σχεδιασμού. (β) Ο χρόνος στη ράβδο μετρήθηκε για τη δοκιμή του ροταρόντ σε τρεις διαδοχικές ημέρες. (cd) Ο χρόνος που χρειάστηκε για να στρίψει (χρόνος στροφής) και να κατέβει ένας στύλος (χρόνος αναρρίχησης) καταγράφηκε για τη δοκιμή πόλου. (ε) Το σωματικό βάρος ποντικού μετρήθηκε στο τέλος της μελέτης, η (fg) ντοπαμίνη (DA) και το διυδροξυ-φαινυλοοξικό οξύ (DOPAC) στο ραβδωτό σώμα αναλύθηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ο μέσος όρος ± SEM.n =9-10 για κάθε ομάδα στο (b, C, d). n=6-8 για κάθε ομάδα σε(f,g).ns, μη σημαντική,*Σ<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,="" 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,="">

χρώση, επαλήθευσε ότι η απώλεια των κυττάρων THt αντανακλά τον κυτταρικό θάνατο αλλά όχι τη μείωση της έκφρασης TH και έδειξε ότι η θεραπεία με Ka αποκατέστησε τη μείωση στον αριθμό των θετικών νευρώνων Nissl στο SNpc των ποντικών που έλαβαν MPTP από 43,3 τοις εκατό σε 25,4 τοις εκατό ( Εικ. 2γ και δ). Επιπλέον, το Ka βελτίωσε σημαντικά την προκαλούμενη από MPTP μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης TH και DAT, όπως μετρήθηκε με στύπωμα Western (Εικ. 2e-g). Αυτά τα στοιχεία επιβεβαιώνουν τη νευροπροστατευτική επίδραση του Ka στο μοντέλο ποντικού PD.

Αποτέλεσμα 3. Το Ka μειώνει τη συσσώρευση κενοτοπίων LD και το οξειδωτικό στρες στο SNpc των ποντικών που έλαβαν MPTP/p

Όλο και περισσότερα στοιχεία έχουν δείξει τη συμμετοχή των LD σε NDDs [10], με συνέπεια, η προηγούμενη εργασία μας εντόπισε αυξημένα LDs στο SNpc ποντικών PD που προκαλούνται από MPTP [12]. Τα LD μπορούν εύκολα να αναγνωριστούν και να εμφανίσουν στρογγυλές, χαμηλής πυκνότητας δομές με ομοιογενή άμορφα περιεχόμενα [28]. Κανονικά, τα LDs μπορούν να αποικοδομηθούν μέσω αυτοφαγίας για να αποφευχθεί η συσσώρευση [29]. Για να διερευνηθεί εάν το Ka μπορούσε να ρυθμίσει τα LD σε PD, η συσσώρευση LDs αναλύθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (TEM) στο SNpc των ποντικών ελέγχου, MPTP/p και MPTP/p συν Ka. Όπως φαίνεται στην προηγούμενη εργασία μας [12], ο αριθμός και το μέγεθος των LD αυξήθηκαν σε ποντίκια MPTP/p σε σύγκριση με τους μάρτυρες που έλαβαν αγωγή με αλατούχο διάλυμα (Εικ. 3a και β) και μειώθηκαν σημαντικά σε ποντίκια που έλαβαν Ka (Εικ. 3c- μι). Επιπλέον, σε ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Ka, τα LDs παρατηρήθηκαν πιο συχνά κοντά, εγκλωβίστηκαν ή αποικοδομήθηκαν από αυτολυσοσώματα, τα οποία ορίστηκαν ως κόκκοι λιποφουσκίνης με πυκνότητα ηλεκτρονίων. Περαιτέρω ιστολογική χρώση των νευρώνων TH plus με BODIPY, μια χρωστική που επισημαίνει ειδικά ουδέτερα λιπίδια και χρησιμοποιείται συνήθως για την ανίχνευση LDs [30], έδειξε ότι τόσο ο αριθμός όσο και το μέγεθος των BODIPY συν LD στο SNpc ήταν υψηλότεροι σε ποντίκια PD από ό,τι στους μάρτυρες. και μειώθηκαν σημαντικά με την επεξεργασία Ka (Εικ. 3f-h).

Εάν τα LD δεν μπορούν να αποικοδομηθούν έγκαιρα, τα συσσωρευμένα LD μπορεί να υποστούν υπεροξείδωση και να συμβάλουν στο στρες που προκαλείται από το μιτοχονδριακό ROS [4], το οποίο ενισχύει τη νευροτοξικότητα και την εξέλιξη της νόσου. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε περαιτέρω τα προφίλ έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με την προστασία από την τοξικότητα της ελεύθερης FA (Gpx8), τα εξουδετερωτικά οξειδωτικά είδη, τις ρίζες υπεροξειδίου (Sod3) και το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Cat) και τον μεταβολισμό FA (Acsbg1 και Dbi) όπως αναφέρεται [31] , όλα αυτά μειώθηκαν εντυπωσιακά στο SNpc των ποντικών που έλαβαν MPTP σε σύγκριση με τους μάρτυρες, και αυτά τα αποτελέσματα βελτιώθηκαν σε ποντίκια PD που έλαβαν Ka (Εικ. 3i). Ομοίως, το MPTP/p αύξησε επίσης τα επίπεδα έκφρασης του mRNA

υπομονάδων οξειδάσης NADPH όπως Nox1, Nox2 και Nox4 στο SNpc ποντικών MPTP/p, οι οποίες αμβλύνθηκαν περαιτέρω με την επεξεργασία Ka (Εικ. 3j). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το Ka ανακουφίζει τη συσσώρευση LD που προκαλείται από MPTP/p, την υπεροξείδωση και το στρες που προκαλείται από το ROS.

Αυτό το άρθρο εξάγεται από τις λίστες περιεχομένων που είναι διαθέσιμες στην αρχική σελίδα του περιοδικού ScienceDirect Redox Biology: www.elsevier.com/locate/redox