Οι πολυσακχαρίτες τζιτζιφιού μετριάζουν την αναιμία σε αρουραίους με χρόνια νεφρική νόσο

Επικοινωνία: emily.li@wecistanche.com

Shiying Huang, et al

Αφηρημένη

Οι πολυσακχαρίτες Jujube (JP) είναι μία από τις ενεργές γλυκάνες που προέρχονται από τρόφιμα στο διαιτητικό φρούτο του Ziziphus jujuba, το οποίο έχει θεωρηθεί για τη θεραπεία της ανεπάρκειας αίματος. Σε αυτή τη μελέτη, αχρόνιοςνεφρόνόσοςΤο μοντέλο αρουραίου (CKD) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της επίδρασης της JP και του μηχανισμού της στην αναιμία που σχετίζεται με τη ΧΝΝ. Σε αρουραίους με ΧΝΝ, η θεραπεία με JP βελτιώθηκε σημαντικάνεφρόλειτουργία, νεφρόπαθολογικόςβλάβηκαι αιματολογικές παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένης της αύξησης του αριθμού των ερυθρών αιμοσφαιρίων, της αιμοσφαιρίνης, του αιματοκρίτη και του αριθμού των αιμοπεταλίων. Επιπλέον, τα στοχευμένα αποτελέσματα μεταβολομικής LC-MS/MS έδειξαν ότι η JP προήγαγε την απελευθέρωση λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας (SCFAs) σε επίμυες με ΧΝΝ. Επιπλέον, η JP εναλλάσσει το επίπεδο της ερυθροποιητίνης ορού (EPO), το mRNA EPO νεφρού καινεφρόΠρωτεΐνη EPO μέσω σηματοδότησης HIF. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν στοιχεία ότι η επίδραση της JP στην αναιμία που σχετίζεται με ΧΝΝ μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της απελευθέρωσης SCFAs και της παραγωγής ερυθροποιητίνης, υποστηρίζοντας την περαιτέρω ανάπτυξη της JP ως συμπληρώματα διατροφής στη θεραπεία της αναιμίας που σχετίζεται με τη ΧΝΝ.

Λέξεις κλειδιά: Πολυσακχαρίτες τζιτζιφιέςΧρόνιοςνεφρό νόσοςΑναιμία Ερυθροποιητίνη Παράγοντας που προκαλείται από υποξία- Λιπαρά οξέα βραχείας αλυσίδας

Κάντε κλικ εδώ για να λάβετε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το Cistanche

1. Εισαγωγή

Χρόνιοςνεφρό νόσος(ΧΝΝ) ορίζεται ως ένα κλινικό σύνδρομο νεφρικών δομικών ανωμαλιών ή λειτουργικών βλαβών και γίνεται όλο και πιο επιβάρυνση για τη δημόσια υγεία παγκοσμίως (Webster, Nagler, Morton, & Masson, 2017). Η νεφρική αναιμία είναι μια από τις πιο συχνές επιπλοκές της ΧΝΝ που συμβάλλουν στον αυξημένο κίνδυνο θανάτου (Locatelli et al., 2019). Η ανεπάρκεια παραγωγής ερυθροποιητίνης (ΕΡΟ) είναι ένας αναγνωρισμένος κύριος κινητήριος παράγοντας αναιμίας στη ΧΝΝ (Παππά, Ντουνούση, Ντούνη, & Κατωπόδης, 2015). Η ΕΡΟ παράγεται στο ήπαρ καινεφρό, το οποίο είναι απαραίτητο για την παραγωγή ερυθροκυττάρων (Lappin & Lee, 2019). Υπό συνθήκες υποξίας, ο επαγόμενος από την υποξία παράγοντας (HIF) μπορεί να ενεργοποιήσει την έκφραση της ΕΡΟ (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Επομένως, η στόχευση του HIF για την πρόκληση παραγωγής EPO έχει θεωρηθεί μια νέα θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία της αναιμίας που σχετίζεται με τη ΧΝΝ.

Η τζιτζιφιά είναι οι καρποί του Ziziphus jujuba Mill. (Rhamnaceae), γνωστή και ως κινέζικη ημερομηνία. Η τζιτζιφιά έχει μια μακρά παραδοσιακή χρήση που εκτείνεται εδώ και χιλιάδες χρόνια ως φαρμακευτικό βότανο και συμπλήρωμα διατροφής. Η τζιτζιφιά χρησιμοποιείται ως συμπλήρωμα υγείας για άτομα που έχουν αιματογόνο ή πάσχουν από χρόνιο υποσιτισμό. Οι πολυσακχαρίτες Jujube (JP), ένα υδατοδιαλυτό συστατικό που συντίθεται με διαφορετικές αναλογίες μονοσακχαρίτη και ουρονικού οξέος (Ji, Hou, Yan, Shi, & Liu, 2020), είναι ένα από τα ενεργά συστατικά της τζιτζιφιάς (Ji et al., 2017 ), το οποίο έχει γίνει καλά αποδεκτό ότι παρουσιάζει ηπατοπροστατευτική δράση και ανοσοτροποποιητική δραστηριότητα και ενισχύει τη λειτουργία του εντερικού φραγμού (Liu et al., 2015, Yue et al., 2015). Πράγματι, η JP θεωρείται επίσης ότι έχει πιθανές επιπτώσεις στην αναιμία. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός του JP στη θεραπεία της αναιμίας είναι ακόμα λιγότερο γνωστός.

Τα τελευταία χρόνια, η μεταβολομική έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την κατανόηση πιθανών παραγόντων που συμβάλλουν στην εξέλιξη της νόσου. Η στοχευμένη μεταβολομική έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τον εντοπισμό μοριακών δεικτών πολύπλοκων ανθρώπινων ασθενειών όπως η ΧΝΝ. Το θειικό ινδοξύλιο (IS) και το p-κρεσυλοθειικό (PCS) επαληθεύτηκαν ότι είναι ο βιοδείκτης της εξέλιξης της ΧΝΝ (Meijers & Evenepoel, 2011) και ο αυξημένος βαθμός τριμεθυλαμίνης-Ν-οξειδίου (TMAO) θα μπορούσε άμεσα να οδηγήσει σε νεφρική διάμεση ίνωση και δυσλειτουργία (Tang et al., 2015). Τα λιπαρά οξέα βραχείας αλυσίδας (SCFAs), οι μικροβιο-εξαρτώμενοι μεταβολίτες του εντέρου, είναι τα ενεργειακά υποστρώματα με την ικανότητα να επηρεάζουν διάφορες φυσιολογικές διεργασίες (LeBlanc et al., 2017) και η μείωση των SCFAs έχει αναφερθεί ότι συμβάλλει στην εξέλιξη της ΧΝΝ (Koh, De Vader, Kovatcheva-Datchary, & B¨ ackhed, 2016, Wang et al., 2019). Επιπλέον, τα SCFA ήταν σε θέση να προστατεύσουν τη δομή των νεφρών από βλάβες μέσω της αναστολής του οξειδωτικού στρες (Li, Ma, & Fu, 2017). Ταυτόχρονα, τα SCFAs έχουν βρεθεί ότι δείχνουν ευεργετική επίδραση στην απορρόφηση σιδήρου και ρυθμίζουν προς τα πάνω την έκφραση γονιδίου εμβρυϊκής/εμβρυϊκής σφαιρίνης, η οποία προκαλεί ερυθροποίηση και διορθώνει την αναιμία (Tako, Glahn, Knez, & Stangoulis, 2014). Ωστόσο, ο μηχανισμός των SCFAs στη νεφρική αναιμία χρειάζεται ακόμη να διευκρινιστεί.

Σε αυτή τη μελέτη, υποθέτουμε ότι το JP θα μπορούσε να ρυθμίσει την απελευθέρωση των SCFAs και να διεγείρει την παραγωγή EPO με τη μεσολάβηση HIF, το αποτέλεσμα της οποίας είναι η διόρθωση της νεφρικής αναιμίας. Εδώ, θα διερευνήσουμε την επίδραση του JP στη βελτίωση της νεφρικής αναιμίας σε αρουραίους με νεφρεκτομή 5/6 που προκαλείται από ΧΝΝ, συμπεριλαμβανομένων των νεφρικών λειτουργιών και των αιματολογικών παραμέτρων. Αναπτύχθηκε μια στοχευμένη μεταβολομική προσέγγιση χρησιμοποιώντας LC-MS/MS για τον προσδιορισμό οκτώ SCFAs συμπεριλαμβανομένων οξικού οξέος, προπανοϊκού οξέος, ισοβουτυρικού οξέος, βουτυρικού οξέος, 2-μεθυλβουτυρικού οξέος, ισοβαλερικού οξέος, βαλερικού οξέος και εξανοϊκού οξέος στα κόπρανα και Τα δείγματα νεφρών και τα επίπεδα των στοχευμένων SCFAs αξιολογούνται σε υγιείς και με ΧΝΝ αρουραίους. Επιπλέον, αποκαλύπτεται επίσης η συμμετοχή της σηματοδότησης HIF σε αρουραίους που έλαβαν JP.

Εικ. 1. Τυπική χρωματογραφία GC-MS του JP. (Α) Συντακτικοί τύποι μονοσακχαρίτη μετά από παραγωγοποίηση οξικού αλδονιτριλίου. (Β) Τα αντιπροσωπευτικά προφίλ χρωματογραφίας μικτών ιόντων GC–MS (MIC) του τυπικού μείγματος μονοσακχαριτών και των υδρολυμένων μονοσακχαριτών JP. Οι κορυφές στα προφίλ χρωματογραφίας αντιστοιχούσαν στον χημικό δείκτη που φαίνεται στο (Α): 1. ραμνόζη, 2. αραβινόζη, 3. φουκόζη, 4. ξυλόζη, 5. μαννόζη, 6. γλυκόζη, 7. γαλακτόζη, 8. ινοσιτόλη (ISTD ).

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Παρασκευή πολυσακχαρίτη τζιτζιφιάς

Οι καρποί του Z. jujuba αγοράστηκαν από την Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co., Ltd. Τα υλικά επικυρώθηκαν από τον Dr. Jianping Chen σύμφωνα με τη Φαρμακοποιία της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας Έκδοση 2015. Τα δείγματα κουπονιών φυλάσσονταν στο Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital με αριθμό 18100601.

Το ακατέργαστο JP εξήχθη από την τζιτζιφιά όπως περιγράφηκε προηγουμένως, με μικρές τροποποιήσεις (Ji et al., 2020). Εν συντομία, οι τζιτζιφιές επωάστηκαν με 10 vol νερού (ο/β) σε λουτρό νερού στους 80 ◦C για 3 ώρες και εκχυλίστηκαν 3 φορές. Μετά τη διήθηση, συνδυάστε τα διηθήματα και συμπυκνώστε αυτόν τον συνδυασμό σε περιστροφικό εξατμιστή υπό ελεγχόμενο κενό. Το συμπυκνωμένο διάλυμα καταβυθίστηκε περαιτέρω με προσθήκη τεσσάρων πτυχών αιθανόλης (ν/ν) στους 4°C για 12 ώρες. Το ίζημα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση και ξηράνθηκε υπό ελαττωμένη πίεση έως ξηρού για να ληφθεί το ακατέργαστο JP. Η καθαρότητα του JP προσδιορίστηκε ότι είναι 80 τοις εκατό χρησιμοποιώντας θερμιδομετρία.

2.2. Χαρακτηρισμός της μονοσακχαριτικής σύνθεσης του πολυσακχαρίτη τζιτζιφιάς

Ένα σύστημα Shimadzu GC–MS (Shimadzu GC–MS TQ8040 σε διασύνδεση με Shimadzu GC 2010 plus) εξοπλισμένο με πηγή EI, τριχοειδή στήλη SH-Rxi-5Sil MS (30 m Χ 0,25 mm ID, 0,25 μm πάχος φιλμ, Shimadzu) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των υδρολυμένων μονοσακχαριτών παραγωγοποίησης με αναλογία διαχωρισμού 10:1. Η θερμοκρασία έγχυσης, η πηγή ιόντων και η διεπαφή ήταν 250 ◦C, 200 ◦C και 250 ◦C. Η αρχική θερμοκρασία της στήλης διατηρήθηκε στους 120 ◦C για 1 λεπτό, στη συνέχεια αυξήθηκε στους 15 ◦C/min στους 160 ◦C και διατηρήθηκε για 4 λεπτά, 2 ◦C/min στους 165 ◦C και διατηρήθηκε για 2 λεπτά, 20 ◦C /

min στους 195 ◦C, 5 ◦C/min στους 250 ◦C και διατηρήθηκε για 3 λεπτά. Ο ρυθμός ροής αερίου φορέα ηλίου διατηρήθηκε στα 46 cm/s και 2 μL από κάθε δείγμα εγχύθηκαν στο όργανο. Οι αναλυόμενες ουσίες ποσοτικοποιήθηκαν στον επιλεγμένο τρόπο παρακολούθησης ιόντων (SIM), το ιόν στόχο: ραμνόζη (m/z 129.00), αραβινόζη (m/z 115.00), φουκόζη (m/ z 103.00), ξυλόζη (m/z 115.00), μαννόζη (m/z 115.00), γλυκόζη (m/z 115.00 ), γαλακτόζη (m/z 115.00), ινοσιτόλη (m/z 126.00). Τα πρότυπα μονοσακχαριτών καταγράφηκαν ως εξής: L (συν)-αραβινόζη (1506-200202), φουκόζη (112014-201902), D-ξυλόζη (111508-201605), D-γλυκόζη (110833-201908-201-201), r ), γαλακτόζη (100226–201807), D-μαννόζη (140651–201805) αγοράστηκαν από Εθνικά Ινστιτούτα Ελέγχου Τροφίμων και Φαρμάκων. Η ινοσιτόλη ελήφθη από τη Sigma (Ι7508-50 g).

Το εκχυλισμένο JP (10 mg) υδρολύθηκε σε μονοσακχαρίτες με 10 mL 2 mol/L τριφθοροξικού οξέος (TFA) στους 105 ◦C για 3 ώρες και οι υδρολυμένοι μονοσακχαρίτες από JP συμπυκνώθηκαν και πλύθηκαν υπό μειωμένη πίεση στους 60 ◦C έως αφαιρέστε το TFA και τα υπολείμματα ανασυστάθηκαν με 2 mL νερού. Προστέθηκαν 250 µL διαλύματος υδροχλωρικής υδροξυλαμίνης/πυριδίνης 20 mg/mL σε διάλυμα υδρολυμένων μονοσακχαριτών 100 μL και διατηρήθηκαν σε υδατόλουτρο 90 ◦C για 45 λεπτά. Στη συνέχεια προστέθηκαν 250 µL οξικού ανυδρίτη και διατηρήθηκαν σε υδατόλουτρο 90 ◦C για άλλα 45 λεπτά. Στο τέλος της αντίδρασης, το μίγμα εκχυλίστηκε με 1 mL κυκλοεξανίου 5 φορές, και η στιβάδα κυκλοεξανίου συμπυκνώθηκε σε 1 mL. Έγινε ένεση 1 μL υπερκειμένου σε GC-MS για ανάλυση (Li & Shi, 2013).

2.3. Των ζώων

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Επιτροπή Χρήσης Ιδρυματικής Φροντίδας Ζώων του Πανεπιστημίου Κινέζικης Ιατρικής Guangzhou. Οι αρουραίοι Sprague–Dawley, αρσενικοί και θηλυκοί, βάρους 180–220 g, ελήφθησαν από το Ιατρικό Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων του Γκουανγκντόνγκ (Foshan, China, Permission No. SCXK (Yue) 2008–0002) και διατηρήθηκαν σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο (SPF) ) εγκατάσταση ζώων σε κύκλο φωτός-σκότους 12 ωρών, με ελεύθερη τροφή και νερό.

Για την επαγόμενη νεφρική ανεπάρκεια, πραγματοποιήθηκε νεφρεκτομή 5/6 σύμφωνα με την προηγούμενη περιγραφή (Chen et al., 2019). Όλη η χειρουργική επέμβαση έγινε υπό αναισθησία με 10 τοις εκατό ένυδρη χλωράλη. Η ομάδα εικονικής επέμβασης (n=6) έκανε τα ίδια βήματα για να ανοίξει την κοιλιακή κοιλότητα και εξέθεσε το νεφρό. Οι αρουραίοι νεφρεκτομής 5/6 χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες. Αρουραίοι χωρίς θεραπεία (ομάδα ΧΝΝ, n=6) και αρουραίοι που έλαβαν JP (CKD συν ομάδα JP, n=6) ​​από το στόμα με καθετηριασμό σε δόση 1,2 g/kg/ημέρα. Μετά από 90 ημέρες λειτουργίας, άρχισαν 90 ημέρες χορήγησης. Η 90ή ημέρα ήταν ο τελικός χρόνος χορήγησης του JP σε αρουραίους, και μετά από 24 ώρες τα ζώα θυσιάστηκαν με λήψη αίματος από την κοιλιακή αορτή και συλλέχθηκαν δείγματα ούρων, κοπράνων, ορού και νεφρών από κάθε αρουραίο. Όλα τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -80 ◦C πριν από περαιτέρω ανάλυση.

2.4. Βιοχημική ανάλυση

Ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, το άζωτο ουρίας αίματος (BUN) και η κρεατινίνη ορού (Scr) μετρήθηκαν με κιτ ανίχνευσης ορού κρεατινίνης και κιτ ανίχνευσης BUN (WAKO, Ginza, Ιαπωνία) και η πρωτεΐνη ούρων μετρήθηκε με κιτ Elisa (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institution, Nanjing, Κίνα). Τα ερυθρά αιμοσφαίρια (RBC), η αιμοσφαιρίνη (Hb), ο αιματοκρίτης (HCT) και ο αριθμός των αιμοπεταλίων (PLT) αναλύθηκαν από την Hematology Systems (Siemens 2021i, Erlangen, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

2.5. Ιστολογική εξέταση

Η χρώση Periodic acid-Schiff (PAS) και Masson χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της νεφρικής παθολογικής βλάβης, μεταξύ των οποίων χρησιμοποιήθηκε χρώση PAS για την αποκάλυψη της ατροφίας των νεφρικών σωληναριακών και της σπειραματικής περιοχής και η χρώση Masson για τη νεφρική διάμεση ίνωση (Xie et al. , 2020). Η μέθοδος ποσοτικής ανάλυσης διεξήχθη σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες (Chen et al., 2019). Εν συντομία, η βαθμολογία σωληνοειδούς ατροφίας στη χρώση PAS ορίστηκε ως εξής: 1. σπάνιο μονό ατροφικό σωληνάριο. 2. αρκετές συστάδες ατροφικών σωληναρίων. 3. μαζική ατροφία. Η σπειραματική περιοχή μετρήθηκε με λογισμικό ZEN 3.1 (Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Γερμανία). Η ινωτική περιοχή στη χρώση Masson μετρήθηκε με χρήση λογισμικού Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). Τουλάχιστον δέκα μικροσκοπικά πεδία (200×) 6 αρουραίων ανά ομάδα καταγράφηκαν τυχαία για τη μέτρηση του βαθμού ατροφίας, της σπειραματικής περιοχής και της ινωτικής περιοχής, με τουλάχιστον ένα σπείραμα σε κάθε μικροσκοπικό πεδίο.

2.6. Ανοσοϊστοχημεία ανάλυση

Το τμήμα νεφρικής παραφίνης (4 μm) από κάθε δείγμα ήταν σταδιακή αφυδάτωση με ξυλόλιο δύο φορές και η αιθανόλη βαθμίδωσης (100–95–90–80–70 τοις εκατό), το αντιγόνο ανακτήθηκε με ρυθμιστικό κιτρικού οξέος (pH 6,0 ) για 30 λεπτά, μπλοκαρίστηκε με 3 τοις εκατό υπεροξείδιο του υδρογόνου για 10 λεπτά και ορό κατσίκας για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές ιστού επωάστηκαν ξεχωριστά από πρωτογενές αντίσωμα HIF-1 (Bioss, bs-0737R, 1: 500, Lot: BA01279129), HIF-2 (Bioss, bs-1447 R, 1: 500, Παρτίδα: BJ2044786) στους 4 ◦C για 10 ώρες και συζευγμένο με HRP δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας κατά κουνελιού (Abcam, ab6712, 1:1000) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, χρησιμοποιήθηκε DAB (in diaminobezid) για ανίχνευση της δραστηριότητας HRP, ο πυρήνας αντιχρωματίστηκε με αιματοξυλίνη. ο. Η ανοσοϊστοχημεία αναλύθηκε κάτω από μικροσκοπικά πεδία 400× από κάθε ομάδα και καθορίστηκε η γραμμή κλίμακας=20 μm από το Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Γερμανία. Ο πυρήνας ήταν μπλε χρώση από αιματοξυλίνη και η ανοσοθετικότητα του DAB ήταν καφέ, η βαθύτερη χρώση DAB σημαίνει ισχυρότερη θετική ανοσοϊστοχημεία.

2.7. Ανίχνευση EPO

Το περιεχόμενο EPO ορού ανιχνεύτηκε από το κιτ ELISA (Abcam, ab274398) και το πείραμα αναφερόταν στο πρωτόκολλο του κιτ ELISA. Όπως συνοψίζεται, προστέθηκε κοκτέιλ αντισώματος ΕΡΟ στο δείγμα και επωάστηκε για 1 ώρα. μετά την επώαση, πλύθηκε κάθε φρεάτιο με ρυθμιστικό πλύσης 3 φορές, προστέθηκε ΤΜΒ στο δεύτερο που επωάστηκε για 15 λεπτά και σταμάτησε την αντίδραση.

Το συνολικό mRNA του νεφρού εκχυλίστηκε από κατεψυγμένο νεφρικό ιστό χρησιμοποιώντας Trizol και μεταφράστηκε το mRNA σε cDNA. Η PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA, K0223) σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών. Το πράσινο σήμα SYBR αποκτήθηκε και μετρήθηκε με σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Οι εκκινητές ήταν: 5'-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC-3' και 5'-ACC CGA AGC AGT GAA GTG-3' για αρουραίους EPO (214 bps, NM_017001). 2); 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G-3′ και 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C- 3′ για GAPDH (181 bps, NM_017008.3), το νοικοκυριό ως εσωτερικό έλεγχο σε όλες τις περιπτώσεις. Και η σχετική ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκε με την κανονικοποιημένη μέθοδο γονιδιακής έκφρασης (2− ΔΔCT).

Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης προϊόντων λύσης νεφρικού φλοιού φορτώθηκαν και διαχωρίστηκαν με 10 τοις εκατό SDS γέλη και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Αφού δεσμεύτηκαν σε μη λιπαρό γάλα 5 τοις εκατό για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ◦C όλη τη νύχτα. Στη συνέχεια οι μεμβράνες επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP (υπεροξειδάση χρένου) αντι-ποντικού IgG (Life Technologies) σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά. Η δραστηριότητα HRP οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα Clarity Western ECL και αναλύθηκε με το σύστημα απεικόνισης Tanon. Το ακόλουθο πρωτογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη: μονοκλωνική EPO (B- 4) από ποντίκια (Santa Cruz Biotechnology, sc-5290, αραίωση 1/500), μονοκλωνική ακτίνη από ποντίκια (Τεχνολογία κυτταρικής σηματοδότησης, 8H10D10, αραίωση 1/1000).

2.8. Ανάλυση λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας

Ένα σύστημα Shimadzu UHPLC-LCMS/MS (Shimadzu LC-MS 8045 σε διασύνδεση με Shimadzu LC-20AD) εξοπλισμένο με πηγή ESI.

Οι χρωματογραφικοί διαχωρισμοί πραγματοποιήθηκαν σε στήλη Shim-pack GIST C18 (2,1 × 1{00 mm, 2 μm), χρησιμοποιώντας {{10}}.1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ σε νερό ( διαλύτης Α) και ακετονιτρίλιο (διαλύτης Β) με ρυθμό ροής 0,3 mL/min με βαθμιδωτή έκλουση: 0–9 λεπτά, 25–30 τοις εκατό Β. 9–11 λεπτά, 30–40 τοις εκατό Β; 11–20 λεπτά, 40–50 τοις εκατό Β; 20–20,1 λεπτά, 50–100 τοις εκατό Β; 20,1–23 λεπτά, 100 τοις εκατό Β; 23,1 λεπτά–25 τοις εκατό Β για επαναισορρόπηση. Η θερμοκρασία της στήλης ήταν 35 ◦C και ο αυτόματος δειγματολήπτης διατηρήθηκε στους 4 ◦C κατά την ανάλυση, 1 μL από κάθε δείγμα εγχύθηκε στο όργανο. Η ανίχνευση της αναλυόμενης ουσίας πραγματοποιήθηκε σε λειτουργία παρακολούθησης πολλαπλών αντιδράσεων (MRM), που λειτουργούσε σε λειτουργία θετικού ιόντος. Οι παράμετροι MS: Ροή αερίου νεφελοποίησης: 3,0 L/min. Ξήρανση Ροή αερίου: 10 L/min; Θέρμανση Ροή αερίου: 10 L/min; Θερμοκρασία DL: 250 ◦C; θερμοκρασία διεπαφής: 300 ◦C; Θέρμανση: 400 ◦C. Οι μεταβάσεις MRM και η ενέργεια σύγκρουσης (CE) επιλέχθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν με άμεση έγχυση κάθε τυπικού παραγώγου. Οι ποσότητες αναλυτών μεταπτώσεις MRM συνοψίστηκαν στον Πίνακα S1.

SCFA κοπράνων: Προστέθηκαν 100 μL ακετονιτριλίου 50 τοις εκατό σε 3 mg των λυοφιλοποιημένων κοπράνων και στροβιλίστηκαν για 2 λεπτά. Στη συνέχεια το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις 12000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ◦C και μεταφέρετε με σιφώνιο το υπερκείμενο υγρό.

Νεφρικά SCFAs: Ζυγίστηκαν 100 mg νεφρικού ιστού και στροβιλίστηκαν σε πάγο με 4 φορές το φυσιολογικό ορό (100 mg/400 μL) για την παρασκευή ομογενοποίησης ιστού. Προστέθηκε 3 φορές ψυχρή μεθανόλη σε 300 μL ομογενοποιημένου ιστού και στροβιλίστηκε για 2 λεπτά, στη συνέχεια το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις 12000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ◦C και μεταφέρετε με σιφώνιο το υπερκείμενο υγρό. Το υπερκείμενο ξηράνθηκε με Ν2 και ανασυστάθηκε με 100 μL ακετονιτριλίου 50 τοις εκατό.

Προστέθηκε 500 mmol/L υδροχλωρικό N-(3-διμεθυλ αμινοπροπυλ)-Ń-αιθυλοκαρβοδιιμίδιο (EDC, Aladdin, Shanghai, Κίνα), 50 mmol/L 3H-[1,2,3]-Triazolo[4, 5-b] πυριδίνη-3-όλη (HOAT, Aladdin, Shanghai, China) και 50 mg/mL 12C-Dansylhydrazine (12C-DnsHz, J&K, Beijing, China) σε 20 μL της εκχύλισης του δείγματος σε ακολουθία με τον ίδιο όγκο. Το EDC και το HOAT παρασκευάστηκαν με φρέσκο ​​500 mmol/L 2-(Ν-Μορφολινο) αιθανοσουλφονικό οξύ (MES, Macklin, Σαγκάη, Κίνα). Μετά από επώαση στους 20 ◦C για 90 λεπτά, προστέθηκαν στο μίγμα 20 μL 50 mmol/L CuCl2 (Macklin, Shanghai, Κίνα) για να σβήσει η αντίδραση παραγωγοποίησης στους 40 ◦C για 30 λεπτά (Zhao & Li, 2018). Στο τέλος της παραγωγοποίησης, το μίγμα αραιώθηκε 10 φορές με 25 τοις εκατό ακετονιτρίλιο. Πριν από την ανάλυση, 100 μL υπερκειμένου αναμίχθηκαν με διάλυμα εσωτερικού προτύπου 100 μL. Η ετικέτα 13C-DnsHz χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικά πρότυπα (ISTD1-8) σύμφωνα με την ίδια αντίδραση παραγωγοποίησης. Το πρότυπο SCFAs: οξικό οξύ (AA, A116173), προπανοϊκό οξύ (PA, P110446), ισοβουτυρικό οξύ (IBA, I103524), βουτυρικό οξύ (BA, B110438), 2-μεθυλβουτυρικό οξύ (2- ΒΑ, Μ107377), ισοβαλερικό οξύ (IVA, 1108280), βαλερικό οξύ (VA, V108271), εξανοϊκό οξύ (ΗΑ, Η103632) παρέχονται από την Aladdin (Σαγκάη, Κίνα).

2.9. Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα κάθε ομάδας εκφράστηκαν ως μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ των ομάδων πραγματοποιήθηκε με μονόδρομη ANOVA και post hoc ανάλυση με τη δοκιμή Student-Newman-Keuls (SNK) ή τη δοκιμή Dunnett's T3. Η τιμή του P < 0.05="" θεωρήθηκε="" στατιστικά="" σημαντική.="" όλα="" τα="" δεδομένα="" πραγματοποιήθηκαν="" χρησιμοποιώντας="" στατιστικό="" λογισμικό="" spss="" (έκδοση="" 22.0,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

3. Αποτελέσματα

3.1. Το JP βελτίωσε τη νεφρική λειτουργία των αρουραίων με ΧΝΝ

Ο μονοσακχαρίτης του JP χαρακτηρίστηκε πριν από τη θεραπεία σε ζώα. Το JP που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη αποτελούνταν από επτά μονοσακχαρίτες, δηλαδή ραμνόζη (1,62 τοις εκατό), αραβινόζη (15,79 τοις εκατό), φουκόζη (0,21 τοις εκατό), ξυλόζη (4,56 τοις εκατό), μαννόζη (3. 00 τοις εκατό), γλυκόζη (73,44 τοις εκατό) και γαλακτόζη (4,99 τοις εκατό) (Εικ. 1). Η μέθοδος ανάλυσής μας επικυρώθηκε με γραμμικότητα, ακρίβεια, επαναληψιμότητα, σταθερότητα και ανάκτηση (Πίνακες S2–S3). Οι αναλυόμενες ουσίες επιβεβαιώθηκαν ότι είναι σταθερές σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες. Η απόδοση του JP θα πρέπει να είναι υψηλότερη από 8,63 τοις εκατό και η καθαρότητα δεν πρέπει να είναι μικρότερη από 77,16 τοις εκατό. Η προαναφερθείσα χημική ανάλυση του JP χρησίμευσε ως προσέγγιση ποιοτικού ελέγχου για να εξασφαλιστεί η αναπαραγωγιμότητα των παρακάτω μελετών σε ζώα.

Το Scr, το BUN και η πρωτεΐνη των ούρων ήταν πιο αντιπροσωπευτικά των νεφρικών λειτουργιών. Τα επίπεδα Scr, BUN και πρωτεΐνης στα ούρα σε αρουραίους με ΧΝΝ ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά της ψευδούς ομάδας (P < {{0}}.01).="" μετά="" από="" 90="" ημέρες="" θεραπείας="" με="" jp,="" τα="" επίπεδα="" scr,="" bun="" και="" πρωτεΐνης="" ούρων="" μειώθηκαν="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" χνν="" (p=""><0,01) (εικ.="">

3.2. Η JP βελτίωσε τη νεφρική παθολογική βλάβη σε επίμυες με ΧΝΝ

Το βάρος ολόκληρου του δεξιού νεφρού για την εικονική ομάδα και του υπολειπόμενου δεξιού νεφρού για ΧΝΝ και ΧΝΝ συν JP ομάδα χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση της μορφολογίας του νεφρού κατά βάρος νεφρού (KW) και βάρος νεφρού/σωματικό βάρος (KW/BW). Στο τέλος των πειραμάτων, τα KW και KW/BW της ομάδας ΧΝΝ αυξήθηκαν σε σύγκριση με την εικονική ομάδα (όλα P < {{0}}.05).="" στο="" μοντέλο="" χνν="" που="" προκαλείται="" από="" νεφρεκτομή="" 5/6,="" η="" μείωση="" της="" δραστηριότητας="" της="" νεφρικής="" πρωτεϊνάσης="" προκάλεσε="" αντισταθμιστική="" νεφρική="" ανάπτυξη,="" εταιρείες="" με="" νεφρική="" υπερτροφία="" (morton="" &="" griffiths,="" 1985)="" και="" επιβεβαίωσαν="" αυτή="" τη="" δήλωση.="" μετά="" τη="" θεραπεία="" με="" jp,="" το="" kw="" μειώθηκε="" σημαντικά="" (p="">< 0.05)="" και="" έκλεισε="" σε="" μια="" εικονική="" ομάδα="" (p="" ˃="" 0,05).="" ενώ="" το="" kw/bw="" ήταν="" ελαφρώς="" μειωμένο="" (p="" ˃="" 0,05).="" (εικ.="">

Εικ. 2. Η JP προστάτευσε τη νεφρική λειτουργία σε αρουραίους με ΧΝΝ. Το επίπεδο Scr (A), BUN (B) και πρωτεΐνης ούρων (C) σε διαφορετική ομάδα. (Δ) βάρος νεφρού, (Ε) KW/BW. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SD, n=6 ανά ομάδα (**P < 0.01="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" εικονική="" ομάδα·="" #p="">< 0.05="" ,="" ##p="">< 0,01="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="">

Στην ομάδα ΧΝΝ, η νεφρική σωληναριακή ατροφία παρουσίασε μαζική ατροφία σε σύγκριση με την εικονική ομάδα (P < {{0}}.01),="" και="" η="" περιοχή="" του="" σπειράματος="" και="" η="" νεφρική="" διάμεση="" ίνωση="" ήταν="" σχεδόν="" δύο="" φορές="" περισσότερες="" από="" αυτή="" της="" εικονικής="" ομάδας="" στην="" ποσοτική="" ανάλυση="" (p="">< 0.01).="" μετά="" τη="" θεραπεία="" με="" jp,="" η="" βαθμολογία="" της="" σωληναριακής="" ατροφίας="" μειώθηκε="" σχεδόν="" δύο="" φορές="" (p=""><0,01), η="" περιοχή="" του="" σπειράματος="" σχεδόν="" ανακτήθηκε="" σε="" μια="" ψευδή="" ομάδα="" (p=""><0,01) και="" η="" νεφρική="" διάμεση="" ίνωση="" μειώθηκε="" κατά="" ένα="" τρίτο="" (p=""><0,01) καθώς="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" χνν="" (εικ.="">

Εικ. 3. Η JP προστάτευσε τη δομή των νεφρών σε αρουραίους με ΧΝΝ. (Α) Χρώση PAS. (Β) Χρώση Masson. (Γ) Βαθμολογία σωληναριακής ατροφίας. (Δ) Σπειραματική περιοχή (Ε) Ινωτική περιοχή. Όλες οι εικόνες παρουσιάζονται με την ίδια μεγέθυνση, 200×, γραμμή κλίμακας=100 μm. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσοι όροι ± SD, n=6 ανά ομάδα (**P < 0.01="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ψευδή="" ομάδα,="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01 σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" χνν="">

3.3. Η JP τροποποίησε τις αιματολογικές παραμέτρους σε αρουραίους ΧΝΝ

Για τις αιματολογικές παραμέτρους βιοχημική ανάλυση, μετρήθηκαν RBC, Hb, HCT και PLT. Σε επίμυες με ΧΝΝ, το επίπεδο των RBC μειώθηκε από 9.06 σε 7,20 × 1012 /L, Hb από 15,28 σε 13,22 g/dL, HCT από 47,1 σε 40,4 τοις εκατό και αυξήθηκε η PLT από 1012 έως 1526 × 109 /L σε σύγκριση με μια εικονική ομάδα (P < 0,01),="" η="" οποία="" έδειξε="" ότι="" τα="" σημεία="" αναιμίας="" παρατηρήθηκαν="" σε="" επίμυες="" χνν.="" τα="" μειωμένα="" επίπεδα="" rbc,="" hb,="" hct="" και="" plt="" σε="" αρουραίους="" χνν="" που="" έλαβαν="" jps="" αποκαταστάθηκαν="" (ρ="">< 0,01)="" (εικ.="">

Εικ. 4. Η JP αποκατέστησε τις αιματολογικές παραμέτρους σε αρουραίους ΧΝΝ. Το επίπεδο των PLT (A), RBC (B), Hb (C), HCT (D). Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SD, n=6 ανά ομάδα (**P < 0.01="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" εικονική="" ομάδα·="" #p="">< 0.05="" ,="" ##p="">< 0,01="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="">

3.4. Η JP διέγειρε την έκφραση ΕΡΟ

Σε σύγκριση με την εικονική ομάδα, το επίπεδο EPO στον ορό και η ποσότητα mRNA EPO νεφρού μειώθηκαν σημαντικά σε επίμυες με CKD-αναιμία (P < 0.01).="" η="" ανάλυση="" western="" blotting="" αποκάλυψε="" ότι="" το="" επίπεδο="" πρωτεΐνης="" ερο="" παρουσίασε="" ελαφρά="" μείωση="" στην="" ομάδα="" χνν="" χωρίς="" σημαντική="" διαφορά.="" μετά="" τη="" θεραπεία="" με="" jp,="" το="" επίπεδο="" epo="" στον="" ορό,="" το="" mrna="" epo="" νεφρού="" και="" η="" πρωτεΐνη="" αναβαθμίστηκαν="" σημαντικά="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="" χνν="" (p="">< 0,01="" ή="" p=""><0,05) (εικ.="">

Στον φλοιό των νεφρών, ο HIF-1 παρήχθη κυρίως από επιθηλιακά κύτταρα των νεφρικών σωληναριών, ο HIF-2 εκφράστηκε κυρίως σε ενδοθηλιακά κύτταρα και νεφρικούς διάμεσους ινοβλάστες (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Η ανάλυση ανοσοϊστοχημικής χημείας έδειξε ότι, όπως και για το HIF-1, στους αρουραίους με ΧΝΝ, τα σωληνάρια ήταν πιο δυνατά χρωματισμένα από την εικονική ομάδα. Μετά τη θεραπεία με JP, το νεφρικό σωληνάριο είχε ισχυρότερη και μεγαλύτερη χρώση περιοχής σε σύγκριση με την ομάδα ΧΝΝ όπως φαίνεται στο κόκκινο βέλος στην Εικ. 5Ε. HIF-2 έδειξε σχετικά ασθενή ανοσοϊστοχημεία θετική στο νεφρικό διάμεσο στην ομάδα Sham. Στην ομάδα ΧΝΝ, το HIF-2 έδειξε ανοσοϊστοχημεία θετικό. Μετά τη θεραπεία με JP, το HIF-2 έδειξε ισχυρότερη ανοσοϊστοχημεία σε σύγκριση με την ομάδα CKD (Εικ. 5F).

Εικ. 5. Το JP διέγειρε την έκφραση ΕΡΟ. (Α) Περιεκτικότητα σε ορό EPO. (ΣΙ)ΝεφρόΕΡΟ σχετικό mRNA. Το GAPDH θεωρήθηκε ως γονίδιο οικιακής φροντίδας. (Γ) Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες western blot της έκφρασης πρωτεΐνης ΕΡΟ. (Δ) Πυκνομετρική ανάλυση ΕΡΟ. (Ε) Ανοσοϊστοχημεία HIF{{0}} . (ΣΤ) Ανοσοϊστοχημεία του HIF- 2 κανονικοποιημένη σε -ακτίνη. Οι εικόνες ανοσοϊστοχημείας παρουσιάζονται με την ίδια μεγέθυνση, 400×, γραμμή κλίμακας=20 μm. Ο πυρήνας ήταν μπλε χρώση από αιματοξυλίνη και η ανοσοθετικότητα του DAB ήταν καφέ, η βαθύτερη χρώση DAB σημαίνει ισχυρότερη θετική ανοσοϊστοχημεία. Το κόκκινο βέλος δείχνει θετική ανοσοϊστοχημεία. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SD, n=6 ανά ομάδα (*P <0,05 σε="" σύγκριση="" με="" την="" ψευδή="" ομάδα,="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01 σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="">

3.5. Η JP προκάλεσε την απελευθέρωση SCFA

Αναπτύχθηκε μια στοχευμένη μεταβολομική προσέγγιση που βασίζεται σε LC-MS για να ποσοτικοποιήσει την απελευθέρωση οκτώ SCFAs σε δείγματα κοπράνων. Η καθιερωμένη μέθοδος επικυρώθηκε αξιολογώντας τη γραμμικότητα, την ευαισθησία, την ακρίβεια, το φαινόμενο της μήτρας, την ακρίβεια και τη σταθερότητα. Δείγματα ποιοτικού ελέγχου χαμηλής, μέσης και υψηλής συγκέντρωσης (LQC, QMC, HQC) για επικύρωση ευαισθησίας, ακρίβειας, ακρίβειας και σταθερότητας, επιλέχθηκαν σύμφωνα με τα χαμηλότερα, μεσαία και υψηλότερα σημεία συγκέντρωσης της τυπικής καμπύλης μήτρας και τα αποτελέσματα φαίνονται στους Πίνακες S4–S6. Οι αναλυόμενες ουσίες επιβεβαιώθηκαν ότι είναι σταθερές στους 4 ◦C για 48 ώρες. Το χρωματογράφημα LC-MS/MS των SCFAs παρουσιάστηκε στο Σχ. 6.

Εικ. 6. Χρωματογραφία UHPLC-MS/MS των SCFAs. (Α) Η άνω ήταν η χημική εξίσωση παραγωγοποίησης SCFAs. Ο κάτω ήταν ο δομικός τύπος SCFAs μετά την παραγωγοποίηση της δανσυλυδραζίνης. (Β) Το χρωματογράφημα UHPLC/MRM-MS των προτύπων μίγματος και του δείγματος κοπράνων, οι χρωματογραφικές κορυφές στο (Β) ανταποκρίθηκαν στον χημικό δείκτη που φαίνεται στο (Α):1. 12C-οξικό οξύ; 2. 13C-οξικό οξύ (ISTD1); 3. 12C-προπανοϊκό οξύ; 4. 13C-προπανοϊκό οξύ (ISTD2); 5. 12C-ισο βουτυρικό οξύ. 6. 12C-βουτυρικό οξύ; 7. 13C-ισοβουτυρικό οξύ (ISTD3); 8. 13C-βουτυρικό οξύ (ISTD4); 9. 12C-2-μεθυλβουτυρικό οξύ. 10. 12C-ισοβαλερικό οξύ; 11. 12C βαλερικό οξύ; 12. 13C-2-μεθυλβουτυρικό οξύ (ISTD5); 13. 13C-ισοβαλερικό οξύ (ISTD6); 14. 13C-βαλερικό οξύ (ISTD7); 15. 12C-εξανοϊκό οξύ; 16. 13C-εξανοϊκό οξύ (ISTD8).

Όσον αφορά το δείγμα κοπράνων, στην ομάδα ΧΝΝ, τα επίπεδα AA και PA μειώθηκαν σημαντικά σχεδόν 4 φορές και 5 φορές σε σύγκριση με μια εικονική ομάδα (P < 0.01).="" ενώ="" μετά="" τη="" θεραπεία="" με="" jp,="" οι="" ποσότητες="" aa="" και="" pa="" αποκαταστάθηκαν="" στα="" 4/5="" της="" ψευδούς="" ομάδας="" (p="">< {{0}}.01).="" ομοίως,="" τα="" επίπεδα="" ba="" και="" va="" μειώθηκαν="" σημαντικά="" σχεδόν="" 30="" φορές="" και="" 4="" φορές="" στην="" ομάδα="" χνν="" σε="" σύγκριση="" με="" μια="" εικονική="" ομάδα="" (p="">< 0.01).="" η="" θεραπεία="" με="" jp="" έδειξε="" αυξητική="" τάση="" αλλά="" όχι="" σημαντική="" βελτίωση.="" το="" περιεχόμενο="" των="" iba,="" iva="" και="" 2-ba="" δεν="" παρουσίασε="" αξιοσημείωτη="" αλλαγή="" μεταξύ="" ckd="" και="" εικονικής="" ομάδας.="" μετά="" τη="" θεραπεία="" με="" jp,="" τα="" επίπεδα="" iba,="" iva="" και="" 2-ba="" αυξήθηκαν="" (p=""><0,01). ωστόσο,="" η="" ηα="" δεν="" έδειξε="" εμφανή="" αλλαγή="" μεταξύ="" των="" τριών="" ομάδων="" (εικ.="" 7α).="" επιπλέον,="" όσον="" αφορά="" τον="" νεφρικό="" ιστό,="" στην="" ομάδα="" χνν,="" οι="" ποσότητες="" των="" οκτώ="" scfa="" ήταν="" όλες="" σημαντικά="" μειωμένες="" (p="">< 0,01),="" ενώ="" μετά="" τη="" θεραπεία="" με="" jp,="" τα="" επίπεδα="" των="" scfas="" αυξήθηκαν="" εκτός="" από="" τα="" ba="" και="" ha="" (p="">< 0,01="" ή="" p="">< 0,5).="" η="" βα="" αυξήθηκε="" ελαφρά="" χωρίς="" σημαντικά="" και="" η="" ηα="" δεν="" παρουσίασε="" αλλαγή="" μετά="" τη="" θεραπεία="" με="" jp="" (εικ.="">

Εικ. 7. Περιεκτικότητα σε SCFAs σε διαφορετική ομάδα. (Α) SCFA κοπράνων. (Β) νεφρικά SCFAs. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσος όρος ± SD, n=6 ανά ομάδα (**P < 0.01="" σε="" σύγκριση="" με="" την="" εικονική="" ομάδα·="" ##p="">< 0.="" 01,="" #p=""><0,05 σε="" σύγκριση="" με="" την="" ομάδα="">

4. Συζήτηση

Στο παρόν μοντέλο νεφρεκτομής 5/6 ΧΝΝ αρουραίου, τονεφρόλειτουργίαΟι δείκτες (Scr, BUN και πρωτεΐνη ούρων) αυξήθηκαν σημαντικά, εμφανίστηκε η υπολειπόμενη νεφρική υπερτροφία και η νεφρική παθολογική βλάβη, συνοδευόμενη από αλλαγή των αιματολογικών παραμέτρων. Αυτά τα δεδομένα ήταν σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες (Garrido et al., 2015, Morton & Griffiths, 1985). Οι παραπάνω δείκτες έδειξαν ότι οι αρουραίοι με ΧΝΝ-αναιμία που προκλήθηκαν από τη νεφρεκτομή 5/6 εγκαταστάθηκαν επιτυχώς και μπορούσαν να επαληθευτούν για την ευεργετική επίδραση του JP στη θεραπεία αρουραίων με ΧΝΝ-αναιμία. Με τονεφρόλειτουργίαεπιδεινώθηκε περαιτέρω, η αναιμία έχει αναγνωριστεί ως γνωστή ευκαιριακή επιπλοκή της ΧΝΝ, η οποία επηρέασε αρνητικά την ποιότητα ζωής των ασθενών (Locatelli, Fishbane, Block, & Macdougall, 2017). Η κατανόηση των παραγόντων κινδύνου που σχετίζονται με την εξέλιξη της νεφρικής αναιμίας θα βοηθήσει στην ανάπτυξη θεραπευτικών προσεγγίσεων. Σήμερα, η σχέση μεταξύ της νόσου και της μεταβολικής μικροχλωρίδας του εντέρου έχει προσελκύσει όλο και περισσότερο την προσοχή, ενώ η σχέση μεταξύ των SCFAs και της νεφρικής αναιμίας είναι ακόμα λιγότερο γνωστή. Τα SCFA, που μεταβολίζονται κυρίως από το Clostridium, το Coprococcus και το Bacteroides (Koh et al., 2016), στοχεύουν σε συγκεκριμένους υποδοχείς που συνδέονται με τη μεμβράνη, οι οποίοι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ισορροπίας του περιβάλλοντος του εντέρου και της υγείας ολόκληρου του σώματος. Τα SCFA έχουν ήδη αποδειχθεί ότι έχουν μια άρρηκτη σχέση με τη ΧΝΝ και τα επίπεδα οξικού οξέος, προπιονικού οξέος και βουτυρικού οξέος μειώθηκαν στη ΧΝΝ (Wang et al., 2019). Σε αρουραίους ΧΝΝ που προκαλούνται από αδενίνη, η αφθονία και η ποικιλομορφία της μικροχλωρίδας του εντέρου άλλαξαν σημαντικά, οι εταιρείες μείωσαν τα επίπεδα προπανικού οξέος, βουτυρικού οξέος και βαλερικού οξέος (Lakshmanan, Al, Ali, & Terranegra, 2021). Με βάση την προηγούμενη μελέτη μας, ο προσδιορισμός αλληλουχίας 16S rDNA έδειξε ότι η δυσβίωση της μικροχλωρίδας του εντέρου εμφανίστηκε σε 5/6 επίμυες ΧΝΝ που προκλήθηκαν από νεφρεκτομή σε σύγκριση με την εικονική ομάδα. Ορισμένα από τα SCFA που παράγουν γένη, ειδικά το βουτυρικό οξύ από το Clostridium, Coprococcus παρουσίασαν διαφορές σε επίμυες με ΧΝΝ (Zheng et al., 2020). Σε συμφωνία με αυτό, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι οι ποσότητες οξικού οξέος, προπιονικού οξέος, βουτυρικού οξέος, βαλερικού οξέος μειώθηκαν κατά περίπου 60 τοις εκατό , 80 τοις εκατό , 85 τοις εκατό και 60 τοις εκατό σε αρουραίους ΧΝΝ, υποδεικνύοντας ότι, η μείωση των SCFA αντιστοιχούσε με ανισορροπία του περιβάλλοντος του εντέρου. Αξίζει να σημειωθεί ότι η διαταραχή του περιβάλλοντος του εντέρου που προκαλείται από τη ΧΝΝ προκάλεσε ανώμαλο μεταβολισμό της μικροχλωρίδας του εντέρου (Feng et al., 2019). Επιπλέον, βρήκαμε ότι, σε αρουραίους με ΧΝΝ-αναιμία, οκτώ είδη επιπέδων SCFA μειώθηκαν. Για παράδειγμα, η ανωμαλία των μεταβολικών τελικών προϊόντων, π.χ. SCFAs μπορεί να οφείλεται στην εξέλιξη της ΧΝΝ.

Πολυσακχαρίτες, ένα από τα ενεργά συστατικά έχουν βρεθεί σε διάφορα βότανα, όπως το Dioscoreae Rhizoma, το Schisandra Chinensis, το Astragali Radix και το Jujubae Fructus. Οι πολυσακχαρίτες μπορούν να ζυμωθούν και να αποικοδομηθούν από τη μικροχλωρίδα του εντέρου. Ως αποτέλεσμα, οι πολυσακχαρίτες παρουσιάζονται ως υπόστρωμα για τη μικροχλωρίδα του εντέρου για μεταβολισμό σε SCFAs ή θεωρείται ότι έχουν πρεβιοτική δράση για τη βελτίωση της σύνθεσης της μικροχλωρίδας του εντέρου για τη διευκόλυνση της παραγωγής SCFAs (Cai et al., 2019). Σε αυτή τη μελέτη, τα ευρήματά μας αποκάλυψαν ότι οι πολυσακχαρίτες από την τζιτζιφιά διεγείρουν την απελευθέρωση μικροχλωρίδας του εντέρου των SCFAs, όπως οξικό οξύ, προπανικό οξύ, ισοβουτυρικό οξύ, 2-μεθυλβουτυρικό οξύ σε επίμυες με ΧΝΝ. Επιπλέον, μετά τη θεραπεία με JP, τα επίπεδα SCFAs στους νεφρούς αρουραίων με ΧΝΝ-αναιμία βελτιώθηκαν και η τάση αλλαγής ήταν σύμφωνη με το δείγμα κοπράνων. Με βάση την υπάρχουσα έρευνα, η σχέση μεταξύ SCFAs και ΧΝΝ είχε γίνει σταδιακά σαφής. Για παράδειγμα, το οξικό οξύ αναφέρθηκε ότι ρυθμίζει το ανοσοποιητικό σύστημα και βελτιώνει την οξύτητανεφρόβλάβηαναστέλλοντας τη σηματοδότηση της οξειδάσης NADPH σε Τ κύτταρα (Al-Harbi et al., 2018). Το προπανοϊκό οξύ έχει αποδειχθεί ότι αποτρέπει την εξέλιξη της ΧΝΝ που προκαλείται από αδενίνη μέσω του υποδοχέα 2 ελεύθερων λιπαρών οξέων (FFA2) και του FFA3 (Mikami et al., 2020). Επομένως, συμπεράνουμε ότι η ανάκτηση του επιπέδου SCFA του νεφρού ήταν ευεργετική για έναν άρρωστο νεφρό. Έχει αναφερθεί ότι η JP αύξησε την ποικιλότητα της μικροχλωρίδας του εντέρου και αύξησε τη σχετική αφθονία του ενεργού μικροβίου των SCFAs (Bacteroides) σε ποντικούς με καρκίνο του παχέος εντέρου (Ji et al., 2020). Επιπλέον, η JP αύξησε τη συγκέντρωση των συνολικών SCFAs σε δείγματα κοπράνων (Ji et al., 2019). Επομένως, συμπεράνουμε ότι το JP θα μπορούσε να διεγείρει την παραγωγή SCFAs για να επιτύχει τον σκοπό της επιβράδυνσης της εξέλιξης της ΧΝΝ. Το JP μπορεί επίσης να είναι ένα υπόστρωμα μεταβολισμού για το κυρίαρχο μικρόβιο SCFA για την τόνωση της παραγωγής SCFAs στη ΧΝΝ, ή ένα συστατικό παρόμοιο με πρεβιοτικά για την αποκατάσταση του περιβάλλοντος του εντέρου, ειδικά την ποικιλία των κυρίαρχων μικροβίων SCFA, και την περαιτέρω προώθηση της απελευθέρωσης SCFAs, έτσι ώστε να πρόληψη της εξέλιξης της ΧΝΝ.

Γενικά, τα SCFAs (χωρίς άνθρακα από 6) με μικρό μοριακό βάρος και υψηλή χημική πολικότητα είναι δύσκολο να αναλυθούν άμεσα με χρωματογραφικές προσεγγίσεις. Μια στρατηγική χημικής παραγωγοποίησης των SCFAs με σήμανση με ισότοπο θα μπορούσε να βελτιώσει την ευαισθησία του οργάνου και να μειώσει τα σφάλματα ανάλυσης, κάτι που παρείχε μια χρήσιμη στρατηγική για τον προσδιορισμό των SCFAs στην ανάλυση LC-MS/MS (Higashi & Ogawa, 2016). Πρόσφατα, προσεγγίσεις με επισήμανση dansyl hydrazine έχουν χρησιμοποιηθεί ικανοποιητικά για την ανίχνευση στοχευόμενων μεταβολιτών ανθρώπινου πλάσματος που περιέχουν καρβοξυλικό οξύ (Chen & Zhang, 2020). Προς υποστήριξη αυτού, σε αυτή τη μελέτη, αναπτύξαμε περαιτέρω τη χημική παραγωγοποίηση με βάση την προσέγγιση LC-MS/MS για τον προσδιορισμό 8 SCFAs σε κόπρανα αρουραίου. Τα SCFA παράγονται από τη μικροχλωρίδα του εντέρου και σχεδόν το 10% των SCFAs απεκκρίνονται μέσω των κοπράνων (Boets et al., 2015). Ως εκ τούτου, μια ανάλυση δειγμάτων κοπράνων των SCFAs μπορεί να αντικατοπτρίζει τις αλλαγές στο περιβάλλον του εντέρου άμεσα και έχει μεγαλύτερη αναφορά στην κοινή ανάλυση πολλαπλών ωμικών μεταξύ SCFA και μικροχλωρίδας του εντέρου. Συγκεκριμένα, η επικύρωση της αστάθειας, βρήκαμε ότι τα SCFA με επισήμανση dansyl hydrazine ήταν ασταθή σε θερμοκρασία δωματίου και η έντασή τους στο φάσμα μάζας έδειξε πτωτική τάση με το χρόνο, αλλά μπορούσε να παραμείνει σταθερή για 48 ώρες στους 4 ◦C. Έτσι, μετά την παραγωγοποίηση των SCFAs, οι αναλυόμενες ουσίες θα πρέπει να διατηρούνται στους 4 ◦C πριν από την ανάλυση.

Σε προχωρημένα στάδια ΧΝΝ 4-5, η ανεπάρκεια της παραγωγής EPO περιορίζει την ερυθροποίηση, η οποία συμβάλλει στον πιο κρίσιμο παράγοντα στην ανάπτυξη νεφρικής αναιμίας (Sakashita, Tanaka, & Nangaku, 2019). Η θεραπεία ρουτίνας με παράγοντες διέγερσης της ερυθροποίησης (ESA) για την αναιμία προτείνεται από τις κατευθυντήριες οδηγίες της κλινικής πρακτικής. Ωστόσο, η ασφάλεια των ESA που σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο θανάτου και τα καρδιαγγειακά συμβάντα πρέπει να ληφθεί υπόψη (Thavarajah & Choi, 2019). Σε ασθενείς με νεφρική αναιμία, η έκφραση της ΕΡΟ έπρεπε να είναι σταθερή ή αυξημένη οπτικά σε σύγκριση με τα υγιή σώματα (Babitt & Lin, 2012). Σε πρώιμο στάδιο, το επίπεδο EPO παρουσίασε την τάση αναβάθμισης, ενώ στο τελευταίο στάδιο, το επίπεδο EPO παρουσίασε πτωτική τάση σε σύγκριση με το αρχικό στάδιο, ακόμη χαμηλότερο από το κανονικό (Panjeta, Tahirovi´c, Sofi's, ´ Cori's, & Derviˇsevi γ, 2017). Αντίστοιχα με προηγούμενα πειράματα (Chen et al., 2019; Wang et al., 2020), τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το επίπεδο EPO στον ορό μειώθηκε σε αρουραίους με ΧΝΝ-αναιμία. Ανιχνεύσαμε αντίστοιχα το επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης EPO νεφρού σε αρουραίους ΧΝΝ και το επίπεδο πρωτεΐνης ΕΡΟ νεφρού μειώθηκε ελαφρώς σε σύγκριση με την εικονική ομάδα, ενώ η ποσότητα του mRNA EPO νεφρού υποβαθμίστηκε και ο βαθμός του ήταν μεγαλύτερος από το επίπεδο EPO στον ορό. Ο νεφρός είναι η κύρια πηγή σύνθεσης της EPO σε ενήλικες και ασθενείς με ΕΠΣνεφράεξακολουθεί να διατηρεί την ικανότητα να παράγει ερυθροποιητίνη (Bernhardt et al., 2010). Για τη διόρθωση των ενδογενών επιπέδων EPO στον ορό και την προσαρμογή στη νεφρική αναιμία, ενεργοποιήθηκε η παραγωγή νεφρικής EPO, αν καινεφρόβλάβημειωμένη έκφραση mRNA EPO (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Μετά τη θεραπεία με JP, το επίπεδο EPO στον ορό αυξήθηκε, καθώς και τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης EPO νεφρού αναβαθμίστηκαν και τα δύο. Στην προηγούμενη μελέτη μας, η JP θα μπορούσε να διεγείρει τη μεταγραφική δραστηριότητα HRE και να ενισχύσει το γονίδιο EPO (Chen et al., 2014). Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η JP θα μπορούσε να ανακτήσει το επίπεδο ΕΡΟ στον ορό της ΧΝΝ αρουραίου σε ρυθμιζόμενη νεφρική αναιμία, η οποία μπορεί να συνεισφέρει από τη διεγερμένη έκφραση γονιδίου EPO νεφρού σε επίπεδο mRNA.

Στον φλοιό, το HIF-1 βρέθηκε κυρίως στο σωληναριακό και το HIF-2 στο νεφρικό διάμεσο. Επειδή η EPO παράγεται κυρίως από ινοβλάστες στους οποίους βρίσκεται το HIF-2, αυτό υποστηρίζει ότι το HIF-2 μπορεί να ευθύνεται για τη ρύθμιση της παραγωγής EPO (Maxwell, 2003). Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι το HIF-1 και το HIF-2 θα μπορούσαν να ενεργοποιηθούν από τη ΧΝΝ και η θεραπεία με JP θα μπορούσε να διεγείρει τη δραστηριότητα HIF{-1 και HIF-2 σε σύγκριση με αρουραίους ΧΝΝ . Είχε αποδειχθεί ότι το HIF-2 έχει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της παραγωγής EPO (Kapitsinou et al., 2010), ενώ η ανοδική ρύθμιση του HIF-1 μπορεί να έχει μια επίδραση νεφρικής προστασίας στους νεφρούς (Jiang et al. al., 2020), η οποία βελτιώνει έμμεσα την παραγωγή EPO. Η παραγωγή EPO νεφρού αρχικά ρυθμίστηκε σε επίπεδο mRNA, υπό αναιμία ή υποξία, η έκφραση του mRNA του EPO μπορούσε να αυξηθεί με διέγερση πρωτεΐνης HIF. Προηγουμένως, η φαρμακολογική έρευνα έδειξε ότι η τζιτζιφιά διέγειρε την έκφραση της EPO μέσω της ρύθμισης του επιπέδου πρωτεΐνης HIF στο κυτταρικό μοντέλο (Chen et al., 2014, Lam et al., 2016). Ως εκ τούτου, συμπεράνουμε ότι το JP μπορεί να ρυθμίσει προς τα πάνω την έκφραση mRNA του EPO μέσω της πρωτεΐνης HIF- για να επιτευχθεί ο σκοπός της ανακούφισης της νεφρικής αναιμίας.

Επιπλέον, με βάση τα τρέχοντα αποτελέσματα, εικάζουμε ότι η μείωση των SCFAs μπορεί να έχει κρίσιμους ρόλους στην έκφραση EPO με τη μεσολάβηση HIF, η οποία συμβάλλει στην αναιμία ΧΝΝ. Σε αντίθεση με αυτό, έχει διευκρινιστεί ότι το αυξημένο επίπεδο οξικού οξέος ήταν ευεργετικό για την ακετυλίωση του HIF και τη δημιουργία συμπλόκου πρωτεΐνης δέσμευσης CREB-HIF 2 και προκάλεσε περαιτέρω έκφραση ΕΡΟ (Xu et al., 2014). Το προπιονικό οξύ εξασθενούσε τη μιτοχονδριακή διαταραχή, την απόπτωση του ιππόκαμπου και τα νευρολογικά ελλείμματα μέσω της οδού HIF-1 /ERK (Cheng et al., 2019). Επιπλέον, το βουτυρικό οξύ βρέθηκε ότι σταθεροποιεί τα γονίδια-στόχους HIF-1, ενεργών HIF σε κύτταρα του παχέος εντέρου και μετριάζει τη φλεγμονώδη απόκριση του παχέος εντέρου (Kelly et al., 2015). Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι τα επίπεδα οξικού οξέος, προπανοϊκού οξέος και βουτυρικού οξέος μειώθηκαν σημαντικά συνοδευόμενα από μη φυσιολογική έκφραση πρωτεΐνης HIF σε αρουραίους CKD, γεγονός που έδειξε ότι η σταθερότητα του HIF- μπορεί να σχετίζεται με τη μείωση των SCFAs και τα SCFAs μπορεί να έχουν η επίδραση της σταθεροποίησης του HIF για τη ρύθμιση της έκφρασης EPO.

5. Συμπεράσματα

Συμπερασματικά, αποδείξαμε ότι η JP βελτίωσε τη ΧΝΝ και τη σχετική αναιμία, ο μηχανισμός της οποίας εμπλέκεται στη ρύθμιση της απελευθέρωσης SCFAs και της παραγωγής EPO. Και το JP μπορεί να είναι το βιοδραστικό συστατικό της τζιτζιφιάς για τη θεραπεία της αναιμίας. Αυτά τα ευρήματα μπορεί να παρέχουν στοιχεία για περαιτέρω ανάπτυξη της JP ως συμπληρώματα διατροφής για τη θεραπεία της αναιμίας που σχετίζεται με ΧΝΝ.

Ηθική δήλωση

Όλα τα πειράματα σε ζώα στην έρευνά μας διεξήχθησαν με πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Κινέζικης Ιατρικής Guangzhou και σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας για τη φροντίδα και τη χρήση ζώων εργαστηρίου (Εκδόσεις NIH Αρ. 80-23, αναθεωρημένο 1996). Δεν υπάρχει παραβίαση των παραπάνω οδηγιών στην έρευνά μας.

Ευχαριστίες

Αυτή η εργασία υποστηρίζεται από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Γκουανγκντόνγκ (2018A030313305), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81804052, 81973577 και 82004248), το Πρόγραμμα Σχεδίου Επιστήμης και Τεχνολογίας Shenzhen (JSGG20191129101021, το Σχέδιο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (JSGG20191129101021, JSGG2019112910221). 20201320).

βιβλιογραφικές αναφορές

Al-Harbi, NO, Nadeem, A., Ahmad, SF, Alotaibi, MR, AlAsmari, AF, Alanazi, WA, … Ibrahim, KE (2018). Το οξικό λιπαρό οξύ βραχείας αλυσίδας βελτιώνει την οξεία σήψη που προκαλείταινεφρόβλάβημε αναστολή της σηματοδότησης της οξειδάσης NADPH στα Τ κύτταρα. International Immunopharmacology, 58, 24-31.
Babitt, JL, & Lin, HY (2012). Μηχανισμοί αναιμίας σε ΧΝΝ. Journal of the American Society of Nephrology, 23(10), 1631–1634.
Bernhardt, WM, Wiesener, MS, Scigalla, P., Chou, J., Schmieder, RE, Günzler, V., …Eckardt, KU (2010). Η αναστολή των προλυλ υδροξυλάσης αυξάνει την παραγωγή ερυθροποιητίνης σε ESRD. Journal of the American Society of Nephrology, 21(12),
2151–2156.
Boets, E., Deroover, L., Houben, E., Vermeulen, K., Gomand, SV, Delcour, JA, … Verbeke, K. (2015). Ποσοτικοποίηση in vivo παραγωγής λιπαρών οξέων μικρής αλυσίδας παχέος εντέρου από ινουλίνη. Nutrients, 7(11), 8916–8929.

Cai, Y., Liu, W., Lin, Y., Zhang, S., Zou, B., Xiao, D., … Xie, Z. (2019). Οι σύνθετοι πολυσακχαρίτες βελτιώνουν την πειραματική κολίτιδα ρυθμίζοντας τη σύνθεση και τη λειτουργία της μικροχλωρίδας του εντέρου. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 34(9),1554–1562.

Chen, G., & Zhang, Q. (2020). Ταυτόχρονη ποσοτικοποίηση ελεύθερων λιπαρών οξέων και ακυλοκαρνιτινών σε δείγματα πλάσματος χρησιμοποιώντας επισήμανση dansylhydrazine και υγρή χρωματογραφία – φασματομετρία μάζας τριπλού τετραπόλου. Αναλυτική και ΒιοαναλυτικήChemistry, 412(12), 2841-2849.

Chen, J., Lam, CT, Kong, AY, Zhang, WL, Zhan, JY, Bi, CW, … Tsim, KW (2014). Το εκχύλισμα του φρούτου Ziziphus jujuba (τζιτζιφιές) επάγει την έκφραση της ερυθροποιητίνης μέσω του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα-1 σε καλλιεργημένα κύτταρα Hep3B. PlantaMedica, 80(17), 1622–1627.

Chen, J., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Li, Z., Qi, A., … Li, S. (2019). Το αφέψημα Jian-Pi-Yi-Shen ανακουφίζει από τη νεφρική αναιμία σε αρουραίους που έχουν υποβληθεί σε νεφρεκτομή 5/6: Παραγωγή ερυθροποιητίνης μέσω σηματοδότησης παράγοντα που προκαλείται από την υποξία. Συμπληρωματική και Εναλλακτική Ιατρική Βασισμένη σε Στοιχεία, 2019, 1–8.
Cheng, Y., Mai, Q., Zeng, X., Wang, H., Xiao, Y., Tang, L., … Ding, H. (2019). Το προπιονικό ανακουφίζει από επιληπτικές κρίσεις που προκαλούνται από πεντυλενοτετραζόλη, επακόλουθη μιτοχονδριακή διαταραχή, νέκρωση νευρώνων και νευρολογικά ελλείμματα σε ποντίκια. Biochemical Pharmacology, 169, Άρθρο 113607.
Feng, YL, Cao, G., Chen, DQ, Vaziri, ND, Chen, L., Zhang, J., … Zhao, YY (2019). Το μικροβίωμα-μεταβολομική αποκαλύπτει μικροβίωμα του εντέρου που σχετίζεται με συζευγμένους μεταβολίτες με γλυκίνη και μεταβολισμό πολυαμίνης στη χρόνια νεφρική νόσο. Cellular and Molecular Life Sciences, 76(24), 4961-4978.
Garrido, P., Ribeiro, S., Fernandes, J., Vala, H., Bronze-da-Rocha, E., Rocha-Pereira, P., … Reis, F. (2015). Δυσμεταβολισμός σιδήρου-εψιδίνης, αναιμία και νεφρική υποξία, φλεγμονή και ίνωση στο μοντέλο υπολειπόμενου νεφρού επίμυος. PLoS ONE, 10(4), Άρθρο e124048.
Higashi, T., & Ogawa, S. (2016). Αντιδραστήρια παραγωγοποίησης που ενισχύουν το ESI με ισότοπο για διαφορική ανάλυση, ποσοτικό προσδιορισμό και προσδιορισμό προφίλ μεταβολιτών σε βιολογικά δείγματα με LC/MS: Μια ανασκόπηση. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 130, 181-193.
Ji, X., Hou, C., Gao, Y., Xue, Y., Yan, Y., & Guo, X. (2020). Μεταγονιδιωματική ανάλυση των ρυθμιστικών επιδράσεων της μικροβιακής χλωρίδας του εντέρου των πολυσακχαριτών τζιτζιφιού (Ziziphus jujuba Mill.) σε μοντέλο ποντικού με καρκίνο του παχέος εντέρου. Food & Function, 11(1), 163–173.
Ji, X., Hou, C., Yan, Y., Shi, M., & Liu, Y. (2020). Σύγκριση δομικού χαρακτηρισμού και αντιοξειδωτικής δράσης πολυσακχαριτών από τζιτζιφιά (Ziziphus jujuba Mill.). International Journal of Biological Macromolecules, 149, 1008-1018.

Ji, X., Hou, C., Zhang, X., Han, L., Yin, S., Peng, Q., … Wang, M. (2019). Μικροβιομεταβολική ανάλυση της επίδρασης του Zizyphus jujuba cv. Κατανάλωση πολυσακχαριτών Muzao σε μικροβίωμα κοπράνων και μεταβολίτες ποντικών με καρκίνο του παχέος εντέρου.International Journal of Biological Macromolecules, 131, 1067-1076.

Ji, X., Peng, Q., Yuan, Y., Shen, J., Xie, X., & Wang, M. (2017). Απομόνωση, δομές και βιοδραστηριότητες των πολυσακχαριτών από φρούτα τζιτζιφιάς (Ziziphus jujuba Mill.): Μια ανασκόπηση. Food Chemistry, 227, 349-357.
Jiang, N., Zhao, H., Han, Y., Li, L., Xiong, S., Zeng, L., … Sun, L. (2020). Ο HIF-1 βελτιώνει τη σωληναριακή βλάβη στη διαβητική νεφροπάθεια μέσω του ελέγχου της μιτοχονδριακής δυναμικής με τη μεσολάβηση ΗΟ. Cell Proliferation, 53(11), Άρθρο e12909.
Kapitsinou, PP, Liu, Q., Unger, TL, Rha, J., Davidoff, O., Keith, B., … Haase, VH (2010). Το ηπατικό HIF-2 ρυθμίζει τις ερυθροποιητικές αποκρίσεις στην υποξία στη νεφρική αναιμία. Blood, 116(16), 3039-3048.
Kelly, CJ, Zheng, L., Campbell, EL, Saeedi, B., Scholz, CC, Bayless, AJ, … Colgan, SP (2015). Η αντιπαράθεση μεταξύ των λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας που προέρχονται από τη μικροβιακή χλωρίδα και του εντερικού επιθηλίου HIF αυξάνει τη λειτουργία του φραγμού των ιστών. Cell Host & Microbe, 17 (5), 662–671.
Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., & B¨ akhed, F. (2016). Από τις διαιτητικές ίνες στη φυσιολογία του ξενιστή: Τα λιπαρά οξέα βραχείας αλυσίδας ως βασικοί βακτηριακοί μεταβολίτες. Cell, 165(6), 1332–1345.
Lakshmanan, AP, Al, ZM, Ali, BH, & Terranegra, A. (2021). Η επίδραση του πρεβιοτικού κόμμεος ακακίας στη σύνθεση του εντερικού μικροβιώματος σε αρουραίους με πειραματική χρόνια νεφρική νόσο. Biomedicine & Pharmacotherapy, 133, Άρθρο
110992.
Lam, C., Chan, PH, Lee, P., Lau, KM, Kong, A., Gong, A., … Tsim, K. (2016). Χημική και βιολογική αξιολόγηση των αφεψημάτων βοτάνων που περιέχουν Jujube (Ziziphus jujuba): Επαγωγή έκφρασης ερυθροποιητίνης σε καλλιέργειες. Journal of Chromatography BAnalytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 1026, 254–262.
Lappin, TR, & Lee, FS (2019). Ενημέρωση για τις μεταλλάξεις στο HIF: μονοπάτι EPO και ο ρόλος τους στην ερυθροκυττάρωση. Blood Reviews, 37, Άρθρο 100590.
LeBlanc, JG, Chain, F., Martín, R., Bermúdez-Humaran, ´ LG, Courau, S., & Langella, P. (2017). Ευεργετικές επιδράσεις στον ενεργειακό μεταβολισμό του ξενιστή των λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας και των βιταμινών που παράγονται από κοινά και προβιοτικά βακτήρια. Microbial Cell Factories, 16 (1), 79.
Li, L., Ma, L., & Fu, P. (2017). Λιπαρά οξέα βραχείας αλυσίδας που προέρχονται από τη μικροχλωρίδα του εντέρου και παθήσεις των νεφρών. Drug Design Development and Therapy, 11, 3531-3542.
Li, L., & Shi, JY (2013). Ανάλυση πολυσακχαριτών και λιπιδικών συστατικών του φλοιού της κανέλας με GC-MS. Zhong Yao Cai, 36(4), 578–580.
Liu, G., Liu, X., Zhang, Y., Zhang, F., Wei, T., Yang, M., … Zhao, Z. (2015). Ηπατοπροστατευτικές επιδράσεις πολυσακχαριτών που εξάγονται από Zizyphus jujube cv. Huanghetanzao. International Journal of Biological Macromolecules, 76, 169-175.

Locatelli, F., Fishbane, S., Block, GA, & Macdougall, IC (2017). Στοχεύοντας στην υποξία Επαγόμενοι παράγοντες για τη θεραπεία της αναιμίας σε ασθενείς με χρόνια νεφρική νόσο. American Journal of Nephrology, 45(3), 187–199.

Locatelli, F., Hannedouche, T., Fishbane, S., Morgan, Z., Oguey, D., & White, WB (2019). Καρδιαγγειακή ασφάλεια και θνησιμότητα όλων των αιτιών από μεθοξυ πολυαιθυλένιο

Γλυκολική-Εποετίνη βήτα και άλλοι παράγοντες διέγερσης της ερυθροποίησης στην αναιμία της ΧΝΝ: Μια τυχαιοποιημένη δοκιμή μη κατωτερότητας. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN, 14(12), 1701–1710.
Maxwell, P. (2003). HIF-1: Ένα σύστημα απόκρισης οξυγόνου με ιδιαίτερη σημασία για το νεφρό. Journal of the American Society of Nephrology, 14(11), 2712–2722.
Meijers, BK, & Evenepoel, P. (2011). Άξονας εντέρου-νεφρού: θειικό ινδοξύλιο, θειικό ρ-κρεσύλιο και εξέλιξη της ΧΝΝ. Nephrology Dialysis Transplantation, 26(3), 759-761.
Mikami, D., Kobayashi, M., Uwada, J., Yazawa, T., Kamiyama, K., Nishimori, K., … Iwano, M. (2020). Τα λιπαρά οξέα βραχείας αλυσίδας μετριάζουν τη χρόνια νεφρική νόσο που προκαλείται από αδενίνη μέσω των οδών FFA2 και FFA3. Biochimica Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology Lipids, 1865(6), Άρθρο 158666.
Morton, DB, & Griffiths, PH (1985). Οδηγίες για την αναγνώριση του πόνου, της αγωνίας και της δυσφορίας σε πειραματόζωα και μια υπόθεση για αξιολόγηση. Veterinary Record, 116(16), 431–436.
Panjeta, M., Tahirovi´c, I., Sofi´c, E., Cori ´´c, J., & Derviˇsevi´c, A. (2017). Ερμηνεία των επιπέδων ερυθροποιητίνης και αιμοσφαιρίνης σε ασθενείς με διάφορα στάδια χρόνιας νεφρικής νόσου. Journal of Medical Biochemistry, 36(2), 145-152.
Παππά, Μ., Ντουνούση, Ε., Ντούνη, Α., & Κατωπόδης, Κ. (2015). Λιγότερο γνωστοί παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί αναιμίας σε ασθενείς με διαβητική νεφροπάθεια. International Urology and Nephrology, 47(8), 1365–1372.
Sakashita, M., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2019). Αναστολείς τομέα υποξίας-επαγώγιμου παράγοντα-προλυλ υδροξυλάσης για τη θεραπεία της αναιμίας σε χρόνια νεφρική νόσο. Contributions to Nephrology, 198, 112–123. https://doi.org/10.1159/000496531.
Schodel, ¨ J., & Ratcliffe, PJ (2019). Μηχανισμοί σηματοδότησης υποξίας: Νέες επιπτώσεις για τη νεφρολογία. Nature Reviews Nephrology, 15(10), 641–659.
Tako, E., Glahn, RP, Knez, M., & Stangoulis, JC (2014). Η επίδραση των πρεβιοτικών σιταριού στον βακτηριακό πληθυσμό του εντέρου και την κατάσταση σιδήρου των κοτόπουλων κρεατοπαραγωγής με έλλειψη σιδήρου. Nutrition Journal, 13, 58.
Tang, WH, Wang, Z., Kennedy, DJ, Wu, Y., Buffa, JA, Agatisa-Boyle, B., … Hazen, SL (2015). Το μονοπάτι του Ν-οξειδίου της τριμεθυλαμίνης (TMAO) που εξαρτάται από τη μικροβία του εντέρου συμβάλλει τόσο στην ανάπτυξη νεφρικής ανεπάρκειας όσο και στον κίνδυνο θνησιμότητας σε χρόνια νεφρική νόσο. Circulation Research, 116(3), 448–455.
Thavarajah, S., & Choi, MJ (2019). Η χρήση παραγόντων διέγερσης της ερυθροποίησης σε ασθενείς με ΧΝΝ και καρκίνο: Μια κλινική προσέγγιση. American Journal of Kidney Diseases, 74(5), 667-674.
Wang, F., Yu, H., Huang, S., Zheng, L., Zheng, P., Zhang, S., … Chen, J. (2020). Το Jian-PiYi-Shen ρυθμίζει τις εκφράσεις EPO και πρωτεϊνών ανακύκλωσης σιδήρου σε αναιμικούς αρουραίους με χρόνια νεφρική νόσο: Συσσώρευση επαγώγιμου παράγοντα υποξίας-2 μέσω σηματοδότησης ERK. Συμπληρωματική και Εναλλακτική Ιατρική Βασισμένη σε Αποδείξεις, 2020, 8894257.
Wang, S., Lv, D., Jiang, S., Jiang, J., Liang, M., Hou, F., … Chen, Y. (2019). Η ποσοτική μείωση των λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας, ιδιαίτερα του βουτυρικού, συμβάλλει στην εξέλιξη της χρόνιας νεφρικής νόσου. Clinical Science, 133(17), 1857–1870.
Webster, AC, Nagler, EV, Morton, RL, & Masson, P. (2017). Χρόνια νεφρική νόσος. Lancet (Λονδίνο, Αγγλία), 389 (10075), 1238–1252.
Xie, X., Yang, X., Wu, J., Ma, J., Wei, W., Fei, X., … Wang, M. (2020). Το Trib1 συμβάλλει στην ανάρρωση από οξεία νεφρική βλάβη που προκαλείται από ισχαιμία/επαναιμάτωση, ρυθμίζοντας την πόλωση των νεφρικών μακροφάγων. Frontiers in Immunology, 11, 473.
Xu, M., Nagati, JS, Xie, J., Li, J., Walters, H., Moon, YA, … Garcia, JA (2014). Ένας διακόπτης οξικού άλατος ρυθμίζει την ερυθροποίηση του στρες. Nature Medicine, 20(9), 1018–1026.
Yue, Y., Wu, S., Li, Z., Li, J., Li, X., Xiang, J., … Ding, H. (2015). Οι πολυσακχαρίτες άγριας τζιτζιφιάς προστατεύουν από την πειραματική φλεγμονώδη νόσο του εντέρου επιτρέποντας την ενισχυμένη λειτουργία του εντερικού φραγμού. Food & Function, 6(8), 2568–2577.

Zhao, S., & Li, L. (2018). Σήμανση ισοτόπου Dansylhydrazine LC-MS για ολοκληρωμένο προφίλ υπομεταβολώματος καρβοξυλικού οξέος. Analytical Chemistry, 90(22), 13514–13522.

Zheng, L., Chen, S., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Yang, X., … Chen, J. (2020). Διακεκριμένες αποκρίσεις της μικροχλωρίδας του εντέρου στο αφέψημα Jian-Pi-Yi-Shen σχετίζονται με βελτιωμένα κλινικά αποτελέσματα σε αρουραίους με νεφρεκτομή 5/6. Frontiers in Pharmacology, 11, 604.