Επιδράσεις του αφεψήματος Jianpi Bushen Yiqi στην ανοσοποιητική λειτουργία και τις νευρομυϊκές συνδέσεις σε ποντίκια EAMG

2.3 Ιστομορφολογική σύγκριση του θύμου και των λεμφαδένων σε κάθε ομάδα ποντικών

Όπως φαίνεται στοΕικόνα 1, ο θυμικός φλοιός και ο μυελός στοκενή ομάδα ελέγχουτα ποντίκια ήταν σαφώς οριοθετημένα, με τακτοποιημένα κύτταρα. Αντίθετα, τοομάδα ελέγχου μοντέλουεμφάνισαν ασαφή όρια φλοιού-μυελού και αραιή κυτταρική κατανομή. Σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων, τα ποντίκια στοομάδα πρεδνιζόνηςκαιομάδες αφεψήματος Jianpi Bushen Yiqi χαμηλής, μεσαίας και υψηλής δόσηςπαρουσίασε σχετικά καθαρά όρια φλοιού-μυελού και πυκνά, καλά οργανωμένα κύτταρα.

Εικόνα 2δείχνει ότι τα κύτταρα των λεμφαδένων στην κενή ομάδα ελέγχου εμφάνισαν πλήρη δομή και εύρυθμη διάταξη. Τα πρωτογενή λεμφοειδή ωοθυλάκια ήταν ορατά στον φλοιό, χωρίς δευτερεύοντα ωοθυλάκια ή βλαστικά κέντρα. Στην ομάδα του μοντέλου, η κυτταρική δομή ήταν αποδιοργανωμένη, με πολλαπλασιασμένα πρωτογενή ωοθυλάκια και ορατά δευτερεύοντα ωοθυλάκια και βλαστικά κέντρα. Οι ομάδες πρεδνιζόνης και Jianpi Bushen Yiqi εμφάνισαν μειωμένη υπερπλασία των λεμφοθυλακίων.

Πίνακας 3καταδεικνύει ότι, σε σύγκριση με την τυφλή ομάδα ελέγχου, η ομάδα μοντέλου είχε μειωμένη αναλογία περιοχής φλοιού προς μυελό στον θύμο και αυξημένα βλαστικά κέντρα στους λεμφαδένες (P < 0,05 ή P < 0,01). Σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων, τοπρεδνιζόνηκαιυψηλή δόση Jianpi

 

 

 

Σχήμα 1 Σύγκριση της ιστοπαθολογικής μορφολογίας του θύμου ιστού μεταξύ διαφορετικών ομάδων ποντικών (χρώση HE)

 

Πίνακας 3. Σύγκριση της αναλογίας της περιοχής του θύμου φλοιού-μυελού και του αριθμού των βλαστικών κέντρων των λεμφαδένων σε κάθε ομάδα ποντικών

Μονάδα: (x̄ ± s)

Ομάδα	n	Αναλογία Θυμικού Φλοιού/Μυελού	Αριθμός βλαστικού κέντρου (ανά LN)
Κενός έλεγχος	3	3.62 ± 0.18	0.00 ± 0.00
Έλεγχος μοντέλου	3	1.74 ± 0.11 ᵃ	6.47 ± 1.51 ᵃ
Πρεδνιζόνη	3	4.62 ± 1.41 ᵇ ᶜ	3.52 ± 0.35 ᵇ ᶜ
Αφέψημα Χαμηλή δόση	3	2.91 ± 0.42 ᶜ	5.77 ± 0.66 ᶜ
Αφέψημα Μέτρια Δόση	3	3.41 ± 1.05 ᶜ	4.12 ± 0.25 ᶜ
Αφέψημα Υψηλής Δόσης	3	4.60 ± 0.55 ᵇ ᶜ	3.00 ± 0.71 ᶜ

Σημειώσεις:

ᵃ: P < 0,01 έναντι κενού στοιχείου ελέγχου

ᵇ: P < 0,05 έναντι Μοντέλου ελέγχου

ᶜ: P < 0,01 έναντι Μοντέλου ελέγχου

Bushen Yiqiοι ομάδες έδειξαν υψηλότερο λόγο φλοιού προς μυελό. Όλες οι ομάδες παρέμβασης, συμπεριλαμβανομένης της πρεδνιζόνης και των τριών δόσεων αφεψήματος, μείωσαν σημαντικά τον αριθμό των βλαστικών κέντρων (P < 0,01). Σε σύγκριση με την ομάδα της πρεδνιζόνης, του αφεψήματοςομάδες χαμηλής και μεσαίας δόσηςεξακολουθούσε να παρουσιάζει ελαφρώς περισσότερα βλαστικά κέντρα, ενώ ηομάδα υψηλής δόσηςδεν είχε σημαντική διαφορά.

Σημείωση: Τα μαύρα βέλη δείχνουν προς τα λεμφικά ωοθυλάκια και τα κόκκινα βέλη δείχνουν τα βλαστικά κέντρα.

Σχήμα 2 Σύγκριση ιστοπαθολογικής μορφολογίας ιστών λεμφαδένων μεταξύ διαφορετικών ομάδων ποντικών (χρώση HE)

 

 

 

 

2.4 Σύγκριση ποσοστών κυττάρων Th1, Th2, Th17, Treg και Tfh σε εναιωρήματα κυττάρων σπλήνας

Όπως φαίνεται στοΠίνακας 4, σε σύγκριση με την κενή ομάδα ελέγχου, τοομάδα μοντέλωνέδειξε αυξημένα ποσοστά των κυττάρων Th1, Th2, Th17 και Tfh και μειωμένο ποσοστό Treg (P < 0,05 ή P < 0,01). Σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων, τοομάδες αφεψήματος μεσαίας και υψηλής δόσηςείχε μειώσει τα ποσοστά Th1 και αύξησε τα ποσοστά Treg. Και οι τρεις ομάδες αφεψήματος έδειξαν μειωμένα ποσοστά Th17 και Tfh. Συγκεκριμένα, τοομάδα πρεδνιζόνηςμείωσε τα ποσοστά Treg, εγείροντας ανησυχίες για τη δυνατότητά του να διαταράξει την ομοιόσταση του ανοσοποιητικού.

Σε σύγκριση με την ομάδα πρεδνιζόνης, όλες οι ομάδες με αφέψημα εμφάνισαν μειώσεις στα κύτταρα Th2, Th17 και Tfh. Οομάδες μεσαίας και υψηλής δόσηςπεραιτέρω μείωση Th1 και αύξηση των κυττάρων Treg (P < 0,05 ή P < 0,01), υποδηλώνοντας μια πιο ισορροπημένη ανοσορρύθμιση.

 

 

 

Σημείωση: NMJ, νευρομυϊκή σύνδεση. AChR, υποδοχέας ακετυλοχολίνης.

Σχήμα 3 Σύγκριση μορφολογίας AChR στις νευρομυϊκές συνδέσεις μυϊκών ομάδων μεταξύ διαφορετικών ομάδων ποντικών
(χρώση ανοσοφθορισμού, × 100)

 

Πίνακας 4. Σύγκριση των ποσοστών των κυττάρων Th1, Th2, Th17, Treg και Tfh σε εναιωρήματα κυττάρων σπλήνας μεταξύ διαφορετικών ομάδων ποντικών

Μονάδα: (% , x̄ ± s)

Ομάδα	n	Θ1	Θ2	Th17	Treg	Tfh
Κενός έλεγχος	6	0.05 ± 0.04	0.03 ± 0.02	0.11 ± 0.06	16.42 ± 2.59	9.45 ± 3.29
Έλεγχος μοντέλου	7	3.43 ± 1.11 ᵃ	0.82 ± 0.22 ᵃ	1.64 ± 0.65 ᵇ	7.99 ± 3.26 ᵃ	18.27 ± 4.21 ᵃ
Πρεδνιζόνη	7	1.84 ± 0.26	0.84 ± 0.47	1.03 ± 0.71	5.02 ± 1.58 ᵃ	15.32 ± 3.84
Αφέψημα Χαμηλή δόση	7	1.42 ± 0.59 ᶜ ᵉ	0.60 ± 0.16 ᶜ ᶠ	0.73 ± 0.24 ᶜ ᶠ	14.97 ± 2.11 ᶠ	10.35 ± 3.72 ᶜ ᶠ
Αφέψημα Μέτρια Δόση	7	1.08 ± 0.59 ᶜ ᵉ	0.47 ± 0.14 ᶜ ᶠ	0.45 ± 0.20 ᶜ ᶠ	13.82 ± 2.21 ᶠ	9.87 ± 3.65 ᶜ ᶠ
Αφέψημα Υψηλής Δόσης	7	1.23 ± 0.62 ᶜ ᵉ	0.32 ± 0.14 ᶠ	0.34 ± 0.22 ᶜ ᶠ	13.50 ± 2.47 ᶠ	7.97 ± 3.60 ᶜ ᶠ

Σημειώσεις:

ᵃ: P < 0,01 έναντι κενού στοιχείου ελέγχου

ᵇ: P < 0,05 έναντι κενού στοιχείου ελέγχου

ᶜ: P < 0,01 έναντι Μοντέλου ελέγχου

ᵈ: P < 0,05 έναντι Μοντέλου ελέγχου

ᵉ: P < 0,05 έναντι πρεδνιζόνης

ᶠ: P < 0,01 έναντι πρεδνιζόνης

 

 

2.5 Σύγκριση Μορφολογίας AChR στο NMJ σε κάθε μυϊκή ομάδα

Εικόνα 3δείχνει ότι τα NMJ AChR στην τυφλή ομάδα ελέγχου ήταν δομικά άθικτα και εμφανίστηκαν ως συμπαγείς σχηματισμοί που μοιάζουν με κουλούρια. Στην ομάδα μοντέλου, οι NMJ στους οφθαλμικούς, στερνοκλειδομαστοειδής, δελτοειδή και κνημιαίους πρόσθιους μύες εμφανίστηκαν κατακερματισμένοι και παραμορφωμένοι, ενώ οι μασητήρες, οι μεσοπλεύριοι και οι μύες του διαφράγματος εμφάνιζαν σοβαρά διαταραγμένες δομές. Όλες οι ομάδες παρέμβασης εμφάνισαν ποικίλους βαθμούς βελτίωσης στη μορφολογία της AChR.

Όπως φαίνεται στοΠίνακας 5, σε σύγκριση με την κενή ομάδα ελέγχου, η ομάδα μοντέλου είχε σημαντικά μειωμένες αναλογίες περιοχής AChR σε πολλούς μύες (P < 0,05 ή P < 0,01). Σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων, τοπρεδνιζόνηκαιαφέψημα μεσαίας δόσηςομάδες έδειξαν αυξημένη περιοχή AChR στους οφθαλμικούς μύες. Οομάδα αφεψήματος χαμηλής δόσηςβελτιωμένες περιοχές AChR στον δελτοειδή και στην πρόσθια κνημιαία. Οομάδα υψηλής δόσηςβελτιώθηκαν οι περιοχές AChR στους οφθαλμικούς, στερνοκλειδομαστοειδείς, δελτοειδή και πρόσθιο μύες της κνήμης.

Σε σύγκριση με την πρεδνιζόνη, ηομάδα χαμηλής δόσηςβελτιωμένες περιοχές AChR στους οφθαλμικούς και μασητικούς μύες. οομάδα μεσαίας δόσηςσε μασητικό μυ? και τοομάδα υψηλής δόσηςσε στερνοκλειδομαστοειδές και πρόσθιο κνημιαίο (P < 0,05 ή P < 0,01).

Πίνακας 5. Σύγκριση της περιοχής AChR στη νευρομυϊκή συμβολή σε κάθε ομάδα μυϊκών ομάδων ποντικών

Μονάδα: (% , x̄ ± s)

Ομάδα	n	Οφθαλμικός μυς	Μασητικός μυς	Στερνοκλειδομαστοειδές	Δελτοειδής μυς	Μεσοπλεύριος μυς	Διάφραγμα	Κνημιαία πρόσθια
Κενός έλεγχος	3	3.83 ± 0.28	4.28 ± 0.29	4.48 ± 0.77	3.79 ± 0.12	3.78 ± 0.22	4.80 ± 0.26	3.60 ± 0.32
Έλεγχος μοντέλου	3	2.58 ± 0.34 ᵃ	2.55 ± 0.45 ᵃ	2.15 ± 0.31 ᵇ	2.33 ± 0.15	2.55 ± 0.33	2.98 ± 0.34ᵇ	2.95 ± 0.49
Πρεδνιζόνη	3	3.33 ± 0.49ᶜ	2.67 ± 0.55	3.83 ± 0.54	3.49 ± 0.38	3.60 ± 0.16	3.45 ± 0.67	3.02 ± 0.40
Αφέψημα Χαμηλή δόση	3	2.76 ± 0.49ᵉ	3.05 ± 0.37ᵉ	3.77 ± 0.64	2.77 ± 0.44ᶜ	3.03 ± 0.25	3.33 ± 0.33	3.44 ± 0.71ᶜ
Αφέψημα Μέτρια Δόση	3	3.32 ± 0.40ᶜ	3.27 ± 0.75ᵉ	3.98 ± 0.43	3.27 ± 0.65	3.50 ± 0.28	3.85 ± 0.42	3.56 ± 0.52
Αφέψημα Υψηλής Δόσης	3	3.46 ± 0.37ᶜ	3.34 ± 0.23ᵉ	4.54 ± 0.67ᶜ	3.69 ± 0.39	3.75 ± 0.36	3.75 ± 0.35	3.84 ± 0.52ᶜ

Σημειώσεις:

ᵃ: P < 0,05 έναντι κενού ελέγχου

ᵇ: P < 0,01 έναντι κενού στοιχείου ελέγχου

ᶜ: P < 0,05 έναντι Μοντέλου ελέγχου

ᵈ: P < 0,01 έναντι Μοντέλου ελέγχου

ᵉ: P < 0,05 έναντι πρεδνιζόνης

 

Πίνακας 6. Σύγκριση των επιπέδων AChR-Ab, IL-6 και TNF- στον ορό μεταξύ διαφορετικών ομάδων ποντικών

Μονάδα: (x̄ ± s)

Ομάδα	n	AChR-Ab (P-1)	IL-6 (pg·ml-1)	TNF- (pg·ml-1)
Κενός έλεγχος	12	1.00 ± 0.13	110.66 ± 30.75	25.84 ± 9.71
Έλεγχος μοντέλου	12	3.13 ± 0.97 ᵃ	327.91 ± 38.71 ᵃ	124.15 ± 37.61 ᵃ
Πρεδνιζόνη	11	2.05 ± 0.29 ᵇ ᶜ	487.21 ± 124.09 ᵇ	78.76 ± 22.35 ᵇ ᶜ
Αφέψημα Χαμηλή δόση	13	2.50 ± 0.49ᵉ	306.42 ± 93.91ᶜ	89.14 ± 25.90 ᶜ
Αφέψημα Μέτρια Δόση	13	1.98 ± 0.34 ᶜ	278.60 ± 63.97ᶜ	80.36 ± 21.95ᶜ
Αφέψημα Υψηλής Δόσης	13	1.42 ± 0.33 ᶜ	224.43 ± 49.03ᶜ	84.26 ± 36.60ᶜ

Σημειώσεις:

ᵃ: P < 0,01 έναντι κενού στοιχείου ελέγχου

ᵇ: P < 0,01 έναντι Μοντέλου ελέγχου

ᶜ: P < 0,01 έναντι Μοντέλου ελέγχου

ᵈ: P < 0,05 έναντι πρεδνιζόνης

ᵉ: P < 0,01 έναντι πρεδνιζόνης

2.6 Σύγκριση των επιπέδων AChR-Ab, IL-6 και TNF ορού

Πίνακας 6δείχνει ότι, σε σύγκριση με την κενή ομάδα ελέγχου, τοομάδα μοντέλωνείχε σημαντικά αυξημένα επίπεδα AChR-Ab, IL-6 και TNF- (P < 0,01). Σε σύγκριση με την ομάδα μοντέλων, τοπρεδνιζόνηκαιομάδες αφεψήματος μεσαίας και υψηλής δόσηςμείωσε σημαντικά το AChR-Ab. Ωστόσο,αυξημένη πρεδνιζόνη IL-6, ενώ τοη ομάδα αφεψήματος υψηλής δόσης μειώθηκε IL-6. Τόσο η πρεδνιζόνη όσο και ηομάδες μεσαίας και υψηλής δόσηςμειωμένος TNF- (P < 0,05 ή P < 0,01).

Σε σύγκριση με την πρεδνιζόνη, ηομάδα αφεψήματος χαμηλής δόσηςείχε υψηλότερο επίπεδο AChR-Ab, αλλάόλες οι ομάδες αφέψημαμείωσε το IL-6, αποφεύγοντας τις προφλεγμονώδεις επιδράσεις της πρεδνιζόνης.

3. Συζήτηση

Κλινικά, η MG κατηγοριοποιείται σε οφθαλμική μυασθένεια gravis (oMG) και γενικευμένη MG (gMG). Το oMG εκδηλώνεται κυρίως ως πτώση και διπλωπία και μπορεί να εξελιχθεί σε gMG, που χαρακτηρίζεται από συστηματική αδυναμία των σκελετικών μυών [1]. Η θεωρία της Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής (TCM) αποδίδει την παθογένεια της MG σε δυσλειτουργίες στηνσπλήνα και νεφρό. Ο σπλήνας κυβερνά τους μύες και τα άκρα, καθώς είναι η μεταγεννητική ρίζα και η πηγή του Qi και του αίματος. Το νεφρό αποθηκεύει την ουσία και κυβερνά τα οστά και τον μυελό. Η ανεπάρκεια και στα δύο οδηγεί σε μυϊκή αδυναμία, όπως φαίνεται στο MG [15-16].

Με βάση την αρχή TCM της "θεραπείας της ρίζας",τονωτικό της σπλήνας και των νεφρώνγίνεται κεντρικός. ΟΑφέψημα Jianpi Bushen Yiqiενσωματώνει αυτή την προσέγγιση. Το κύριο συστατικό του,Astragalus membranaceus, ενισχύει το Qi της σπλήνας και ανυψώνει το Yang.Κόλλα για κέλυφος χελώναςκαικόλλα ελαφοκέρατουεμπλουτίζει την ουσία και το yang των νεφρών, ενισχύοντας τους μυς και τα οστά.Codonopsis, Angelica sinensis, Bupleurum, Cimicifuga, καιγλυκόριζα τηγανητή με μέλιλειτουργούν συνεργικά για να θρέψουν το αίμα, να ανυψώσουν το Yang και να εναρμονίσουν τη φόρμουλα.

Μια βασική προσθήκη σε αυτό το σκεύασμα είναιCistanche deserticola, ένα διάσημο βότανο γιατονωτικό γιανγκ των νεφρών και αναπλήρωση της ζωτικής ουσίας. Το Cistanche έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει τη ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος και βελτιώνει την αντίσταση στην κόπωση, καθιστώντας το ιδανικό για καταστάσεις όπως το MG. Σύμφωνα με το XJCistanche, το εκχύλισμα Cistanche υποστηρίζειζωτικότητα των νεύρων και των μυών, προωθείισορροπία νευροδιαβιβαστών, και βελτιώνεταιανοσοποιητική ομοιόσταση-μηχανισμοί άμεσα σχετικοί με την παθοφυσιολογία της MG.

Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε ένα μοντέλο ποντικού EAMG για να αξιολογήσει τις επιδράσεις του αφεψήματος σε διαστάσεις συμπεριφοράς, ανοσοποιητικού και NMJ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότιπρεδνιζόνηβελτίωσε τη δύναμη πρόσφυσης και τις βαθμολογίες του Lennon αλλά προκάλεσε σημαντικέςαπώλεια βάρους, σύμφωνα με τις γνωστές παρενέργειες των γλυκοκορτικοειδών [19]. Αντίθετα, όλες οι δόσεις αφεψήματοςαυξημένο σωματικό βάρος, υποδηλώνοντας καλύτερη ασφάλεια.

Η θεραπευτική αποτελεσματικότητα ήτανδοσοεξαρτώμενη, με τοομάδα υψηλής δόσηςεπίτευξη συγκρίσιμης βελτίωσης στη δύναμη πρόσφυσης και στο σκορ Lennon με την προσφορά πρεδνιζόνης και των δύοαποτελεσματικότητα και ασφάλεια.

Οι δείκτες των οργάνων του ανοσοποιητικού συστήματος αποκάλυψαν ότι η πρεδνιζόνη μείωσε τον δείκτη θύμου και προκάλεσε ατροφία του φλοιού-μυελού, μειώνοντας την κεντρική ανοχή [20]. Το αφέψημα, ωστόσο, διατήρησε ή βελτίωσε τη δομή του θύμου, ειδικά σε υψηλές δόσεις. Οι δείκτες του σπλήνα ακολούθησαν αδιφασικό μοτίβο ρύθμισης, με χαμηλές και μεσαίες δόσεις που καταστέλλουν τον ανώμαλο πολλαπλασιασμό του ανοσοποιητικού, ενώ η υψηλή δόση διατήρησε την ισορροπία.

Όλες οι ομάδες αφέψημα μείωσαν την υπερπλασία των ωοθυλακίων των λεμφαδένων, αν και μόνο η υψηλή δόση ταίριαζε με πρεδνιζόνη στην καταστολή του βλαστικού κέντρου, υποδηλώνοντας την ανώτερη ρύθμιση της κεντρικής και της περιφερικής ανοσίας σε υψηλή δόση.

Δεδομένου ότι η ανισορροπία των Τ-κυττάρων CD4+ βασίζεται στο EAMG [4], η ικανότητα του αφεψήματος ναrebalance Th1/Th2/Th17/Tfh and Tregτα κύτταρα είναι κομβικής σημασίας. Σε αντίθεση με την πρεδνιζόνη, η οποία μείωσε το Treg, το αφέψημα (ειδικά μεσαίες και υψηλές δόσεις)ενισχυμένη Tregκαι κατέστειλε προφλεγμονώδη υποσύνολα. Αυτόανοσορύθμιση, αντί για καταστολή του ανοσοποιητικού, ευθυγραμμίζεται καλύτερα με τις ανάγκες αυτοάνοσων νοσημάτων όπως το MG.

Για την ακεραιότητα του NMJ, το αφέψημα αποδείχθηκεπολυμυϊκή επιδιόρθωση AChR, ξεπερνώντας την πρεδνιζόνη σε αρκετές μυϊκές ομάδες. Επιπλέον, μειώθηκε αποτελεσματικάAChR-Ab, IL-6 και TNF-, με την υψηλή δόση να δείχνει την πιο ολοκληρωμένη αντιφλεγμονώδη δράση-χωρίς αύξηση της πρεδνιζόνης IL-6.

 

Σύναψη

ΟΑφέψημα Jianpi Bushen Yiqi, εμπλουτισμένο μεCistanche deserticola, ασκεί θεραπευτικά αποτελέσματα πολλαπλών στόχων σε ποντίκια EAMG. Το:

Εξισορροπεί εκ νέου τον άξονα Th/Treg και καταστέλλει την ενεργοποίηση των Β κυττάρων με τη μεσολάβηση Tfh

Μειώνει τα παθογόνα αντισώματα και τις φλεγμονώδεις κυτοκίνες

Επιδιορθώνει τις δομές του NMJ και αποκαθιστά τη μυϊκή λειτουργία

Σε σύγκριση με την πρεδνιζόνη, προσφέρει ανώτερηασφάλεια, ανοσολογική αποκατάσταση, καιστόχευση πολλαπλών μυών, αναδεικνύοντας τις δυνατότητές του ως ακλινική εναλλακτικήήσυμπληρωματική θεραπείαγια MG.

Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να το διερευνήσουνβιοδραστικές ενώσεις, μεταβολικές οδούς, καιμοριακούς στόχους, πιθανώς μέσωφαρμακολογία δικτύουκαιπρωτεομική, για να επιταχύνει την ανάπτυξή του ως ένα νέο θεραπευτικό που βασίζεται σε TCM.