Ο αναστολέας JAK Αποκλείει τη σηματοδότηση JAK-STAT-APOL1 που προκαλείται από την COVID{0}}κυτοκίνη στα σπειραματικά κύτταρα και την ποδοκυτταροπάθεια σε οργανοειδή ανθρώπινου νεφρού

Αφηρημένη

αιτίες μόλυνσης από COVID-19κατάρρευση των σπειραματικών τριχοειδών αγγείωνκαιαπώλεια ποδοκυττάρων, που καταλήγει σε ασοβαρή νεφρική νόσοπου ονομάζεταιΝεφροπάθεια που σχετίζεται με τον COVID-19-(COVAN). Ο υποκείμενος μηχανισμός του COVID-19 είναι άγνωστος. Υποθέσαμε ότι οι κυτοκίνες που προκαλούνται από τον COVID-19 πυροδοτούν την έκφραση του παθογόνου APOL1 μέσω της σηματοδότησης JAK-STAT, με αποτέλεσμα την απώλεια ποδοκυττάρων και τον φαινότυπο COVAN. Εδώ, με βάση εννέα περιπτώσεις COVAN που έχουν αποδειχθεί με βιοψία, δείξαμε για πρώτη φορά ότι η ΑΠΗ πρωτεΐνη OL1 εκφράζεται σε αφθονία στα ποδοκύτταρα καισπειραματικό ενδοθηλιακόκύτταρα (GECs) των νεφρών COVAN αλλά όχι σε μάρτυρες. Επιπλέον, η πλειοψηφία (77,8%) των ασθενών με COVAN έφεραν δύοΑΠΟΛ1αλληλόμορφα κινδύνου. Δείξαμε ότι οι ανασυνδυασμένες κυτοκίνες που προκαλούνται από τον SARS-CoV-2 δρουν συνεργικά στην οδήγησηΑΠΟΛ1έκφραση μέσω της οδού JAK-STAT σε πρωτογενή ανθρώπινα ποδοκύτταρα, GECs καιμικροοργανοειδή των νεφρώνπου προέρχεται από έναν φορέα δύοΑΠΟΛ1αλληλόμορφα κινδύνου αλλά αποκλείστηκαν από τον αναστολέα JAK1/2-, τη βαρισιτινίμπη. Δείξαμε για πρώτη φορά ότι η προκαλούμενη από κυτοκίνη σηματοδότηση JAK-STAT-APOL1 μείωσε τη βιωσιμότητα των νεφρικών οργανοειδών ποδοκυττάρων, αλλά διασώθηκε από τη baricitinib. Μαζί, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότιΚυτοκίνες που προκαλούνται από τον COVID-19-είναι επαρκείς για να οδηγήσουν την ποδοκυτταροπάθεια που σχετίζεται με το COVAN μέσω σηματοδότησης JAK-STAT-APOL1 και ότι ο αναστολέας JAK θα μπορούσε να εμποδίσει αυτήν την παθογόνο διαδικασία. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι οι αναστολείς JAK μπορεί να έχουν θεραπευτικά οφέλη για τη διαχείριση της προκαλούμενης από κυτοκίνης APOL1-ποδοκυτταροπάθειας.

Υποστήριξη της Wecistanche-Ο μεγαλύτερος εξαγωγέας κιστάνι στην Κίνα:

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Αγορά για περισσότερες λεπτομέρειες Λεπτομέρειες:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ΠΑΡΕΤΕ ΦΥΣΙΚΟ ΟΡΓΑΝΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΚΙΣΤΑΝΧΗΣ ΜΕ 25% ΕΧΙΝΑΚΟΣΙΔΗ ΚΑΙ 9% ΑΚΤΕΟΣΙΔΗ ΓΙΑ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ

Εισαγωγή

Η νεφρική ανεπάρκεια είναι μια καταστροφική επιπλοκή τουμόλυνση από COVID-19. Έως και το 50% των εισαγωγών σε νοσοκομεία και το 70% των εισαγωγών COVID-19 σε μονάδες εντατικής θεραπείας περιπλέκονται από οξεία νεφρική βλάβη (ΑΚΙ), η οποία με τη σειρά της αυξάνει τη θνησιμότητα κατά 30-50% (1, 2). Μια σειρά περιπτώσεων βιοψίας νεφρού αποκάλυψε ότι η καταρρέουσα σπειραματοπάθεια είναι η πιο κοινή ιστοπαθολογική διάγνωση σε AKI που σχετίζεται με τον COVID-19-(3). Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της καταρρέουσας σπειραματοπάθειας που σχετίζεται με τον COVID-19- (συντομογραφία COVAN) είναι η σχεδόν αποκλειστική προτίμηση για Αφροαμερικανούς ή Μαύρους που φέρουν δύο αλληλόμορφα κινδύνου της απολιποπρωτεΐνης L1 (APOL1) (3, 4). Τα δύο αλληλόμορφα κινδύνου (που ονομάζονται G1 και G2) εμφανίστηκαν ως κωδικοποιητικές παραλλαγές στο γονίδιο APOL1 και παρέχουν προστασία έναντι της αφρικανικής τρυπανοσωμίασης. Ωστόσο, η μεταφορά G1G1, G2G2 ή G1G2 (ονομάζονται γονότυποι υψηλού κινδύνου) αυξάνει τον κίνδυνο ενός φάσματος νεφρικής νόσου και εξηγεί μεγάλο μέρος του υπερβολικού κινδύνου μη διαβητικής νεφρικής νόσου μεταξύ των Αφροαμερικανών (5-8). Υπολογίζεται ότι το 13% των Αφροαμερικανών φέρει γονότυπους APOL1 υψηλού κινδύνου (7). Κατά τη διάρκεια της πανδημίας του COVID{30}}, μελέτες διαπίστωσαν ότι ένα αξιοσημείωτο 92% των περιπτώσεων COVAN που έχουν αποδειχθεί με βιοψία ήταν φορείς γονότυπου APOL1 υψηλού κινδύνου, το 61% των οποίων χρειάστηκε αιμοκάθαρση κατά την παρουσίαση (3, 9). Αυτά τα ευρήματα καθιερώνουν τις παραλλαγές APOL1 ως σημαντικό παράγοντα που συμβάλλει στη φυλετική ανισότητα στα αποτελέσματα υγείας του COVID{39}}. Παρά αυτήν την εντυπωσιακή συσχέτιση, ο κυτταρικός μηχανισμός που συνδέει τους γονότυπους APOL1 υψηλού κινδύνου με τη λοίμωξη SARS CoV-2 και η παθογένεια της καταρρέουσας σπειραματοπάθειας του COVAN παραμένει άγνωστη.

Η ισχυρή επιδημιολογική συσχέτιση μεταξύ του γονότυπου APOL1 υψηλού κινδύνου και του COVAN οδήγησε στην υπόθεση ότι ο COVID-19-προκάλεσε την έκφραση του APOL1 G1 ή G2 σε ποδοκύτταρα και σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα - τα νεφρικά κύτταρα επηρεάζονται στην κατάρρευση της σπειραματοπάθειας. COVAN. Αυτή η υπόθεση υποστηρίχθηκε από πρόσφατες αναφορές ότι η διαγονιδιακή υπερέκφραση των αλληλίων κινδύνου APOL1 σε ποδοκύτταρα ποντικού ή σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα προκάλεσε ποδοκυτταροπάθεια, ενδοθηλιοπάθεια, σπειραματοπάθεια και κλινικές εκδηλώσεις νεφρικής ανεπάρκειας (10-14). Αυτά τα μοντέλα ασθένειας ποντικού υποδηλώνουν ότι ο μηχανισμός που βασίζεται στην έκφραση APOL1 που προκαλείται από τον COVID{10}}θα ήταν ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για τον COVID-19. Ωστόσο, υπάρχουν δύο σημαντικά άγνωστα. Πρώτον, είναι άγνωστο εάν η έκφραση της πρωτεΐνης APOL1 ρυθμίζεται προς τα πάνω στα σπειράματα ασθενών με COVAN. Δεύτερον, είναι άγνωστο εάν ο SARS-CoV-2 επάγει την έκφραση APOL1 απευθείας με ιογενή μόλυνση των νεφρικών κυττάρων ή έμμεσα μέσω των επιπτώσεων της καταιγίδας κυτοκινών που προκαλείται από τον SARS-CoV-2-.

Η αποτυχία εντοπισμού του SARS-CoV-2 σεβιοψίες νεφρού COVANΟι ασθενείς παρέχουν έμμεση υποστήριξη για την υπόθεση ότι το COVAN πιθανότατα προκύπτει από τις επιδράσεις της καταιγίδας κυτοκινών παρά από την άμεση ιογενή μόλυνση του νεφρικού παρεγχύματος. Η περιστασιακή ανίχνευση ιικών σωματιδίων SARS-CoV-2 έχει γίνει σε δείγματα νεφρών αυτοψίας στα οποία δεν μπορούσε να αποκλειστεί η συγχυτική επίδραση της αυτόλυσης ιστών (3, 4, 15, 16). Αρκετές φλεγμονώδεις κυτοκίνες και χημειοκίνες έχουν σημειωθεί ότι ρυθμίζονται προς τα πάνω στοορός ασθενών με COVID-19και/ή COVAN (4, 17, 18). Αυτός ο κατάλογος περιλαμβάνει κυτοκίνες όπως ιντερφερόνες άλφα, βήτα, γάμμα και TNF που ήταν προηγουμένως γνωστό ότι ρυθμίζουν προς τα πάνω την έκφραση APOL1. Ωστόσο, ο κατάλογος περιλαμβάνει επίσης αρκετές φλεγμονώδεις κυτοκίνες που ρυθμίζονται σθεναρά από τη μόλυνση από τον COVID-19. Είναι άγνωστο εάν αυτές οι κυτοκίνες έχουν προσθετικές, συνεργικές ή ανταγωνιστικές επιδράσεις στην έκφραση της APOL1 και τη σχετική ποδοκυτταροπάθεια.

Στην τρέχουσα μελέτη, αντιμετωπίσαμε αυτά τα κενά γνώσης αξιοποιώντας βιοψίες νεφρού που ελήφθησαν από εννέα ασθενείς με COVAN και δύο ανθρώπινους νεφρούς ελέγχου για να διερευνήσουμε εάν και πού εκφράζεται η πρωτεΐνη APOL1 στο COVAN και στους νεφρούς ελέγχου. Κατασκευάσαμε προφίλ δεκαοκτώ-19-επαγώμενες από τον COVID-19 κυτοκίνες για να εντοπίσουμε οκτώ κυτοκίνες που ήταν επαρκείς, απουσία SARS-CoV-2, για να επάγουν συνεργικά την έκφραση APOL1 σε πρωτογενή ανθρώπινα σπειραματικά κύτταρα και να προκαλέσουν ποδοκυτταροπάθεια σε μικρο- οργανοειδή. Αυτή η μελέτη όχι μόνο προσφέρει την πρώτη απόδειξη σε ένα πειραματικό μοντέλο που προέρχεται από τον άνθρωπο ότι η καταιγίδα κυτοκίνης COVID-19 προκαλεί έκφραση APOL1 και ποδοκυτταροπάθεια, αλλά προσδιορίζει επίσης την κοινή οδό σηματοδότησης που μεσολαβεί στις παθογόνες επιδράσεις. Αυτή η μελέτη έχει επιπτώσεις που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τις στρατηγικές για τον έλεγχο και τη θεραπεία του COVID-19 σε μαύρους και ισπανόφωνους ασθενείς. Εγείρει ερωτήματα σχετικά με την ασφάλεια των συμπληρωματικών ιντερφερονών ως θεραπεία για τον COVID{10}} σε μαύρα και ισπανόφωνα άτομα που φέρουν γονότυπους APOL1 υψηλού κινδύνου (19, 20).

Αποτελέσματα

Η έκφραση APOL1 ρυθμίζεται προς τα πάνω στα ποδοκύτταρα και στα σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα ασθενών με COVAN. Για να διερευνήσουμε εάν οι ασθενείς με αποδεδειγμένη από βιοψία διάγνωση COVAN έχουν αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης APOL1 στα ποδοκύτταρα και τα σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα (GECs), πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική συν-χρώση του APOL1, της συναπτοποδίνης (μια πρωτεΐνη διαφοροποιημένων ποδοκυττάρων που σχετίζεται με την ακτίνη) και CD31 (ένας δείκτης ενδοθηλιακών κυττάρων) σε βιοψίες νεφρού δύο ασθενών με διάγνωση COVAN (Εικόνα 1). Η έκφραση APOL1 ήταν άφθονη στα σπειράματα και της περίπτωσης 1, η οποία υποβλήθηκε σε βιοψία δέκα μήνες μετά τη διάγνωση του COVID-19 (Εικόνα 1A-F) και της περίπτωσης 6, στην οποία υποβλήθηκε σε βιοψία εννέα ημέρες μετά τη διάγνωση του COVID{-19 (Εικόνα 1 G-L). Και στους δύο ασθενείς, υπήρχε έντονη χρώση APOL1 στα θετικά στη συναπτοποδίνη ποδοκύτταρα (βέλος· Εικόνα 1Β, Ε, Η και Κ) και κατά μήκος του CD31-θετικού σπειραματικού ενδοθηλίου (κεφαλή βέλους· Εικόνα 1C, F, I, και L ). Η παρουσία της πρωτεΐνης APOL1 σε ποδοκύτταρα και GEC σε περιόδους 9 ημέρες και 10 μήνες μετά τη διάγνωση της λοίμωξης COVID{-19 υποδηλώνει ότι η έκφραση APOL1 προκαλείται νωρίς και μπορεί να παραμείνει στα σπειράματα για αρκετούς μήνες, πολύ μετά την ενεργοποίηση του COVID{{{ 27}} η μόλυνση έχει επιλυθεί.

Η έκφραση APOL1 ρυθμίζεται προς τα πάνω στον βιοψικό ιστό των περιπτώσεων COVAN αλλά όχι στους ελέγχους. Για να αξιολογήσουμε περαιτέρω τη γενίκευση αυτών των ανοσοϊστοχημικών ευρημάτων, εντοπίσαμε συνολικά εννέα περιπτώσεις COVAN με διαθέσιμο ιστό βιοψίας για γονότυπο και IHC (Εικόνα 2) καθώς και δύο ασθενείς ελέγχου, συμπεριλαμβανομένου ενός ελέγχου νεκροψίας ασθενούς που είχε COVID{{2 }} λοίμωξη αλλά δεν ανέπτυξε AKI (Εικόνα 2Β και 2Γ). Τα κλασικά ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά του COVAN περιελάμβαναν κατάρρευση σπειραματικής τριχοειδούς τούφας με υπερτροφία και πολλαπλασιασμό παρακείμενων ποδοκυττάρων, συχνά με σταγονίδια επαναρρόφησης πρωτεΐνης των ποδοκυττάρων που σχετίζονται με σπειραματική πρωτεϊνουρία (Εύκολο Σχήμα 1 και Εύκαμπτο Σχήμα 2). Η χρώση APOL1 IHC απουσίαζε σε όλα τα σπειράματα των μαρτύρων (Εικόνα AC) αλλά υπήρχε στα σπειράματα και των εννέα ασθενών με COVAN (Εικόνα 2D-X). Η χρώση APOL1 ήταν άφθονη στο κυτταρόπλασμα των ποδοκυττάρων, των GECs και σε ορισμένα βρεγματικά επιθηλιακά κύτταρα (Εικόνα 2Ν, κατακερματισμένος κύκλος) (Εικόνα 1, Εικόνα 2 και Suppl Σχήμα 3). Η πρωτεΐνη APOL1 μπορεί να παρατηρηθεί σε σπειράματα με ανοιχτά τριχοειδή αγγεία καθώς και σε περιοχές σπειραματικής κατάρρευσης. Η φαινομενική παρουσία της πρωτεΐνης APOL1 μέσα σε κάποιο τριχοειδικό αυλό πιθανότατα αντιπροσώπευε την κυκλοφορούσα APOL1, η οποία παράγεται κυρίως από το ήπαρ (21). Επιπλέον, το APOL1 παρατηρήθηκε επίσης σε περισωληνάρια τριχοειδή αγγεία και σε τραυματισμένα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα (αστερίσκοι). Η ιδιαιτερότητα και η σημασία αυτού του τελευταίου ευρήματος είναι ασαφής. Συγκεκριμένα, επτά από τις εννέα περιπτώσεις COVAN έφεραν γονότυπο APOL1 υψηλού κινδύνου (Εικόνα 2D-V). Οι άλλες δύο περιπτώσεις, η περίπτωση 9 και η περίπτωση 4, έφεραν γονότυπους G{0G{0 χαμηλού κινδύνου (Εικόνα 2W και 2X). Παρά το γεγονός ότι ήταν γονότυπου χαμηλού κινδύνου, η έκφραση APOL1 της περίπτωσης 9 ήταν συγκρίσιμη με εκείνη των επτά περιπτώσεων υψηλού κινδύνου (Εικόνα 2W). Υπήρχαν μόνο δύο σπειράματα στην περίπτωση βιοψίας νεφρού 4 και η έκφραση APOL1 ήταν χαμηλότερη σε αυτά τα σπειράματα (Εικόνα 2Χ). Μαζί, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι η έκφραση APOL1 του βασικού νεφρού είναι χαμηλή στα σπειράματα ατόμων χωρίς σπειραματική βλάβη, ακόμη και όταν το άτομο έχει λοίμωξη από COVID-19. ενώ η έκφραση APOL1 ρυθμίζεται προς τα πάνω στα ποδοκύτταρα και τα GECs στο πλαίσιο του COVAN στο 89% των περιπτώσεων μας.

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, επτά από τους εννέα ασθενείς (77,8%) με αποδεδειγμένο με βιοψία COVAN αυτοπροσδιορίστηκαν ως Αφροαμερικανοί. Έξι από αυτούς τους επτά ασθενείς (85,7%) έφεραν γονότυπους APOL1 υψηλού κινδύνου (τέσσερις G1G1, ένας G1G2, ένας G2G2). Συγκριτικά, το 13% των Αφροαμερικανών φέρει γονότυπο APOL1 υψηλού κινδύνου. Οι υπόλοιποι δύο ασθενείς αυτοπροσδιορίστηκαν ως Λευκός Ισπανόφωνος, αλλά κυρίως, ο ένας από αυτούς έφερε επίσης γονότυπο APOL1 υψηλού κινδύνου. Συνολικά, επτά από τους εννέα ασθενείς με COVAN (77,8%) έφεραν γονότυπους APOL1 υψηλού κινδύνου. Η διάμεση ηλικία των κρουσμάτων ήταν 51 έτη (εύρος 37-60). Και οι εννέα περιπτώσεις ανέπτυξαν οξεία νεφρική βλάβη και είχαν διάφορους βαθμούς πρωτεϊνουρίας, που κυμαίνονταν από υπονεφρωσικό έως νεφρωσικό εύρος (1.4- 14 g/24 ώρες). Οι περισσότερες βιοψίες πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον 1 μήνα μετά τη μόλυνση με COVID{-19, με εξαίρεση την περίπτωση 6 που υποβλήθηκε σε βιοψία 9 ημέρες μετά τη θετική δοκιμασία PCR. Η βιοψία ενός ασθενούς δεν ακολούθησε παρά μόνο 10 μήνες μετά τη λοίμωξη λόγω της ελλιπούς ανάρρωσης. Και οι εννέα βιοψίες ασθενών εμφάνισαν καταρρέουσα σπειραματοπάθεια, σωληναριακό τραυματισμό και διάμεση φλεγμονή. Δεν παρατηρήθηκαν ενδοθηλιακά σωληναριακά δικτυωτά εγκλείσματα σε καμία από τις περιπτώσεις. Συγκεκριμένα, στις δύο βιοψίες COVAN που δοκιμάστηκαν για άμεση ιογενή λοίμωξη από SARS-CoV-2 με IHC και in situ υβριδισμό, δεν ανιχνεύθηκε ιός (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται).

Οι ανασυνδυασμένες κυτοκίνες που προκαλούνται από τον COVID-19-ρυθμίζουν συνεργιστικά την έκφραση APOL1 σε πρωτογενή ανθρώπινα σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα και ποδοκύτταρα. Για να διερευνήσουμε εάν η καταιγίδα κυτοκίνης-19-επαγόμενη από τον COVID είναι επαρκής για να πυροδοτήσει την έκφραση APOL1 σε ανθρώπινα σπειραματικά κύτταρα, καλλιεργήσαμε πρωτογενή ανθρώπινα ποδοκύτταρα που απομονώθηκαν από νεκρό νεφρό δότη και πρωτογενή ανθρώπινα σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα (GECs) σε 1 από 18 κυτοκίνες και χημειοκίνες στο παρελθόν αναφέρθηκε ότι είναι αυξημένος στον ορό ασθενών με SARS-CoV-2 (Εικόνα 3Α) (4, 17). Η ταυτότητα των ποδοκυττάρων επιβεβαιώθηκε με πολλαπλούς δείκτες ποδοκυττάρων συμπεριλαμβανομένου του όγκου Wilms 1, της συναπτοποδίνης, της νεφρίνης και της ποδοκαλυξίνης (Εικόνα 3Β και Suppl Σχήμα 4Α-Β). Η ταυτότητα GEC επιβεβαιώθηκε με έκφραση του PECAM1 σε σχέση μεανθρώπινο εμβρυϊκό νεφρό293 cells (HEK) (Figure 3C). Induced APOL1 expression was quantitated by qPCR and immunoblot after 48hr treatment in GECs (Figure 3D and 3F) and podocytes (Figure 3E and 3G). Consistent with prior report (22), we found that interferons (gamma > beta > alpha) robustly induced expression of APOL1 in both GECs and in podocytes. Similarly, we found that TNF also induced a modest APOL1 expression in GECs and podocytes. Unexpectedly, we found that three cytokines-IL-6, IL-1β, and IL-18, which were previously unrecognized as inducers of APOL1 expression, also individually induced modest APOL1 expression in GECs or podocytes. Notably, the combination of all 18 recombinant cytokines produced a synergistic upregulation of APOL1 that was an order of magnitude higher than that produced by any of the interferons alone (Figure 3D). These effects were not only observed with cytokine concentration of 50ng/mL (Figures 3D and 3E) but also at 20ng/mL and 10ng/mL (Supplemental Figure 5). Cytokine conditions inducing >1,5 φορές το αντίγραφο APOL1 σε σύγκριση με τον μάρτυρα που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μέσα αναλύθηκε περαιτέρω ως προς τη σημασία. Η σημασία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μη ζευγαρωμένο t-test με διόρθωση Holm-Sidak για πολλαπλές συγκρίσεις. Οι τιμές P που αναφέρονται είναι οι προσαρμοσμένες τιμές p. Αυτά τα αποτελέσματα επεκτείνουν τον κατάλογο των φυσιολογικών κυτοκινών που είναι ικανές να επάγουν έκφραση APOL1 πέρα ​​από τις καλά αναγνωρισμένες ιντερφερόνες και TNF. Είναι σημαντικό ότι τα ευρήματα υποδεικνύουν επίσης ότι η συνέργεια των κυτοκινών που προκαλούνται από τον COVID{10}μπορεί να είναι πιο σχετική για τη ρύθμιση της APOL1 παρά ο αντίκτυπος μιας απομονωμένης κυτοκίνης μόνο.

Μεσολαβεί η σηματοδότηση JAK-STATΈκφραση APOL1 που προκαλείται από την COVID-19-κυτοκίνη. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε εάν οι επαγόμενες από τον COVID{0}} κυτοκίνες ρυθμίζουν προς τα πάνω την έκφραση APOL1 μέσω μιας κοινής οδού ενδοκυτταρικής σηματοδότησης που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως θεραπευτικός στόχος. Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι η επαγωγή της APOL1 με ιντερφερόνη προκαλείται από το JAK-STAT1/2 (22, 23). Η σηματοδότηση μέσω του υποδοχέα IL-6 έχει αποδειχθεί ότι διαμεσολαβείται από το STAT3 και το IL{10}} και το TNF αναφέρεται ότι ενεργοποιούν έμμεσα το STAT3 (24, 25). Ενδιαφέρον, οι Meliambro et al ανέφεραν πρόσφατα ανοδική ρύθμιση της φωσφο-STAT3 στον ιστό βιοψίας μιας περίπτωσης COVAN και νεφροπάθειας που σχετίζεται με τον HIV (HIVAN) σε σύγκριση με τον έλεγχο (26). Με βάση αυτές τις βασικές πληροφορίες, υποθέσαμε ότι τα μονοπάτια JAK1/2-STAT1/2/3 είναι οι κύριοι μεσολαβητές των επιδράσεων των κυτοκινών που προκαλούνται από τον COVID-19-στην ώθηση της έκφρασης APOL1. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, προσδιορίσαμε την κατάσταση αυτών των μονοπατιών σηματοδότησης μετρώντας τα φωσφορυλιωμένα STAT1, 2 και 3 σε προϊόντα λύσης των GEC μετά από καλλιέργεια σε μεμονωμένες ή συνδυασμένες κυτοκίνες για 48 ώρες (Εικόνα 3F). Οι ιντερφερόνες τύπου Ι (IFN και IFN ) αύξησαν τη φωσφορυλίωση του STAT1-3 ενώ η IFN ρύθμισε προς τα πάνω τη φωσφορυλίωση των STAT 1 και 3. Η IL-1, η TNF και η IL-6 αύξησαν τη φωσφορυλίωση μόνο της STAT3. Οι συνδυασμένες κυτοκίνες αύξησαν τη φωσφορυλίωση του STAT1-3. Γνωρίζοντας ότι το JAK1 και το JAK2 είναι οι πρωτογενείς κινάσες πρωτεΐνης που φωσφορυλιώνουν το STAT1-3, υποθέσαμε ότι η αναστολή του JAK1/2 θα εμπόδιζε την έκφραση APOL1 που προκαλείται από "όλες τις κυτοκίνες". Σύμφωνα με αυτήν την πρόβλεψη, βρήκαμε ότι ένας ειδικός αναστολέας JAK1/{{44}, η βαρισιτινίμπη, μείωσε σημαντικά την έκφραση APOL1 mRNA και APOL1 από GEC που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κυτοκίνη και πρωτογενή ποδοκύτταρα (Εικόνα 3D G). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η σηματοδότηση JAK-STAT είναι η κύρια οδός που μεσολαβεί στην έκφραση APOL1 που προκαλείται από την COVID{51}}κυτοκίνη.

Οι επαγόμενες από τον COVID{0}}κυτοκίνες επαρκούν για να οδηγήσουν την έκφραση APOL1 σε μικροοργανοειδή νεφρών που προέρχονται από ανθρώπινο iPSC μέσω της οδού JAK-STAT. Το μικροοργανοειδές ανθρώπινου νεφρού είναι μια αποδεδειγμένη πλατφόρμα για τη μοντελοποίηση της ανθρώπινης νεφρικής νόσου και τη διευκόλυνση της κλινικής μετάφρασης. Ρωτήσαμε εάν τα αποτελέσματα που λάβαμε από πρωτογενή ανθρώπινα ποδοκύτταρα και GEC ήταν γενικεύσιμα και επικυρωμένα από ένα μοντέλο μικροοργανοειδών νεφρού που προέρχεται από τον άνθρωπο. Επομένως, δημιουργήσαμε μικροοργανοειδή νεφρών από επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs) ενός Αφροαμερικανού φορέα του γονότυπου G1G2 APOL1 για να διερευνήσουμε τη ρύθμιση, την έκφραση και τα αποτελέσματα του APOL1 σε αυτό το μοντέλο (Εικόνα 4Α). Καλλιεργήσαμε μικροοργανοειδή νεφρού σε IFN 10ng/mL ή σε συνδυασμό οκτώ κυτοκινών (IFN , IFN , IFN , IL-18, IL-8, IL{-6, TNF, IL{{18 }}) το καθένα στα 10 ng/mL είτε απουσία είτε παρουσία baricitinib, 10 μΜ για 24 ώρες. Αυτές οι οκτώ κυτοκίνες επιλέχθηκαν λόγω της παρατηρούμενης ρύθμισης της έκφρασης APOL1 στα προηγούμενα πειράματα. Τα ποδοκύτταρα και τα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα στα μικροοργανοειδή των νεφρών επιβεβαιώθηκαν με δείκτη (Εικόνα 4Β). Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία (27), τα ενδοθηλιακά κύτταρα υποεκπροσωπούνται στα μικροοργανοειδή των νεφρών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανακαλύψαμε ότι η έκφραση της βασικής πρωτεΐνης APOL1 ήταν χαμηλή σε μικροοργανοειδή. Η θεραπεία με IFN προκάλεσε ουσιαστική έκφραση APOL1, με την υψηλότερη ένταση να συνεντοπίζεται στις περιοχές του δείκτη ποδοκυττάρων, της ποδοκαλυξίνης. Το κοκτέιλ των κυτοκινών προκάλεσε μια υπερμεγέθη και ισχυρή έκφραση APOL1 σε όλη τη δομή των μικροοργανοειδών σε σύγκριση με άλλες θεραπείες. Οι ομάδες που έλαβαν θεραπεία με IFN συν baricitinib και όλες οι κυτοκίνες συν baricitinib δεν έδειξαν έκφραση APOL1, σύμφωνα με την πλήρη αναστολή της δράσης της κυτοκίνης. Η έκφραση APOL1 στα νεφρικά μικροοργανοειδή ποδοκύτταρα θύμιζε εκείνη που παρατηρήθηκε στα ποδοκύτταρα ασθενών με COVAN. Ωστόσο, σε αντίθεση με τους νεφρούς COVAN στους οποίους δεν παρατηρήθηκε σημαντική έκφραση APOL1 σε υγιή σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα, τα νεφρικά μικροοργανοειδή σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα θετικά στην E-Cadherin εξέφρασαν APOL1. Αυτή η διαφορά θα μπορούσε να οφείλεται σε διαφορές στους υποδοχείς κυτοκίνης της μεμβράνης ή σε επιγενετικούς παράγοντες που επηρεάζουν την έκφραση πρωτεΐνης στα ανώριμα σωληνάρια των μικροοργανοειδών του νεφρού. Συνοπτικά, τα ανθρώπινα μικροοργανοειδή νεφρού που προέρχονται από το iPSC που καλλιεργήθηκαν με κυτοκίνες επαγόμενες από τον COVID-19-εμφανίζουν ισχυρή ανοδική ρύθμιση της παθογόνου πρωτεΐνης G1G2 APOL1 και η έκφραση μπλοκαρίστηκε με την αναστολή της σηματοδότησης JAK-STAT.

Η επαγόμενη από κυτοκίνη σηματοδότηση JAK-STAT-APOL1 μείωσε τη βιωσιμότητα των νεφρικών μικροοργανοειδών ποδοκυττάρων που διασώθηκαν από τον αναστολέα JAK. Τέλος, ρωτήσαμε εάν το G1G2 APOL1 που εκφράζεται σε μικροοργανισμούς των νεφρών βλάπτει τη βιωσιμότητα των ποδοκυττάρων. Υποθέσαμε ότι η παραλλαγμένη πρωτεΐνη APOL1 που προκαλείται από κυτοκίνη θα προκαλούσε απώλεια ποδοκυττάρων - χαρακτηριστικό φαινότυπο του COVAN. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, απομονώσαμε ποδοκύτταρα από μικροοργανοειδή νεφρών που παράγονται από iPSC ενός φορέα του G1G2. Τα ποδοκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε IFN (10 ng/mL), ή σε συνδυασμό οκτώ κυτοκινών (10 ng/mL η καθεμία), τόσο παρουσία όσο και απουσία βαρισιτινίμπης (10 μΜ) για 96 ώρες (Εικόνα 5Α και Β). Η θεραπεία με κυτοκίνη προκάλεσε σθεναρά την έκφραση APOL1 και αυτή η έκφραση μπλοκαρίστηκε από τη βαρισιτινίμπη, σύμφωνα με τα προηγούμενα πειράματά μας (Εικόνα 5Γ). Ομοίως, η θεραπεία με κυτοκίνη προκάλεσε σημαντική απώλεια ποδοκυττάρων, όπως υποδεικνύεται από τη δοκιμασία βιωσιμότητας και το ολικό κυτταρικό ΑΤΡ (Εικόνα 5Δ και 5Ε). Αξιοσημείωτο είναι ότι η βαρισιτινίμπη διέσωσε πλήρως την απώλεια ποδοκυττάρων που προκλήθηκε από κυτοκίνη. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι οι κυτοκίνες που προκαλούνται από τον COVID-19-πυροδοτούν τη σηματοδότηση JAK-STAT-APOL1, η οποία με τη σειρά της προκαλεί τραυματισμό και απώλεια των ποδοκυττάρων. Η προστατευτική επίδραση της αναστολής JAK στη βιωσιμότητα των ποδοκυττάρων υποστηρίζει έντονα αυτήν την υπόθεση.

Συζήτηση

Τα κύρια συμπεράσματα της τρέχουσας μελέτης είναι ότι αρκετές κυτοκίνες που προκαλούνται από τον COVID-19-εκτός από τις ιντερφερόνες δρουν συνεργικά μέσω της σηματοδότησης JAK-STAT για να οδηγήσουν την παθογόνο έκφραση APOL1, με αποτέλεσμα τον τραυματισμό και την απώλεια των ποδοκυττάρων που εμποδίζεται από την αναστολή του JAK. Με βάση μια σειρά περιπτώσεων, αποδεικνύουμε για πρώτη φορά ότι η πρωτεΐνη APOL1 εκφράζεται σε αφθονία στα ποδοκύτταρα και τα GEC ασθενών που έχουν διαγνωστεί με COVID-19 αλλά όχι στα σπειράματα υγιών ελέγχων ούτε στα θετικά για COVID-19- COVAN-αρνητικός έλεγχος. Σε τρία πειραματικά μοντέλα, αποδεικνύουμε ότι οι ανασυνδυασμένες κυτοκίνες που ρυθμίζονται προς τα πάνω στη λοίμωξη COVID-19 είναι επαρκείς για να οδηγήσουν σε ισχυρή έκφραση APOL1 και απροσδόκητα, ότι η ισχυρή συνεργία που παράγεται από έναν συνδυασμό κυτοκινών προκλήθηκε κυρίως μέσω μιας κοινής ενδοκυτταρικής οδού σηματοδότησης. Συλλογικά, τα πειραματικά μας στοιχεία υποστηρίζουν σθεναρά μια αιτιώδη σχέση μεταξύ της επαγόμενης από κυτοκίνη σηματοδότησης JAK-STAT-APOL1 και του in vivo σπειραματικού φαινοτύπου COVAN και υποστηρίζουν περαιτέρω έρευνα σε αυτόν τον θεραπευτικό στόχο.

Η αυξημένη συχνότητα του γονότυπου APOL1 υψηλού κινδύνου (77,8%) μεταξύ των ασθενών με COVAN που αναφέρουμε εδώ συσχετίζεται με μια πρόσφατη διεθνή πολυκεντρική ανασκόπηση παθολογίας που ανέφερε γονότυπο APOL1 υψηλού κινδύνου στο 91,7% των ασθενών με COVAN (3). Δεδομένου ότι η συχνότητα του υψηλού κινδύνου γονότυπου APOL1 στον γενικό πληθυσμό της Αφρικής Αμερικής είναι 13% (28), η ανακάλυψη μιας συχνότητας 77-90% στο COVAN είναι βαθιά και συγκρίσιμη με τη συχνότητα 60-70% που αναφέρεται στο Νεφροπάθεια που σχετίζεται με τον HIV (HIVAN) (28-31). Η ύπαρξη του υπόλοιπου 20-30% των περιπτώσεων COVAN (και HIVAN) που δεν φέρουν γονότυπους υψηλού κινδύνου APOL1 υποδηλώνει την πιθανότητα ενός ανεξάρτητου παθομηχανισμού APOL{{{2{{{0}} ή την πιθανότητα ότι σε ορισμένες περιπτώσεις Η επαγόμενη από τον COVID-19-υπερφυσιολογική έκφραση του G0 APOL1 μπορεί επίσης να προκαλέσει ποδοκυτταροπάθεια. Η ανάλυση αυτών των δυνατοτήτων θα απαιτήσει περαιτέρω μελέτες. Ωστόσο, δείξαμε προηγουμένως σεανθρώπινο εμβρυϊκό νεφρόΚύτταρα (HEK) με σύστημα έκφρασης APOL1 που επάγεται από τετρακυκλίνη, το οποίο η κυτταροτοξικότητα του APOL1 εξαρτάται τόσο από την παραλλαγή όσο και από τη δόση (32, 33). Η δοσοεξαρτώμενη κυτταροτοξικότητα της APOL1 αναφέρθηκε επίσης από άλλους ερευνητές σε παρόμοια συστήματα που βασίζονται σε κύτταρα (34). Επιπλέον, τα μοντέλα διαγονιδιακών ποντικών APOL1 όχι μόνο έχουν επικυρώσει την αιτιώδη σχέση μεταξύ των αλληλόμορφων κινδύνου APOL1 και του τραυματισμού των ποδοκυττάρων, αλλά έχουν δείξει ότι ο βαθμός της ποδοκυτταροπάθειας συσχετίζεται με τα επίπεδα έκφρασης APOL1 (10, 12-14, 35) . Η ανακάλυψή μας ότι οκτώ από τις εννέα περιπτώσεις COVAN έδειξαν ισχυρή σπειραματική έκφραση APOL1 σε σχέση με τους μάρτυρες και η απόδειξη ότι η έκφραση ενδογενών αλληλόμορφων κινδύνου APOL1 προκαλεί ποδοκυτταροπάθεια σε μικροοργανοειδή ανθρώπινου νεφρού υποστηρίζει την αιτιολογική σχέση μεταξύ APOL1 και ποδοκυτταροπάθειας. Αντίθετα, η έλλειψη APOL1 στα σπειράματα του COVID-19 θετικό αλλά αρνητικό για AKI G0G0 έλεγχος νεκροψίας υποδηλώνει ότι η λοίμωξη από COVID{-19 χωρίς επαγωγή APOL1 δεν είναι επαρκής οδηγόςΝόσος COVAN.