Απομόνωση ενός εκχυλίσματος από τον συμβιωτικό μικροοργανισμό μαλακών κοραλλιών Salinispora Arenicola που ασκεί κυτταροπροστατευτικά και αντιγηραντικά αποτελέσματα Μέρος 1

Αφηρημένη: Τα κύτταρα έχουν αναπτύξει ένα εξαιρετικά ολοκληρωμένο σύστημα υπεύθυνο για τη σταθερότητα του πρωτεώματος, δηλαδή το δίκτυο πρωτεόστασης (PN). Καθώς η απώλεια της πρωτεόστασης είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα της γήρανσης και των ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία, η ενεργοποίηση των μονάδων PN μπορεί πιθανότατα να επεκτείνει το διάστημα της υγείας. Εδώ, παρουσιάζουμε δεδομένα σχετικά με τη βιοδραστικότητα ενός εκχυλίσματος (SA223-S2BM) που καθαρίστηκε από το στέλεχος Salinispora arenicola TM223-S2 που απομονώθηκε από το μαλακό κοράλλι Scleronephthya lewinsohni. αυτό το κοράλλι συλλέχτηκε σε βάθος 65 μέτρων από το μεσοφωτικό οικοσύστημα της Ερυθράς Θάλασσας EAPC (νότιο Εϊλάτ, Ισραήλ). Η επεξεργασία ανθρώπινων κυττάρων με πρωτεοστατικές μονάδες ενεργοποιούμενες από SA223-S2BM μείωσε το οξειδωτικό φορτίο και παρείχε προστασία έναντι του οξειδωτικού και γονιδιοτοξικού στρες. Επιπλέον, το SA{9}}S2BM ενίσχυσε τις δραστηριότητες πρωτεασώματος και λυσοσωμικών καθεψινών στις μύγες Drosophila και παρουσίασε προστατευτικά αποτελέσματα του δέρματος, όπως αποδεικνύεται από την αποτελεσματική αναστολή των ενζύμων, της ελαστάσης και της τυροσινάσης που σχετίζονται με τη γήρανση του δέρματος. Προτείνουμε ότι το εκχύλισμα SA{13}}S2BM αποτελεί μια πιθανώς πολλά υποσχόμενη πηγή για την ιεράρχηση μορίων με αντιγηραντικές ιδιότητες.

Ο γλυκοσίδης του cistanche μπορεί επίσης να αυξήσει τη δραστηριότητα του SOD στους ιστούς της καρδιάς και του ήπατος και να μειώσει σημαντικά την περιεκτικότητα σε λιποφουσκίνη και MDA σε κάθε ιστό, καθαρίζοντας αποτελεσματικά διάφορες δραστικές ρίζες οξυγόνου (OH-, H2O2, κ.λπ.) και προστατεύοντας από βλάβη του DNA που προκαλείται από ρίζες ΟΗ. Οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες του Cistanche έχουν ισχυρή ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών, υψηλότερη αναγωγική ικανότητα από τη βιταμίνη C, βελτιώνουν τη δραστηριότητα του SOD στο εναιώρημα σπέρματος, μειώνουν την περιεκτικότητα σε MDA και έχουν μια ορισμένη προστατευτική δράση στη λειτουργία της σπερματικής μεμβράνης. Οι πολυσακχαρίτες Cistanche μπορούν να ενισχύσουν τη δραστηριότητα των SOD και GSH-Px σε ερυθροκύτταρα και πνευμονικούς ιστούς πειραματικά γηρασμένων ποντικών που προκαλούνται από D-γαλακτόζη, καθώς και να μειώσουν την περιεκτικότητα σε MDA και κολλαγόνο στους πνεύμονες και στο πλάσμα και να αυξήσουν την περιεκτικότητα σε ελαστίνη. ένα καλό αποτέλεσμα σάρωσης στο DPPH, παρατείνει το χρόνο της υποξίας σε γηρασμένα ποντίκια, βελτιώνει τη δραστηριότητα του SOD στον ορό και καθυστερεί τον φυσιολογικό εκφυλισμό του πνεύμονα σε πειραματικά γηρασμένα ποντίκια Με τον κυτταρικό μορφολογικό εκφυλισμό, τα πειράματα έχουν δείξει ότι το Cistanche έχει την καλή αντιοξειδωτική ικανότητα και έχει τη δυνατότητα να είναι φάρμακο για την πρόληψη και τη θεραπεία ασθενειών της γήρανσης του δέρματος. Ταυτόχρονα, η εχινακοσίδη στο Cistanche έχει σημαντική ικανότητα να καθαρίζει τις ελεύθερες ρίζες DPPH και έχει την ικανότητα να καθαρίζει δραστικά είδη οξυγόνου και να αποτρέπει την αποικοδόμηση του κολλαγόνου που προκαλείται από ελεύθερες ρίζες, και έχει επίσης μια καλή επίδραση επιδιόρθωσης στη βλάβη των ανιόντων από τις ελεύθερες ρίζες θυμίνης.

Κάντε κλικ στο cistanches herba

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Λέξεις-κλειδιά: γήρανση; αντιοξειδωτικές αποκρίσεις? θαλάσσιος μικροοργανισμός; δίκτυο πρωτεόστασης; Salinispora arenicola

1. Εισαγωγή

Η γήρανση χαρακτηρίζεται από μια χρονικά εξαρτώμενη μείωση της λειτουργικής ικανότητας και της αντοχής στο στρες, καθώς και από αυξημένα ποσοστά θνησιμότητας και νοσηρότητας [1]. Η γήρανση δεν είναι απλώς μια παθητική διαδικασία, καθώς ρυθμίζεται από εξελικτικά διατηρημένα μοριακά και κυτταρικά συμβάντα σηματοδότησης [2,3]. Οι οργανισμοί αμφισβητούνται συνεχώς τόσο από εσωτερικούς (σχετιζόμενους με το μεταβολισμό) όσο και από εξωτερικούς (προερχόμενους από τη διατροφή ή το περιβάλλον) στρεσογόνους παράγοντες, οι οποίοι μπορούν να οδηγήσουν στη σταδιακή συσσώρευση κατεστραμμένων βιομορίων και τελικά να θέσουν σε κίνδυνο την κυτταρική ομοιόσταση [4,5]. Οι πρωτεΐνες εμπλέκονται σε όλες τις βασικές κυτταρικές λειτουργίες και ως εκ τούτου, η ομοιόσταση του πρωτεώματος (πρωτεόσταση) είναι κρίσιμη για την κυτταρική λειτουργικότητα και την επιβίωση [6].

Η ακεραιότητα του πρωτεώματος διατηρείται από το δίκτυο πρωτεόστασης (PN), το οποίο εκτείνεται σε όλα τα υποκυτταρικά διαμερίσματα και ρυθμίζεται σε κυτταρικό, ιστό και επίπεδο οργανισμού για να εξασφαλίσει την υγεία και τη μακροζωία του οργανισμού [7]. Η διατήρηση της πρωτεόστασης απαιτεί από τα κύτταρα να συντονίζουν και να ρυθμίζουν τις λειτουργίες σύνθεσης, αναδίπλωσης, ταξινόμησης, μεταφοράς και αποικοδόμησης όλων των πολυπεπτιδίων [8,9]. Αυτές οι κυτταρικές λειτουργίες εκτελούνται ως επί το πλείστον από τρεις κύριους διασυνδεδεμένους κλάδους του PN, δηλαδή το δίκτυο των μοριακών συνοδών, τα πρωτεολυτικά μονοπάτια ουβικιτίνης-πρωτεάσωμα-(UPP) και αυτοφαγίας-λυσοσώματος-(ALP) [10,11].

Οι μοριακές συνοδούς εξασφαλίζουν σωστή αναδίπλωση πρωτεϊνών και διαμορφωτική συντήρηση, και επίσης συνεργάζονται με τις οδούς αποδόμησης [12]. Η UPP είναι η κύρια τοποθεσία ποιοτικού ελέγχου της πρωτεϊνικής σύνθεσης και εμπλέκεται στην ανακύκλωση κανονικών πρωτεϊνών βραχείας διάρκειας και μη επισκευάσιμων πρωτεϊνών που έχουν διπλωθεί ή ξεδιπλωθεί [6], ενώ η ALP είναι υπεύθυνη για την αναγνώριση και την απομάκρυνση των συσσωματωμάτων πρωτεΐνης και των κατεστραμμένων οργανιδίων [13]. Η απώλεια της πρωτεόστασης είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα της γήρανσης [14], καθώς και ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου για πολλές ανθρώπινες παθολογίες που σχετίζονται με την ηλικία, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου, του διαβήτη, των καρδιαγγειακών διαταραχών και των νευροεκφυλιστικών ασθενειών [15]. Ως εκ τούτου, η ενεργοποίηση του PN θεωρείται μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την καθυστέρηση της εμφάνισης ή/και της εξέλιξης της γήρανσης και των ασθενειών που σχετίζονται με την ηλικία [16-18].

Η γήρανση του δέρματος χαρακτηρίζεται από δομικές και λειτουργικές αλλαγές (μεταξύ άλλων) σε συστατικά της εξωκυτταρικής μήτρας, όπως η ελαστίνη [19]. Η ελαστάση είναι το ένζυμο που εμπλέκεται στην αποικοδόμηση της ελαστίνης, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη ρυτίδων και την απώλεια της ελαστικότητας [20]. Η τυροσινάση είναι ένα βασικό ένζυμο στη σύνθεση μελανίνης, το οποίο είναι υπεύθυνο για τη μελάγχρωση (μεταξύ άλλων) του ανθρώπινου δέρματος [21,22]. Ωστόσο, η υπερβολική ενεργοποίηση της τυροσινάσης σχετίζεται με αρκετές δερματικές διαταραχές, όπως η υπερμελάγχρωση και το μελάνωμα[22,23]. Ως εκ τούτου, η αναστολή της ελαστάσης και της τυροσινάσης αποτελούν μια εξέχουσα προσέγγιση κατά της γήρανσης του δέρματος.

Τα φυσικά προϊόντα (NPs) έχουν μακρά ιστορία - καλά τεκμηριωμένη, πριν από τη γέννηση της σύγχρονης επιστήμης και τεχνολογίας, σε διάφορους πολιτισμούς - στη θεραπεία ανθρώπινων ασθενειών [24-26]. Έτσι, τα NPs μπορούν να χρησιμεύσουν ως εξαιρετικά εμπλουτισμένα αρχικά υλικά και ικριώματα για την ανάπτυξη φαρμάκων. Πράγματι, πάνω από τα μισά από όλα τα φάρμακα είναι είτε NPs, είτε προερχόμενα από NPs είτε εμπνευσμένα από NPs [27-29]. Ο θαλάσσιος κόσμος, ο οποίος φιλοξενεί τη μεγαλύτερη βιοποικιλότητα, είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητος και επομένως μπορεί να είναι ο μεγαλύτερος πόρος για την ανακάλυψη νέων NP [30]. Μεταξύ των οργανισμών που ζουν σε θαλάσσια περιβάλλοντα, τα μαλακά κοράλλια είναι πολλά υποσχόμενοι προμηθευτές βιοδραστικών NP και είναι γνωστό ότι φιλοξενούν πολλούς διαφορετικούς μικροοργανισμούς [31,32].

Δεδομένων αυτών των γεγονότων, εκτελούμε επί του παρόντος έναν εκτεταμένο έλεγχο υψηλής απόδοσης των NP για τον εντοπισμό βιοδραστικών μορίων που θα μπορούσαν ενδεχομένως να καθυστερήσουν τη γήρανση των κυττάρων ή/και τη γήρανση in vivo. Στη μελέτη που παρουσιάζεται εδώ, εξετάσαμε ένα μεθανολικό εκχύλισμα, συγκεκριμένα SA223-S2BM, του στελέχους Salinispora arenicola (S. arenicola) TM223-S2 εφαρμόζοντας in vitro δοκιμές, καθώς και με βάση τα κύτταρα και in vivo βιο-καθοδηγούμενες προσεγγίσεις. Το στέλεχος S. arenicola TM223-S2 απομονώθηκε από το μαλακό κοράλλι Scleronephthya lewinsohni (S. Levinson) (αρχικά ονομάστηκε ως Scleronephthya lewinsohni από τους Verseveldt and Benayahu, 1978), το οποίο ελήφθη με βιώσιμο τρόπο από το μεσοφωτικό EAPC eAP νότιο Εϊλάτ, Ισραήλ) σε βάθος 65 μ. Το μεθανολικό εκχύλισμα SA{11}}S2BM ενεργοποίησε κυτταροπροστατευτικούς μηχανισμούς τόσο σε ανθρώπινα κύτταρα όσο και σε μύγες Drosophila melanogaster (D. melanogaster) και άσκησε in vitro προστατευτικές ιδιότητες του δέρματος. Επομένως, το εκχύλισμα SA{13}}S2BM θα μπορούσε να είναι η πηγή για την πιθανή ταυτοποίηση μορίων με πιθανές κυτταροπροστατευτικές και αντιγηραντικές ιδιότητες.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. SA223-Προέλευση και απομόνωση του εκχυλίσματος S2BM

2.1.1. Συλλογή Κοραλλιών

Το μαλακό κοράλλι S. Levinson συλλέχτηκε από ένα ROV H800 (ECA Robotics) που χειριζόταν ο Sam Rothberg R/V του Διαπανεπιστημιακού Ινστιτούτου Θαλάσσιων Επιστημών στο Eilat (IUI). Επί τόπου, η φωτογράφιση πραγματοποιήθηκε από μια ασπρόμαυρη κάμερα χαμηλού φωτισμού VS300 (ECA Robotics) και μια κάμερα 1CAM Alpha HD (SubC Imaging). Λήφθηκαν δείγματα από τον βραχίονα ROV από τον μεσοφωτικό ύφαλο του Eilat, από τον τερματικό σταθμό της προβλήτας πετρελαίου (29◦300 47.0900 N, 34◦350 56.7100 E), στα 65 m, στις 7 Μαρτίου 2017. Ο χώρος συλλογής χαρακτηρίζεται από μέτρια κλίση με βραχώδη τμήματα που περιβάλλονται από αμμώδη βυθό. Κατά τη συλλογή, το υλικό καταψύχθηκε αμέσως στους -80 ◦C. Ένα δείγμα κουπονιού διατηρήθηκε σε αιθανόλη 70 τοις εκατό για ταξινομική ταυτοποίηση και κατατέθηκε στο Μουσείο Φυσικής Ιστορίας Steinhardt, Πανεπιστήμιο του Τελ Αβίβ (SMNHTAU_Co_37500).

2.1.2. Απομόνωση και ταυτοποίηση στελέχους

Το S. arenicola TM223-S2 απομονώθηκε από ένα δείγμα 1 mL του S. Levinson. Το συλλεγμένο δείγμα μαλακού κοραλλιού αλέστηκε σε αποστειρωμένο θαλασσινό νερό και θερμάνθηκε στους 50 ◦C για 1 ώρα. Το προκύπτον εναιώρημα αραιώθηκε σειριακά, απλώθηκε σε μέσο εκλεκτικής απομόνωσης άγαρ και επωάστηκε στους 28 ◦C για τουλάχιστον 6 εβδομάδες. Το στέλεχος Salinispora απομονώθηκε και η αποικία καθαρίστηκε σε άγαρ θαλάσσιου ζωμού (MBA) (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ΗΠΑ) και διατηρήθηκε στους -20 ◦C σε διάλυμα γλυκερίνης 10 τοις εκατό.

2.1.3. Έρευνα Φυλογένεσης

Η φυλογονική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα θραύσμα του γονιδίου 16S rRNA που ενισχύθηκε από το γονιδιωματικό DNA του S. arenicola TM223-S2. Το γονιδιωματικό DNA του στελέχους TM223-S2 απομονώθηκε χρησιμοποιώντας κιτ DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το θραύσμα ριβοσωματικού RNA 16S ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές 16S F 27, AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG (Tm: 56,3 ◦C) και 16S R 1492, TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG ACT T ( Tm: 57,5 ​​◦C). Τα αμπλικόνια αλληλουχήθηκαν με προσδιορισμό αλληλουχίας Sanger και οι αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν με τη βάση δεδομένων ριβοσωμικού RNA 16S του έργου Targeted Loci του NCBI χρησιμοποιώντας MUSCLE. Η ευθυγράμμιση επιθεωρήθηκε χειροκίνητα και αφαιρέθηκαν τα κενά. Το εξελικτικό ιστορικό συνήχθη χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μέγιστης πιθανότητας και το μοντέλο Tamura-Nei [33] με 1000 επαναλήψεις. Το αρχικό δέντρο για την ευρετική αναζήτηση λήφθηκε αυτόματα με την εφαρμογή αλγορίθμων γειτονικής σύνδεσης και BioNJ σε έναν πίνακα αποστάσεων κατά ζεύγη που υπολογίζονται χρησιμοποιώντας την προσέγγιση μέγιστης σύνθετης πιθανότητας (MCL) και στη συνέχεια επιλέγοντας την τοπολογία με ανώτερη τιμή log realihood. Οι εξελικτικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στην έκδοση 10.1.7 του MEGA X [34].

2.1.4. Συνθήκες Καλλιέργειας

Τα σπόρια S. arenicola TM{0}}S2 διατηρήθηκαν στους -20 ◦C σε 10 τοις εκατό γλυκερόλη. Πριν από την καλλιέργεια, το στέλεχος αναζωογονήθηκε για 15 ημέρες σε μια πλάκα Petri 15 cm που περιείχε MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) συμπληρωμένο με 2 τοις εκατό άγαρ (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA , ΗΠΑ). Αποστειρωμένο θαλασσινό νερό (4 χ 10 mL) χύθηκε στην επιφάνεια της πλάκας και τα σπόρια και το μυκήλιο ανακτήθηκαν από την πλάκα με απαλό ξύσιμο της επιφάνειας με νυστέρι για να δημιουργηθεί το εμβόλιο. Η ζύμωση υγρής κατάστασης (LSF) διεξήχθη σε φιάλη Erlenmeyer των 2 L για 20 ημέρες στους 28 ◦C και ανάδευση 130 rpm. Η ρητίνη Amberlite XAD16 (30 g/L) (Amberlite XAD16HP N, Certis, Lenntech, Delfgauw, Ολλανδία) προστέθηκε πριν από την αποστείρωση για να επιτραπεί η in situ παγίδευση των μικροβιακών μεταβολιτών. Πέντε χιλιοστόλιτρα του εμβολίου χρησιμοποιήθηκαν για τον εμβολιασμό 1 L σε ΜΒ που περιείχε 30 g ρητίνης Amberlite XAD16. Η ζύμωση σε κατάσταση άγαρ σε συνδυασμό με εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) [35] πραγματοποιήθηκε σε μέσο MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) συμπληρωμένο με 2 τοις εκατό άγαρ (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ΗΠΑ) για 20 ημέρες στους 28 ◦C. Αποστειρωμένο Amberlite XAD16 (35 g) αναμεμειγμένο με 35 mL εμβολίου απλώθηκε ομοιογενώς στην επιφάνεια πλάκας Petri άγαρ 1 MB (25 cm χ 25 cm).

Για το LSF, η ρητίνη XAD16 διαχωρίστηκε από την καλλιέργεια ζωμού μέσω διήθησης και πλύθηκε με νερό πριν εκλουσθεί με οξικό αιθυλεστέρα (100 mL) και στη συνέχεια με μεθανόλη (100 mL). Τα εκλούσματα συμπυκνώθηκαν μέχρι ξηρού υπό κενό και διαλυτοποιήθηκαν σε DMSO σε συγκέντρωση 10 mg/mL. Το προκύπτον εκχύλισμα, SA223-S2LAE (εκχυλίστηκε με χρήση οξικού αιθυλεστέρα), χρησιμοποιήθηκε για βιολογικές αξιολογήσεις.

Για το SPE, η ρητίνη XAD16 ανακτήθηκε ξύνοντας προσεκτικά την επιφάνεια της πλάκας άγαρ. Η ανακτηθείσα ρητίνη πλύθηκε με νερό για να εξαλειφθεί η βιομάζα πριν εκλουσθεί με οξικό αιθυλεστέρα (100 mL) και στη συνέχεια με μεθανόλη (100 mL). Τα εκλούσματα συμπυκνώθηκαν μέχρι ξηρού υπό κενό και διαλυτοποιήθηκαν σε DMSO σε συγκέντρωση 10 mg/mL. Τα εκχυλίσματα που προέκυψαν, SA{4}}S2BAE (εκχυλίστηκε με χρήση οξικού αιθυλεστέρα) και SA223-S2BM (εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας μεθανόλη), χρησιμοποιήθηκαν για βιολογικές αξιολογήσεις.

2.2. Ανασταλτικές Δραστηριότητες Ελαστάσης και Τυροσινάσης

Η ανασταλτική δράση ελαστάσης του εκχυλίσματος με προτεραιότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ελαστάση από πάγκρεας χοίρου (PPE) τύπου IV (Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία) και το υπόστρωμα N-ηλεκτρυλο-Ala-Ala-Ala-p-νιτροανιλίδιο (Merck KGaA, Darmstadt, Γερμανία), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, προσδιορίστηκε η ικανότητα του εκχυλίσματος να αναστέλλει την καταλυτική δράση της τυροσινάσης στην οξείδωση του L-DOPA σε ντόπαχρωμα [37].

2.3. Κυτταρικές Σειρές, Συνθήκες Κυτταρικής Καλλιέργειας και Δοκιμασία Κυτταρικής Βιωσιμότητας

Οι ανθρώπινοι ινοβλάστες ακροποσθίας (κύτταρα BJ) αγοράστηκαν από την American Tissue Culture Collection (ATCC), ενώ ανθρώπινα αθανατοποιημένα κερατινοκύτταρα (κύτταρα HaCaT) ελήφθησαν από την Elabscience, Inc. Και οι δύο κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEMsher) (Ther) Scientific Inc., Waltham, MA, USA) συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό (v/v) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και 1 τοις εκατό (v/v) μη βασικά αμινοξέα και διατηρήθηκαν σε συνθήκες 5 τοις εκατό CO2, 95 τοις εκατό υγρασία και 37 ◦C. Σε όλες τις πειραματικές διαδικασίες που εφαρμόστηκαν, τα κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα θρυψίνης/ΕϋΤΑ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ). Η επίδραση του εκχυλίσματος SA223-S2BM στη βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MTT, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [38]. Η κυτταρική επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) και δοξορουβικίνη (DXR) διεξήχθη όπως περιγράφεται στα θρυλικά σχήματα. Το H2O2 και το DXR ελήφθησαν από τη Merck KGaA (Darmstadt, Γερμανία).

2.4. Drosophila Lines and Longevity Assay

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το στέλεχος Drosophila w1118 που αγοράστηκε από το Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN, ΗΠΑ). Οι μύγες διατηρήθηκαν στους 25 ◦C και 60 τοις εκατό υγρασία σε κύκλο φωτός 12 ωρών: 12 ωρών σκότους. Σε όλα τα πειράματα που παρουσιάστηκαν, αναλύθηκαν μόνο σωματικοί ιστοί (κεφάλι και θώρακας) μυγών, καθώς οι αναπαραγωγικοί ιστοί εμφανίζουν διακριτή ρύθμιση των πρωτεοστατικών μηχανισμών και ρυθμούς γήρανσης σε σύγκριση με τους σωματικούς ιστούς [39].

Η μακροζωία των μυγών προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε πριν [40] χρησιμοποιώντας θηλυκές και αρσενικές μύγες (ίσος αριθμός ανά φύλο) που καλλιεργήθηκαν σε φιαλίδια που περιείχαν (ή όχι) το εκχύλισμα που μελετήθηκε. Οι μύγες μεταφέρονταν σε φιαλίδια με φρέσκια τροφή κάθε δύο ημέρες και οι θάνατοι καταγράφονταν καθημερινά. Για τις καμπύλες επιβίωσης και τη στατιστική ανάλυση, χρησιμοποιήθηκαν η διαδικασία Kaplan-Meier και το τεστ log-rank (Mantel-Cox). Η σημασία έγινε αποδεκτή στο p <0,05.

2.5. Μέτρηση ειδών αντιδραστικού οξυγόνου (ROS)

Τα κύτταρα ή οι ιστοί των μυγών επωάστηκαν με τη χρωστική CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) σε συγκέντρωση 10 μΜ σε PBS για 30 λεπτά στο σκοτάδι (37 ◦C και 25 ◦C, αντίστοιχα). Μετά την αφαίρεση της βαφής, τα κύτταρα ή οι ιστοί των μυγών επωάστηκαν με PBS για 15 λεπτά στο σκοτάδι (37 ◦C και 25 ◦C, αντίστοιχα), λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [150 mM NaCl, 1 τοις εκατό (v/v) NP{{ 11}}, 50 mM Tris, ρΗ 8,0] και, στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στους 14,000 g για 15 λεπτά (4 ◦C). Στη συνέχεια, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη μετρήθηκε με τη δοκιμασία Bradford (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) και ο παραγόμενος φθορισμός μετρήθηκε σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών Spark® (Tecan Trading AG, Männedorf, Switzerland) κατά τη διέγερση και μήκη κύματος εκπομπής 490 και 540 nm, αντίστοιχα. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας, καθώς είναι ευρέως γνωστό ότι προκαλεί οξειδωτική βλάβη/στρές [41].

2.6. Εκχύλιση RNA, σύνθεση cDNA, και ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR (Q-RT-PCR)

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας RNAiso plus (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) και ποσοτικοποιήθηκε με ένα φασματοφωτόμετρο BioSpec-νανο (Shimadzu Inc., Kyoto, Japan). Στη συνέχεια, 1 μg RNA μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας το κιτ cDNA Scriptase II FastGene (NIPPON Genetics, Düren, Γερμανία). Για τη διεξαγωγή ποσοτικών αναλύσεων PCR σε πραγματικό χρόνο, χρησιμοποιήθηκαν το 5x HOT FIREpol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne, Tartu, Εσθονία) και το PikoRealTM Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Οι ειδικοί εκκινητές για τα ανθρώπινα γονίδια που μελετήθηκαν ήταν όπως περιγράφηκαν προηγουμένως [42]. Το γονίδιο HMBS χρησιμοποιήθηκε ως κανονικοποιητής.

2.7. Ανάλυση ανοσοστύπωσης και μέτρηση της δραστηριότητας πρωτεασωμάτων και καθεψινών

Οι μελέτες ανοσοστύπωσης διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43]. Πρωτογενή και συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου δευτερογενή αντισώματα εφαρμόστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και αναπτύχθηκαν ανοσοκηλίδες χρησιμοποιώντας ένα κιτ αντιδραστηρίου ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Η ποσοτικοποίηση των ανοσοκηλίδων πραγματοποιήθηκε με πυκνομετρία σάρωσης και λογισμικό ImageJ [44].

Οι ενζυμικές δραστηριότητες πρωτεασώματος και καθεψινών σε κύτταρα ή ιστούς μυγών μετρήθηκαν σε σύστημα φθορόμετρου VersaFluor™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) χρησιμοποιώντας Suc-LLVY-AMC (δραστηριότητα παρόμοια με τη χυμοτρυψίνη, CT-L) και Z-FR-AMC φθοριοπεπτίδια (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, ΗΠΑ), αντίστοιχα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42,45,46]. Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε η 6-βρωμοϊνδιρουβίνη-30 -οξίμη (6BIO), καθώς είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί την UPP τόσο σε ανθρώπινα κύτταρα όσο και σε μύγες Drosophila [42,47]. το φάρμακο Rapamycin, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας για την επαγωγή ALP και καθεψινών [48].

2.8. Αντισώματα που χρησιμοποιούνται

Πρωτογενή αντισώματα κατά της υπομονάδας πρωτεασώματος 5 (sc-55009), NQO1 (sc-16464), Beclin 1 (BECN1) (sc-11427), Clusterin (CLU) (sc{{7} }), HSP27 (sc-13132), HSP70 (sc{-59570) και GAPDH (sc-25778), καθώς και τα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου δευτερογενή αντισώματα, αγοράστηκαν από τη Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA). Τα πρωτεύοντα αντισώματα έναντι 53BP1 (4937), φωσφο-ιστόνης H2A.XSer139 (H2A.X) (9718) και φωσφόρου-p53Ser15 (9286) ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Το αντίσωμα κατά του SQSTM1/p62 (BML-PW9860) αγοράστηκε από την Enzo Life Science, Inc. (Farmingdale, ΝΥ, ΗΠΑ).

2.9. Στατιστικές αναλύσεις

Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον εις διπλούν. Για τις στατιστικές αναλύσεις χρησιμοποιήθηκε το MS Excel. Η στατιστική σημασία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το Student's t-test (t-test). Τα σημεία δεδομένων αντιστοιχούν στον μέσο όρο των ανεξάρτητων πειραμάτων και οι γραμμές σφάλματος υποδηλώνουν την τυπική απόκλιση (SD). σημασία στο p < 0.05 ή p < 0,01 υποδεικνύεται σε γραφήματα με έναν ή δύο αστερίσκους, αντίστοιχα.

3. Αποτελέσματα

3.1. Ταυτοποίηση του ακτινομύκητα που σχετίζεται με το μαλακό κοράλλι S. Levinson

Το στοχευόμενο μικροβιακό στέλεχος απομονώθηκε από το κοράλλι S. Levinson, το οποίο είναι ένα μαλακό κοράλλι ενδημικό της Ερυθράς Θάλασσας. Οι αποικίες αυτού του κοραλλιού βρίσκονται συνήθως σε βαθιές τοποθεσίες, τόσο στα οικοσυστήματα των ανώτερων μεσοφωτικών κοραλλιογενών υφάλων (30-60 m) όσο και στα οικοσυστήματα των κάτω μεσοφωτικών κοραλλιογενών υφάλων (60-105 m) [49]. Επιπλέον, είναι ένα αζωοξανθελικό μαλακό κοράλλι που λαμβάνει τις ενεργειακές του απαιτήσεις με τροφοδοσία με φίλτρο και, ως εκ τούτου, βρίσκεται σε ενδιαιτήματα που εκτίθενται σε ισχυρά ρεύματα νερού.

Από τη φυλογενετική ανάλυση που βασίζεται στην αλληλουχία 16S rRNA, το προϊόν απομόνωσης TM223-S2 βρέθηκε ότι ανήκει στο γένος Salinispora (Εικόνα 1).

Εφόσον το S. arenicola μπορεί να διακριθεί από το S. Pacifica και το S. tropica με βάση την αλληλουχία 16S rRNA [50], ονομάσαμε αυτό το προϊόν απομόνωσης S. arenicola TM223-S2 με αριθμό πρόσβασης Genbank MW446171. Το στέλεχος καλλιεργήθηκε όπως αναφέρεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι και εκχυλίστηκε αντίστοιχα με οξικό αιθυλεστέρα και μεθανόλη. Η προκαταρκτική βιολογική έρευνα έδειξε ότι το εκχύλισμα από την υγρή καλλιέργεια, SA223-S2BAE, και το εκχύλισμα οξικού αιθυλεστέρα από τη στερεά καλλιέργεια, SA223-S2LAE, δεν είχαν καμία σημαντική βιολογική δραστηριότητα (Εικόνα S1). Επομένως, μόνο το μεθανολικό εκχύλισμα από τη στερεά καλλιέργεια που σχετίζεται με την εκχύλιση σε στερεά φάση, SA223-S2BM, χρησιμοποιήθηκε σε αυτήν τη μελέτη.

3.2. Το εκχύλισμα SA223-S2BM δεν εμφανίζει τοξικότητα σε ανθρώπινα κύτταρα και ενεργοποιεί βασικά στοιχεία του PN

Αρχικά, εξετάσαμε την επίδραση του SA223-S2BM στη βιωσιμότητα των ινοβλαστών BJ φυσιολογικού δέρματος και των κερατινοκυττάρων HaCaT που απαθανατίστηκαν από τον άνθρωπο, πραγματοποιώντας τον προσδιορισμό τοξικότητας MTT. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος και, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α1, Α2, το εκχύλισμα δεν ασκεί κυτταροτοξική επίδραση σε καμία από τις δύο κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν σε συγκεντρώσεις έως 10 μg/mL ; σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (πάνω από 10 μg/mL), το εκχύλισμα μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων κυρίως στα κύτταρα HaCaT.

Στη συνέχεια μελετήσαμε την επίδραση του εκχυλίσματος στις κυτταρικές οδούς, οι οποίες διασφαλίζουν τη σταθερότητα του πρωτεώματος του κυττάρου. Παρατηρήσαμε ότι η βραχυπρόθεσμη (24 ώρες) έκθεση των ινοβλαστών BJ στο μελετημένο εκχύλισμα προκάλεσε σημαντικά την έκφραση του γονιδίου πρωτεασώματος PSMB7 (σε συγκέντρωση 10 μg/mL), ενώ παράλληλα, έτεινε να αυξήσει την έκφραση του γονίδιο PSMB6 στην ίδια συγκέντρωση (Εικόνα 2Β1). Επιπλέον, το εκχύλισμα προκάλεσε την έκφραση του γονιδίου πρωτεασώματος 20S, PSMB6, και του γονιδίου πρωτεασώματος 19S, RPN11 σε συγκέντρωση 1 μg/mL σε κύτταρα HaCaT (Εικόνα 2Β2). Επιπλέον, η επεξεργασία των ινοβλαστών BJ με το εκχύλισμα για 24 ώρες οδήγησε σε μια ήπια επαγωγή των επιπέδων έκφρασης της υπομονάδας πρωτεασώματος 20S 5 στη συγκέντρωση 1 μg/mL (Εικόνα 2C). Προς υποστήριξη των ευρημάτων μας, η έκθεση στο εκχύλισμα αύξησε σημαντικά τη δραστηριότητα πρωτεασώματος τύπου χυμοθρυψίνης τόσο στους ινοβλάστες BJ όσο και στα κερατινοκύτταρα HaCaT μετά από 24 ώρες επώασης (Εικόνα 2D1, D2). Τα διαφορετικά αποτελέσματα των εξεταζόμενων συγκεντρώσεων του εκχυλίσματος μεταξύ των κυττάρων BJ και HaCaT μπορούν να αποδοθούν σε επιδράσεις κυτταρικού τύπου.

Επιπλέον, οι αναλύσεις έκφρασης Q-RT-PCR αποκάλυψαν ότι η επεξεργασία των ινοβλαστών BJ με το εκχύλισμα για 24 ώρες προκάλεσε τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με ALP, που ονομάζονται CTSB, CTSL, CTSD και SQSTM1, σε συγκέντρωση 10 μg/mL. Εικόνα 3A1). Περαιτέρω, παρατηρήσαμε ότι η έκθεση των κυττάρων HaCaT στο εκχύλισμα για 24 ώρες οδήγησε στην επαγωγή των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται στη λειτουργικότητα της ALP (CTSB, CTSL, CTSD και SQSTM1) (Εικόνα 3Α2).

Σύμφωνα με αυτά τα ευρήματα, παρατηρήσαμε ανοδική ρύθμιση των πρωτεϊνών BECN1 και SQSTM1/p62 που σχετίζονται με την αυτοφαγία μετά από έκθεση ινοβλαστών BJ στο εκχύλισμα σε συγκέντρωση 1 μg/mL (Εικόνα 3Β1). αυξημένα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών BECN1 και SQSTM1/p62 παρατηρήθηκαν επίσης στα κερατινοκύτταρα HaCaT και στις δύο συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν (Εικόνα 3Β2). Σε συμφωνία, βρήκαμε ότι το εκχύλισμα ενίσχυσε την ενζυματική δραστηριότητα των λυσοσωμικών καθεψινών και στα κύτταρα BJ και HaCaT (Εικόνα 3C1, C2). και πάλι, τα διαφορετικά αποτελέσματα των εξεταζόμενων συγκεντρώσεων του εκχυλίσματος μεταξύ των κυττάρων BJ και HaCaT μπορούν να αποδοθούν σε επιδράσεις κυτταρικού τύπου.

Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση του εκχυλίσματος στα επίπεδα έκφρασης των βασικών μοριακών συνοδών. Έτσι, οι αναλύσεις ανοσοστύπωσης αποκάλυψαν ότι το εκχύλισμα προκάλεσε τα επίπεδα έκφρασης των μοριακών συνοδών CLU (και στις δύο μελετημένες συγκεντρώσεις) σε κύτταρα BJ (Εικόνα 3D1), καθώς και των HSP27 (1 μg/mL) και HSP70 (και στις δύο μελετημένες συγκεντρώσεις) σε κύτταρα HaCaT (Εικόνα 3D2).

【Για περισσότερες πληροφορίες:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】