Η Isoastilbin αναστέλλει τη νευρωνική απόπτωση και το οξειδωτικό στρες στο μοντέλο Arat του τραυματισμού ισχαιμίας-επαναιμάτωσης στον εγκέφαλο: Συμμετοχή του SIRT1/3/6

Για περισσότερες πληροφορίες Emailtina.xiang@wecistanche.com

Αφηρημένη

Ιστορικό.Το Isoastilbin (IAB) έχει αποδειχθεί ότι έχειαντιοξειδωτικόκαι αντι-αποπτωτικές λειτουργίες. Μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι το IAB μπορεί να μειώσειοξειδωτικόστρες στη νόσο του Αλτσχάιμερ. Ωστόσο, παραμένει άγνωστο εάν η αντιοξειδωτική λειτουργία του IAB είναι επίσης προστατευτική σε άλλες παθήσεις του εγκεφάλου.
Στόχοι.Για τη διερεύνηση των ρόλων και των υποκείμενων μηχανισμών του IAB στην επαναιμάτωση απόφραξης της μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας (MCAO/R) σε αρουραίους.
Υλικά και μέθοδοι.Αρσενικοί αρουραίοι Wistar χωρίστηκαν τυχαία σε 5 ομάδες: εικονική ομάδα, ομάδα MCAO/R και 3 ομάδες MCAO/R στις οποίες χορηγήθηκε IAB (20 mg/kg, 40 mg/kg ή 80 mg/kg) μία φορά την ημέρα για 3 ημέρες. Μέγεθος εμφράγματος, τροποποιημένη βαθμολογία νευρολογικής σοβαρότητας (mNSS),οξειδωτικόστρεςδείκτες και δείκτες νευρωνικής απόπτωσης χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της λειτουργίας του IAB.
Αποτελέσματα.Σε σύγκριση με την ομάδα MCAO/R, η χορήγηση του IAB μείωσε το μέγεθος του εμφράγματος και τις βαθμολογίες mNSS σε αρουραίους MCAO/R. Η ισοαστιλβίνη μείωσε επίσης το επίπεδο της μηλονοδιαλδεΰδης (MDA) και ενίσχυσε τη δραστηριότητα της καταλάσης (CAT), της δισμουτάσης του υπεροξειδίου (SOD) και της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GSH-PX). Η θεραπεία με ισοαστιλβίνη εξασθένησε τον νευρώνα που προκαλείται από MCAO/Rαπόπτωσησε σύγκριση με την ομάδα theMCAO/R, όπως υποδεικνύεται από τα αποτελέσματα των δοκιμασιών με τη μεσολάβηση τερματικής δεοξυνουκλεοτιδικής τρανσφεράσης X-dUTP nick-end (TUNEL) και western blot. Η ισοαστιλβίνη ανέστρεψε επίσης την προκαλούμενη από MCAO/R μείωση της έκφρασης πρωτεΐνης SIRT1/3/6.
συμπεράσματα.Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι το IAB προστατεύει απόοξειδωτικόστρες και νευρωνική απόπτωση σε αρουραίους μετά από τραυματισμό εγκεφαλικής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης (I/R) μέσω της ανοδικής ρύθμισης του SIRT1/3/6, υποδεικνύοντας ότι το IAB μπορεί να είναι ένας πολλά υποσχόμενος θεραπευτικός παράγοντας για εγκεφαλική βλάβη I/R.
Λέξεις-κλειδιά:απόπτωση, οξειδωτικό στρες, ισοαστιλβίνη, εστιακός τραυματισμός εγκεφαλικής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης

Ιστορικό

Το ισχαιμικό και αιμορραγικό εγκεφαλικό είναι από τις κύριες αιτίες αναπηρίας και θανάτου σε όλο τον κόσμο.1,2 Το ισχαιμικό εγκεφαλικό προκαλείται από αποφράξεις στα αιμοφόρα αγγεία, θέτοντας έτσι τα όργανα στόχους σε κίνδυνο κυτταρικού θανάτου.3 Αν και η πιο αποτελεσματική θεραπεία για την εγκεφαλική ισχαιμία είναι η ταχεία αποκαταστήσει την παροχή αίματος, η θρομβολυτική θεραπεία μπορεί να αυξήσει το μέγεθος του εμφράγματος και να επιδεινώσει τον τραυματισμό ισχαιμίας-επαναιμάτωσης (I/R) στον εγκέφαλο.1,4 Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη ανάπτυξης νέων φαρμάκων για τη θεραπεία της εγκεφαλικής βλάβης I/R.

Η βλάβη ισχαιμίας-επαναιμάτωσης στον εγκέφαλο περιλαμβάνει πολύπλοκη παθοφυσιολογία, συμπεριλαμβανομένης της εμφάνισηςοξειδωτικόστρες, απόπτωση και εξάντληση τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP), τα οποία όλα μπορούν να οδηγήσουν σε νευρωνική βλάβη.5 Τα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παράγονται κατά την ισχαιμία, οδηγώντας σε νευρωνικήαπόπτωσηκαι νευρολογική δυσλειτουργία.6 Συγκεκριμένα, οι οξειδάσες NADPH δημιουργούν ROS κατά τη διάρκεια τραυματισμού I/R, που προκαλείοξειδωτικόστρες. Αυτό το στρες χαρακτηρίζεται από αυξημένη υπεροξείδωση λιπιδίων, μειωμένη δραστηριότητα καταλάσης (CAT) και υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD) και μειωμένο επίπεδο γλουταθειόνης (GSH).7–11 Υψηλά επίπεδα ROS καιοξειδωτικόστρεςθα πυροδοτήσει με τη σειρά του τον κυτταρικό θάνατο μέσω της μιτοχονδριακής αποπτωτικής οδού μετά από εγκεφαλική βλάβη I/R. ως κυτόχρωμα c, που τελικά ξεκινά τον καταρράκτη των κασπασών και καταλήγει σε κυτταρικό θάνατο.12 Geng et al. πρότεινε ότι η απόπτωση των νευρωνικών κυττάρων προκαλείται τουλάχιστον εν μέρει από το μονοπάτι της μιτοχονδριακής απόπτωσης στην εγκεφαλική βλάβη I/R.13 Κατά συνέπεια, η αναστολή ή η αναστροφή του οξειδωτικού στρες και της νευρωνικής απόπτωσης υπόσχονται νέες μεθόδους για την άμβλυνση της εγκεφαλικής βλάβης I/R.

Για να διερευνήσουμε τον μηχανισμό μέσω του οποίου το IAB εξασθενεί τις βλάβες που προκαλούνται από I/R, εστιάσαμε στον καταρράκτη σηματοδότησης SIRT. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει έναν προστατευτικό ρόλο του SIRT1/3/6 σε διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του νευρικού εκφυλισμού στον εγκέφαλο, της φλεγμονής των αιμοφόρων αγγείων και της συσσώρευσης λίπους στο σώμα. Πράγματι, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία με IAB αυξάνει το επίπεδο έκφρασης SIRT κατά τη διάρκεια τραυματισμού I/R, υποδεικνύοντας ότι το IAB μπορεί να προστατεύει από τα κύτταρααπόπτωσηρυθμίζοντας προς τα πάνω την έκφραση SIRT. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι το IAB είναι μια δυνητικά χρήσιμη θεραπεία για την κλινική εγκεφαλική βλάβη I/R.

Στόχοι

Ο γενικός μας στόχος ήταν να εξετάσουμε τα αποτελέσματα και τους υποκείμενους μηχανισμούς του IAB σε τραυματισμό I/R χρησιμοποιώντας το ζωικό μοντέλο MCAO/R.

Υλικά και μέθοδοι

Των ζώων

Αρσενικοί αρουραίοι Wistar αποκτήθηκαν από την Shanghai Laboratory Animal Company (Σαγκάη, Κίνα). Αρουραίοι ηλικίας 60-90 ημερών με φυσιολογικό σωματικό βάρος (200-250 g) τρέφονταν κατά βούληση με τροφή και νερό και διατηρήθηκαν σε σταθερό περιβάλλον (25 ±2 βαθμοί, 40 ±10 τοις εκατό σχετική υγρασία και 12 ώρες κύκλος φωτός/σκότους) . Ο χειρισμός των ζώων έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες για τη φροντίδα και τη χρήση εργαστηριακών ζώων του Jiamusi College, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Κίνα. Η Επιτροπή Θεσμικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Κολεγίου Jiamusi, του Πανεπιστημίου Κινεζικής Ιατρικής του Heilongjiang ενέκρινε τις διαδικασίες για τα ζώα (αρ. έγκρισης 20190815).

Καθιέρωση τραυματισμού MCAO/R και θεραπεία IAB

Η τοξικότητα του IAB προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως.15 Isoastilbin (Chengdu Purechem-Standard Co., Ltd., Chengdu, Κίνα) αραιώθηκε σε τελικές συγκεντρώσεις 20 mg/kg, 40 mg/kg και 80 mg/kg σε φωσφορικό -ρυθμιστικό διάλυμα (PBS). Τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν σε 5 ομάδες: 1. εικονική; 2. MCAO/R; 3. MCAO/R ακολουθούμενο από 20 mg/kg IAB. 4. MCAO/R ακολουθούμενο από 40 mg/kg IAB. και 5. MCAO/R ακολουθούμενο από 80 mg/kg IAB.

Οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενδοπεριτοναϊκή (ip.) ένεση 50 mg/kg πεντοβαρβιτάλης νατρίου (Sinopharm Chemical Reagent, Πεκίνο, Κίνα). Για την εισαγωγή του MCAO/R, εκθέσαμε τις καρωτιδικές αρτηρίες, δηλαδή την εξωτερική καρωτιδική αρτηρία (ECA), τη δεξιά κοινή καρωτίδα (CCA) και την εσωτερική καρωτιδική αρτηρία (ICA). Το ECA και το CCA απολινώθηκαν εγγύς. Το ICA απολινώθηκε χρησιμοποιώντας ένα ράμμα μονόινα 0,285 mm, που εισήχθη στον αυλό του ICA για περίπου 18 mm μέσω του κολοβώματος ECA για απόφραξη της μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας (MCA). Ένα λέιζερΤο Doppler (USCN KIT INC., Wuhan, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει ότι η ροή του αίματος μειώθηκε σε λιγότερο από το 20 τοις εκατό του κανονικού επιπέδου. Η εικονική ομάδα υποβλήθηκε στην ίδια επέμβαση. Ωστόσο, οι αρτηρίες δεν απολινώθηκαν. Μετά από 2 ώρες απόφραξης, οι απολινωμένες αρτηρίες επαναιμάτωσης και οι αρουραίοι στη συνέχεια χορηγήθηκαν με καθετήρα με IAB (20 mg/kg, 40 mg/kg ή 80 mg/kg) ή PBS ημερησίως για 3 διαδοχικές ημέρες. Τέλος, 72 ώρες μετά το MCAO/R, αξιολογήθηκε η νευρολογική ικανότητα των αρουραίων.

Αξιολόγηση του όγκου εμφράγματος εγκεφάλου αρουραίου

Μετά τη θεραπεία με IAB, οι εγκέφαλοι ζυγίστηκαν γρήγορα για να μετρηθεί το υγρό βάρος τους. Στη συνέχεια, οι εγκέφαλοι αφυδατώθηκαν στους 100 βαθμούς για 24 ώρες για να εκτιμηθεί το ξηρό βάρος τους. Η συγκέντρωση του νερού στον εγκέφαλο υπολογίστηκε ως: ((υγρό βάρος ‒ ξηρό βάρος)/υγρό βάρος) × 100 τοις εκατό .

Τροποποιημένη βαθμολογία νευρολογικής βαρύτητας (mNSS)

Οι αισθητηριακές, κινητικές, ισορροπημένες και αντανακλαστικές νευρολογικές λειτουργίες αξιολογήθηκαν 72 ώρες μετά τη χειρουργική επέμβαση MCAO χρησιμοποιώντας mNSS.17 Η σοβαρότητα των νευρολογικών ελλειμμάτων ταξινομήθηκε σε μια κλίμακα από 0 έως 10, με υψηλότερη βαθμολογία που υποδηλώνει πιο σοβαρή βλάβη στο νευρικό σύστημα.

Μέτρηση υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD), μηλονοδιαλδεΰδης (MDA), καταλάσης (CAT) και υπεροξειδάσης γλουταθειόνης (GSH-PX)

Μετά τη θεραπεία με IAB, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε από τους ιστούς του εγκεφάλου. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των ομογενοποιημάτων του φλοιού προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ BCA (Beyotime, Shanghai, Κίνα). Τα SOD, MDA, CAT και GSH-PX εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα κιτ (αριθμός καταλόγου A003-1, A001-3, A007 και A005; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Κίνα). Εν συντομία, συλλέχθηκε το υπερκείμενο ομογενοποιημένου φλοιού. Για το SOD, τα δείγματα επωάστηκαν με WST-8/ενζυμικό διάλυμα εργασίας στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε σε μήκος κύματος 450 nm. Μία μονάδα ενζυματικής δραστηριότητας SOD (U) ορίστηκε ως η ποσότητα του δείγματος που απαιτείται για να επιτευχθεί ποσοστό αναστολής 50 τοις εκατό της χρωστικής φορμαζάνης WST{10}}. Για το MDA, τα δείγματα αναμίχθηκαν με ένα διάλυμα εργασίας και στη συνέχεια θερμάνθηκαν στους 100 βαθμούς για 15 λεπτά. Η απορρόφηση του υπερκειμένου μετρήθηκε σε μήκος κύματος 532 nm. Για το CAT, τα δείγματα αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα ανίχνευσης CAT και διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 25 βαθμούς για 5 λεπτά. Η απορρόφηση ανιχνεύθηκε σε μήκος κύματος 520 nm. Για το GSH-PX, τα δείγματα αναμίχθηκαν με GSH στους 37 βαθμούς για 5 λεπτά. Η απορρόφηση του υπερκειμένου μετρήθηκε σε μήκος κύματος 412 nm. Μία μονάδα (U) ενζυμικής δραστηριότητας ορίστηκε ως η ποσότητα GSH-PX σε 1 mg πρωτεΐνης που καταλύει την κατανάλωση 1 μmol/L GSH ενώ αφαιρεί το αποτέλεσμα της μη ενζυμικής αντίδρασης.

Χρώση τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης dUTP nick end labeling (TUNEL)

Οι ιστοί του εγκεφάλου του ομόπλευρου ημισφαιρίου απομονώθηκαν, στερεώθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης και ενσωματώθηκαν σε παραφίνη. Στη συνέχεια οι ιστοί κόπηκαν σε φέτες 5-μm και το αντιγόνο εκτέθηκε μετά από 10 λεπτά θέρμανσης σε μικροκύματα σε κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα. Η νευρωνική απόπτωση αξιολογήθηκε με τη χρήση της δοκιμασίας TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Roche, Penzberg, Γερμανία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, οι φέτες του εγκεφάλου τοποθετήθηκαν σε παγωμένη παραφορμαλδεΰδη 4 τοις εκατό για 30 λεπτά και στη συνέχεια, επωάστηκαν στο σκοτάδι με το μίγμα αντίδρασης TUNEL στους 37 βαθμούς για 1 ώρα. Στη συνέχεια, οι πυρήνες χρωματίστηκαν με 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI, Sigma-Aldrich). Τα δείγματα απεικονίστηκαν και ο δείκτης απόπτωσης υπολογίστηκε ως ο αριθμός των θετικών στο TUNEL κυττάρων διαιρεμένος με τον συνολικό αριθμό κυττάρων.

Western blot

Οι ιστοί του εγκεφάλου αρουραίου λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα ραδιο-ανοσοκαθίζησης (RIPA) (Beyotime, Dalian, China). Οι πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση γέλης 12-15 τοις εκατό δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore, Billerica, ΗΠΑ). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας γάλα 5 τοις εκατό χωρίς λιπαρά και επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα στους 4 βαθμούς όλη τη νύχτα. Δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση χρένου (HRP) στη συνέχεια επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Ειδικά σήματα επισημασμένων πρωτεϊνών ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα χημειοφωταύγειας. Η -ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για την ομαλοποίηση των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης των Bcl-2, Bax και Sirtuin (SIRT1/3/6). Οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD) από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα από κάθε ομάδα επιβεβαιώθηκαν ότι ακολουθούν μια κανονική κατανομή χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Shapiro-Wilk. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από δοκιμασία post hoc Tukey χρησιμοποιώντας λογισμικό Prism v. 8 (GraphPad Software, San Diego, USA). Μια τιμή του p< 0.05 indicated="" statistical="" significance.="" a post="" hoc="" power="" analysis="" was="" performed="" using="" g*power="" 3.1.9.7="" software="" (heinrich="" heine="" university,="" düsseldorf,="">

Αποτελέσματα

Το Isoastilbin προστατεύει τους νευρώνες από τραυματισμό που προκαλείται από MCAO/R

Για να διερευνηθεί εάν οι νευρώνες που προστάτευαν το IAB που υποβλήθηκαν σε εγκεφαλικό I/R, αναλύθηκαν η συγκέντρωση νερού στον εγκέφαλο και ο όγκος του εμφράγματος. Στα ζώα ελέγχου, δεν υπήρξε έμφραγμα και η συγκέντρωση του νερού ήταν σχετικά χαμηλή (Σχ. 1 Β, C, εικονική ομάδα). Μετά από χειρουργική επέμβαση MCAO/R, παρατηρήσαμε σημαντικές αυξήσεις στο μέγεθος του εμφράγματος και στη συγκέντρωση νερού (Εικ. 1Β, Γ). Το έμφραγμα και το ισχαιμικό οίδημα υποδεικνύουν ότι η προσέγγισή μας δημιούργησε με επιτυχία το μοντέλο I/R σε αρουραίους. Είναι ενδιαφέρον ότι όταν εφαρμόσαμε διαφορετικές συγκεντρώσεις IAB (20 mg/kg, 40 mg/kg και 80 mg/kg) αμέσως μετά τον τραυματισμό, παρατηρήσαμε δοσοεξαρτώμενη ανάκτηση του εμφράγματος και ισχαιμικού εγκεφαλικού οιδήματος (Εικ. 1B,C). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι το IAB προστατεύει από εγκεφαλική βλάβη που προκαλείται από ισχαιμία. Στη συνέχεια, εξετάσαμε το κελίαπόπτωσηχρησιμοποιώντας την ανάλυση mNSS. Όπως φαίνεται στην Εικ. 1D, οι επίμυες που χειρουργήθηκαν ψευδώς δεν εμφάνισαν εμφανή νευρολογικά ελλείμματα, ενώ οι αρουραίοι MCAO/R εμφάνισαν σημαντικά αυξημένες βαθμολογίες mNSS. Σε συμφωνία με τις μορφολογικές αλλαγές που φαίνονται στο Σχήμα 1Β και στο Σχήμα 1C, η θεραπεία με IAB μείωσε σημαντικά τη βαθμολογία mNSS των αρουραίων MCAO/R (Εικ. 1D). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν στοιχεία ότι το IAB έχει μια νευροπροστατευτική λειτουργία σε ένα μοντέλο τρωκτικών Vivo εγκεφαλικής βλάβης I/R. Δεδομένου ότι μια υψηλότερη συγκέντρωση IAB είχε καλύτερα προστατευτικά αποτελέσματα χωρίς εμφανείς παρενέργειες, χρησιμοποιήσαμε 80 mg/kg για τα ακόλουθα πειράματα.

Το Isoastilbin μειώνει το οξειδωτικό στρες σε αρουραίους MCAO/R

Για την αξιολόγηση της επιρροής του IAB στοοξειδωτικό στρες, τα επίπεδα GHS-PX, MDA, SOD και CAT αξιολογήθηκαν μετά τη θεραπεία με IAB. Λόγω της αύξησης του οξειδωτικού στρες, οι αρουραίοι που υποβλήθηκαν σε MCAO/R είχαν υψηλότερα επίπεδα MDA σε σύγκριση με τους εικονικούς αρουραίους. Αυτό το αποτέλεσμα μετριάστηκε με αγωγή με IAB (Εικ. 2Α). Επιπλέον, τα επίπεδα CAT, SOD και GHS-PX μειώθηκαν σε αρουραίους MCAO/R σε σύγκριση με εικονικούς αρουραίους (Εικ. 2Β, Δ). Η θεραπεία με IAB αύξησε τα επίπεδα CAT, SOD και GHS-PX σε αρουραίους MCAO/R (Εικ. 2B, D), υποδηλώνοντας ότι το IAB προστατεύει από την εγκεφαλική βλάβη I/R μειώνοντας το οξειδωτικό στρες.

Η ισοαστιλβίνη αναστέλλει την απόπτωση των νευρώνων σε αρουραίους MCAO/R

Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία TUNEL για την αξιολόγηση των νευρώνωναπόπτωσημετά από εγκεφαλική βλάβη I/R. Όπως απεικονίζεται στο Σχ. 3Α, υπήρξε αυξημένος αριθμός θετικών στο TUNEL κυττάρων σε αρουραίους MCAO/R, ο οποίος μειώθηκε με αγωγή με IAB (Εικ. 3Α). Για να διερευνήσουμε τους υποκείμενους μηχανισμούς προστασίας του IAB, εξετάσαμε την έκφραση των πρωτεϊνών απόπτωσης Bax και Bcl-2 χρησιμοποιώντας western blot. Σε αρουραίους που υποβλήθηκαν σε MCAO/R, η έκφραση του Bax (προ-αποπτωτικός δείκτης) ρυθμίστηκε προς τα πάνω, ενώ αυτή του Bcl-2 (αντι-αποπτωτικός δείκτης) ήταν μειωμένη, σε σύγκριση με την εικονική ομάδα (Εικ. 3B, C ). Ωστόσο, η θεραπεία με IAB απέτρεψε αλλαγές που προκαλούνται από MCAO/R (Εικ. 3Β, Γ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το IAB ανέστειλε την απόπτωση των νευρώνων σε αρουραίους MCAO/R.

Το Isoastilbin ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση SIRT

Στη συνέχεια, προσπαθήσαμε να εξετάσουμε πώς το IAB προστατεύει τους νευρώνες απόοξειδωτικό στρες. Το SIRT, μια εξαρτώμενη από το NAD συν δεακετυλάση που εντοπίζεται κυρίως στα μιτοχόνδρια, έχει βρεθεί ότι σχετίζεται με την κυτταρική επιβίωση και απόπτωση, τον μεταβολισμό των κυττάρων και την απόκριση στο στρες. Το SIRT μπορεί να ενεργοποιήσει μιτοχονδριακά σήματα και μονοπάτια για την προώθηση του πολλαπλασιασμού των μιτοχονδρίων και τη δημιουργία ATP. Συμμετέχει επίσης στη φλεγμονή, με τρόπο που η μείωση του SIRT οδηγεί σε αυξήσεις των παραγόντων χρόνιας φλεγμονής, όπως η δραστηριότητα NFκB και RelA/p65.18–20 Είναι ενδιαφέρον, αρκετές μελέτες έχουν βρει ότι το SIRT ασκεί νευροπροστατευτική δράση και εξασθενεί το οξειδωτικό στρες στην παθοφυσιολογία της εγκεφαλικής βλάβης I/R.21 Εδώ, διερευνήσαμε την έκφραση του εγκεφάλου του SIRT1/3/6 σε αρουραίους που υποβλήθηκαν σε MCAO/R. Βρήκαμε ότι ο τραυματισμός MCAO/R μείωσε τα επίπεδα πρωτεΐνης του SIRT1/3/6, ενώ η θεραπεία με IAB μείωσε αυτές τις επιδράσεις (Εικ. 4A–D). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το IAB μπορεί να είναι προστατευτικό σε αρουραίους MCAO/R ρυθμίζοντας προς τα πάνω την έκφραση SIRT1/3/6 για προστασία από το οξειδωτικό στρες.

Συζήτηση

Η συγκέντρωση του ROS αυξάνεται σε ένα μέγιστο, το οποίο μπορεί δυνητικά να προκαλέσει απόπτωση ή κυτταρική νέκρωση.25–28 Υπάρχουν αρκετοί καλά εδραιωμένοι δείκτες οξειδωτικού στρες. Για παράδειγμα, το MDA, μια κυτταροτοξική ένωση που παράγεται από την υπεροξείδωση των λιπιδίων,29 αυξάνεται στα καρδιομυοκύτταρα αρουραίου μετά από βλάβη στο I/R.30 Τα αντιοξειδωτικά ένζυμα SOD, CAT και GHS-PX παίζουν σημαντικό ρόλο στη δέσμευση των υπεροξειδίων και στην πρόληψη της οξειδωτικής βλάβης.31. 32 Επιπλέον, αλλαγές στη δραστηριότητα αυτών των ενζύμων σχετίζονται και με το οξειδωτικό στρες. Η άμβλυνση του οξειδωτικού στρες είναι ένας πιθανός τρόπος προστασίας των ιστών από τραυματισμό I/R.

Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η νευροπροστατευτική δράση του IAB μπορεί να οφείλεται στη ρύθμιση του οξειδωτικού στρες. Συγκεκριμένα, η μελέτη διαπίστωσε ότι το IAB ανέστειλε τη δημιουργία ROS και προκάλεσε SOD και GSH-PX για τη βελτίωση της οξειδωτικής βλάβης σε ένα μοντέλο AD ποντικού.15 Ωστόσο, εάν και πώς το IAB προστατεύει από τραυματισμό I/R στον εγκέφαλο, δεν είναι ακόμη γνωστό. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι το IAB εξασθενεί με επιτυχία την εγκεφαλική βλάβη I/R μειώνοντας τον όγκο του εμφράγματος και τα νευρολογικά ελλείμματα μετά από τραυματισμό MCAO/R. Για να ελέγξουμε εάν τα αποτελέσματα του IAB οφείλονται στην εξασθένηση των ειδών ROS, μετρήσαμε αρκετούς δείκτες οξειδωτικού στρες. Η θεραπεία με ισοαστιλβίνη μετά από MCAO/R βρέθηκε ότι μειώνει τα επίπεδα MDA, αλλά αυξάνει τη δραστηριότητα CAT, SOD και GSH-PX. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο υποκείμενος μηχανισμός της νευροπροστασίας με τη μεσολάβηση του IAB έναντι της βλάβης του I/R είναι μέσω της μείωσης του οξειδωτικού στρες.

Πράγματι, το εγκεφαλικό I/R είναι ικανό να επάγει απόπτωση νευρώνων.33,34 Η ενεργοποίηση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών (Bax και Bak) και η παράλληλη αδρανοποίηση αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών (όπως το Bcl-2) συνέβη κατά τη διάρκεια της εγκεφαλικής Τραυματισμός I/R. Τόσο, το Bcl-2 και το Bax βρίσκονται στο εξωτερικό μέρος της μιτοχονδριακής μεμβράνης και συμμετέχουν στη ρύθμιση της κυτταρικής απόπτωσης.35-37 Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση Bcl-2 εμποδίζει τον νευρωνικό θάνατο in vitro και in vivo.38Erfani et al. διαπιστώθηκε ότι η αναλογία Bax/Bcl-2 αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της εγκεφαλικής βλάβης I/R, συμβάλλοντας στην απόπτωση των νευρώνων.39 Επιπλέον, ανοδική ρύθμιση Bax και μείωση Bcl-2 βρέθηκαν σε εγκεφάλους ποντικών που υποβλήθηκαν σε MCAO/R. 40 Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι το IAB ρυθμίζει τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης τόσο του Bcl-2 όσο και του Bax για τη βελτίωση του οξειδοαναγωγικού συστήματος σε ποντικούς με AD, υποδεικνύοντας τον αντι-αποπτωτικό ρόλο του IAB σε αυτή την κατάσταση.15 Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η χορήγηση του IAB μείωσε την επαγόμενη από I/R νευρωνική απόπτωση in vivo με μείωση του Bax και ρυθμίζοντας προς τα πάνω το Bcl-2. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η νευροπροστατευτική ικανότητα του IAB εξαρτάται από την αντι-αποπτωτική του δράση σε αρουραίους. Ωστόσο, το I/R μπορεί επίσης να οδηγήσει σε νέκρωση, η οποία δεν προκαλείται από οξειδωτικό στρες.25–28 Έχει μεγάλο ενδιαφέρον να εξεταστεί εάν το IAB μπορεί επίσης να λειτουργήσει αναστέλλοντας τη νέκρωση για να μετριάσει τον τραυματισμό του I/R.

Για να εξετάσουμε τον μηχανισμό μέσω του οποίου το IAB μειώνει το οξειδωτικό στρες, εστιάσαμε στις πρωτεΐνες SIRT. Μια προηγούμενη αναφορά είχε βρει ότι η υπερέκφραση του SIRT3 ανέστειλε τη μιτοχονδριακή σχάση για να προστατεύσει από εγκεφαλική βλάβη I/R. Επιπλέον, το SIRT6 μπορεί να προστατεύσει τον εγκέφαλο από βλάβες I/R μέσω της καταστολής του οξειδωτικού στρες.2 Εδώ, ανακαλύψαμε ότι το SIRT1/3/ 6 υπορυθμίστηκε σημαντικά σε αρουραίους MCAO/R, ενώ η χορήγηση ΙΑΒ αύξησε την έκφραση του SIRTl/3/6. Από όσο γνωρίζουμε, αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που καταδεικνύει ότι το IAB μπορεί να αυξήσει την έκφραση της πρωτεΐνης SIRT1/3/6 για να μετριάσει το οξειδωτικό στρες και την απόπτωση των νευρώνων που προκαλείται από εγκεφαλική βλάβη I/R.

Περιορισμοί

Υπάρχουν πολλές διαφορετικές προστατευτικές οδοί κατά του οξειδωτικού στρες. Εδώ, δείξαμε ότι ο μηχανισμός σηματοδότησης της προστασίας IAB είναι μέσω του SIRT 1/3/6. Ωστόσο, άλλοι μηχανισμοί κατά του οξειδωτικού στρες ή του εγκεφαλικού I/R τραυματισμού θα πρέπει να διευκρινιστούν περαιτέρω. Κατά τη διάρκεια του τραυματισμού I/R, εμπλέκονται τόσο η απόπτωση όσο και η νέκρωση. Ωστόσο, επικεντρωθήκαμε μόνο στην απόπτωση. Έτσι, περαιτέρω έρευνα για το ρόλο του IAB στη νέκρωση θα είναι απαραίτητη για να εξηγηθεί πλήρως η προστατευτική λειτουργία του IAB κατά τη διάρκεια του τραυματισμού I/R.

συμπεράσματα

Εδώ, δείξαμε ότι το IAB μπορεί να ανακουφίσει το οξειδωτικό στρες και την απόπτωση των νευρώνων σε αρουραίους που υποβλήθηκαν σε εγκεφαλικό I/R. Επιπλέον, το αντιοξειδωτικό στρες και οι αντι-αποπτωτικές λειτουργίες του IAB μπορεί να προκύψουν μέσω της ρύθμισης της έκφρασης SIRT1/3/6. Συνολικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι το IAB είναι υποψήφια θεραπεία για εγκεφαλική βλάβη I/R.

ORCID iDs Lifeng An  https://orcid.org/0000-0002-4835-1817 Dandan Zhu  https://orcid.org/0000-0001-9119-9956 Xin Zhang  https://orcid.org/0000-0002-9496-1691 Jingwen Huang  https://orcid.org/0000-0001-6449-5362 Guangbao Lu https://orcid.org/0000-0002-2465-8996

Lifeng An1,B,D, Dandan Zhu2,B, Σιν Ζανγκ2,C, Jingwen Huang1,C, Γκουανγκμπάο Λου1,A,F

1 Jiamusi College, Πανεπιστήμιο Κινεζικής Ιατρικής Heilongjiang, Κίνα

2 Μεταπτυχιακό Σχολείο, Πανεπιστήμιο Κινεζικής Ιατρικής Heilongjiang, Jiamusi, Κίνα

Α – ερευνητική ιδέα και σχεδιασμός. Β – συλλογή και/ή συγκέντρωση δεδομένων. Γ – ανάλυση και ερμηνεία δεδομένων.

Δ – σύνταξη του άρθρου. Ε – κριτική αναθεώρηση του άρθρου. ΣΤ – τελική έγκριση του άρθρου

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Rossi DJ, Brady JD, Mohr C. Μεταβολισμός αστροκυττάρων και σηματοδότηση κατά την ισχαιμία του εγκεφάλου. Nat Neurosci. 2007;10(11):1377–1386. doi:10.1038/ nn2004
2. Ribeiro PW, Cola PC, Gatto AR, et al. Σχέση μεταξύ της δυσφαγίας, της βαθμολογίας της κλίμακας εγκεφαλικών επεισοδίων του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας και των προγνωστικών παραγόντων πνευμονίας μετά από ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2015; 24(9):2088–2094. doi:10.1016/j.jstrokecerebrovasdis.2015.05.009
3. Hu X, De Silva TM, Chen J, Faraci FM. Εγκεφαλική αγγειακή νόσος και νευροαγγειακή βλάβη σε ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο. Circ Res. 2017; 120 (3): 449–471. doi:10.1161/circresaha.116.308427
4. Tabassum R, Vaibhav Κ, Shrivastava Ρ, et αϊ. Η περιλλυλική αλκοόλη βελτιώνει τα λειτουργικά και ιστολογικά αποτελέσματα έναντι του τραυματισμού ισχαιμίας-επαναιμάτωσης με την εξασθένηση του οξειδωτικού στρες και την καταστολή των COX-2, NOS-2 και NF-κB σε αρουραίους απόφραξης της μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας. Eur J Pharmacol. 2015; 747:190–199. doi:10.1016/j.ejphar.2014.09.015
5. Woodruff TM, Thundyil J, Tang SC, Sobey CG, Taylor SM, Arumugam TV. Παθοφυσιολογία, θεραπεία και ζωικά και κυτταρικά μοντέλα ανθρώπινου ισχαιμικού εγκεφαλικού επεισοδίου. ΜοΙ Νευροεκφυλιστικό. 2011; 6 (1): 11. doi:10.1186/1750- 1326-6-11
6. Gonzalez-Rodriguez PJ, Xiong F, Li Y, Zhou J, Zhang L. Η εμβρυϊκή υποξία αυξάνει την ευπάθεια της υποξικής-ισχαιμικής εγκεφαλικής βλάβης σε νεογνικούς αρουραίους: Ρόλος υποδοχέων γλυκοκορτικοειδών. Neurobiol Dis. 2014; 65:172–179. doi:10.1016/j.nbd.2014.01.020
7. Rodrigo R, Fernández-Gajardo R, Gutiérrez R, et al. Οξειδωτικό στρες και παθοφυσιολογία του ισχαιμικού εγκεφαλικού: Νέες θεραπευτικές ευκαιρίες. CNS Neurol Disord Drug Targets.2013;12(5):698–714. doi:10.2174/ 1871527311312050015
8. Zhang C, Ling CL, Pang L, et al. Απευθείας μακρομοριακή χορήγηση φαρμάκου στην περιοχή της εγκεφαλικής ισχαιμίας χρησιμοποιώντας νανοσωματίδια με τη μεσολάβηση ουδετερόφιλων. Theranostics. 2017; 7(13): 3260–3275. doi:10.7150/thno.19979
9. Kahles T, Luedike P, Endres M, et al. Η οξειδάση NADPH παίζει κεντρικό ρόλο στη βλάβη του αιματοεγκεφαλικού φραγμού σε πειραματικό εγκεφαλικό επεισόδιο. Εγκεφαλικό. 2007;38(11):3000–3006. doi:10.1161/strokeaha.107.489765
10. Chen H, Song YS, Chan PH. Η αναστολή της οξειδάσης NADPH είναι νευροπροστατευτική μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση. J Cereb Blood Flow Metab. 2009; 29(7):1262–1272. doi:10.1038/jcbfm.2009.47
11. Kapoor Μ, Sharma Ν, Sandhir R, Nehru Β. Επίδραση της αποκυνίνης αναστολέα οξειδάσης NADPH σε τραυματισμό ιππόκαμπου ισχαιμίας-επαναιμάτωσης σε εγκέφαλο αρουραίου. Biomed Pharmacother. 2018; 97:458–472. doi: 10.1016/j. biopha.2017.10.123
12. Yu S, Wang C, Cheng Q, et al. Ένα ενεργό συστατικό των πολυπεπτιδίων Achyranthes bintata παρέχει νευροπροστασία μέσω της αναστολής της εξαρτώμενης από τα μιτοχόνδρια αποπτωτικής οδού σε καλλιεργημένους νευρώνες και σε ζωικά μοντέλα εγκεφαλικής ισχαιμίας. PLoS One. 2014; 9(10):e109923. doi:10.1371/journal.pone.0109923
13. Geng HX, Li RP, Li YG, et al. 14,15-Η EET καταστέλλει την απόπτωση των νευρώνων στην ισχαιμία-επαναιμάτωση μέσω της μιτοχονδριακής οδού. Neurochem Res.2017;42(10):2841-2849. doi:10.1007/s11064-017-2297-6
14. Du Q, Li L, Jerz G. Καθαρισμός αστιλβίνης και ισοαστιλβίνης στο εκχύλισμα ριζώματος smilax glabra με χρωματογραφία αντίθετης ροής υψηλής ταχύτητας. J Chromatogr A. 2005;1077(1):98–101. doi:10.1016/j.chroma. 072.04.2005
15. Yu H, Yuan B, Chu Q, Wang C, Bi H. Προστατευτικοί ρόλοι της ισοαστιλβίνης έναντι της νόσου του Alzheimer μέσω της αντιοξειδωτικής και αντι-απόπτωσης με τη μεσολάβηση Nrf2-. Int J Mol Med.2019;43(3):1406–1416. doi:10.3892/ijmm. 2019.4058
16. Zhou X, Xu Q, Li JX, Chen T. Δομική αναθεώρηση δύο γλυκοζιτών φλαβανονόλης από Smilax glabra. Planta Med. 2009; 75 (6): 654-655. doi:10. 1055/s-0029-1185360
17. Morimoto J, Yasuhara Τ, Kameda Μ, et αϊ. Η ηλεκτρική διέγερση ενισχύει τη μεταναστευτική ικανότητα των μεταμοσχευμένων στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών σε ένα μοντέλο ισχαιμικού εγκεφαλικού επεισοδίου τρωκτικών. Cell Physiol Biochem. 2018; 46(1):57–68. doi: 10.1159/000488409
18. Torrens-Mas M, Pons DG, Sastre-Serra J, Oliver J, Roca P. Η σίγαση SIRT3 ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα του μαστού σε κυτταροτοξικές θεραπείες μέσω μιας αύξησης στην παραγωγή ROS. J Cell Biochem. 2017; 118 (2): 397–406. doi:10.1002/jcb.25653
19. Nassir F, Arndt JJ, Johnson SA, Ibdah JA. Η ρύθμιση της μιτοχονδριακής τριλειτουργικής πρωτεΐνης ρυθμίζει τη μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος σε ποντίκια. J Lipid Res. 2018; 59 (6): 967–973. doi:10.1194/jlr.M080952
20. Torrens-Mas M, Hernández-López R, Oliver J, Roca P, Sastre-Serra J. Η σίγαση Sirtuin 3 βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της οξαλιπλατίνης μέσω της ακετυλίωσης του MnSOD στον καρκίνο του παχέος εντέρου. J Cell Physiol. 2018; 233(8):6067–6076. doi:10.1002/jcp.26443
21. Hernández-Jiménez Μ, Hurtado Ο, Cuartero ΜΙ, et αϊ. Ο σιωπηλός ρυθμιστής πληροφοριών 1 προστατεύει τον εγκέφαλο από την εγκεφαλική ισχαιμική βλάβη. Εγκεφαλικό. 2013;44(8):2333–2337. doi:10.1161/strokeaha.113.001715
22. Chen GY, Nuñez G. Αποστειρωμένη φλεγμονή: αίσθηση και αντίδραση σε βλάβη. Nat Rev Immunol. 2010; 10(12):826–837. doi:10.1038/nri2873
23. Eltzschig HK, Eckle T. Ισχαιμία και επαναιμάτωση: Από τον μηχανισμό στη μετάφραση. Nat Med. 2011, 17(11):1391–1401. doi:10.1038/nm.2507
24. Dziedzic T. Συστημική φλεγμονή ως θεραπευτικός στόχος σε οξύ ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο. Expert Rev Neurother.2015;15(5):523–531. doi:10.1586/ 14737175.2015.1035712
25. Yemisci M, Gursoy-Ozdemir Y, Vural A, Can A, Topalkara K, Dalkara T. Η συστολή των περικυττάρων που προκαλείται από το οξειδωτικό-νιτρικό στρες βλάπτει την τριχοειδική επαναρροή παρά την επιτυχή διάνοιξη μιας αποφραγμένης εγκεφαλικής αρτηρίας. Nat Med. 2009, 15(9):1031–1037. doi:10.1038/nm.2022
26. Chen Η, Yoshioka Η, Kim GS, et αϊ. Οξειδωτικό στρες σε ισχαιμική εγκεφαλική βλάβη: Μηχανισμοί κυτταρικού θανάτου και πιθανοί μοριακοί στόχοι για νευροπροστασία. Σήμα αντιοξειδωτικής οξειδοαναγωγής. 2011, 14(8):1505–1517. doi:10.1089/ars.2010.3576
27. Olmez I, Ozyurt Η. Αντιδραστικά είδη οξυγόνου και ισχαιμική εγκεφαλοαγγειακή νόσος. Neurochem Int. 2012; 60 (2): 208–212. doi: 10.1016/j. neuint.2011.11.009
28. Guo J, Cheng C, Chen CS, et αϊ. Η υπερέκφραση της Fibulin-5 εξασθενεί τον τραυματισμό ισχαιμίας/επαναιμάτωσης μετά από απόφραξη της μέσης εγκεφαλικής αρτηρίας σε αρουραίους. ΜοΙ Neurobiol. 2016; 53 (5): 3154–3167. doi:10.1007/s12035- 015-9222-2
29. Qiang Μ, Xu Y, Lu Y, et αϊ. Αυτοφθορισμός πρωτεϊνών τροποποιημένων με MDA ως ανιχνευτής in vitro και in vivo στην ανάλυση οξειδωτικού στρες. Πρωτεϊνικό Κύτταρο. 2014; 5 (6): 484–487. doi:10.1007/s13238-014-0052-1
30. Hou S, Zhao MM, Shen PP, et αϊ. Νευροπροστατευτική δράση των σαλβιανολικών οξέων κατά της εγκεφαλικής ισχαιμίας/ τραυματισμού επαναιμάτωσης. Int J Mol Sci. 2016; 17 (7). doi:10.3390/ijms17071190
31. Adibhatla RM, Hatcher JF. Οξείδωση και υπεροξείδωση λιπιδίων στην υγεία και τη νόσο του ΚΝΣ: Από τους μοριακούς μηχανισμούς στις θεραπευτικές ευκαιρίες. Σήμα αντιοξειδωτικής οξειδοαναγωγής. 2010; 12 (1): 125–169. doi:10.1089/ ars.2009.2668
32. Staroń A, Mąkosa G, Koter-Michalak M. Οξειδωτικό στρες σε ερυθροκύτταρα από ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα. Rheumatol Int. 2012; 32(2):331–334. doi:10.1007/s00296-010-1611-2
33. Aşcı S, Demirci S, Aşcı H, Doğuç DK, Onaran İ. Νευροπροστατευτικές επιδράσεις της πρεγκαμπαλίνης στην εγκεφαλική ισχαιμία και επαναιμάτωση. Balkan Med J. 2016;33(2):221–227. doi:10.5152/balkanmedj.2015.15742
34. Tao T, Li CL, Yang WC, et al. Προστατευτικές επιδράσεις της προποφόλης έναντι ολικής εγκεφαλικής ισχαιμίας/ τραυματισμού επαναιμάτωσης σε αρουραίους μέσω της αναστολής της οδού του παράγοντα που προκαλεί απόπτωση. Brain Res.2016;1644: 9–14. doi:10.1016/j.brainres.2016.05.006
35. Martinou JC, Youle RJ. Μιτοχόνδρια σε απόπτωση: Bcl-2 μέλη της οικογένειας και μιτοχονδριακή δυναμική. Dev Cell. 2011; 21 (1): 92–101. doi:10.1016/j.devcel.2011.06.017
36. Borner C, Andrews DW. Ο αποπτωτικός πόρος στα μιτοχόνδρια: Διαπερνάμε ή ακόμα κολλάμε; Διαφέρει ο κυτταρικός θάνατος. 2014; 21 (2): 187–191. doi:10.1038/cdd.2013.169
37. Siddiqui WA, Ahad A, Ahsan H. Το μυστήριο της οικογένειας BCL2: Bcl-2 πρωτεΐνες και απόπτωση. Μια ενημέρωση. Arch Toxicol. 2015; 89 (3): 289–317. doi:10.1007/s{10}}
38. Maes ME, Schlamp CL, Nickells RW. BAX στα βασικά: Πώς η οικογένεια γονιδίων BCL2 ελέγχει τον θάνατο των γαγγλιακών κυττάρων του αμφιβληστροειδούς. Prog Retin Eye Res. 2017; 57:1–25. doi:10.1016/j.preteyeres.2017.01.002
39. Erfani S, Khaksari M, Oryan S, Shamsaei N, Aboutaleb N, Nikbakht F. Το Nampt/PBEF/visfatin ασκεί νευροπροστατευτικά αποτελέσματα έναντι τραυματισμού ισχαιμίας/επαναιμάτωσης μέσω διαμόρφωσης του λόγου Bax/Bcl-2 και πρόληψης της κασπάσης{ {2}} ενεργοποίηση. J Mol Neurosci. 2015; 56 (1): 237–243. doi:10.1007/s{10}}

40. Chen L, Cao J, Cao D, et al. Protective effect of dexmedetomidine

κατά της επιδεινούμενης από διαβητική υπεργλυκαιμία εγκεφαλικής ισχαιμίας/ τραυματισμού επαναιμάτωσης: Μια in vivo και in vitro μελέτη, Life Sdi,2019:235:116553.doi; 10.1016/ilfs.2019116553

41. Zhao Η, Luo Υ, Chen L, et αϊ. Το Sirt3 αναστέλλει τον τραυματισμό της εγκεφαλικής ισχαιμίας-επαναιμάτωσης μέσω της ομαλοποίησης της οδού Wnt/-κατενίνης και του αποκλεισμού της μιτοχονδριακής σχάσης. Κυτταρικό στρες Chaperones. 2018; 23(5): 1079–1092. doi:10.1007/s12192-018-0917-y

42. Zhang W, Wei R, Zhang L, Tan Y, Qian C. Το Sirtuin 6 προστατεύει τον εγκέφαλο από εγκεφαλική ισχαιμία/ τραυματισμό επαναιμάτωσης μέσω της ενεργοποίησης του NRF2. Neuroscience.2017;366:95–104. doi:10.1016/j.neuroscience.2017.09.035