Η εντερική προστασία από τις προανθοκυανιδίνες περιλαμβάνει αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις δράσεις σε συνδυασμό με βελτίωση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη, στα λιπίδια και στην ομοιόσταση της γλυκόζης Μέρος 2

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Έκφραση Tein με χρήση Western blot. Το Σχήμα 6 δείχνει ότι η προσθήκη Fe/Asc σε κύτταρα Caco-2/15 αύξησε το επίπεδο των δύο σημαντικών ενζύμων, αλλά τα PAC αντιστάθμισαν την επαγόμενη από Fe/Asc ανοδική ρύθμιση.

Δεδομένου ότι η σηματοδότηση της ινσουλίνης ρυθμίζει τις διαδικασίες της λιπογένεσης, της οξείδωσης FA και της γλυκονεογένεσης, ήταν σημαντικό να διερευνηθεί η επίδραση των Fe/Asc και PAC στα MAPKs και τα PI3K/Akt, τα δύο κύρια μονοπάτια σηματοδότησης της ινσουλίνης. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα Caco{-2/15 προεπωάστηκαν με ινσουλίνη πριν από τα άλλα κύτταρα Caco-2/15

Εικόνα 6. Επιδράσεις των PAC στη γλυκογένεση σε κύτταρα Caco-2/15. Προανθοκυανιδίνες (PACs, 250 ug/mL) προστέθηκαν στο διαμέρισμα των κορυφαίων κυττάρων για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία με Fe/Asc (200μM/2 mM) για 6 ώρες στους 37 βαθμούς. Η έκφραση πρωτεΐνης της (Α) G6Pase και (Β) PEPCK αξιολογήθηκε με στύπωμα Western.σκόνη κιστάνιΤα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τον μέσο όρο±SEM 3 ανεξάρτητων πειραμάτων, το καθένα εις τριπλούν. Εμφανίζεται ένα αντιπροσωπευτικό στύπωμα Western, που απεικονίζει ένα πείραμα εις τριπλούν στο ίδιο τζελ και στην ίδια έκθεση.*P<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">ρίζα κιστανάκιG6Pase γλυκόζη-6-φωσφατάση, PEPCK φωσφοενολοπυρουβική καρβοξυκινάση.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

θεραπείες προκειμένου να ενεργοποιηθεί η οδός σηματοδότησης. Ενώ το Fe/Asc αύξησε την έκφραση της πρωτεΐνης p38-MAPK και την αναλογία φωσφορ38-MAPK/p38-MAPK, τα PAC απέτρεψαν αυτές τις ενέργειες (Εικ. 7A-C). Από την άλλη πλευρά, ενώ το Fe/Asc μείωσε την πρωτεϊνική μάζα του φωσφο Akt (pAkt) και την αναλογία Akt/Akt, τα PAC έδειξαν την ικανότητα να διατηρούν το φυσιολογικό τους επίπεδο. Μια παρόμοια τάση σημειώθηκε για το PI3K (Εικ. 7D-I. Ως εκ τούτου, αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν τον ευνοϊκό ρόλο των PAC στη σηματοδότηση της ινσουλίνης.

Συζήτηση

Οι πολυφαινόλες είναι γνωστές για τα πλειοτροπικά βιολογικά και φαρμακευτικά τους αποτελέσματα, γεγονός που εξηγεί την έλξη πολλών επιστημόνων και βιομηχανιών τροφίμων σε αυτά τα συναρπαστικά φυσικά προϊόντα φυτικής προέλευσης. Τα PAC ξεχωρίζουν από την ποικιλία και τον υψηλό αριθμό πολυφαινολών λόγω των φαρμακολογικών και θεραπευτικών επιπτώσεών τους στις χρόνιες διαταραχές2021. Παρά τα αξιέπαινα χαρακτηριστικά τους, υπάρχουν ακόμη πολλά που παραμένουν άγνωστα σχετικά με την επιρροή τους στον γαστρεντερικό σωλήνα, ο οποίος αναπτύσσει εκτεταμένα πεπτικά, ανοσολογικά, νευρωνικά και μεταγονιδιωματικά δίκτυα2.ύπνος σιστάνιΓια το λόγο αυτό, στην παρούσα έρευνα έχουν αφιερωθεί προσπάθειες για να διευκρινιστεί ο ρόλος των PAC στο εντερικό OxS, την αντιοξειδωτική άμυνα, τη φλεγμονή, την οξείδωση FA, τη λιπογένεση και τη γλυκονεογένεση, ενώ ταυτόχρονα επιχειρείται να διευκρινιστούν οι υποκείμενοι μηχανισμοί όπως η σηματοδότηση της ινσουλίνης. και την κατάσταση των παραγόντων μεταγραφής.

Για να διερευνήσουμε τα αποτελέσματα του PAC, χρησιμοποιήσαμε την κυτταρική σειρά Caco-2/15, ένα δημοφιλές εντερικό μοντέλο που εκτιμάται κυρίως από την επιστημονική κοινότητα2 και αναγνωρίζεται από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων για διαδικασίες πρόσληψης και μεταφοράς4. Όχι μόνο τα κύτταρα Caco-2/15 διαφοροποιούνται αυθόρμητα σε λειτουργικά και μορφολογικά παρόμοια με ανθρώπινα εντεροκύτταρα3,25, αλλά χρησιμεύουν επίσης για την αποτελεσματική διερεύνηση της απορρόφησης και των αλληλεπιδράσεων του εντέρου, τη διατροφή, την τοξικολογία, τη μικροβιολογία τροφίμων, τις δοκιμές βιοδιαθεσιμότητας και τον έλεγχο διαπερατότητα φαρμάκων στο πρόγραμμα ανακάλυψης2²627. Όπως και στις προηγούμενες αναφορές μας σχετικά με διάφορα θέματα28-3】, η κυτταρική σειρά Caco-2/15 έπαιξε καθοριστικό ρόλο στην τρέχουσα μελέτη για την αποκάλυψη της δυνατότητας των PAC να ρυθμίζουν διάφορες μεταβολικές οδούς. Είναι σημαντικό ότι σε αυτή τη μελέτη, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πορώδη φίλτρα, επιτρέποντας την πρόσβαση και στις δύο πλευρές του διπολικού εντερικού επιθηλίου: κορυφαία και βασεοπλάγια διαμερίσματα που αντιστοιχούν στον εντερικό αυλό ή στην οροειδική κυκλοφορία, αντίστοιχα. Επιπλέον, προεπωάσαμε το Caco{{14} /15 κύτταρα με Fe/Asc, καθώς αυτό το σύστημα ήταν πολύ σχετικό στο εργαστήριό μας για την πρόκληση ισχυρού OxS και φλεγμονής, οι οποίες με τη σειρά τους αμφισβητήθηκαν από ένα μεγάλο φάσμα τελεστών17,1932-3 Αξιοσημείωτο, το Fe/Asc ως ισχυρό οξυγόνο -το σύστημα παραγωγής ριζών προκαλεί οξειδωτική βλάβη στα βιολογικά μακρομόρια, μεταβάλλει το ενδοκυτταρικό οξειδοαναγωγικό περιβάλλον και εμπλέκεται σε πολυάριθμες παθολογικές καταστάσεις2.35,56. Τα ευρήματά μας δείχνουν σημαντική αύξηση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων (υψηλά επίπεδα MDA) μαζί με ευάλωτη αντιοξειδωτική άμυνα (χαμηλό GPx και εκφράσεις πρωτεΐνης SOD2).οφέλη του cistanche tubulosaΕπιπλέον, λόγω της ικανότητάς του να δημιουργεί υπεροξείδια λιπιδίων, το σύμπλεγμα Fe/Asc προάγει τη φλεγμονή όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη έκφραση των TNFa, COX2 και NF-is. Συλλογικά, τα παρόντα αποτελέσματα επικυρώνουν τη δημιουργία ριζών και φλεγμονών σε απόκριση σε Fe/Asc

Η παρουσία των PAC εξουδετέρωσε την προκαλούμενη από Fe/Asc υπεροξείδωση λιπιδίων. Καθώς η αποτυχία της αντιοξειδωτικής άμυνας θα μπορούσε να εξηγήσει την επαγωγή του OCS, εξετάσαμε τη δράση του σε ενδογενή αντιοξειδωτικά ένζυμα. Στην πραγματικότητα, τα PAC μπόρεσαν να αποκαταστήσουν την πτώση SOD2 και GPx που προκαλείται από Fe/Asc. Για να οριοθετήσουμε τον μηχανισμό για την έξαρση του OxS από Fe/Asc και την ανακούφιση από τα PACs, αξιολογήσαμε τη σηματοδοτική οδό Keap1-NRF2-αντιοξειδωτικού στοιχείου απόκρισης (ARE), η οποία θεωρείται το πιο ισχυρό ενδογενές αντιοξειδωτικό ρυθμιστής37.τσάι κιστάνσεΟ NRF2 είναι ένας κυτταρικός αισθητήρας OCS του οποίου η λειτουργία είναι η διατήρηση της ομοιόστασης οξειδοαναγωγής. Σε κανονικές συνθήκες. Το NRF2 υφίσταται συνεχώς ουμπικιτινοποίηση και στοχεύει στην πρωτεασωμική αποικοδόμηση από τον αρνητικό δεσμευμένο ρυθμιστή Keap18. Παρουσία ενδογενών και εξωγενών τελεστών, το Keapl αδρανοποιείται και ρυθμίζεται προς τα κάτω, διαταράσσοντας έτσι την αλληλεπίδραση Keapl-NRF2 και απελευθερώνοντας το NRF2, το οποίο μετατοπίζεται στον πυρήνα του κυττάρου, δεσμεύεται στους υποκινητές που περιέχουν

Εικόνα 7. Επιδράσεις των PAC στην ευαισθησία στην ινσουλίνη στην κυτταρική σειρά Caco-2/15. Προανθοκυανιδίνες (PACs, 250 ug/mL) προστέθηκαν στο διαμέρισμα των κορυφαίων κυττάρων για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία με Fe/Asc (200μM/2 mM) για 6 ώρες στους 37 βαθμούς. Δύο ώρες πριν από το τέλος της 6ωρης επώασης με μίγμα Fe/Asc, προστέθηκε ινσουλίνη (100 ηΜ) για να αξιολογηθεί η ευαισθησία στην ινσουλίνη. Η έκφραση πρωτεΐνης του (A) p38-MAPK, (B) φωσφόρου p38-MAPK, (D)Akt, (E)phospho Akt, (G) PI3k και (H) φωσφο PI3k ήταν αξιολογήθηκε με Western blot. Στη συνέχεια υπολογίστηκαν οι αναλογίες(C) phospho p38-MAPK/p38-MAPK,(F)phospho Akt/Akt και (Dphospho PI3k/PI3k. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους±SEM 3 ανεξάρτητων πειραμάτων Εμφανίζεται ένα αντιπροσωπευτικό Western blot, που απεικονίζει ένα πείραμα εις τριπλούν στην ίδια γέλη και με την ίδια έκθεση.*P<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">

ARE, και επιταχύνει τη μεταγραφή των αντιοξειδωτικών ενζύμων39. Σύμφωνα με τα δεδομένα μας, η επεξεργασία των κυττάρων Caco-2/15 με PACs κατέστειλε το Keapl και πιθανότατα επέτρεψε στον NRF2 να μετατοπιστεί στον πυρήνα επιτρέποντας τη δέσμευση στο ARE (πυρηνική αλληλουχία: 5'TGACnnnGC3') στην περιοχή προαγωγέα των αντιοξειδωτικών γονιδίων (SOD2 και GPx), με αποτέλεσμα τη διέγερση της μεταγραφής τους και τη συντονισμένη ανοδική ρύθμιση. Σύμφωνα με αυτά τα δεδομένα, η ένωση φαινολικής ρεσβερατρόλης εμπόδισε το OxS σε αρθρικά κύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες με ρευματοειδή αρθρίτιδα που έλαβαν θεραπεία με Η,Ο, προάγοντας την έκφραση του NRF2 και μειώνοντας την έκφραση του Keap12. Επιπλέον, σύμφωνα με τους Kanzaki et al, η ενεργοποίηση αντιοξειδωτικών και κυτταροπροστατευτικών ενζύμων μπορεί να συσχετιστεί με την αναλογία NRF2/Keapl1.

Όπως αναμενόταν από τη βελτίωση του OCS, τα PAC μείωσαν σημαντικά τη φλεγμονή, όπως αποδεικνύεται από τη μείωση της ρύθμισης των TNFa και COX2. Επειδή το NF-KB είναι ένας βασικός ρυθμιστής των προφλεγμονωδών κυτοκινών, εξετάσαμε την απόκρισή του στα PAC. Σύμφωνα με την τάση των φλεγμονωδών παραγόντων, τα PAC ακύρωσαν την επαγωγή NF-KB με τη μεσολάβηση Fe/Asc και μείωσαν την αναλογία NF-KB/IikB. Έτσι, μπορούμε εύλογα να υποθέσουμε ότι τα PAC βοηθούν στην προστασία από φλεγμονή που θέτει σε κίνδυνο τις λειτουργίες των εντερικών κυττάρων μέσω του ελέγχου του NF-kB, του κύριου ρυθμιστή της φλεγμονώδους απόκρισης. Αξίζει να αναφερθεί ότι τα PAC μπορεί να προστατεύουν από τη φλεγμονή διεγείροντας τους κυτταρικούς αντιοξειδωτικούς αμυντικούς μηχανισμούς καθώς υπάρχει στενή σχέση μεταξύ βιοδεικτών ανισορροπίας οξειδοαναγωγής και φλεγμονής2.

Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει τις επιδράσεις του Pac στην ομοιόσταση των λιπιδίων του εντέρου. Τα ενδιαφέροντα ευρήματά μας έδειξαν ότι τα PAC ρύθμισαν προς τα πάνω το CPTla, από τη μία πλευρά, και μείωσαν το FAS, που αντιπροσωπεύουν τους βιοδείκτες της οξείδωσης και της λιπογένεσης FA, αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, αυτά τα ένζυμα είναι πιθανοί στόχοι των PACs, γεγονός που υποδεικνύει την πολυφαινολική δυνατότητα αποτροπής της συσσώρευσης λιπιδίων, που θεωρείται παθολογική εκδήλωση της φλεγμονής του OxSand σε πολλούς ιστούς*3. Οι μοριακοί μηχανισμοί πιθανώς σχετίζονται με την ανοδική ρύθμιση του PPARa και την καθοδική ρύθμιση του SREBPlc, δύο μεταγραφικοί παράγοντες που ρυθμίζουν τον μεταβολισμό των λιπιδίων. Το FAS είναι το κεντρικό ένζυμο στη λιπογένεση, υπεύθυνο για την κατάλυση της μετατροπής του μηλονυλο-CoA σε FAs45. Από την πλευρά του, το ACC καταλύει το σχηματισμό του μαλονυλο-CoA, ενός ουσιαστικού υποστρώματος για το FAS. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας, οι πολυφαινόλες Solanum nigrum βρέθηκαν επίσης να μειώνουν τα FAS και SREBP, ενώ αυξάνουν τα CPTla και PPARa σε ηπατοκύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με ελαϊκό οξύ»6.

Οι μηχανισμοί δράσης των πολυφαινολών συνδέονται γενικά με την ενεργοποίηση της φωσφορυλίωσης AMPKa7. Είναι σημαντικό ότι το φωσφορυλιωμένο AMPKa στη μελέτη μας μειώθηκε από το Fe/Asc, αλλά διεγέρθηκε από τα PAC, γεγονός που εξηγεί τη μείωση της ρύθμισης του φωσφορικού ACC, με αποτέλεσμα την αναστολή της λιπογένεσης και τον αυξημένο ενεργειακό μεταβολισμό. Ωστόσο, η έκφραση πρωτεΐνης του AMPKa αυξήθηκε από το επαγόμενο από Fe/Asc OxS σε κύτταρα Caco2/15. Συνεπώς, τα ROS και OxS μπορεί να επάγουν AMPKa μέσω διαφορετικών ανοδικών κινασών8.

Το OCS και η φλεγμονή προκαλούν ισχυρά αντίσταση στην ινσουλίνη και πρόσθετες μεταβολικές διαταραχές9,50, γεγονός που μας ώθησε να εκτιμήσουμε την ικανότητα του Pac να ρυθμίζει ορισμένες βασικές πρωτεΐνες σε σχέση με το μονοπάτι σηματοδότησης της ινσουλίνης. Αρχικά εστιάσαμε στο p38-MAPK του οποίου η έκφραση βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω από το OxS ενώ παρεμβαίνει στον καταρράκτη σηματοδότησης των υποδοχέων ινσουλίνης. Η ανάλυση της p{3}}MAPKφωσφορυλίωσης και ο υπολογισμός της αναλογίας φωσφο p38-MAPK/p38-MAPK αποκάλυψαν σημαντική αύξηση στην απόκριση σε Fe/Asc, η οποία είναι συμβατή με μειωμένη IS στο Caco{ {6}}/15 κελιά. Η επικύρωση ελήφθη με την πτώση των pAkt και PI3K. Αντίθετα, τα PAC αντέστρεψαν την τάση καθώς εμφάνιζαν την ικανότητα να μειώνουν τη φωσφορυλίωση p38-MAPK και την αναλογία φωσφοp{10}}MAPK/p38-MAPK ενώ ενίσχυαν τη οδό σηματοδότησης PI3K/Akt, που είναι γνωστό ότι μεσολαβεί στις κύριες βιολογικές δράσεις της ινσουλίνης ρυθμίζοντας τη μεταφορά γλυκόζης, τη σύνθεση πρωτεϊνών, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την κυτταρική επιβίωση και τη γλυκονεογένεση. Η διαταραχή του IS λόγω OxS και χρόνιας φλεγμονής μπορεί επίσης να επηρεάσει τη διαδικασία γλυκονεογένεσης3,54. Η ανάλυση των δύο κύριων ενζύμων που εμπλέκονται στη de novo σύνθεση γλυκόζης (PEPCK, G6Pase) αποκάλυψε σημαντική αύξηση στην απόκριση σε Fe/Asc ενώ η χορήγηση PACs τα επανέφερε σε φυσιολογικά επίπεδα στα κύτταρα Caco2/15.

Συμπερασματικά, πολυάριθμες μελέτες στην επιστημονική βιβλιογραφία καταδεικνύουν σημαντικές επιπτώσεις στην υγεία των φαινολικών ενώσεων είτε ως συγκεκριμένο φαινολικό μόριο είτε ως μείγμα πολλών πολυφαινολών με έμμεσα στοιχεία. Η παρούσα εργασία επισημαίνει την κρίσιμη επίδραση των PACs (σύνθετες φλαβανόλες) στην εντερική ομοιόσταση προλαμβάνοντας το OxS, τη φλεγμονή και τις σχετικές μεταβολικές διαταραχές. Δεδομένου ότι τα PAC μπορεί να μην απορροφώνται πλήρως από το λεπτό έντερο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για τη διερεύνηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στις ευεργετικές επιδράσεις τους στην υγεία στο λεπτό έντερο.

Υλικό και μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία εντερικού Caco-2/15. Για όλα τα πειράματα, χρησιμοποιήσαμε την κυτταρική σειρά του ανθρώπινου επιθηλιακού ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος Caco{-2/15, έναν σταθερό κλώνο των μητρικών κυττάρων Caco-2 (American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA), που ελήφθη από τον Dr. JF Beaulieu (Τμήμα Κυτταρικής Βιολογίας, Ιατρική Σχολή, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Κεμπέκ, Καναδάς). Η κυτταρική σειρά Caco-2/15 έχει τη μοναδική ιδιότητα να διαφοροποιείται in vitro σε πολωμένα ώριμα εντεροκύτταρα και να σχηματίζει ένα αδιαπέραστο μονοπάτι. Τα κύτταρα Caco-2/15 καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως323455 και χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της ακεραιότητας των κυττάρων, της OCS και της φλεγμονής17,19 και IS56.

Ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης με ανοσοστύπωμα. Μετά από επώαση με διάφορες επεξεργασίες, τα κύτταρα Caco-2/15 λύθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM Na2E-DTA, 1 mM EGTA, 1 τοις εκατό NP -40, 1 τοις εκατό δεοξυχολικό, 2,5 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM Na2VO4, 1 ug/mL λευπεπτίνης και 1 mM PMSF. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης κάθε δείγματος προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford (Bio-Rad). Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μετουσιώθηκαν για 5 λεπτά σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος που περιείχε SDS και β-μερκαπτοαιθανόλη. Τα ομογενοποιημένα προϊόντα που περιείχαν 15 ug συνολικών πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα 10 τοις εκατό SDS-πολυακρυλαμιδίου σύμφωνα με τα μοριακά βάρη της πρωτεΐνης και ηλεκτροστυπώθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Το γάλα χωρίς λίπος χρησιμοποιήθηκε για τον αποκλεισμό μη ειδικών θέσεων των μεμβρανών πριν από την προσθήκη πρωτογενών αντισωμάτων κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 βαθμούς. Η αραίωση των αντισωμάτων αναφέρεται στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες και στην πρόσφατη δημοσίευσή μας. Οι αντιδραστικές ζώνες καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας ένα ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad). Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως η αναλογία της πρωτεΐνης στόχου προς -ακτίνη στο ίδιο δείγμα.

Στατιστική ανάλυση. Όλες οι τιμές εκφράζονται ως ο μέσος όρος±SEM τουλάχιστον τριών διαφορετικών πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από δοκιμές πολλαπλών συγκρίσεων του Tukey χρησιμοποιώντας PRISM 7.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές στο P<>

Αυτό το άρθρο προέρχεται από το Scientifc Reports|(2021) 11:3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5