Νανοένζυμα που μιμούνται την καταλάση με αίσθηση φλεγμονής ανακουφίζουν την οξεία νεφρική βλάβη μέσω της αντιστροφής του τοπικού οξειδωτικού στρες

Περίληψη

Ιστορικό: Τοαντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)και η φλεγμονή, ένας κρίσιμος παράγοντας που συμβάλλει στη βλάβη των ιστών, είναι γνωστό ότι σχετίζεται με διάφορες ασθένειες. Ο νεφρός είναι ευαίσθητος στην υποξία και ευάλωτος σε ROS. Έτσι, ο φαύλος κύκλος μεταξύοξειδωτικό στρεςκαι νεφρικήη υποξία συμβάλλει κρίσιμαστην εξέλιξη τουχρόνια νεφρική νόσοκαι τέλος,νεφρική νόσο τελικού σταδίου. Έτσι, η παροχή θεραπευτικών παραγόντων στην πλούσια σε ROS περιοχή φλεγμονής και η απελευθέρωση των θεραπευτικών παραγόντων είναι μια εφικτή λύση.

Νέα βότανα για νεφρική νόσο

Αποτελέσματα: Αναπτύξαμε μια ευέλικτη νανο-πλατφόρμα μακράς κυκλοφορίας, με ανίχνευση φλεγμονής, που σαρώνει ROS, φορτώνοντας σταθερά 1-δωδεκανοθειόλη σταθεροποιημένο Mn3O4 (dMn) που μιμείται την καταλάση3O4) νανοσωματίδια μέσα σε ευαίσθητα σε ROS nanomiκύτταρα (PTC), με αποτέλεσμα ένα ευαίσθητο στο ROS νανοένζυμο (PTC-M). Υδροφοβικό dMn3O4νανοσωματίδια φορτώθηκαν μέσαΜικκύλια PTC για την πρόληψη της πρόωρης απελευθέρωσης κατά τη διάρκεια της κυκλοφορίας και δρουν ως θεραπευτικός παράγοντας με απόκριση στο ROSαπελευθέρωση φορτωμένου dMn3O4μόλις έφτασε στο σημείο της φλεγμονής.

Λέξεις-κλειδιά:Νανοσωματίδια Mn3O4, Νανοένζυμα, Φλεγμονή,Ισχαιμία-επαναιμάτωση, νεφρό

Φόντο

Acute kidney injury (AKI) is the term that covers a broad spectrum of renal function deterioration ranging from small changes in serum creatinine level to conditions requiring renal replacement therapy [1]. The KDIGO (Kidney disease: improving global outcomes) guidelines define AKI as an increase in serum creatinine of either>0.3  mg/dL within 48  h,>1,5 φορές από την έναρξη εντός επτά ημερών ή μείωση του όγκου των ούρων του<0.5 ml/kg/hour for six hours [1]. AKI is one of the rising global health problems that cause high morbidity and mortality and economic burden [2]. The incidence of AKI defined by the KDIGO guidelines was 21.6% in adults in in-hospital settings [3]. AKI may lead to several complications, including metabolic acidosis, hyperkalemia, uremia, volume overload, and damage to other organ systems, including death. Despite advances in medicine, mortality from AKI is still high. According to a meta-analysis of studies in in-hospital settings, AKI-associated mortality was reported to be 23.9% in adults [3]. The mortality rate of dialysis-requiring AKI patients exceeds 50% [4]. AKI increases the long-term risk of subsequent AKI, progressive chronic kidney disease (CKD), and end-stage renal disease (ESRD) [5]. Eventually, AKI increases socioeconomic and healthcare burdens. Nevertheless, there is no clear treatment for AKI to date. When AKI occurs, conservative treatments such as removing the causative factors, controlling water and electrolyte imbalances, performing renal replacement therapy, if necessary, and waiting for renal function to recover are applied.

Κάκωση ισχαιμίας-επαναιμάτωσης (IRI)είναι τραυματισμός οργάνου που προκαλείται από την παροδική μείωση ή διακοπή της ροής του αίματος, ακολουθούμενη από επαναιμάτωση, και μπορεί να εμφανιστεί σε ποικίλες κλινικές καταστάσεις, όπως σοκ, έμφραγμα του μυοκαρδίου, ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο, μείζονα χειρουργική επέμβαση και μεταμόσχευση οργάνων. Η νεφρική IRI είναι μια από τις κύριες αιτίες της ΑΚΙ, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την ταχεία μείωση της νεφρικής λειτουργίας. Ο νεφρός είναι ένα όργανο που είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο σε ισχαιμικές προσβολές και τα τραυματισμένα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα προκαλούν διαδοχικά διαταραχή της απέκκρισης των αποβλήτων και τον έλεγχο της ισορροπίας νερού, ηλεκτρολυτών και οξέος-βάσης [6]. Ο μηχανισμός της βλάβης των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων στην IRI είναι γνωστό ότι περιλαμβάνει φλεγμονή που προκαλείται από αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) που δημιουργούνται κατά την επαναιμάτωση [6-8]. Ως εκ τούτου, έχουν γίνει προσπάθειες να εφαρμοστεί ο καθαρισμός ROS στη θεραπεία της IRI. Ωστόσο, η πραγματική κλινική χρήση του έχει περιοριστεί λόγω ανησυχιών για συστηματικές παρενέργειες, οι οποίες περιλαμβάνουν αντιδράσεις υπερευαισθησίας [9]. Η χορήγηση αντιοξειδωτικών όπως η εδαραβόνη έχει ήδη χρησιμοποιηθεί για τον καθαρισμό των ROS στην IRI. Ωστόσο, συνοδεύτηκε από αρκετές παρενέργειες και ως εκ τούτου, έχουν γίνει απαιτήσεις για νέα και αποτελεσματικά αντιοξειδωτικά όπως τα νανοένζυμα (νανοϋλικά που παρουσιάζουν φυσική ενζυμική δράση) [9-13]. Οι Yao et al. διαπίστωσε ότι τα σωματίδια Mn3O4 nan διέθεταν πολλαπλές δράσεις μίμησης ενζύμων, π.χ. δραστικότητα μίμησης υπεροξειδίου δισμουτάσης και καταλάσης καθώς και δράση δέσμευσης ριζών υδροξυλίου [11]. Αποδείχθηκε ότι το Mn3O4 διέθετε ισχυρότερη ικανότητα σάρωσης ROS από άλλα ένζυμα όπως τα V2O5, CeO2, Co3O4, MnFe2O4 και Fe3O4 και ήταν καλύτερη από αυτή άλλων τύπων οξειδίου του μαγγανίου (MnOx (MnO2, MnO και Mn2O3).

Εικ. 1 Σχηματική απεικόνιση που δείχνει την προετοιμασία και τον τρόπο δράσης του PTC-M A Σύνθεση του PTC-M, B Μηχανισμός δράσης του PTC-M (1) ενδοφλέβια ένεση του PTC-M (2) το PTC-M που εγχύεται κυκλοφορεί στο αίμα και συσσωρεύεται στη θέση φλεγμονής (3) η αποσταθεροποίηση του PTC-M λόγω του εγγενούς ROS που υπάρχει στη θέση φλεγμονής (4) η απελευθέρωση του φορτωμένου dMn 3O4 στη θέση φλεγμονής (5) το απελευθερωμένο dMn3O4 καταλύει τη σάρωση ROS που οδηγεί σε (6) μείωση της φλεγμονής, απόπτωσης και ίνωσης (7) ανακούφιση της νεφρικής βλάβης και (8) βελτιωμένη νεφρική λειτουργία

Αποτελέσματα

Σύνθεση και χαρακτηρισμός νανοσωματιδίων dMn3O4 και συζυγών πολυμερών

Τα dMn3O4 NPs συντέθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συγκαταβύθισης και σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ομάδες θειόλης 1-δωδεκανοθειόλης (Εικ. 2Α). Η ανάλυση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο εκπομπής πεδίου (FE-TEM) έδειξε ότι τα NP dMn3O4 είχαν μέσο μέγεθος μικρότερο από 2{{1{0}} nm (18.0±0,6 nm) (Εικ. 2B) (Εικ. 2B) ). Πρόσθετο αρχείο 1: Τα σχήματα S1A και S1B δείχνουν τις εικόνες και τη σχηματική αναπαράσταση του προετοιμασμένου dMn3O4. Τα δεδομένα της φασματοσκοπίας ακτίνων Χ διασποράς ενέργειας (EDS) έδειξαν την παρουσία Mn από Mn3O4 και θείου και άνθρακα από SH-C12 (Εικ. 2C και πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S1C). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης της φασματοσκοπίας φωτονίων ακτίνων Χ (XPS) απεικόνισαν το φάσμα XPS του Mn 2p, το οποίο αποτελούνταν από δύο κορυφές που βρίσκονται στα 641,42 eV και 653,23 eV και αυτές οι κορυφές αποδίδονταν σε Mn 2p3/2 και Mn 2p1/2, αντίστοιχα (Εικ. 2D και πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S2). Το ενεργειακό χάσμα μεταξύ αυτών των δύο κορυφών ήταν 11,81 eV, το οποίο ήταν σε καλή συμφωνία με την αναφερόμενη βιβλιογραφία για το Mn3O4. Στο μοτίβο περίθλασης σκόνης ακτίνων Χ (XRD) των dMn3O4 NPs, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε, όλες οι μετρούμενες κορυφές περίθλασης ταίριαξαν καλά με το τυπικό σχέδιο του hausmannite Mn3O4 [ICDD: #001–1127], επιβεβαιώνοντας την εξαιρετικά κρυσταλλική τους φύση. Το σύζευγμα PTC που ανταποκρίνεται στο ROS παρασκευάστηκε μέσω σταδιακών χημικών αντιδράσεων όπου ο συνδετήρας θειοκετάλης (ΤΚ) με μια τερματική καρβοξυλική ομάδα προσδιορίστηκε το πρώτο μέγεθος. Η καρβοξυλική ομάδα του συνδέτη ΤΚ στη συνέχεια συζεύχθηκε με την αμινομάδα της μεθοξυ-PEG αμίνης (PEG-AM) χρησιμοποιώντας την αντίδραση EDC/NHS για να σχηματίσει PEG-TK. Τέλος, η άλλη καρβοξυλική ομάδα της PEG-TK συζεύχθηκε με την αμινομάδα της στεαραμίνης ξανά μέσω της αντίδρασης EDC/NHS [15]. Το ROS μη αποκρινόμενο συζυγές PC παρασκευάστηκε με σύζευξη στεατικού οξέος με PEG-AM. Η σύνθεση του PTC και του PC αναλύθηκε με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού 1Η (NMR) (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S3). Τα φάσματα NMR έδειξαν χαρακτηριστικές κορυφές στα δ 0,83 και 1,23 ppm που αντιστοιχούν στα πρωτόνια μεθυλίου και μεθυλενίου του C18. Η κορυφή στο δ 3,6 αντιστοιχούσε σε O–CH2–CH2- της PEG. Ο βαθμός υποκατάστασης (DS %) του C18 σε PTC και PC υπολογίστηκε ως 78% και 46%, αντίστοιχα

Παρασκευή και χαρακτηρισμός του ενζύμου PTC-M

Τα ευαίσθητα στο ROS νανομικκύλια (PTC) φορτώθηκαν με dMn3O4, με αποτέλεσμα το PTC-M. Η αναλογία τροφοδοσίας dMn3O4 (20%) του PTC χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή του PTC-M. Οι εικόνες υδροδυναμικής διαμέτρου, δυναμικού ζήτα και FE-TEM των προετοιμασμένων PTC και PTC-M φαίνονται στο Σχήμα 3Α και στο Πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S4A. Οι εικόνες FE-TEM του PTC έδειξαν σφαιρικά νανομικκύλια με ομοιόμορφα μεγέθη σωματιδίων. Η υδροδυναμική διάμετρος του PTC-M αυξήθηκε ελαφρώς μετά τη φόρτωση του dMn3O4 λόγω της συσσώρευσης του dMn3O4 στον υδρόφοβο χώρο ενώ το δυναμικό ζήτα παρέμεινε αρνητικό και στα δύο νανομικκύλια λόγω της θωράκισης PEG. Οι εικόνες FE-TEM των PTC και PTC-M έδειξαν ομοιόμορφα κατανεμημένα σωματίδια. Το περιεχόμενο φόρτωσης και η απόδοση της ενθυλάκωσης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας φασματομετρική ανάλυση μάζας και υπολογίστηκαν ότι είναι 10±3% και 17±6%, αντίστοιχα. Η παρουσία dMn3O4 ήταν ορατή στις εικόνες FE-TEM του PTC-M (Εικ. 3Α), η οποία επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανάλυση EDS του PTC-M, που δείχνει Mn από Mn3O4, θείο και άνθρακα από SH-C12 και άνθρακα , άζωτο και οξυγόνο από PEG (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S5). Πραγματοποιήθηκε θερμοβαρυμετρική ανάλυση (TGA) και η φόρτωση dMn3O4 υπολογίστηκε ότι είναι 12% (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S6B). Μικκύλια μη ευαίσθητα στο ROS φορτωμένα με dMn3O4 (PC-M) παρασκευάστηκαν επίσης ως μάρτυρες με την ίδια μέθοδο.

Για να επιβεβαιωθεί ο ρόλος της σύνδεσης TK στην αποσταθεροποίηση του PTC-M που ανταποκρίνεται στο ROS και στην απελευθέρωση του dMn3O4, το PTC-M εκτέθηκε σε συνθήκες ROS με την προσθήκη H2O2. Ως στοιχεία ελέγχου, χρησιμοποιήσαμε το μη ευαίσθητο σε ROS PC-M. Τόσο το PTC-M όσο και το PC-M εμφάνισαν μια σφαιρική μορφολογία με σφιχτά συσκευασμένο dMn3O4 στα νανομικκύλια, αλλά μετά την επεξεργασία με H2O2, η υπερσυναρμολόγηση του PTC-M παραμορφώθηκε, ακολουθούμενη από την απελευθέρωση dMn3O4, η οποία στη συνέχεια συγκεντρώθηκαν όπως φαίνεται στις εικόνες FE-TEM, ενώ το PC-M έδειξε σταθερές δομές ακόμη και μετά την έκθεση σε H2O2 (Εικ. 3Β και Πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S4B). Η ευαισθησία ROS του PTC-M επιβεβαιώθηκε περαιτέρω συγκρίνοντας τις αλλαγές στην υδροδυναμική διάμετρο και το δυναμικό ζήτα με το PC-M, όπως φαίνεται στο πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S7. Η υδροδυναμική διάμετρος και το δυναμικό ζήτα του μη ευαίσθητου στο ROS PC-M δεν έδειξαν καμία διακριτή διαφορά μετά την προσθήκη H2O2. Ωστόσο, το ευαίσθητο στο ROS PTC-M παρουσίασε μειωμένα υδροδυναμικά μεγέθη, πιθανώς λόγω της αφαίρεσης της θωράκισης PEG μέσω θραύσης TK, με αποτέλεσμα την αποσταθεροποίηση της δομής. Μετά την προσθήκη του H2O2, το δυναμικό ζήτα επανήλθε από αρνητικό σε θετικό φορτίο, το οποίο θα μπορούσε να οφείλεται στην αφαίρεση του PEG και στην έκθεση στον ατμό. Μελετήσαμε περαιτέρω τη διακύμανση μεγέθους ελέγχοντας τη σταθερότητα με την πάροδο του χρόνου παρακολουθώντας τις υδροδυναμικές διαμέτρους παρουσία ή απουσία H2O2 (Εικ. 3C). Μετά την προσθήκη H2O2, οι υδροδυναμικές διάμετροι μειώθηκαν σημαντικά μέσα σε 10 δευτερόλεπτα χωρίς περαιτέρω αλλαγές με το χρόνο έως και έξι ημέρες, ενώ το PTC-M μόνο έδειξε σταθερά μεγέθη κατά τη διάρκεια του πειράματος, υποδηλώνοντας την καλή κολλοειδή σταθερότητα του PTC-M. Ελέγξαμε επίσης τη σταθερότητα σε 10% FBS και παρατηρήσαμε ότι το PTC-M έδειξε καλή σταθερότητα για έως και 4 ημέρες (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S9). Οι δυναμικές διάμετροι υδροξυλίου και η διακύμανση του δυναμικού ζήτα επιβεβαιώθηκαν επίσης με ευαίσθητα στο ROS και μη ευαίσθητα κενά νανομικκύλια (PTC και PC) (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S8). Όλες αυτές οι συγκριτικές μελέτες παρουσία ή απουσία ROS κατέδειξαν τη σταθερότητα και την ευαισθησία ROS των παρασκευασμένων νανομορίων ή του τελικού ενζύμου dMn3O4 PTC-M.

Εικ. 2 Σύνθεση και χαρακτηρισμός του dMn3O4 Μια σχηματική απεικόνιση σύνθεσης dMn 3O4, εικόνες B FE-TEM, ανάλυση C EDS, φάσμα D XPS και μοτίβα E XRD των dMn3O4 NP

Ελέγξαμε περαιτέρω την ιδιότητα εξάλειψης του H2O2 του τελικού ενζύμου PTC-M λόγω φόρτωσης NP dMn3O4. Αυτό δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας τερεφθαλικό οξύ (ΤΑ) ως ανιχνευτή μελλοντικών cent. Το TA αντέδρασε με το H2O2 για να σχηματίσει 2-υδροξυτερικό φθαλικό οξύ με κορυφή φθορισμού στα 425 nm. Το dMn3O4 θα μετατρέψει το H2O2 σε νερό και οξυγόνο και ως εκ τούτου, η ένταση του φθορισμού μειώνεται, επιβεβαιώνοντας τη δραστηριότητα της καταλάσης, όπως φαίνεται στο Σχ. 3D. Το Te PTC-M έδειξε ισχυρή μείωση στην ένταση φθορισμού σε σύγκριση με το PTC κενού μικκυλίου παρουσία H2O2 με την πάροδο του χρόνου. Η όμοια με την καταλάση δραστικότητα του PTC-M ήταν επίσης εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση, όπως φαίνεται στο πρόσθετο αρχείο 1: Σχήμα S10. Η ικανότητα παραγωγής οξυγόνου του PTC-M επιβεβαιώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας έναν ειδικό φθορισμού ανιχνευτή Ο2-Ru(DDP) παρουσία H2O2. Ο φθορισμός σε δέκα πόλεις του Ru(DDP) μειώνεται παρουσία O2, υποδηλώνοντας την αποτελεσματική παραγωγή O2. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Ε, η ένταση φθορισμού του Ru(DDP) μειώθηκε παρουσία H2O2 στην ομάδα PTC-M, ενώ η παρουσία του H2O2 στην ομάδα PTC-μόνο έδειξε μικρή μείωση στον φθορισμό (Εικ. 3F). επιβεβαιώνοντας τη δραστηριότητα καταλάσης που οδηγεί σε παραγωγή οξυγόνου στο PTC-M. Τέλος, επιβεβαιώσαμε την ιδιότητα εξάλειψης του H2O2 του PTC-M χρησιμοποιώντας έναν μετρητή ανίχνευσης οξυγόνου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3G, η παραγωγή οξυγόνου από το PTC-M αυξήθηκε εντός του αρχικού χρόνου, ακολουθούμενη από μια αργή αύξηση, ενώ τα άδεια μικκύλια PTC δεν παρουσίασαν παραγωγή οξυγόνου. Η δυσαναλογία του H2O2 παρατηρήθηκε με το σχηματισμό φυσαλίδων οξυγόνου στην ομάδα PTC-M όπως φαίνεται στο πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S11A. Παρατηρήθηκε επίσης ότι το PTC-M έδειξε υψηλότερη παραγωγή οξυγόνου σε σύγκριση με το dMn3O4 μόνο, πιθανώς λόγω της στενής συσκευασίας του dMn3O4 στο PTC-M, καθιστώντας το πιο διαθέσιμο για την αντίδραση σε σύγκριση με το ελεύθερο dMn3O4 (Επιπλέον αρχείο 1: Σχήμα ure S11B). Παρόλο που τα νανομικκύλια είχαν χαλαρώσει λόγω της επεξεργασίας με H2O2, όπως φαίνεται στο FE-TEM, το dMn3O4 μπορεί να εξακολουθούσε να υπάρχει μέσα στο PTC-M, με αποτέλεσμα υψηλή δραστηριότητα καταλάσης σε σύγκριση με το ελεύθερο dMn3O4. Όλα αυτά τα αποτελέσματα μαζί επιβεβαίωσαν την ανώτερη δράση μίμησης καταλάσης του PTC-M.

In vitro κυτταρική βιωσιμότητα και κυτταρική πρόσληψη

Για να επιβεβαιώσουμε την κυτταρική πρόσληψη και, την ευαίσθητη σε ROS πόλη του ενδοκυτταρικά κατανεμημένου ευαίσθητου στο ROS-PTC και το μοτίβο απελευθέρωσης του ωφέλιμου φορτίου, συγκρίναμε το PTC με τις συνθήκες PC in vitro. Αρχικά, ελέγξαμε τη βιωσιμότητα των κυττάρων του προετοιμασμένου PTC, PC, PTC-M και PC-M σε κύτταρα HK-2 με τη δοκιμασία WST-1 (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S12). Τα άδεια μικκύλια υπέστησαν μικρό κυτταρικό θάνατο, αλλά μετά τη φόρτωση dMn3O4-, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε αλλά η αλλαγή δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Δεδομένου ότι τα άδεια μικκύλια δεν ήταν κυτταροτοξικά, η μικρή διακύμανση στη βιωσιμότητα των κυττάρων θα μπορούσε να οφείλεται στο προσροφημένο στην επιφάνεια dMn3O4. Η τιμή IC50 των PTC-M και PC-M προσδιορίστηκε ότι είναι 130,41 και 247,17 ug/ml, αντίστοιχα (Σχ. 4Α). Για να εξεταστεί περαιτέρω η ενδοκυτταρική πρόσληψη και κατανομή των νανομικκυλίων, το IR780 χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο φάρμακο και παρασκεύασε νανομικκύτταρα PTC φορτωμένα με IR780, PTC-IR780 για να απεικονίσει την ένταση φθορισμού του IR780 χρησιμοποιώντας διασκεδαστική μικροσκοπία παρουσίας (Evos FL Auto 2her, Thermo , ΗΠΑ) (Εικ. 4Β). Ως ομάδα ελέγχου, αναλύσαμε επίσης την πρόσληψη του μη ευαίσθητου στο ROS PC-IR780. Σε σύγκριση με το PC-IR780, το PTC-IR780 έδειξε υψηλότερη πρόσληψη σε κύτταρα HK-2 (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S13). Ο ακριβής λόγος πίσω από την ενισχυμένη πρόσληψη του PTC-IR780 σε μη-ROS συνθήκες δεν είναι ξεκάθαρος, ωστόσο, θα μπορούσε να οφείλεται στο ότι το PTC θα μπορούσε να δείξει ελαφρά ευαισθησία στο κανονικό επίπεδο ROS σε συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας που οδηγεί σε αποθωράκιση PEG αφήνοντας την επιφάνεια φορτίο ελαφρώς θετικό. Το PC-IR780 έδειξε παρόμοιο μοτίβο πρόσληψης ανεξάρτητα από το ROS που προκαλείται από τη θεραπεία με H2O2 ή τις συνθήκες ROS που προκαλούνται από υποξία λόγω της μη ευαίσθητης φύσης, ενώ το PTC-IR780 έδειξε διαφορετικό μοτίβο κατανομής μέσα στα κύτταρα, το οποίο θα μπορούσε να οφείλεται στην ενισχυμένη απελευθέρωση του IR780 μέσα στα κύτταρα. Τα προηγούμενα δεδομένα βιωσιμότητας κυττάρων (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S11) που δείχνουν αυξημένο κυτταρικό θάνατο στο PTC-M θα οφείλονταν επίσης στην ενισχυμένη πρόσληψη του PTC από τα κύτταρα σε σύγκριση με τον υπολογιστή. Το ιωδιούχο IR780 είναι μια εξαιρετικά υδρόφοβη χρωστική που μπορεί να δείξει υψηλή συγγένεια προς την κυτταρική μεμβράνη και δείχνει πολύ φωτεινό σήμα ανεξάρτητα από την έκθεση σε ROS. Η κυτταρική πρόσληψη αναλύθηκε περαιτέρω με έλεγχο της μέσης έντασης φθορισμού (MFI) μέσω ανάλυσης ταξινόμησης κυττάρων ενεργοποιημένης με φθορισμό (FACS) (Εικ. 4C), η οποία υποστήριξε τα δεδομένα που ελήφθησαν με μικροσκόπιο φθορισμού. Όπως φαίνεται, το MFI ήταν υψηλότερο στην ευαίσθητη στο ROS ομάδα PTC IR780 σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες, επιβεβαιώνοντας την ενισχυμένη απελευθέρωση του IR780 στα κύτταρα. Συνδέσαμε περαιτέρω το Quan το MFI από διάφορες ομάδες (Εικ. 4D) οι οποίες υποστήριξαν τα δεδομένα μικροσκοπίας υποδηλώνοντας ότι το PC-IR780 δεν εμφάνισε καμία σημαντική διαφορά στην κυτταρική πρόσληψη ακόμη και υπό συνθήκες που προκαλούνται από ROS, ενώ το PTC IR780 έδειξε σημαντική αύξηση στην κυτταρική πρόσληψη όταν αντιμετωπίζεται υπό συνθήκες που προκαλούνται από ROS. Η κυτταρική πρόσληψη PTC προσδιορίστηκε επίσης με έλεγχο του υπολειπόμενου Mn στα κύτταρα μετά από επεξεργασία με PTC-M. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Ε, το PTC-M έδειξε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση πρόσληψη στα κύτταρα HK-2. Αυτά τα αποτελέσματα συνοψίζουν έτσι την ενισχυμένη εσωτερίκευση των νανομικκυλίων και την επιταχυνόμενη απελευθέρωση μέσα στα κύτταρα πιθανώς λόγω της αποσυναρμολόγησης των νανομικκυλίων με τη μεσολάβηση ROS.

Πραγματοποιήσαμε in vitro μελέτες σε κύτταρα HK-2 για να διερευνήσουμε περαιτέρω τις επιδράσεις του PTC-M στις συνθήκες οξειδωτικού στρες σε κυτταρικό επίπεδο. Τα κύτταρα HK-2 διεγέρθηκαν με H2O2, ένα αντιπροσωπευτικό ROS (Εικ. 5Α). Η έκφραση του H2O2 ενίσχυσε την έκφραση της αίμης οξυγενάσης (HO)-1, η οποία βελτιώθηκε με συν-θεραπεία με PTC-M (Εικ. 5Α). Πραγματοποιήθηκε δοκιμασία 2',7'-διχλωροδιϋδροφουορεσκεΐνης διοξικής (DCF DA) για να ελεγχθεί το πρότυπο της ενδοκυτταρικής αλλαγής ROS. Τα κύτταρα HK{15}} που διεγείρονται από H2O2 έδειξαν υψηλή ένταση φθορισμού, αλλά μετά από συν-επεξεργασία με PTC-M, η ένταση φθορισμού μειώθηκε (Εικ. 5Β). Η αναλογία BAX/BCL-2 αυξήθηκε με τη θεραπεία με H2O2, η οποία ανακτήθηκε επίσης με συμθεραπεία PTC-M, υποδεικνύοντας προστασία έναντι της απόπτωσης (Εικ. 5C). Τα κύτταρα HK-2 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με H2O2 εμφάνισαν μια σημαντική προοδευτική αύξηση στη χρώση αννεξίνης V+/PI−, η οποία αποφεύχθηκε από το PTC-M (Εικ. 5D). Η επαγόμενη από H2O2-φωσφορυλίωση ERK, JNK και p38 καταστέλλεται επίσης με συν-θεραπεία με PTC-M, αν και δεν παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στη φωσφορυλιωμένη P38 (Εικ. 5C). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το PTC-M κατέστειλε αποπτωτικές διεργασίες που προκαλούνται από ROS σε νεφρικά σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα.