Νανοένζυμα που μιμούνται την καταλάση με αίσθηση φλεγμονής ανακουφίζουν την οξεία νεφρική βλάβη μέσω αντιστροφής του τοπικού οξειδωτικού στρες Ⅱ

Βιοκατανομή του ενζύμου PTC-M σε ποντικούς IRI

Η βιοκατανομή του PTC διερευνήθηκε σε ποντικούς IRI με φόρτωση της φθορίζουσας χρωστικής IR780 ως μοντέλου φαρμάκου (PTC-IR780). Συγκρίναμε επίσης τη βιοκατανομή των PC-IR780 και IR780 μόνο και παρατηρήσαμε ότι όλες οι ομάδες έδειξαν φθορισμό στα κύρια όργανα, ωστόσο το PTC-IR780 έδειξε ενισχυμένη συσσώρευση στους νεφρούς σε αντίθεση με την ομάδα PC-IR780 ή IR780 (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S14 A ). Ελέγξαμε επίσης το προφίλ βιοκατανομής του PTC-IR780 σε φυσιολογικά ποντίκια και βρήκαμε ότι έδειξε υψηλότερη συσσώρευση ήπατος, κάτι που είναι κοινό για το νανοσωματίδιο μετά από ενδοφλέβια ένεση, αλλά δεν έχει συσσωρευτεί πολύ στους νεφρούς (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S15). Έτσι, συμπεραίνουμε ότι η ενισχυμένηνεφρόσυσσώρευσητου PTC προκαλείται κυρίως από φλεγμονή των νεφρών. Στη μελέτη μας, σχεδιάσαμε νανομικκύλια PTC με τέτοιο τρόπο ώστε να κυκλοφορούν στο αίμα και να συσσωρεύονται σταδιακά στο σημείο της φλεγμονής, και αφού φτάσουν στο σημείο της φλεγμονής, το PTC αποσταθεροποιείται από την παρουσία ενισχυμένων ROS και το φορτωμένο IR780 θα είναι απελευθερώνεται το οποίο παραμένει στο νεφρό για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα με αποτέλεσμα ενισχυμένο φθορισμό. Η συσσώρευση των νεφρών μεταξύ όλων των ομάδων συγκρίθηκε με την ποσοτικοποίηση της ex-vivo έντασης φθορισμού και παρατήρησε ότι η PTC έδειξε ανώτερησυσσώρευση νεφρώνπαρόλο που δείχνει φθορισμό σε άλλα κύρια όργανα, ο οποίος είναι αναπόφευκτος σε περίπτωση συστηματικής ένεσης (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S14 B) Όπως φαίνεται στην Εικ. 6Α, παρατηρήθηκε ισχυρή ένταση φθορισμού IR780 στους νεφρούς από 6 ώρες μετά την ένεση PTC -IR780. Η ένταση φθορισμού των κύριων οργάνων ήταν υψηλή στην τάξη του ήπατος, των πνευμόνων, του σπλήνα και των νεφρών. Η ένταση φθορισμού άλλων οργάνων μειώθηκε με την πάροδο του χρόνου, ενώ η ένταση φθορισμού των νεφρών παρέμεινε σχετικά σταθερή μέχρι τις 48 ώρες. Έτσι, τοένταση φθορισμού των νεφρώνέναντι του ήπατος έτεινε να αυξάνεται σταδιακά με την πάροδο του χρόνου (Εικ. 6Β). Αυτό θα μπορούσε να είναι σύμφωνο με προηγούμενες μελέτες που ανέφεραν ότι μια αύξηση σεφλεγμονή των νεφρώνθα μπορούσε να οδηγήσει σε αυξημένη διαπερατότητα των αγγείων και ως εκ τούτου, αυξημένη συσσώρευση NM στους νεφρούς [16]. Η βιοκατανομή επιβεβαιώθηκε περαιτέρω ελέγχοντας την περιεκτικότητα σε Mn σε διαφορετικά όργανα χρησιμοποιώντας ανάλυση επαγωγικού συζευγμένου φασματόμετρου μάζας πλάσματος (ICP-MS). Όπως φαίνεται στην Εικ. 6C, η συγκέντρωση Mn και στους δύο νεφρούς κορυφώθηκε στις 6 ώρες μετά την ένεση και σταδιακά μειώθηκε μέχρι τις 48 ώρες. Κατά τη σύγκριση της συγκέντρωσης Mn στους ιστούς με αυτή των άλλων κύριων οργάνων, οι νεφροί έφτασαν σε υψηλότερη συγκέντρωση Mn στους ιστούς από το ήπαρ, τους πνεύμονες και τη σπλήνα σε οποιαδήποτε χρονική στιγμή. Για να επιβεβαιώσουμε την κάθαρση του PTCM, πραγματοποιήσαμε την ανάλυση ICP-MS όλων των οργάνων, των κοπράνων και των ούρων στο τέλος της μελέτης και μετά από μια εβδομάδα παρατηρήσαμε ότι ένα μεγάλο μέρος του Mn εμφανίστηκε στο έντερο και τα κόπρανα . Παρατηρήθηκε ότι η κάθαρση του Mn ακολούθησε κυρίως ηπατοχολική οδό και όχι νεφρική κάθαρση. Υποθέτουμε ότι μετά τη συσσώρευση στο νεφρό το νανοσωματίδιο Mn3O4 αποικοδομείται σε ιόντα Mn που ακολουθεί τη συνήθη ηπατοχολική κάθαρση του Mn (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S16)[17].

Βιολογικά Βότανα για Νεφρική Νόσο

Το ένζυμο PTC-M μειώνει τους δείκτες νεφρικής βλάβης και εξασθενεί τις μορφολογικές αλλαγές στους νεφρούς ποντικών IRI

Τέλος, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα in vivo για να προσδιορίσουμε την αποτελεσματικότητα του PTC-M στη μείωση της νεφρικής βλάβης στη νεφρική IRI. Για τη διερεύνηση της συνολικής κατάστασης της ζημιάς σεIRI νεφρά, μετρήσαμε τη λιποκαλίνη που σχετίζεται με τη ζελατινάση των ουδετερόφιλων πλάσματος (NGAL), έναν πολύ γνωστό δείκτη σωληναριακής βλάβης στο AKI [18]. Το επίπεδο της NGAL στο πλάσμα ήταν σημαντικά υψηλότερο στην ομάδα IRI από ό,τι στην ψευδή ομάδα, αλλά μειώθηκε με τη θεραπεία με PTC-M (Εικ. 7Β). Πραγματοποιήσαμε χρώση με περιοδικό οξύ-Schif (PAS) τουτμήματα νεφρώνγια έλεγχο μορφολογικών αλλαγών (Εικ. 7Γ). Σε αντίθεση με τα εικονικά ποντίκια, παρατηρήθηκε οίδημα των νεφρικών σωληναρίων και διαστολή γεμάτη με νεκρωτικό υλικό. Φλεγμονώδη κύτταρα που διογκώνουν τους διάμεσους χώρους παρατηρήθηκαν σε νεφρούς ποντικών IRI. Αυτές οι αλλαγές βελτιώθηκαν με τη θεραπεία PTC-M. Η σωληναριακή διόγκωση, τα νεκρωτικά υλικά στα σωληνάρια και η διήθηση των φλεγμονωδών κυττάρων μετριάστηκαν σχετικά στους ποντικούς IRI που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PTC. Σε αντίθεση με τις αλλαγές στα σωληνάρια, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μορφολογικές διαφορές στα σπειράματα σε κάθε ομάδα.

Το PTC‑M βελτιώνει τη φλεγμονή και την απόπτωση σε νεφρούς ποντικών IRI

Για να εξετάσουμε εάν το PTC-M θα μπορούσε να μειώσει την κίνηση του βρέφους που προκαλείται από την οξειδωτική βλάβη, εξετάσαμε το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης του HO-1 με ανάλυση western blot για να εκτιμήσουμε τον βαθμό οξειδωτικού στρες στους νεφρούς ποντικών IRI. Βρήκαμε σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης HO-1 στους νεφρούς ποντικών IRI, τα οποία εξασθενήθηκαν με θεραπεία PTC-M (Εικ. 8Α). Η ανοσοϊστοχημική χρώση για HO-1 έδειξε την αυξημένη έκφρασή του στο μεσάγγιο των σπειραμάτων, των περισπειραματικών διαστημάτων και του περισωληναρίου διάμεσου χώρου των νεφρών ποντικών IRI, η οποία μειώθηκε σε νεφρούς ποντικών που έλαβαν PTC-M (Εικ. 8C). Για να αποσαφηνιστεί η ενεργός φλεγμονή στους νεφρούς ποντικών IRI, ελέγξαμε τα επίπεδα μεταγραφής των προφλεγμονωδών κυτοκινών και των μορίων προσκόλλησης με ανάλυση ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (qPCR) (Εικ. 8Β). Επίπεδα έκφρασης mRNA ιντερλευκίνης (IL)-6, μονοκυτταρική χημειοελκυστική πρωτεΐνη (MCP)-1, παράγοντας νέκρωσης όγκου (TNF)-, μόριο ενδοκυτταρικής προσκόλλησης (ICAM)-1, προσκόλληση αγγειακών κυττάρων μόριο (VCAM-1) και αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού (TGF)- αυξήθηκαν σημαντικά στους νεφρούς ποντικών IRI και η θεραπεία με PTC-M κατέστειλε αυτές τις αλλαγές (Εικ. 8Β). Η ανοσοϊστοχημική χρώση για το F4/80, έναν δείκτη μακροφάγων ποντικού, αποκάλυψε αυξημένη έκφραση στους περισπειραματικούς και ενδιάμεσους χώρους των νεφρών ποντικών IRI, η οποία επίσης εξασθενήθηκε με θεραπεία PTC-M (Εικ. 8C). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το PTC-M κατέστειλε τη νεφρική φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες σε ποντικούς IRI.

Για να αξιολογηθεί ο βαθμός θανάτου των νεφρικών σωληναριακών κυττάρων σε ποντικούς IRI, αξιολογήθηκε το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης των αποπτωτικών πρωτεϊνών. Η ανοσοστύπωση αποκάλυψε αυξημένη αναλογία Bax/Bcl-2 και σχισμένες αναλογίες κασπάσης 3/κασπάσης 3 στον νεφρικό ιστό ποντικών IRI, υποδηλώνοντας ότι η απόπτωση επιδεινώθηκε (Εικ. 9Α). Αυτές οι αλλαγές δεν παρατηρήθηκαν στα ποντίκια που έλαβαν PTC-M. Η θεραπεία με PTC-M μείωσε σημαντικά τους αποπτωτικούς καταρράκτες στους νεφρούς ποντικών IRI που προκαλούνται από το οξειδωτικό στρες. Για να προσδιορίσουμε εάν το PTC-M ανέστειλε την απόπτωση που προκαλείται από ROS μέσω ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση (MAPK), υπολογίσαμε τις αλλαγές στο μονοπάτι σηματοδότησης MAPK. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση ανοσοστύπωσης για τα επίπεδα πρωτεΐνης της οδού MAPK και τις φωσφορυλιωμένες (ενεργοποιημένες) μορφές τους (Εικ. 9Β). Τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου ERK, JNK και P38 αυξήθηκαν στους νεφρούς των ποντικών IRI σε σύγκριση με τα εικονικά ποντίκια, τα οποία εξασθενήθηκαν από το PTC-M, αν και δεν παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στη φωσφορυλιωμένη JNK. Η χρώση της τελικής δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης dUDP nickend labeling (TUNEL) έδειξε περισσότερα σωληναριακά επιθηλιακά κύτταρα θετικά στο TUNEL στον φλοιό των νεφρών των ποντικών IRI σε σύγκριση με εκείνη των εικονικών ποντικών, ενώ η θεραπεία με PTC-M μείωσε τον αριθμό των θετικών στο TUNEL κυττάρων (Εικ. 9C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το PTC-M μείωσε την απόπτωση σε νεφρούς ποντικών IRI επηρεάζοντας την οδό σηματοδότησης MAPK. Αυτά τα ευρήματα στους νεφρούς ποντικού IRI ήταν συνεπή με τα αποτελέσματα σε ανθρώπινα νεφρικά κύτταρα που διεγείρονται με H2O, αποδεικνύοντας έναν κοινό μηχανισμό νεφρικής προστασίας PTC-M. Πραγματοποιήθηκε χρώση H&E σε κύρια όργανα που συλλέχθηκαν από φυσιολογικές ομάδες και ομάδες που έλαβαν PTC-M και δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές ιστολογικές αλλαγές που να υποδεικνύουν βλάβες (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S17).