Επαγωγή βλεννογονικής ανοσίας με πνευμονική χορήγηση νανοσωματιδίου που στοχεύει κύτταρα

ΑΦΗΡΗΜΕΝΗ

Βρήκαμε προηγουμένως ότι ένα νανοσωματίδιο κατασκευασμένο με αντιγόνο, χλωριούχο βενζαλκόνιο (BK) και c-πολυγλουταμικό οξύ (c-PGA) έδειξε υψηλή ανοσολογική επαγωγή τύπου Th1 και Th{2- μετά από υποδόρια χορήγηση. Ωστόσο, για την προφύλαξη από λοιμώξεις του αναπνευστικού, θα πρέπει να προκληθεί ανοσία του βλεννογόνου. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την επίδραση της πνευμονικής χορήγησης ενός νανοσωματιδίου που περιλαμβάνει ωοαλβουμίνη (OVA) ως μοντέλο αντιγόνου, BK και c-PGA στην επαγωγή ανοσίας του βλεννογόνου στους πνεύμονες και στον ορό.

Το σύμπλοκο απορροφήθηκε έντονα από τα κύτταρα RAW264.7 και DC2.4. Μετά από πνευμονική χορήγηση, η κατακράτηση των πνευμόνων ήταν μεγαλύτερη για το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA από ότι για το OVA μόνο. Η ειδική για την OVA ανοσοσφαιρίνη ορού (Ig)G προκλήθηκε σε μεγάλο βαθμό από το σύμπλοκο. Υψηλά επίπεδα IgG και IgA προκλήθηκαν επίσης στο βρογχοκυψελιδικό υγρό πλύσης και in vivo, δεν παρατηρήθηκαν τοξικότητες. Συμπερασματικά, επαγάγαμε αποτελεσματικά και με ασφάλεια την ανοσία του βλεννογόνου με πνευμονική χορήγηση ενός συμπλόκου OVA/BK/c-PGA.

Τα τελευταία χρόνια, όλο και περισσότερες μελέτες έχουν δείξει ότι η ανοσία του βλεννογόνου παίζει σημαντικό ρόλο στο ανοσοποιητικό σύστημα του οργανισμού. Η ανοσία του βλεννογόνου αναφέρεται στο ανοσοποιητικό σύστημα που βασίζεται στη βλεννογόνο μεμβράνη του ανθρώπινου σώματος και οι αμυντικές του ικανότητες στοχεύουν κυρίως στην εισβολή παθογόνων στους ανθρώπινους βλεννογόνους όπως η αναπνευστική οδός, η πεπτική οδός και η αναπαραγωγική οδός.

Η ίδια η ανοσία του βλεννογόνου δεν κάνει τον οργανισμό πιο άνοσο, αλλά μπορεί να βοηθήσει τον οργανισμό μας να αντιμετωπίσει αποτελεσματικότερα την εισβολή ξένων παθογόνων. Διεγείροντας συνεχώς την ανοσία του βλεννογόνου, το σώμα μας παράγει περισσότερα αντισώματα, τα οποία ενισχύουν την ανοσία μας.

Λοιπόν, πώς μπορεί να τονωθεί η ανοσία του βλεννογόνου; Ακολουθούν μερικές προτάσεις:

1. Λαμβάνετε αρκετή βιταμίνη C. Η βιταμίνη C είναι ένα φυσικό αντιοξειδωτικό που ενισχύει τη λειτουργία των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, η οποία βοηθά στην καταπολέμηση των λοιμώξεων. Τα φρούτα και τα πράσινα φυλλώδη λαχανικά όπως τα λεμόνια, τα πορτοκάλια και οι φράουλες είναι πλούσια σε βιταμίνη C.

2. Αυξήστε την πρόσληψη βακτηρίων γαλακτικού οξέος. Τα βακτήρια γαλακτικού οξέος μπορούν να προάγουν την ισορροπία της εντερικής χλωρίδας και να αναστέλλουν την ανάπτυξη επιβλαβών βακτηρίων. Τα κοινά τρόφιμα με βακτήρια γαλακτικού οξέος περιλαμβάνουν το γιαούρτι, το ξινολάχανο, το kimchi κ.λπ.

3. Εξασκηθείτε στις βαθιές αναπνοές. Η βαθιά αναπνοή αυξάνει την παροχή οξυγόνου και τον αερισμό στους πνεύμονες, κάτι που μπορεί να βοηθήσει στην απομάκρυνση των συσσωρευμένων παθογόνων από τους πνεύμονες.

Εν ολίγοις, η τόνωση της ανοσίας του βλεννογόνου είναι ένα σημαντικό μέσο για τη βελτίωση της ανοσίας. Θα πρέπει να κάνουμε το καλύτερο δυνατό για να βελτιώσουμε την ανοσία του βλεννογόνου μας μέσω της διατροφής και των συνηθειών διαβίωσης, για να προστατεύσουμε την υγεία μας. Από αυτή την άποψη, πρέπει να βελτιώσουμε την ανοσία. Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την ανοσία επειδή η τέφρα του κρέατος περιέχει μια ποικιλία βιολογικά ενεργών συστατικών, όπως πολυσακχαρίτες, δύο μανιτάρια και Huang Li, τα οποία μπορούν να τονώσουν το ανοσοποιητικό σύστημα. Διάφοροι τύποι κυττάρων, αυξάνουν την ανοσοποιητική τους δραστηριότητα.

Κάντε κλικ στο συμπλήρωμα cistanche deserticola

1. Εισαγωγή

Οι οξείες λοιμώξεις του αναπνευστικού είναι σχεδόν σίγουρα η κύρια αιτία θανάτου σε παιδιά < 5 ετών στις αναπτυσσόμενες χώρες (Williams et al., 2002). Αρκετά εμβόλια, όπως αυτά για τη γρίπη, τον κοκκύτη και τον πνευμονιόκοκκο, έχουν αναπτυχθεί για λοιμώξεις του αναπνευστικού (White, 1988· Pittman, 1991· Chen et al., 2020). Τα περισσότερα από αυτά τα εμβόλια χορηγούνται με την ενδομυϊκή και υποδόρια οδό, που θα μπορούσαν να επάγουν αποτελεσματικά την ανοσοσφαιρίνη ορού (Ig)G. Ωστόσο, άλλες οδοί είναι πιο χρήσιμες για την τόνωση της ανοσίας του βλεννογόνου για την πρόληψη οξειών αναπνευστικών λοιμώξεων. Οι χορηγήσεις του βλεννογόνου, όπως η ενδορινική και η πνευμονική, έχει αναφερθεί ότι επάγουν αποτελεσματικά την IgA του βλεννογόνου και αποτρέπουν τις αναπνευστικές λοιμώξεις (Giri et al., 2005; Ainai et al., 2017).

Από την άλλη πλευρά, τα εμβόλια για ενδορινική και πνευμονική χορήγηση δεν πρέπει να περιέχουν ανοσοενισχυτικά που έχουν αναφερθεί ότι προκαλούν φλεγμονώδεις αντιδράσεις και έλκος στο σημείο χορήγησης (Tamura et al., 1988; McKee et al., 2007). Μια άλλη προσέγγιση για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας των εμβολίων χωρίς ανοσοενισχυτικά είναι η ανάπτυξη ενός συστήματος που μπορεί να παρέχει αποτελεσματικά εμβόλια σε κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο του βλεννογόνου (APCs).

Σε μια προηγούμενη μελέτη, αναπτύξαμε έναν νέο φορέα παροχής εμβολίου που κατασκευάστηκε με ένα αντιγόνο, χλωριούχο βενζαλκόνιο (BK) και c-πολυγλουταμικό οξύ (c-PGA). Ένα σύμπλεγμα που περιλαμβάνει ωολευκωματίνη (OVA) ως μοντέλο αντιγόνου, BK και c-PGA (σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA) παρέδωσε αποτελεσματικά OVA σε δενδριτικά κύτταρα και βελτίωσε την ειδική για την OVA επαγωγή IgG ορού μετά από υποδόρια χορήγηση σε ποντικούς (Kurosaki et al. ., 2012). Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει την επίδραση της πνευμονικής χορήγησης ενός συμπλόκου OVA/BK/c-PGA στην επαγωγή ανοσίας του βλεννογόνου στους πνεύμονες και στον ορό.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Χημικά

Το OVA αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Το ΒΚ ελήφθη από την Nacalai Tesque, Inc. (Κιότο, Ιαπωνία). Το c-PGA παρασχέθηκε από την Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (Τόκιο, Ιαπωνία). Επισημασμένη με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη OVA (FITC-OVA) και Alexa Fluor 647-επισημασμένη OVA (Alexa647- OVA) ελήφθη από την Invitrogen (Carls, CA, USA). Ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) αγοράστηκε από την Biological Industries Ltd. (Kibbutz Beit Haemek, Ισραήλ). Το OPTI-MEM I ελήφθη από την GIBCO BRL (Grand Island, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) και ένα διάλυμα αντιβιοτικών προμίγματος που περιέχει πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη και L-γλουταμίνη ελήφθη από την Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Οσάκα, Ιαπωνία). Το Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) και το μέσο RPMI1640 ελήφθησαν από τη Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. (Τόκιο, Ιαπωνία).

2.2. Σύνθετη προετοιμασία

Προηγουμένως, κατασκευάσαμε ένα σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA σε αναλογία βάρους 1:0.2:0.2 (Kurosaki et al., 2012). Για να παρασκευαστεί το σύμπλοκο OVA/BK, κατάλληλη ποσότητα διαλύματος ΒΚ (pH 5.0) διαλυμένη σε 5 τοις εκατό γλυκόζη αναμείχθηκε με διάλυμα OVA (ρΗ 7.0) διαλυμένο σε 5 τοις εκατό γλυκόζη και αφέθηκε για 15 λεπτά στους 4 C. Για να επικαλυφθεί το σύμπλοκο OVA/BK με c-PGA, ένα διάλυμα c-PGA (pH 7,0) διαλυμένο σε 5 τοις εκατό γλυκόζη προστέθηκε στο σύμπλοκο OVA/BK και αφέθηκε για άλλα 15 λεπτά σε 4 C. Το μέγεθος σωματιδίων και το δυναμικό f κάθε συμπλόκου μετρήθηκαν με χρήση Zetasiser Nano ZS (Malvern Instruments, Ltd., Malvern, UK).

2.3. Κύτταρα

Χρησιμοποιήθηκαν κυτταρική σειρά μακροφάγων ποντικού RAW264.7 και δενδριτική κυτταρική σειρά DC2.4. Τα κύτταρα RAW264.7 αναπτύχθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS και αντιβιοτικά. Τα κύτταρα DC2.4 αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS, αντιβιοτικά, 1 mM μη απαραίτητα αμινοξέα και 1 ηΜ 2-μερκαπτοαιθανόλη. Αυτά τα κύτταρα αξιολογήθηκαν κάτω από μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5 τοις εκατό CO2 στον αέρα στους 37 C.

2.4. Πείραμα κυτταρικής πρόσληψης in vitro

Τα κύτταρα RAW264.7 και τα κύτταρα DC2.4 επιστρώθηκαν σε 24-πλάκες φρεατίων (Corning, NY, ΗΠΑ) σε πυκνότητα 2.0 104 κυττάρων/φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν σε 50{19}}{101} {21}} mL μέσου καλλιέργειας. Μετά από 24- ώρες προεπώασης, το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο OPTI-MEM I και τα κύτταρα επωάστηκαν με 5 mg FITC-OVA και το σύμπλοκο που περιείχε 5 mg FITC-OVA για 2 ώρες. Μετά την επώαση, αυτά τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (BIOREVO BZ-9000· Keyence Co., Osaka, Ιαπωνία). Μετά από παρατήρηση, αυτά τα κύτταρα λύθηκαν σε 300 l ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (ρΗ 7,8 και 0,1 Μ Tris/HCl ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0,05 τοις εκατό Triton Χ-100 και 2 mM EDTA). Τα προϊόντα λύσης τοποθετήθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων και ο φθορισμός του FITC-OVA μετρήθηκε σε μήκος κύματος εκπομπής 530 nm με μήκος κύματος διέγερσης 480 nm, χρησιμοποιώντας φθορομετρικό αναγνώστη μικροπλακών (Infinite-200Pro M-Plex, Tecan Japan Co., Ltd., Kanagawa, Ιαπωνία). Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη του προϊόντος λύσης προσδιορίστηκε με δοκιμασία Bradford χρησιμοποιώντας BSA ως πρότυπο. Η απορρόφηση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών στα 570 nm. Η πρόσληψη του FITC-OVA υποδείχθηκε ως mg ανά mg πρωτεΐνης.

2.5. Των ζώων

Η φροντίδα των ζώων και οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν από τις Οδηγίες για Πειραματισμό σε Ζώα του Πανεπιστημίου του Ναγκασάκι με έγκριση από την Επιτροπή Θεσμικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων. Αρσενικά ποντίκια C57BL/6N (ηλικίας 5 εβδομάδων) αγοράστηκαν από την Japan SLC (Shizuoka, Ιαπωνία). Αφού μεταφέρθηκαν, τα ποντίκια αφέθηκαν να εγκλιματιστούν στο νέο τους περιβάλλον για 1 ημέρα πριν από τα πειράματα. Η πνευμονική χορήγηση (40 mL) πραγματοποιήθηκε με χρήση γλωσσοπίεστου με φως με αυθόρμητη αναπνοή σε ποντίκια που αναισθητοποιήθηκαν με εισπνοή ισοφλουρανίου (Horiguchi et al., 2015).

2.6. Συσσώρευση συμπλέγματος στους πνεύμονες

Για να εξεταστεί η συσσώρευση OVA, τα 40 mg Alexa647-OVA και το σύμπλοκο που περιέχει 40 mg Alexa647- OVA σε όγκο 40 mL ανά ποντίκι χορηγήθηκαν σε ποντικούς μέσω πνευμονικής οδού. Έξι ημέρες μετά τη χορήγηση, ποντίκια θυσιάστηκαν και οι πνεύμονες ανατέμθηκαν. Η ένταση φθορισμού της Alexa647-OVA στον πνεύμονα του ποντικού παρατηρήθηκε με σύστημα Xenogen IVIS Lumina σε συνδυασμό με λογισμικό Living Image για απόκτηση δεδομένων (Xenogen, Co, Almeda, CA, USA). Μετά την παρατήρηση, αυτοί οι πνεύμονες ομογενοποιήθηκαν με ρυθμιστικό λύσης και τα ομογενοποιήματα φυγοκεντρήθηκαν στις 15,{7}} rpm (Kubota-3500, Kubota Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία) για 5 λεπτά και ο φθορισμός του Alexa647 σε αυτά τα υπερκείμενα προσδιορίστηκε με οδηγό μικροπλάκας σε μήκος κύματος διέγερσης και εκπομπής 640 και 670 nm, αντίστοιχα.

2.7. Ανοσοποίηση

Τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με διάλυμα γλυκόζης 5 τοις εκατό, 40 mg OVA, ένα κενό σύμπλοκο 8 mg BK και 8 mg c-PGA (φορέας) και σύμπλοκο OVA/BK/c-PGA που περιείχε 40 mg OVA με πνευμονική χορήγηση, 4 φορές εβδομαδιαίος. Δύο εβδομάδες μετά την τελευταία ανοσοποίηση, ελήφθη υγρό βρογχοκυψελιδικής πλύσης (BALF) και ορός. Το BALF και ο ορός χρησιμοποιήθηκαν για προσδιορισμούς ανοσοπροσροφητικού προσδιορισμού συνδεδεμένου με ένζυμα (ELISA).

2.8. Προσδιορισμός επαγωγής ειδικών για την OVA αντισωμάτων

Για την επίστρωση OVA, 100 mL διαλύματος OVA (10 mg/mL, σε όξινο ανθρακικό νάτριο 1 Μ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο των πλακών ELISA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 C. Οι πλάκες πλύθηκαν τρεις φορές με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά που περιείχε 0,05 τοις εκατό Tween-20 (PBST), 200 mL αντιδραστηρίου αποκλεισμού Ν 102 (Nichiyu, Co., Ltd., Τόκιο, Ιαπωνία ) προστέθηκε για να μπλοκάρει τη μη ειδική σύνδεση και στη συνέχεια επωάστηκε για 6 ώρες στους 4 C. Οι πλάκες πλύθηκαν δύο φορές με PBST. Στη συνέχεια, δείγματα 100 mL 1000-πολλαπλά αραιωμένου ορού και μη αραιωμένων δειγμάτων BALF προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 C. Μετά από πέντε φορές πλύση με PBST, 100 mL έκαστο χρένο υπεροξειδάσης (HRP) – συζευγμένο αντι κατσικίσιο -IgG, IgA, IgM, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b και IgG3 ποντικού (1:10,000) (Abcam, Cambridge, UK) – προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και στη συνέχεια πλύθηκε πέντε φορές με PBST. Χρησιμοποιήθηκε διάλυμα TMB One (Promega, WI, ΗΠΑ) και παρασκευάστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αντίδραση στη συνέχεια σταμάτησε στα 15 λεπτά με την προσθήκη υδροχλωρικού οξέος 1 Ν. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών.

2.9. In vivo τοξικότητα του συμπλόκου OVA/BK/c-PGA

Το σύμπλοκο OVA και OVA/BK/c-PGA χορηγήθηκε σε ποντίκια μέσω της πνευμονικής οδού. Το BALF ελήφθη 3 και 24 ώρες μετά τη χορήγηση από ποντικούς. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά τη χορήγηση, έγινε επίσης ανατομή του πνεύμονα. Η δραστηριότητα της γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) στο BALF μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ QuantiChromTM Lactate Dehydrogenase (BioAssay Systems, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του εργοστασίου. Τα δείγματα πνεύμονα σταθεροποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικής παραφορμαλδεΰδης 4 τοις εκατό. Η τομή και η χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης (ΗΕ) ανατέθηκαν στην GenoStaff (Τόκιο, Ιαπωνία). Οι χρωματισμένες με ΗΕ τομές του πνεύμονα παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο σε μεγέθυνση 20.

2.10. Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημασία των διαφορών μεταξύ των δύο ομάδων αξιολογήθηκε με τη διενέργεια του Student's t-test. Πραγματοποιήθηκαν πολλαπλές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων με την εκτέλεση του τεστ Tukey. Οι τιμές p < 0,05 θεωρήθηκαν ενδεικτικές στατιστικής σημαντικότητας.

3. Αποτελέσματα

3.1. Φυσικοχημικές ιδιότητες του συμπλέγματος

Κατασκευάσαμε ένα ανιονικό σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA σε αναλογία βάρους 1:0.2:0.2. Το επικαλυμμένο με c-PGA σύμπλοκο είχε μέγεθος σωματιδίων περίπου 105,4 nm και δυναμικό f περίπου 35,5 mV.

3.2. Κυτταρική πρόσληψη του συμπλέγματος

Τα κύτταρα RAW264.7 και τα κύτταρα DC2.4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σύμπλοκο FITC-OVA και FITC-OVA/BK/c-PGA και η κυτταρική πρόσληψη του FITC-OVA εμφανίστηκε, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1. FITC-OVA/BK/ Το σύμπλοκο c-PGA λήφθηκε σε μεγάλο βαθμό από τα κύτταρα RAW264.7 και τα κύτταρα DC2.4 και παρατηρήθηκε ισχυρός πράσινος φθορισμός του FITC-OVA (Εικόνα 1 (Α, Β), αντίστοιχα). Ταυτόχρονα, παρατηρήθηκαν μικρές ποσότητες FITC-OVA και στα δύο κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με FITC-OVA.

Οι κυτταρικές προσλήψεις FITC-OVA ποσοτικοποιήθηκαν στα κύτταρα RAW264.7 και στα κύτταρα DC2.4 (Εικόνα 1(C)). Το σύμπλοκο FITC-OVA/BK/c-PGA έδειξε σημαντικά υψηλότερη πρόσληψη από το FITC-OVA και στα δύο κύτταρα (ρ < 0,01).

3.3. Συσσώρευση Alexa647-OVA στους πνεύμονες μετά από πνευμονική χορήγηση

Το σύμπλεγμα Alexa647-OVA και Alexa647-OVA/BK/c-PGA χορηγήθηκε σε ποντίκια μέσω της πνευμονικής οδού για να προσδιοριστεί η συσσώρευση του Alexa647-OVA στους πνεύμονες ως αντιγόνο. Στις 6 ημέρες μετά τη χορήγηση, οι πνεύμονες ανατέμθηκαν και η ένταση φθορισμού τους έγινε ορατό χρησιμοποιώντας ένα Xenogen IVIS Lumina System. Μια ex-vivo φθορίζουσα εικόνα φαίνεται στο Σχήμα 2(Α). Παρατηρήθηκε υψηλή ένταση φθορισμού σε ολόκληρο τον πνεύμονα 6 ημέρες μετά την πνευμονική χορήγηση, αν και δεν υπήρχε ένταση φθορισμού στον σπλήνα, την καρδιά, τους νεφρούς και το ήπαρ (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Η συσσώρευση των πνευμόνων ήταν υψηλότερη για το σύμπλεγμα Alexa647-OVA/BK/c-PGA από ό,τι για το Alexa647-OVA την ημέρα 6. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2(Β), η συσσώρευση των πνευμόνων ήταν σημαντικά υψηλότερη για το Alexa 647-Σύμπλοκο OVA/BK/c-PGA από ό,τι για την Alexa647- OVA (p < .05).

3.4. Ειδικό αντίσωμα OVA στον ορό μετά από πνευμονική χορήγηση του συμπλέγματος

Ένα διάλυμα γλυκόζης 5 τοις εκατό, σύμπλοκο BK/c-PGA (όχημα), σύμπλοκο OVA και OVA/BK/c-PGA χορηγήθηκε μέσω της πνευμονικής οδού σε ποντικούς τέσσερις φορές και στη συνέχεια IgG, IgA, IgM, ειδική για την OVA ορού, και IgE προσδιορίστηκαν με ELISA όπως φαίνεται στο Σχήμα 3. Η πνευμονική χορήγηση του OVA και του συμπλέγματος OVA/BK/c-PGA αύξησε τα επίπεδα IgG σε ποντικούς, αν και η ειδική για OVA IgG δεν ανιχνεύθηκε σε ποντικούς στα οποία χορηγήθηκε 5 τοις εκατό γλυκόζη και φορέας. Επιπλέον, η παραγωγή IgG και IgA ήταν σημαντικά υψηλότερη μετά τη χορήγηση του συμπλόκου OVA/BK/c-PGA από ό,τι μετά τη χορήγηση της OVA (ρ < 0,05 ή 0,01). Από την άλλη πλευρά, οι ειδικές για την OVA IgM και IgE δεν προκλήθηκαν από την OVA ή το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA.

3.5. Ειδικό αντίσωμα OVA στο BALF μετά από πνευμονική χορήγηση του συμπλέγματος

Προσδιορίστηκαν επίσης οι ειδικές για την OVA IgG, IgA, IgM και IgE στο BALF, όπως φαίνεται στην Εικόνα 4. Το επίπεδο της IgG αυξήθηκε σημαντικά από την OVA σε σχέση με τα επίπεδα μετά τη χορήγηση του μάρτυρα και του φορέα (p < 0,05 ή .01). Ωστόσο, το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA αύξησε σημαντικά όχι μόνο την IgG αλλά και την IgA στο BALF (p < 0,01). Ωστόσο, οι ειδικές για την OVA IgM και IgE δεν προκλήθηκαν από την OVA ή το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA.

3.6. Υπότυποι IgG στον ορό μετά από πνευμονική χορήγηση του συμπλέγματος

Τα αποτελέσματα επαγωγής των ειδικών για την OVA υποτύπων IgG, όπως τα IgG1, IgG2a, IgG2b και IgG3 στον ορό προσδιορίστηκαν όπως φαίνεται στο Σχήμα 5. Σε σύγκριση με τον έλεγχο και το όχημα, η OVA αύξησε σημαντικά μόνο την IgG1 (ρ < 0,01). Τα επίπεδα αντισωμάτων όλων των υποτύπων που προκλήθηκαν από το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA ήταν σημαντικά υψηλότερα από τα επίπεδα που προκλήθηκαν από τον έλεγχο και τον φορέα (ρ < 0,05 ή 0,01).

3.7. Υπότυποι IgG στο BALF μετά από πνευμονική χορήγηση του συμπλέγματος

Προσδιορίστηκαν επίσης οι ειδικοί για την OVA υποτύποι IgG, όπως IgG1, IgG2a, IgG2b και IgG3 στο BALF, όπως φαίνεται στο Σχήμα 6. Το OVA αύξησε σημαντικά μόνο τα επίπεδα IgG1 σε σχέση με εκείνα που προκαλούνται από τον έλεγχο και το όχημα (p < 0,01). . Σε σύγκριση με τον έλεγχο, το όχημα και την OVA, το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA προκάλεσε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα αντισωμάτων όλων των υποτύπων (ρ < 0,05 ή 0,01).

3.8. In vivo τοξικότητα του συμπλόκου OVA/BK/c-PGA

Σε ποντίκια χορηγήθηκε διάλυμα γλυκόζης 5 τοις εκατό, OVA και το σύμπλοκο OVA/BK/c-PGA. Η δραστικότητα LDH στο BALF προσδιορίστηκε 3 ή 24 ώρες μετά τη χορήγηση (Εικόνα 7). Η χορήγηση του συμπλόκου OVA και OVA/BK/c-PGA είχε μικρή επίδραση στα επίπεδα LDH στο BALF.

Είκοσι τέσσερις ώρες μετά τη χορήγηση, οι πνεύμονες αποκόπηκαν από αυτά τα ποντίκια για ιστολογική ανάλυση. Τομές πνεύμονα που έχουν χρωματιστεί με ΗΕ φαίνονται στο Σχήμα 8. Δεν παρατηρήθηκαν ιστολογικές ανωμαλίες στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με OVA και το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA.

4. Συζήτηση

Ο πνεύμονας ελέγχει την αναπνοή και εκτίθεται σε πολλά παθογόνα, όπως ιούς και βακτήρια που προκαλούν λοιμώξεις του αναπνευστικού. Αυτά τα παθογόνα μολύνουν μέσω της πνευμονικής βλεννογόνου μεμβράνης, επομένως πρέπει να προκληθεί ανοσία του βλεννογόνου για προστασία από λοιμώξεις του αναπνευστικού. Πρόληψη λοιμώξεων του αναπνευστικού, η ανοσία του βλεννογόνου έχει σημαντικό ρόλο. Ωστόσο, η ενδοδερμική και ενδομυϊκή χορήγηση του εμβολίου δεν μπορεί να διεγείρει έντονα την ανοσία του βλεννογόνου (Ito et al., 2003; Amorij et al., 2007). Το ανοσοποιητικό σύστημα του βλεννογόνου που επάγει την εκκριτική IgA αναπτύσσεται στην επιφάνεια του βλεννογόνου. Αρκετά APC, όπως δενδριτικά κύτταρα και μακροφάγα, έχουν αναφερθεί ότι βρίσκονται στην επιφάνεια του βλεννογόνου (Kopf et al., 2015). Επιπλέον, ο σχετιζόμενος με τους βρόγχους λεμφοειδής ιστός (BALT) βρίσκεται στον βρογχιολικό βλεννογόνο και είναι ένα λεμφοειδές ωοθυλάκιο που έχει κεντρικό ρόλο στην ανοσία του βλεννογόνου της αναπνευστικής οδού (Bienenstock, 1980). Η πνευμονική χορήγηση του εμβολίου αναμένεται να διεγείρει αποτελεσματικά το ανοσοποιητικό σύστημα του βλεννογόνου. Ως εκ τούτου, κατασκευάσαμε το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA για να αξιολογήσουμε τη χρησιμότητά του ως εμβόλιο που χορηγείται μέσω της πνευμονικής οδού.

Το Σχήμα 4 δείχνει τη συγκέντρωση BALF των OVA-ειδικών αντισωμάτων μετά από πνευμονική χορήγηση του OVA και του συμπλέγματος OVA/BK/c-PGA. Η πνευμονική χορήγηση OVA αύξησε την IgG αλλά είχε μικρή επίδραση στην IgA στο BALF. Από την άλλη πλευρά, το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA προκάλεσε σημαντικά την έκκριση IgA στο BALF. Επιπλέον, η επαγωγή IgG ορού ήταν σημαντικά υψηλότερη μετά τη χορήγηση του συμπλόκου OVA/BK/c-PGA από ότι μετά τη χορήγηση της OVA (Εικόνα 3). Η IgG ορού είναι σημαντική για την πρόληψη της επιδείνωσης τυχόν λοιμώξεων (Huber et al., 2006; Schroeder & Cavacini, 2010). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA θα μπορούσε να αποτρέψει αναπνευστικές λοιμώξεις μέσω υψηλής επαγωγής IgA του βλεννογόνου και επιδείνωσης της αναπνευστικής λοίμωξης με επαγωγή υψηλής IgG ορού. Επιπλέον, η επαγωγή IgE από το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA δεν παρατηρήθηκε και αυτό το αποτέλεσμα έδειξε μικρό κίνδυνο αλλεργικής αντίδρασης από το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA.

Το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA θα μπορούσε επίσης να προκαλέσει όχι μόνο IgG1 και IgG2b αλλά επίσης IgG2a και IgG3 (Εικόνα 5). Οι IgG1 και IgG2b είναι γνωστές ως ανοσοσφαιρίνες τύπου Th2- που μεσολαβούν στη χυμική ανοσολογική απόκριση και οι IgG2a και IgG3 είναι γνωστές ως ανοσοσφαιρίνες τύπου Th1- που μεσολαβούν στην κυτταρική ανοσοαπόκριση (Firacative et al., 2018) . Επομένως, το σύμπλοκο OVA/BK/c-PGA θα μπορούσε να προκαλέσει τόσο χυμικές όσο και κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι αυτό το σύστημα θα μπορούσε να είναι χρήσιμο για εμβόλια κατά των λοιμώξεων καθώς και των καρκίνων. Το προληπτικό αποτέλεσμα, οι επαγόμενες από αντιγόνο αποκρίσεις κυτοκίνης τύπου Th{1- και Th{2- σε επαγώγιμη επαγωγή BALT, πληθυσμό Treg και IL-10 θα πρέπει να αξιολογούνται με τη χρήση πραγματικών αντιγόνων από λοιμώξεις ή καρκίνους στο μέλλον σπουδές.

Η ισχυρή επαγωγή της ανοσολογικής απόκρισης από το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA πρέπει να οφείλεται στην υψηλή κατακράτηση του συμπλέγματος στον πνεύμονα και στην αποτελεσματική παροχή OVA στα APC στον πνευμονικό βλεννογόνο. Τα αποτελέσματά μας το επιβεβαίωσαν δείχνοντας ότι 6 ημέρες μετά τη χορήγηση, το σύμπλεγμα Alexa647-OVA/BK/c-PGA παρέμεινε στον πνεύμονα και έδειξε σημαντικά υψηλότερο φθορισμό από το Alexa647- OVA (Εικόνα 2). Ο σχηματισμός συμπλόκου μπορεί να αποτρέψει τη διάχυση της OVA και να προστατεύσει την OVA από την αποικοδόμηση από τις πρωτεάσες στον πνευμονικό βλεννογόνο. Επιπλέον, το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA ήταν σε θέση να απελευθερώσει αποτελεσματικά OVA σε κύτταρα μακροφάγων RAW264.7 και δενδριτικά κύτταρα DC2.4 (Εικόνα 1). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA θα απορροφηθεί από τα κυψελιδικά APC και θα προκαλούσε υψηλή ανοσολογική απόκριση μετά από πνευμονική χορήγηση. Έχει αναφερθεί ότι τα επικαλυμμένα με c-PGA νανοσωματίδια παραλήφθηκαν από την ενδοκυτταρωτική οδό με τη μεσολάβηση γ-γλουταμυλ τρανσπεπτιδάσης (Du et al., 2015). Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι τα επικαλυμμένα με c-PGA νανοσωματίδια απορροφήθηκαν από την ειδική για την c-PGA ενδοκυτταρική οδό (Kurosaki et al., 2009). Το σύμπλεγμα OVA/BK/c-PGA μπορεί να ληφθεί από τα APC στον πνεύμονα μέσω των ίδιων μηχανισμών. Ωστόσο, δεν είναι ακόμη σαφές ποια κύτταρα είναι υπεύθυνα για την πρόσληψη OVA και την επακόλουθη παρουσίαση αντιγόνου στην επαγωγή ειδικής ανοσίας. Περαιτέρω μελέτες σχετικά με λεπτομερείς μηχανισμούς ανοσοεπαγωγής θα πρέπει να πραγματοποιηθούν στο μέλλον.

Πολλά ανοσοενισχυτικά έχουν αναπτυχθεί για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας των εμβολίων. Ωστόσο, έχει αναφερθεί ότι τα ανοσοενισχυτικά προκαλούν φλεγμονώδεις αντιδράσεις στο σημείο της ένεσης (Tamura et al., 1988; McKee et al., 2007). Επομένως, η χορήγηση ανοσοενισχυτικών στον πνεύμονα μπορεί να προκαλέσει σοβαρές παρενέργειες, όπως πνευμονία. Μετά από πνευμονική χορήγηση του συμπλέγματος OVA/BK/c-PGA, τα επίπεδα LDH στο BALF δεν αυξήθηκαν (Εικόνα 7) και δεν παρατηρήθηκαν ιστολογικές ανωμαλίες στην τομή που χρωματίστηκε με ΗΕ (Εικόνα 8). Σύμφωνα με αναφορές, το c-PGA είναι ένα βιοσυμβατό και βιοαποικοδομήσιμο πολυμερές που δεν εμφανίζει ανοσοφλεγμονώδεις αντιδράσεις (Prodhomme et al., 2003; Ye et al., 2006). Η ΒΚ είναι μια ασφαλής ένωση τεταρτοταγούς αμμωνίου που έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως κλινικά ως αντιμικροβιακό πρόσθετο (Marple et al., 2004). Αυτές οι αναφορές υποστηρίζουν επίσης την ασφάλεια του συμπλέγματος OVA/BK/c-PGA. Από την άλλη πλευρά, υψηλότερα επίπεδα LDH παρατηρήθηκαν στις 3 ώρες μετά την πνευμονική χορήγηση από ότι στις 24 ώρες, ακόμη και στην ομάδα ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι προκλήθηκε ελαφρός ερεθισμός από πνευμονική χορήγηση. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες ασφάλειας πριν από την κλινική εφαρμογή του συμπλέγματος OVA/BK/c-PGA.

Στην παρούσα μελέτη, επιδείξαμε υψηλή επαγωγή του ανοσοποιητικού συστήματος του βλεννογόνου από έναν νέο φορέα παροχής εμβολίου που κατασκευάστηκε με πρωτεΐνη αντιγόνου, BK και c-PGA μετά από πνευμονική χορήγηση. Το σύστημα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για εμβόλια κατά διαφόρων λοιμώξεων του αναπνευστικού.

Δήλωση αποκάλυψης

Καμία πιθανή σύγκρουση συμφερόντων δεν αναφέρθηκε από τους δημιουργούς.

Χρηματοδότηση

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από την Ιαπωνική Εταιρεία για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPS) KAKENHI υπό επιχορηγήσεις [JP20K12649 και JP20K07156].

βιβλιογραφικές αναφορές

1.Ainai A, Suzuki T, Tamura SI, et al. (2017). Ενδορινική χορήγηση ολικού αδρανοποιημένου εμβολίου ιού γρίπης ως πολλά υποσχόμενο υποψήφιο εμβόλιο γρίπης. Viral Immunol 30:451-62.

2.Amorij JP, Saluja V, Petersen AH, et al. (2007). Η πνευμονική χορήγηση ενός εμβολίου υπομονάδας γρίπης που έχει σταθεροποιηθεί με ινουλίνη που παρασκευάζεται με ξήρανση με ψεκασμό προκαλεί συστημικές, βλεννογονικές χυμικές καθώς και μεσολαβούμενες από κύτταρα ανοσοαποκρίσεις σε ποντικούς BALB/c. Vaccine 25:8707-17.

3.Bienenstock J. (1980). Λεμφοειδής ιστός που σχετίζεται με βρόγχους και η πηγή των κυττάρων που περιέχουν ανοσοσφαιρίνη στον βλεννογόνο. Environ Health Perspect 35:39–42.

4.Chen JR, Liu YM, Tseng YC, et al. (2020). Καλύτερα εμβόλια κατά της γρίπης: μια προοπτική του κλάδου. J Biomed Sci 27:11.

5. Du X, Xiong L, Dai S, et αϊ. (2015). Μεσοπορώδη νανοσωματίδια πυριτίου επικαλυμμένα με c-PGA με ομοιοπολικά συνδεδεμένα προφάρμακα για ενισχυμένη κυτταρική πρόσληψη και ενδοκυτταρική απελευθέρωση που ανταποκρίνεται στην GSH. Adv Healthc Mater 4: 771–81.

6. Firacative C, Gressler AE, Schubert K, et al. (2018). Ταυτοποίηση αντιγόνων T helper (Th){1- και Th2- του κρυπτόκοκκου neoformans σε ένα μοντέλο πνευμονικής λοίμωξης σε ποντικό. Sci Rep 8:14.

7. Giri PK, Sable SB, Verma I, et al. (2005). Συγκριτική αξιολόγηση ενδορινικής και υποδόριας οδού ανοσοποίησης για την ανάπτυξη εμβολίου βλεννογόνου κατά της πειραματικής φυματίωσης. FEMS Immunol Med Microbiol 45:87-93.

8. Horiguchi Μ, Oiso Υ, Sakai Η, et αϊ. (2015). Η πνευμονική χορήγηση του αναστολέα της φωσφοϊνοσιτίδης 3-κινάσης είναι μια θεραπευτική θεραπεία για τη χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια με κυψελιδική αναγέννηση. J Control Release 213:112–9.

9. Huber VC, McKeon RM, Brackin ΜΝ, et αϊ. (2006). Διακεκριμένες συνεισφορές των αντισωμάτων ανοσοσφαιρίνης G1 (IgG1) και IgG2a που προκαλούνται από το εμβόλιο στην προστατευτική ανοσία έναντι της γρίπης. Clin Vaccine Immunol 13: 981–90.

10. Ito R, Ozaki ΥΑ, Yoshikawa Τ, et αϊ. (2003). Οι ρόλοι των αντισωμάτων IgA και IgG κατά της αιμοσυγκολλητίνης σε διαφορετικές θέσεις της αναπνευστικής οδού εμβολιασμένων ποντικών στην πρόληψη της θανατηφόρου πνευμονίας της γρίπης. Vaccine 21:2362-71.

11.Kopf M, Schneider C, Nobs SP. (2015). Η ανάπτυξη και η λειτουργία των μακροφάγων και των δενδριτικών κυττάρων που κατοικούν στον πνεύμονα. Nat Immunol 16: 36–44.

12.Kurosaki T, Kitahara T, Fumoto S, et al. (2009). Τριμερή σύμπλοκα pDNA, πολυαιθυλενοϊμίνης και γ-πολυγλουταμινικού οξέος για συστήματα παροχής γονιδίων. Biomaterials 30:2846-53.

13.Kurosaki T, Kitahara T, Nakamura T, et al. (2012). Ανάπτυξη αποτελεσματικού εμβολίου κατά του καρκίνου χρησιμοποιώντας σύστημα στόχευσης πρωτεΐνης αντιγόνου σε APCs. Pharm Res 29:483–9.

14. Marple B, Roland P, Benninger M. (2004). Ανασκόπηση ασφάλειας του χλωριούχου βενζαλκονίου που χρησιμοποιείται ως συντηρητικό σε ενδορινικά διαλύματα: επισκόπηση αντικρουόμενων δεδομένων και απόψεων. Otolaryngol Head Neck Surg 130: 131–41.

15.McKee AS, Munks MW, Marrack P. (2007). Πώς λειτουργούν τα ανοσοενισχυτικά; Σημαντικές εκτιμήσεις για τα ανοσοενισχυτικά νέας γενιάς. Immunity 27: 687–90.

For more information:1950477648nn@gmail.com