In vitro Αξιολόγηση των πιο ενεργών προβιοτικών στελεχών ικανών να βελτιώσουν τις λειτουργίες του εντερικού φραγμού και να αποτρέψουν φλεγμονώδεις ασθένειες του γαστρεντερικού συστήματοςⅡ

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Κυτταρικές Καλλιέργειες

Ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου Καυκάσου Κύτταρα Caco{{{0}} (ATCC® HTB-37™) και κύτταρα HT29-MTX που εκκρίνουν βλέννα επιθηλίου ανθρώπινου κόλον (Sigma Aldrich) αρχικά καλλιεργήθηκαν χωριστά, και τα δύο χρησιμοποιώντας Μέσο DMEM (Gibco) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco), 100 IU/mL πενικιλλίνη, 100 mg/mL στρεπτομυκίνη (Gibco) και 2 mM γλουταμίνη (Gibco), στους 37 ◦C σε ατμόσφαιρα 5% CO2. Στη συνέχεια, οι συνκαλλιέργειες τοποθετήθηκαν σε πλάκες 12-wellTranswell® (με ένθετο πολυανθρακικού 12 mm και πόρους 0,4 μm) με επιμετάλλωση των κυττάρων στο βασεοπλευρικό διαμέρισμα σε αναλογία 75:25 Caco-2:HT 29-MTX και πραγματοποιήθηκε για 21 ημέρες, αλλάζοντας το μέσο κάθε 2 ημέρες.

Κάντε κλικ για να ανακουφιστείτε γρήγορα από τη δυσκοιλιότητα

2.2. Βακτηριακά στελέχη

Τα στελέχη Lactobacillus, συμπεριλαμβανομένων των Limosilactobacillus fermentum που απομονώθηκαν από βουβαλόγαλα [32], Levilactobacillus brevis SP-48, Lacticaseibacillus rhamnosus IMC501, Limosilactobacillus reuteri LR92 και Lacticaseibacillus reuteri LR92, και Lacticaseibacillus, η οποία παρέχεται από το έργο IMCSA5cabe. utici Italia, καλλιεργήθηκαν σε ζύμωση βιοαντιδραστήρα επεξεργάζεται και λυοφιλοποιούνται για να ληφθούν οι σκόνες που χρησιμοποιούνται ως πρώτη ύλη. Πριν από το πείραμα, οι σκόνες επαναιωρήθηκαν και αναπτύχθηκαν σε ζωμό Man, Rogosa και Sharpe (MRS-Oxoid) στους 37 ◦C σε μικροαερόφιλες συνθήκες για 24 ώρες.

2.3. Κυτταρική Θεραπεία

Τα συγκαλλιεργημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικά στελέχη Lactobacillus spp. (108 CFUs/mL) σε πολλαπλότητα μόλυνσης (MOI) 100, μόνο ή σε συνδυασμό με 20 μg/mL λιποπολυσακχαρίτη (LPS) S. Typhimurium, για 24 ώρες στους 37 ◦C σε 5% CO2 σε DMEM χωρίς αντιβιοτικά.

2.4. PCR σε πραγματικό χρόνο

Για να αξιολογηθεί η έκφραση των προ- και αντιφλεγμονωδών κυτοκινών, HBD-2 και TJs, τα κύτταρα στο τέλος των θεραπειών πλύθηκαν τρεις φορές με στείρο PBS και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης υψηλού καθαρού RNA ( Roche Diagnostics). Συνολικά 2{{20}}0 ng κυτταρικού RNA μεταγράφηκαν αντίστροφα (Expand Reverse Transcriptase, Roche) σε συμπληρωματικό DNA (cDNA) χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές εξαμερούς (randomhexamers, Roche) στο 42 ◦C για 45 λεπτά, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. PCR σε πραγματικό χρόνο για IL-6, IL-8, TNF- , IL{-1 , TGF-, HBD-2, Occludin, Zonulin-1 και Claudin{{ 14}} διεξήχθη με το κιτ LC Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Diagnostics) χρησιμοποιώντας 2 μL cDNA, που αντιστοιχεί σε 10 ng ολικού RNA σε τελικό όγκο 20 μL, 3 mMMgCl2 και 0,5 μΜ νοηματικά και αντινοηματικά εκκινητές ( Τραπέζι 1). Μετά την ενίσχυση, η ανάλυση της καμπύλης τήξης διεξήχθη με θέρμανση στους 95 ◦ C για 15 s με ρυθμό μετάπτωσης θερμοκρασίας 20 ◦ C/s, ψύξη στους 60 ◦ C για 15 s με ρυθμό μετάπτωσης θερμοκρασίας 20 ◦ C/s, και στη συνέχεια θέρμανση του δείγματος στους 0,1 ◦C/s έως 95 ◦C. Στη συνέχεια τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό LightCycler (Roche Diagnostics). Η τυπική καμπύλη κάθε ζεύγους εκκινητών αποκαταστάθηκε με σειριακές αραιώσεις cDNA. Όλες οι PCR εκτελέστηκαν εις τριπλούν. Η ιδιαιτερότητατων προϊόντων ενίσχυσης επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2% και οπτικοποίηση με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου [6].

2.5. Δοκιμασία ELISA

Η παρουσία IL-6, IL-8, IL-1 , TNF- , TGF- , HBD-2, Zonulin-1, Occludin και Claudin{{7 }} στα κυτταρικά προϊόντα λύσης Caco-2/HT29-MTX συν-καλλιεργειών μολυσμένων με διαφορετικά στελέχη γαλακτοβακίλλων με ή χωρίς LPS αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA, Invitrogen, IL{12 }}, IL{-8, IL-1 άλφα, TNF άλφα και TGF βήτα-1 HumanELISA Kit· Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Defensin 2, βήτα (Human)—ELISA Kit· Elabscience Biotechnology Inc. Human Zonulin, Human OCLN (Occludin) και Human CLDN1 (Claudin 1) ELISA Kit).

2.6. Προσκόλληση και Δοκιμασία Επεμβατικότητας

Η ικανότητα των L. brevis, L. reuteri και L. rhamnosus να μειώνουν την ικανότητα προσκόλλησης και διεισδυτικότητας του S. Typhimurium και του EIEC σε εντερικές συγκαλλιέργειες διερευνήθηκε σε τρεις διαφορετικούς πειραματικούς τύπους: (i) ανταγωνιστική δοκιμασία, στην οποία τα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα επωάστηκαν ταυτόχρονα. με γαλακτοβάκιλλους (108 CFUs/mL) και S. Typhimuriumor EIEC (108 CFUs/mL) για 2 ώρες. (ii) Δοκιμασία αναστολής, στην οποία τα κύτταρα προεπωάστηκαν με γαλακτοβάκιλλους (108 CFUs/mL) για 2 ώρες, και στη συνέχεια προστέθηκε S. Typhimurium ή EIEC (108 CFUs/mL) και επωάστηκαν για επιπλέον 2 ώρες. (iii) Δοκιμασία μετατόπισης στην οποία τα κύτταρα προεπωάστηκαν με S. Typhimurium ή EIEC (108 CFUs/mL) για 2 ώρες και στη συνέχεια γαλακτοβάκιλλοι (108 CFUs/mL) προστέθηκαν και επωάστηκαν περαιτέρω για 2 ώρες. Στο τέλος αυτού του χρόνου, οι μολυσμένες μονοστιβάδες πλύθηκαν εκτενώς σε PBS και στη συνέχεια λύθηκαν με διάλυμα 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ) σε PBS για 10 λεπτά στο δωμάτιο θερμοκρασία για να μετρηθούν τα εσωτερικευμένα βακτήρια. Τα δείγματα των προϊόντων λύσης κυττάρων αραιώθηκαν σειριακά και επιστρώθηκαν σε άγαρ Hektoen (OXOID) και επωάστηκαν στους 37 ◦C όλη τη νύχτα για να ποσοτικοποιηθούν τα συνολικά βιώσιμα συνδεδεμένα με κύτταρα βακτήρια (CFU/mL). Για δοκιμές επεμβατικότητας, μετά την επώαση με βακτήρια, οι μολυσμένες μονοστιβάδες πλύθηκαν εκτενώς με στείρο PBS και επωάστηκαν περαιτέρω για άλλες 2 ώρες στο μέσο DMEM, συμπληρωμένο με θειική γενταμικίνη (250 μg ml-1) (Sigma-Aldrich) για να σκοτωθούν τα εξωκυτταρικά βακτήρια. Στη συνέχεια τα κύτταρα λύθηκαν και επιστρώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως για να ποσοτικοποιηθεί ο συνολικός αριθμός εσωτερικοποιημένων βακτηρίων (CFU/mL).

2.7. Στατιστική ανάλυση

Οι σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν μέσω αμφίδρομης ANOVA χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism 8.0 και η σύγκριση μεταξύ των μέσων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το τεστ t του aStudent. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Φυσικό Βοτανικό Φάρμακο για την Ανακούφιση από τη Δυσκοιλιότητα-Σκιστάνο

Το Cistanche είναι ένα γένος παρασιτικών φυτών που ανήκει στην οικογένεια Orobanchaceae. Αυτά τα φυτά είναι γνωστά για τις φαρμακευτικές τους ιδιότητες και χρησιμοποιούνται στην Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική (TCM) εδώ και αιώνες. Τα είδη Cistanche απαντώνται κυρίως σε άνυδρες και ερημικές περιοχές της Κίνας, της Μογγολίας και σε άλλα μέρη της Κεντρικής Ασίας. Τα φυτά Cistanche χαρακτηρίζονται από τους σαρκώδεις, κιτρινωπούς μίσχους τους και εκτιμώνται ιδιαίτερα για τα πιθανά οφέλη για την υγεία τους. Στο TCM, το Cistanche πιστεύεται ότι έχει τονωτικές ιδιότητες και χρησιμοποιείται συνήθως για τη θρέψη των νεφρών, την ενίσχυση της ζωτικότητας και την υποστήριξη της σεξουαλικής λειτουργίας. Χρησιμοποιείται επίσης για την αντιμετώπιση ζητημάτων που σχετίζονται με τη γήρανση, την κούραση και τη γενική ευεξία. Ενώ το Cistanche έχει μακρά ιστορία χρήσης στην παραδοσιακή ιατρική, η επιστημονική έρευνα για την αποτελεσματικότητα και την ασφάλειά του είναι συνεχής και περιορισμένη. Ωστόσο, είναι γνωστό ότι περιέχει διάφορες βιοδραστικές ενώσεις όπως φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες, ιριδοειδή, λιγνάνες και πολυσακχαρίτες, οι οποίες μπορεί να συμβάλλουν στις φαρμακευτικές του επιδράσεις.

Wecistanche'sσκόνη cistanche, δισκία cistanche, κάψουλες cistanche, και άλλα προϊόντα αναπτύσσονται χρησιμοποιώνταςέρημοςκιστανάκιως πρώτες ύλες, που όλες έχουν καλή επίδραση στην ανακούφιση από τη δυσκοιλιότητα. Ο συγκεκριμένος μηχανισμός είναι ο εξής: Το Cistanche πιστεύεται ότι έχει πιθανά οφέλη για την ανακούφιση από τη δυσκοιλιότητα με βάση την παραδοσιακή χρήση του και ορισμένες ενώσεις που περιέχει. Ενώ η επιστημονική έρευνα ειδικά για την επίδραση του Cistanche στη δυσκοιλιότητα είναι περιορισμένη, πιστεύεται ότι έχει πολλαπλούς μηχανισμούς που μπορεί να συμβάλλουν στη δυνατότητά του να ανακουφίσει τη δυσκοιλιότητα. Υπακτικό αποτέλεσμα:Cistancheέχει χρησιμοποιηθεί από καιρό στην Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική ως θεραπεία για τη δυσκοιλιότητα. Πιστεύεται ότι έχει ένα ήπιο καθαρτικό αποτέλεσμα, το οποίο μπορεί να βοηθήσει στην προώθηση των κινήσεων του εντέρου και να προκαλέσει δυσκοιλιότητα. Αυτή η επίδραση μπορεί να αποδοθεί σε διάφορες ενώσεις που βρίσκονται στο Cistanche, όπως οι φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες και οι πολυσακχαρίτες. Ενυδάτωση των εντέρων: Με βάση την παραδοσιακή χρήση, το Cistanche θεωρείται ότι έχει ενυδατικές ιδιότητες, στοχεύοντας συγκεκριμένα στα έντερα. Η προώθηση της ενυδάτωσης και της λίπανσης των εντέρων μπορεί να βοηθήσει να μαλακώσουν τα εργαλεία και να διευκολύνουν το πέρασμα, ανακουφίζοντας έτσι τη δυσκοιλιότητα. Αντιφλεγμονώδες αποτέλεσμα: Η δυσκοιλιότητα μπορεί μερικές φορές να σχετίζεται με φλεγμονή στο πεπτικό σύστημα. Το Cistanche περιέχει ορισμένες ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων των φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδίων και των λιγνάνων, που πιστεύεται ότι έχουν αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες. Μειώνοντας τη φλεγμονή στα έντερα, μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της κανονικότητας των κινήσεων του εντέρου και στην ανακούφιση από τη δυσκοιλιότητα.