Ανοσοδιεγερτική δράση πολυσακχαριτών που εκχυλίζονται με νερό από το Cistanche Deserticola ως ανοσοενισχυτικό φυτού in vitro και in vivo

Εισαγωγή

Τα εμβόλια είναι σημαντικά για τον έλεγχο ή την πρόληψη ασθενειών. Τα πρόσφατα δημιουργούμενα και αναπτυσσόμενα εμβόλια είναι εξαιρετικά καθαρισμένα ανασυνδυασμένα αντιγόνα με υψηλότερη ασφάλεια, αλλά τα καθαρισμένα αντιγόνα δεν μπορούν να διεγείρουν μια ικανοποιητική ανοσοαπόκριση σε σύγκριση με παρασκευάσματα εξασθενημένων ή αδρανοποιημένων παθογόνων. Με τη βοήθεια ανοσοενισχυτικών, τα εμβόλια μπορούν να προκαλέσουν επίμονες ανοσολογικές αποκρίσεις [1,2]. Νέα ισχυρά ανοσοενισχυτικά αφορούν ευρέως και στα δύο εμβόλιαανάπτυξη και την ανθρώπινη υγεία. Μέχρι σήμερα, έχουν εντοπιστεί και μελετηθεί εκτενώς διάφορα βοηθητικά. Αυτά τα ανοσοενισχυτικά προσφέρουν στα εμβόλια πολλά πλεονεκτήματα, όπως η μείωση της απαιτούμενης ποσότητας αντιγόνων, η ελαχιστοποίηση του αριθμού των εμβολιασμών που απαιτούνται για φυσιολογικές ανοσολογικές αποκρίσεις και η πρόκληση πιο γρήγορων, ευρύτερων και ισχυρότερων ανοσολογικών αποκρίσεων.3–5]. Αν και έχουν αναπτυχθεί πολλά ισχυρά ανοσοενισχυτικά, όπως ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS) και το πλήρες ανοσοενισχυτικό Freund (FCA), δεν εφαρμόζονται ευρέως λόγω της τοξικότητάς τους. Ως εκ τούτου, μόνο μερικά πρόσθετα, όπως το Alum, έχουν άδεια για κλινική χρήση [6]. Συνολικά, θα πρέπει να αναπτυχθούν πιο αποτελεσματικά και ασφαλέστερα ανοσοενισχυτικά για την προώθηση καλύτερων προφυλακτικών και θεραπευτικών εμβολίων κατά των μολυσματικών και μη μολυσματικών ασθενειών.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Η ασφάλεια είναι ένας σημαντικός παράγοντας που λαμβάνεται υπόψη στην ανάπτυξη βοηθητικών. Τα κινεζικά ποώδη συστατικά περιλαμβάνουν θρεπτικά συστατικά και σημαντικά ενεργά σύνθετα, όπως φαινολικές ενώσεις και πολυσακχαρίτες, που μπορούν να δράσουν ως ισχυρά ανοσοδιεγερτικά [7-9]. Μεταξύ αυτών, πολυσακχαρίτες από παραδοσιακά κινέζικα βότανα έχουν διερευνηθεί ευρέως λόγω των ανοσοδιεγερτικών τους δραστηριοτήτων και της χαμηλής τοξικότητάς τους. Για παράδειγμα, η ινουλίνη είναι ένα ανοσοενισχυτικό χωρίς την τοξικότητα άλλων ανοσοενισχυτικών όπως το FCA. Το ανοσοενισχυτικό δέλτα ινουλίνης AdvaxTM έχει επίσης ενισχύσει με επιτυχία την ανοσογονικότητα του εμβολίου [10,11]. Το Astragalus, γνωστό και ως Huangqi στα κινέζικα και Radix Astragali στα λατινικά, διανέμεται ευρέως σε όλο τον κόσμο. Ο πολυσακχαρίτης είναι ένα από τα κύρια ενεργά συστατικά του που είναι υπεύθυνο για την ανοσοτροποποιητική δράση. Πειραματικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο πολυσακχαρίτης Astragalus είχε ισχυρές ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις τόσο in vitro όσο και in vivo [12, 13]. Οι πολυσακχαρίτες Lycium barbarum ως ανοσοενισχυτικό εμβολίου παρουσίασαν επίσης καλές βελτιώσεις και διεγερτικά αποτελέσματα [14, 15]. Αυτές οι μελέτες πρότειναν ότι οι κινεζικοί πολυσακχαρίτες βοτάνων ήταν ιδανικοί υποψήφιοι για την ανάπτυξη ανοσοενισχυτικού.

Cistanche deserticolaΤο YC Ma (CD, "Rou Cong Rong" στα κινέζικα) είναι ένα πολύτιμο παραδοσιακό κινέζικο βότανο και συνήθως θεωρείται το "Ginseng των ερήμων" λόγω των ανώτερων τονωτικών του επιδράσεων. Διανέμεται σε άνυδρες ή ημίξηρες περιοχές στο Xinjiang. Στην Κίνα, το αποξηραμένο σαρκώδες στέλεχος του χρησιμοποιείται ως τονωτική τροφή για εκατοντάδες χρόνια [16, 17]. Για πολλά χρόνια, το βρασμένο CD έχει χρησιμοποιηθεί ως τονωτικό τρόφιμο για τη θεραπεία της βλάβης που προκαλείται από υπερβολική καταπόνηση, υποδηλώνοντας ότι είναι ασφαλές για χορήγηση από το στόμα. Αυτό το φυτό θεωρείται ευρέως λόγω των ευρειών φαρμακευτικών του λειτουργιών. Πρόσφατες φυτοχημικές και φαρμακολογικές μελέτες έδειξαν ότι οι πολυσακχαρίτες ήταν τα κύρια βιολογικά ενεργά συστατικά και είχαν διάφορες βιολογικές επιδράσεις, όπωςανοσοτροποποιητική δράση, αντιοξειδωτική δράση και αντιφλεγμονώδη δράση[18-21]. Ωστόσο, η δραστηριότητα ενίσχυσης του ανοσοποιητικού των πολυσακχαριτών που εκχυλίζονται με νερό από το C. deserticola στο Xinjiang αναφέρθηκε σπάνια.

Είναι ευρέως γνωστό ότι τα DCs είναι σημαντικά κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο (APC) που παρέχουν σήματα που απαιτούνται για την έναρξη ανοσολογικών αποκρίσεων και τη ρύθμιση των εγγενών και προσαρμοστικών κυττάρων. Ορισμένα ανοσοενισχυτικά που βελτιώνουν την πρόσληψη αντιγόνου από τα DCs μπορούν να αυξήσουν τα συν-διεγερτικά ή τα μόρια MHC καιενίσχυση της ανοσίας. Όταν ξεκινά η ωρίμανση των DCs, παράγονται περισσότερα συν-διεγερτικά μόρια και κυτοκίνες και τα DC εμφανίζουν διακριτούς φαινότυπους [22, 23].

Σε αυτή τη μελέτη, αρχικά εκμεταλλευτήκαμε εάν το WPCD θα μπορούσε να προωθήσει την ενεργοποίηση των DC μέσω της οδού σηματοδότησης TLR4 in vivo. Δεδομένου ότι τα DCs ήταν ο σύνδεσμος μεταξύ της έμφυτης και της προσαρμοστικής ανοσοαπόκρισης, υποθέσαμε ότι η ενεργοποίηση των DCs που διεγείρεται από το WPCD θα επηρέαζε το αποτέλεσμα της προσαρμοστικής ανοσίας. Εξετάσαμε την ειδική ανοσοαπόκριση στην ωοαλβουμίνη (OVA) σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με WPCD, συμπεριλαμβανομένων των τίτλων της υποκατηγορίας IgG, IgG1 και IgG2a, του πολλαπλασιασμού Τ- και Β- και της παραγωγής κυτοκίνης. Ερευνήσαμε εάν η θεραπεία με WPCD θα αύξανε τη δραστηριότητα των DCs και των κυττάρων Treg στον σπλήνα αυτών των ποντικών. Τα ευρήματά μας απέδειξαν την πιθανή ανοσοτροποποιητική δράση των φυσικών πολυσακχαριτών από το C. deserticola και διεύρυναν το πεδίο εφαρμογής του.

Υλικά και μέθοδοι

Των ζώων

Θηλυκά ποντίκια C57BL/6, BALB/c ή ICR ηλικίας οκτώ έως δέκα εβδομάδων αγοράστηκαν από το Πρώτο Νοσοκομείο του Ιατρικού Πανεπιστημίου Xinjiang (Urimuqi, Xinjiang, Κίνα). Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε συνθήκες απαλλαγμένες από παθογόνα σύμφωνα με τις οδηγίες της Επιτροπής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων (ACUC) του Πανεπιστημίου Xinjiang για την Υγεία και την Ευημερία των Ζώων. Οι διαδικασίες πειράματος σε ζώα είχαν εγκριθεί από το AUCC του Πανεπιστημίου Xinjiang.

Εκχύλιση υδατικών εκχυλισμάτων

Το C. deserticola είναι ένα φυτό στην επαρχία Xinjiang στην Κίνα. Ο ακατέργαστος πολυσακχαρίτης ελήφθη μέσω εκχύλισης νερού και καθίζησης με αιθανόλη. Εν συντομία, 100 g ξηρού C. deserticola αλέστηκε σε σκόνη και στη συνέχεια διηθήθηκε. Η σκόνη ανέρρευσε με πετρελαϊκό αιθέρα σε θερμοκρασία δωματίου επανειλημμένα και στη συνέχεια ανέρρευσε με άνυδρη αιθανόλη για 1 ώρα για να απομακρυνθούν τα έγχρωμα συστατικά και τα λιπίδια. Τα υπολείμματα εκχυλίστηκαν με βραστό νερό για τρεις φορές και τα εκχυλίσματα συνενώθηκαν μαζί, φυγοκεντρήθηκαν στις 4000 rpm για 10 λεπτά και ανέρρευσαν στους 60°C για 4 ώρες. Τέσσερις φορές όγκος αιθανόλης 95% προστέθηκαν στο διάλυμα για να καταβυθιστούν ακατέργαστοι πολυσακχαρίτες. Οι ακατέργαστοι πολυσακχαρίτες επαναδιαλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αντιδραστήριο Sevage για την απομάκρυνση των πρωτεϊνών. Τα εκχυλίσματα διαλύθηκαν σε PBS και αποστειρώθηκαν μέσω φίλτρου 0,22-μm. Τέλος, η συνολική περιεκτικότητα σε ζάχαρη του WPCD ήταν 59,58%, όπως υποδεικνύεται από την ανάλυση φαινόλης-θειικού οξέος [24].

Δημιουργία DC

Τα BM-DC δημιουργήθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως με μικρές τροποποιήσεις [25]. Τα DC μυελού των οστών από ποντικούς C57BL/6 ξεπλύθηκαν με πλήρες μέσο RPMI-1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone). Τα συλλεχθέντα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 με 50 μM-μερκαπτοαιθανόλη (Sigma, St Louis, MO) και 20 ng/mL GM-CSF ποντικού (Peprotech, Rocky Hill, NY) και επωάστηκαν στους 37˚ C σε ατμόσφαιρα CO2 5%. Το μισό από το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε από φρέσκο ​​μέσο που περιείχε GM-CSF κάθε 1-2 ημέρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν την Ημέρα 6, υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές δόσεις WPCD και LPS (100 ng/mL) (Sigma, St Louis, ΜΟ) για 24 ώρες και στη συνέχεια αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Ανίχνευση ωρίμανσης DCs και ενεργοποίηση Τ κυττάρων in vitro

Η in vitro επίδραση ωρίμανσης του WPCD στα BM-DCs αξιολογήθηκε με βάση τα αποτελέσματα φαινοτυπικής ανάλυσης από τα FAC. Την ημέρα 7, τα BM-DCs από το C57BL/6 προκλήθηκαν παρουσία GM-CSF και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές συγκεντρώσεις WPCD (0.01, 0.{{ 11}}2, 0.05, 0.1 και 0.2 mg/mL) για 12 ώρες εις τριπλούν. Ως θετικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε LPS (100 ng/mL). Αφού τα BM-DCs πλύθηκαν σε PBS και το Fc Block (BD Biosciences, CA) χρησιμοποιήθηκε για να αποτραπεί η μη ειδική δέσμευση αντισωμάτων, τα κύτταρα χρωματίστηκαν σε PBS χρησιμοποιώντας το κατάλληλο FITC-, PE- ή APC-συζευγμένο CD40, CD11c, CD{ {23}}, αντισώματα CD80 και MHC-II (BD) για 20 λεπτά στους 37°C. Τα χρωματισμένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με FACs Calibur (BD). Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό FlowJo (Tree Star).

Στο πείραμα ωρίμανσης DCs in vitro, συλλέχθηκαν επίσης υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας για ανάλυση IL-12 και TNF- χρησιμοποιώντας κιτ προσδιορισμού κυτοκίνης (Boster, Wuhan, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε με συσκευή ανάγνωσης πλακών ELISA (Bio-Rad, ΗΠΑ). Οι ποσότητες κυτοκινών στα δείγματα υπολογίστηκαν με πρότυπες καμπύλες ανασυνδυασμένων κυτοκινών σύμφωνα με τη γραμμική μέθοδο παλινδρόμησης.

Για να ελεγχθεί η αλλογονική διεγερτική τους δράση, το πείραμα της μικτής αντίδρασης λεμφοκυττάρων (MLR) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την προηγούμενη μέθοδο [26] με τη δοκιμασία MTT (Sigma, St Louis, MO). Εν συντομία, τα BM-DC από ποντίκια C57BL/6 που χρησιμοποιήθηκαν ως διεγερτικά κύτταρα ανακτήθηκαν την Ημέρα 7 σε μέσο RPMI-1640 συν GM-CSF και υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις WPCD για 12 ώρες στους 37˚C. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 πριν από την επιμετάλλωση στην πλάκα 24-πηγαδιού. Κύτταρα απόκρισης εναιωρήματος απλών πλενοκυττάρων απομονώθηκαν από ποντικούς BALB/c. Τα BM-DCs αναμίχθηκαν με σπληνοκύτταρα σύμφωνα με τις αναλογίες 1:5 και 1:10. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37°C σε ατμόσφαιρα 5% CO2 για τρεις ημέρες εις τριπλούν. Η θεραπεία LPS χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Οι καλλιέργειες προστέθηκαν στη συνέχεια με 20 μL MTT για την τελική 4-h καλλιέργεια. Οι απορροφήσεις στο μήκος κύματος μέτρησης (490 nm) και στο μήκος κύματος αναφοράς (650 nm) μετρήθηκαν για ανάλυση πολλαπλασιασμού Τ κυττάρων. Όλα τα δείγματα μετρήθηκαν σε σχέση με έναν έλεγχο υποβάθρου.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΑΣ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Θεραπεία με αναστολέα TLR4 in vitro

Τα BM-DCs υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 5 μΜ TAK-242 (αναστολέας του TLR4, Medchemexpress Inc. USA) για 1 ώρα και στη συνέχεια συγκαλλιεργήθηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις WPCD (100 και 200 ​​ug/mL) για 12 ώρες παρουσία ή απουσία Golgi Stop εις τριπλούν. Στον θετικό έλεγχο προστέθηκε LPS. Τα κύτταρα και τα υπερκείμενα ανιχνεύθηκαν με FAC για την ανάλυση επιφανειακών δεικτών CD86 και CD40 και με ELISA για ανάλυση των κυτοκινών TNF-a και IL-12, αντίστοιχα.

Πρωτόκολλο ανοσοποίησης

Δοκιμή οξείας τοξικότητας

Στη δοκιμή οξείας τοξικότητας από το στόμα σε αυτήν τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν 40 υγιείς ενήλικοι ποντικοί ICR. Τα ποντίκια ICR ήταν νηστικά (τροφή αλλά όχι νερό όλη τη νύχτα) πριν από τη δόση. Το WPCD χορηγήθηκε από το στόμα αντίστοιχα σε δόσεις των 0, 50, 500 ή 5000 mg/kg σωματικού βάρους σε κάθε ζώο για 7 ημέρες. Τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε αγωγή με αλατούχο διάλυμα και ποντίκια που έλαβαν στυπτηρία συμπεριλήφθηκαν στην ομάδα ελέγχου. Τα ζώα παρατηρούνταν καθημερινά για 14 διαδοχικές ημέρες. Τα ποντίκια παρατηρήθηκαν μεμονωμένα για να καταγράφουν τη θνησιμότητα και τα κλινικά σημεία. Επιπλέον, το σωματικό βάρος και η κατανάλωση τροφής και νερού μετρήθηκαν σε όλη τη διάρκεια του πειράματος. Την Ημέρα 14, ο δείκτης σπλήνας ή θύμου αδένα υπολογίστηκε ως (βάρος σπλήνας ή θύμου/σωματικό βάρος) × 10.

Ανίχνευση ανοσοτροποποιητικής δραστηριότητας WPCD in vivo.

Για να διερευνηθεί εάν το WPCD είχε ανοσοτροποποιητική δράση, χρησιμοποιήθηκε ωολευκωματίνη (OVA) (Sigma) ως μοντέλο αντιγόνου και θηλυκά ποντίκια ICR διαχωρίστηκαν τυχαία σε 7 ομάδες (ομάδα αρνητικού ελέγχου (0.9% NaCl και WPCD 400 ug ) και τον θετικό έλεγχο (Alum 200 ug με OVA)). Στα ποντίκια χορηγήθηκε υποδόρια δύο φορές με 10 ug OVA μόνο ή WPCD με OVA σύμφωνα με τη δόση των 20, 100 ή 400 ug με ένα διάστημα 2- εβδομάδας. Δείγματα αίματος και σπλήνας ελήφθησαν μετά τον αναμνηστικό εμβολιασμό για την ανίχνευση των τίτλων IgG, των υποκατηγοριών IgG, του πολλαπλασιασμού των σπληνοκυττάρων και της κυτοκίνης, των επιφανειακών δεικτών DCs και της συχνότητας Treg.

Ανίχνευση ειδικών για την OVA αντισωμάτων

Οι ειδικοί για την OVA τίτλοι και υποκατηγορίες IgG εξετάστηκαν με ELISA σύμφωνα με την προηγούμενη μέθοδο [27]. Οι πλάκες ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) επικαλύφθηκαν όλη τη νύχτα και στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν. Τα δείγματα ορού αραιώθηκαν σειριακά για ανάλυση τίτλου IgG ή για την ανίχνευση IgG1 και IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν με PBST που περιέχει συζευγμένο με HRP αντι-ποντικού IgG, IgG1 και IgG2a για 1 ώρα στους 37°C. Η χρωματομετρική αντίδραση αναπτύχθηκε με τετραμεθυλβενζιδίνη (ΤΜΒ) και στη συνέχεια μετρήθηκαν οι απορροφήσεις στα 450 nm/655 nm και εκφράστηκαν ως μονάδες οπτικής πυκνότητας (OD).

Ανίχνευση πολλαπλασιασμού σπληνοκυττάρων και κυτοκίνης

Ο πολλαπλασιασμός των σπληνοκυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Την ημέρα 21 μετά τον πρώτο εμβολιασμό, ελήφθη ένα εναιώρημα σπληνοκυττάρου. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 σε τρυβλία 96-πηγαδιών σύμφωνα με τη συγκέντρωση 1×106 κυττάρων/φρεάτιο εις τριπλούν. Οι καλλιέργειες διεγέρθηκαν με OVA (τελική συγκέντρωση 10 ug/mL), ConA (τελική συγκέντρωση 5 ug/mL) (Sigma, St Louis, MO) και LPS (τελική συγκέντρωση 100 ng/mL) για 48 ώρες στους 37˚C . Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες και 20 μL (5 mg/mL) ΜΤΤ (Sigma, St Louis, MO) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για άλλες 4 ώρες. Μετά την προσθήκη 50 μL DMSO σε κάθε φρεάτιο για να σταματήσει η ανάπτυξη χρώματος (Sigma), οι πλάκες διαβάστηκαν στα 570 nm από συσκευή ανάγνωσης πλακών μικροτιτλοδότησης (BioRad, CA, USA). Ο πολλαπλασιασμός των σπληνοκυττάρων εκφράστηκε ως δείκτης διέγερσης (SI), που ήταν η αναλογία OD570 nm ενός διεγερμένου φρεατίου προς ένα μη διεγερμένο φρεάτιο.

Οι αποδόσεις IL-4 και IFN- σε Τ κύτταρα μετρήθηκαν με ενδοκυτταρική χρώση κυτοκίνης σύμφωνα με ένα δημοσιευμένο πρωτόκολλο με μικρές τροποποιήσεις [27, 28]. Ένα εναιώρημα σπληνοκυττάρου παρασκευάστηκε την Ημέρα 21 μετά τον πρώτο εμβολιασμό. Μετά τη λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων, τα σπληνοκύτταρα (2×106 κύτταρα/mL) επωάστηκαν με OVA (10 ug/mL) για 4-h διέγερση και προστέθηκε Golgi stop (BD) για 12 ώρες επώαση, PMA ως θετικό έλεγχος. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, χρωματίστηκαν με CD{10}}FITC/CD8-FITC και σταθεροποιήθηκαν και διαπερατήθηκαν με κιτ Cytofix/Cytoperm (BD) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ενδοκυτταρική χρώση κυτοκίνης πραγματοποιήθηκε με την κατάλληλη συγκέντρωση αντισωμάτων IL-4-PE ή IFN- -APC στους 4°C για 20 λεπτά. Τα χρωματισμένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με FAC. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε στο FlowJo.

Εκτίμηση της ωρίμανσης των DCs και των κυττάρων Treg στον σπλήνα

Για την ανάλυση της ωρίμανσης DC από σπληνοκύτταρα σε ποντικούς, πραγματοποιήθηκε χρώση της κυτταρικής επιφάνειας με αντισώματα CD11c-PE, CD40-FITC και CD80-APC. Την ημέρα 3 μετά τον πρώτο εμβολιασμό, ελήφθη εναιώρημα απλού σπληνοκυττάρου (1×106 κύτταρα/mL) και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε διπλή χρώση. Οι εντάσεις φθορισμού μετρήθηκαν με τα FACs Calibur και τα μετρούμενα δεδομένα αναλύθηκαν από το FlowJo.

Για να παρατηρήσετε εάν το WPCD θα μπορούσε να μειώσει τη συχνότητα των κυψελών CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg. Εναιώρημα απλού σπληνοκυττάρου παρασκευάστηκε την Ημέρα 7 μετά τον δεύτερο εμβολιασμό. Το σπληνοκύτταρο (2×106 κύτταρα/mL) υποβλήθηκε σε χρώση κυτταρικής επιφάνειας με αντίσωμα CD4-APC, ακολουθούμενη από χρώση πυρηνικής κυτοκίνης με τα κατάλληλα αντισώματα CD25-FITC και Foxp3-PE με το ρυθμιστικό κιτ χρώσης Τ-κυττάρων ποντικιού (eBiosciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συχνότητα των κυψελών CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg δοκιμάστηκε σε FAC. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε στο FlowJo.

Στατιστική ανάλυση

Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές μονόδρομης ανάλυσης διακύμανσης (ANOVA) (Tukey's Multiple-Comparison Test) για να αναλυθούν οι διαφορές μεταξύ πολλαπλών πειραματικών ομάδων. Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Π< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

Αποτελέσματα Το WPCD προώθησε την ωρίμανση και τη λειτουργία των BM-DCs in vitro

Η προσαρμοστική ανοσία καθορίζεται από την ενεργοποίηση των DCs, συμπεριλαμβανομένων των τύπων συν-διεγερτικών μορίων και κυτοκινών [29, 30]. Αρχικά, διερευνήσαμε εάν το WPCD θα μπορούσε να προάγει την έκφραση συν-διεγερτικών μορίων. Σύμφωνα με διαφορετικές δόσεις WPCD, BM-DCs

από το C57BL/6 χορηγήθηκαν. Τα επίπεδα έκφρασης των CD11c, CD86, CD80, CD40 και MHC-II σε κύτταρα αναλύθηκαν (Σχήμα 1). Τα κύτταρα που καλύπτονταν με SSC και FSC έδειξαν ότι η θεραπεία με διαφορετικές δόσεις WPCD δεν άλλαξε τη μορφολογία των BM-DCs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα επίπεδα έκφρασης των CD86, CD80 και CD40 αυξήθηκαν σημαντικά με δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με την ομάδα που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία και έφθασαν στο επίπεδο κάτω από τη δόση των 20 ug/mL WPCD, αλλά η διαφορά ήταν δεν είναι σημαντικό σε σύγκριση με την ομάδα LPS (Εικ. 1A–1C). Το επίπεδο έκφρασης του MHC-II αυξήθηκε σημαντικά στη μέγιστη τιμή του υπό τη δόση των 50 ug/mL (Σχήμα 1D). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης των δεικτών κυτταρικής επιφάνειας έδειξαν ότι τα DC που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LPS ή WPCD έδειξαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης CD86, CD80, CD40 και MHC-II και προάγουν τη φαινοτυπική ωρίμανση.

Ορισμένα ανοσοενισχυτικά θα μπορούσαν να αυξήσουν τα συν-διεγερτικά μόρια στα DC ή να προκαλέσουν άμεσα την έκκριση κυτοκινών. Η IL-12 και ο TNF- είναι οι κύριες κυτοκίνες για την ενεργοποίηση της ανοσοαπόκρισης Th1. Αναλύσαμε τις αποδόσεις κυτοκίνης σε BM-DCs κατά τη θεραπεία με WPCD. Αφού τα BM-DC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικά περιεχόμενα WPCD για 12 ώρες, το υπερκείμενο συλλέχθηκε για να ανιχνευθούν τα περιεχόμενα του IL-12 και του TNF- με ένα κιτ ELISA. Το WPCD θα μπορούσε δοσοεξαρτώμενα να αυξήσει την παραγωγή IL-12 (Εικ. 2Α) και TNF- (Εικ. 2Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το WPCD θα μπορούσε να προκαλέσει τη λειτουργική ωρίμανση των DCs.

Σε μια ανοσοαπόκριση, είναι απαραίτητο να ενεργοποιηθούν λειτουργικά τα DC. Στη συνέχεια, το υψηλότερο επίπεδο πολλαπλασιασμού των αλλογενών Τ-κυττάρων προκλήθηκε από πλήρως ώριμα DCs. Επομένως, η λειτουργική απόκριση των DCs στο WPCD διερευνήθηκε από το MLR. Η αλλοδιεγερτική ικανότητα των επαγόμενων από το WPCD DCs, παρόμοια με το LPS, ενισχύθηκε δραματικά με δοσοεξαρτώμενο τρόπο στην υποδεικνυόμενη αναλογία (Εικ. 2C και 2D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το WPCD βελτίωσε την παρουσίαση αντιγόνου και βελτιστοποίησε την απόκριση των Τ-κυττάρων με MLR in vitro.

Το WPCD προώθησε την ωρίμανση των DCs μέσω της οδού TLR4

Θα μπορούσε να συναχθεί από τα παραπάνω αποτελέσματα ότι τα BM-DCs που ενεργοποιήθηκαν από το WPCD έδειξαν παρόμοιες εκφράσεις επιφανειακών μορίων DCs με το LPS (ένας συνδέτης TLR4). Υποθέσαμε έτσι ότι τα BM-DCs ενεργοποιούνται από το WPCD μέσω της οδού TLR4. Αφού τα BM-DC υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με TAK-242 (αναστολέας TLR4) και συγκαλλιεργήθηκαν με WPCD και LPS για 12 ώρες, η έκφραση των CD40, CD{10}}, TNF-a ή IL{{12 }} εντοπίστηκε με FAC ή ELISA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α και 3Β, η θεραπεία με TAK-242 είχε ως αποτέλεσμα τις σημαντικά μειωμένες εκφράσεις των CD40 και CD86 που προκαλούνται από LPS ή WPCD και παραγωγή κυτοκίνης IL-12 ή Το TNF-a μειώθηκε επίσης σημαντικά (Σχήμα 3C και 3D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το WPCD θα μπορούσε να ενεργοποιήσει την ωρίμανση DC μέσω της οδού TLR4.

Το WPCD ενίσχυσε την χυμική και κυτταρική ανοσία

Για σύγκριση, αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα του WPCD στην πρόκληση χυμικής ανοσολογικής απόκρισης σε ποντικούς ανοσοποιημένους με OVA. Πριν από τον εμβολιασμό και τις Ημέρες 14, 21,

35, και 49 μετά τον πρώτο εμβολιασμό, συλλέχθηκε αίμα για να ανιχνευθεί ο τίτλος IgG και ο ορός των υποκατηγοριών IgG με ELISA. Η απόκριση του αντισώματος IgG στην OVA αυξήθηκε με την αύξηση της δόσης της χορήγησης WPCD (100 και 400 ug) με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 4). Η βέλτιστη συγκέντρωση ήταν 100 ug/mL WPCD και αύξησε τις αποκρίσεις IgG κατά δύο φορές σε σύγκριση με την OVA μόνο τις Ημέρες 21, 35 και 49 (Σχήμα 4Α). Σημαντικές αυξήσεις στα επίπεδα αντισωμάτων IgG1 και IgG2a ειδικών για OVA κάτω από 20 και 100 ug χορήγησης WPCD ελήφθησαν σε σύγκριση με την ομάδα OVA στον ορό την Ημέρα 35 (Σχήμα 4Β). Εν τω μεταξύ, το Alum προώθησε μόνο τα επίπεδα έκφρασης των ειδικών για την OVA αντισωμάτων IgG και IgG1 στα ανοσοποιημένα ποντίκια. Το WPCD από μόνο του δεν πυροδότησε ειδικά για την OVA αντισώματα. Τα παραπάνω αποτελέσματα έδειξαν ότι το WPCD δημιούργησε υψηλότερους τίτλους αντισωμάτων και πιο ισορροπημένες αποκρίσεις Th1/Th2 από το Alum.

Ο πολλαπλασιασμός των σπληνοκυττάρων είναι ένας άλλος δείκτης της κυτταρικής ανοσίας. Το ConA διεγείρει τα Τ-κύτταρα και το LPS διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των Β-κυττάρων. Την ημέρα 21 μετά τον πρώτο εμβολιασμό, ελήφθη εναιώρημα ενός σπληνοκυττάρου και διεγέρθηκε αντίστοιχα με OVA (10 ug/mL), πεπτίδιο OVA323-339 (10 ug/mL), ConA (5 ug/mL) και LPS ( 5 ug/mL) για 48 ώρες. Στη συνέχεια μετρήθηκε ο πολλαπλασιασμός των Τ κυττάρων με τη μέθοδο ΜΤΤ. Το WPCD θα μπορούσε να προάγει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό σπληνοκυττάρων που διεγείρεται από το αντιγόνο OVA, το μιτογόνο Con A και το μιτογόνο LPS στα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν με OVA και WPCD (Εικ. 5) και η βέλτιστη συγκέντρωση του WPCD ήταν 100 ug/mL. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το WPCD ως ανοσοενισχυτικό εμβολίου σε ποντίκια ανοσοποιημένα με OVA θα μπορούσε να διεγείρει αποτελεσματικότερα την ενεργοποίηση Τ-κυττάρων και Β κυττάρων από το Alum.

Όλα τα δοκιμασμένα ανοσοενισχυτικά WCPD που σκευάστηκαν με εμβόλια OVA δημιούργησαν εξίσου ισχυρή χυμική και κυτταρική ανοσία (Εικ. 4 και 5). Με βάση αυτά τα δεδομένα, για να αξιολογήσουμε περαιτέρω τις επιρροές του WPCD στην απόκριση των βοηθητικών κυττάρων Τ (Th) ειδικών για την OVA, αναλύσαμε περαιτέρω τις εκφράσεις κυτοκίνης σε CD{3}} και CD{4}} Τ κύτταρα με κυτταρομετρία ροής (Εικ. 6) . Την ημέρα 21 μετά τον πρώτο εμβολιασμό, ένα μόνο σπληνοκύτταρο ποντικών απομονώθηκε και στη συνέχεια συγκαλλιεργήθηκε με την OVA (10 μg/mL). Η απόδοση IL-4 σε CD{10}} Τ κύτταρα στην ομάδα που χορηγήθηκε με 100 ug OVA/WPCD ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη στην ομάδα OVA/Alum και την ομάδα OVA και παρόμοια με εκείνη στην ομάδα PMA (Εικ. 6Α). Επιπλέον, η απόδοση IFN σε CD{14}} και CD4+ Τ κύτταρα ενισχύθηκε επίσης σημαντικά στα ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε OVA/WPCD (20, 100 και 400 ug) (Εικ. 6B και 6C). Σε σύγκριση με το ανοσοενισχυτικό Alum, το WPCD έδειξε καλύτερη ικανότητα επαγωγής εκκρίσεων IL-4 και IFN- από Τ κύτταρα.

Η διεγερμένη από το WPCD ωρίμανση των DCs και η μειωμένη συχνότητα Treg in vivo Τα DCs αναγνωρίζονται ως τα πιο ισχυρά APC που εμπλέκονται στην έναρξη πρωτογενών ανοσολογικών αποκρίσεων. Έτσι, την Ημέρα 3 μετά τον πρώτο εμβολιασμό, διερευνήσαμε επίσης τις επιδράσεις του WPCD στα CD40 και CD80 στα DC στον σπλήνα σε ποντίκια (Εικ. 7Α και 7Β). Τα ποντίκια στην ομάδα 100-ug OVA/WPCD παρήγαγαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα CD40 και CD80 σε DCs από εκείνα της ομάδας OVA/Alum. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το WPCD θα μπορούσε να ενεργοποιήσει DCs και να προκαλέσει ωρίμανση DC σε ποντίκια. Τα κύτταρα Treg μπορούν να εξισορροπήσουν την ανοχή και τις ανοσολογικές αποκρίσεις. Για περαιτέρω διερεύνηση του τρόπου με τον οποίο το WPCD ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση, τα κύτταρα Treg στον σπλήνα σε ποντίκια χρωματίστηκαν με ένα κιτ ρυθμιστικής χρώσης Τ κυττάρων ποντικού. Την 21η ημέρα μετά τον πρώτο εμβολιασμό, παρατηρήθηκε μειωμένη συχνότητα των κυττάρων CD{10}} Foxp3+ Treg στα συνολικά CD4+ Τ κύτταρα (Εικ. 7C). Σε σύγκριση με τις ομάδες OVA και OVA/Alum, η ομάδα WPCD έδειξε σημαντικά μειωμένη συχνότητα Treg.

Αξιολόγηση ασφάλειας του WPCD σε ποντίκια

Για να εκτιμήσουμε την από του στόματος οξεία τοξικότητα, πραγματοποιήσαμε τη δοκιμή οξείας τοξικότητας. Τα ποντίκια που χορηγήθηκαν από το στόμα με 5000 mg/kg σωματικού βάρους δεν εμφάνισαν ανώμαλη συμπεριφορά ή παρενέργειες και δεν βρέθηκε θνησιμότητα στη δοκιμή αξιολόγησης τοξικότητας. Δεν καταγράφηκε σημαντική διαφορά στην αύξηση του σωματικού βάρους, στον δείκτη θύμου και στον δείκτη σπλήνας μεταξύ διαφόρων ομάδων ποντικών που έλαβαν διαφορετικές δόσεις WPCD και δεν είχαν σημαντική διαφορά (Πίνακας 1). Δεν παρατηρήθηκε θνησιμότητα μετά από 14 ημέρες. Επομένως, η τιμή LD50 του WPCD ήταν μεγαλύτερη από 5000 mg ανά kg σωματικού βάρους.

Για να ελεγχθεί εάν το WPCD είχε αρνητικές επιπτώσεις στην ανάπτυξη των ποντικών, πριν και μετά τον υποδόριο εμβολιασμό, το σωματικό βάρος προσδιορίστηκε αντίστοιχα για κάθε ποντίκι (Πίνακας 2). Στην επακόλουθη παρατήρηση των ποντικών, δεν παρατηρήθηκαν παρενέργειες ή μη φυσιολογικές συμπεριφορές. Επιπλέον, το σωματικό βάρος των ποντικών που χορηγήθηκαν με WPCD και των ποντικών που χορηγήθηκαν με αλατούχο διάλυμα ή OVA/Alum δεν παρουσίασαν σημαντική διαφορά. Αυτά τα αποτελέσματα παρατήρησης έδειξαν ότι η χορήγηση του WPCD ήταν ασφαλής.

Συζήτηση

Τα ανοσοενισχυτικά είναι βασικά συστατικά των εμβολίων [31]. Λόγω της προόδου στη γονιδιωματική και την πρωτεϊνομική, εντοπίζονται όλο και περισσότερα ανασυνδυασμένα και συνθετικά μόρια εμβολίων. Επομένως, απαιτούνται περισσότερα ανοσοενισχυτικά και σκευάσματα. Ορισμένα ισχυρά ανοσοενισχυτικά σχετίζονται γενικά με αυξημένη τοξικότητα, για παράδειγμα, το FCA. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να βρεθεί ένα ασφαλές σκεύασμα που περιέχει διαφορετικά συνεργιστικά συστατικά που οδηγούν τελικά την επιθυμητή ανοσοαπόκριση.Οι πολυσακχαρίτες από κινέζικα βότανα είναι μη τοξικοίκαι δεν εμφανίζουν σημαντικές παρενέργειες [32,28]. Απαιτείται ένα ασφαλές ανοσοενισχυτικό για ένα συγκεκριμένο εμβόλιο.

Το Cistanche deserticola είναι ένα σημαντικό τονωτικό βότανο και υπάρχει ευρέως σε άνυδρες περιοχές και θερμές ερήμους στα βορειοδυτικά της Κίνας. Το Cistanche deserticola ανησυχεί ευρέως λόγω των βιοδραστηριοτήτων του, συμπεριλαμβανομένων των ανοσοτροποποιητικών, αντιοξειδωτικών, αντιβακτηριακών και αντικαρκινικών επιδράσεων [20,21]. Έχει σημειωθεί κάποια πρόοδος στον δομικό χαρακτηρισμό και την ανοσολογική δράση του Cistanche deserticola, το οποίο είναι καλός υποψήφιος για την ανάπτυξη ανοσοενισχυτικών. Αξιολογήσαμε πειραματικά τις επικουρικές επιδράσεις και τον μηχανισμό του WPCD in vitro και in vivo. Η υποδόρια χορήγηση του WPCD προώθησε σημαντικά τις χυμικές και κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις αυξάνοντας τα αντισώματα ορού και τον πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων, ενισχύοντας την έκφραση των κυτοκινών, ρυθμίζοντας προς τα πάνω την ωρίμανση DC και μειώνοντας τη συχνότητα του CD4+ CD{{5} } Foxp3+ Treg κελιά.

Τα DC είναι βασικά APC για την εκκίνηση των αφελών Τ κυττάρων. Η ενεργοποίηση των DCs είναι σημαντική για τα ανοσοενισχυτικά. Τα DCs, ειδικά τα DC που προέρχονται από μυελό ποντικού, χρησιμοποιούνται συχνά για την αξιολόγηση ανοσοενισχυτικών και εμβολίων. Η κυτταρομετρία ροής μπορεί να διακρίνει τα κύτταρα που έχουν ενεργοποιηθεί μετά τη σύλληψη ενός αντιγόνου από τα γύρω κύτταρα. Στην ανάλυση FCM, ο βαθμός συνάθροισης των διεγερμένων

Τα κύτταρα είναι ένας έμμεσος δείκτης αξιολόγησης της ασφάλειας των ανοσοτροποποιητών [3]. Έτσι, τα δεδομένα δραστικότητας του ανοσοενισχυτικού WPCD σε DCs in vitro μπορεί να παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες για ζωικά μοντέλα. Με βάση το μοντέλο BM-DC, τα επίπεδα έκφρασης των MHC-II, CD86, CD80 και CD40, η παραγωγή κυτοκίνης και ο πολλαπλασιασμός των αλλογενών κυττάρων Τ ανιχνεύθηκαν στο εύρος της βέλτιστης συγκέντρωσης WPCD. Τα επίπεδα έκφρασης των MHC-II, CD86, CD80 και CD40 ρυθμίστηκαν προς τα πάνω στα BM-DC και οι αποδόσεις των TNF-a και IL-12 αυξήθηκαν με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Παρατηρήθηκε ο πολλαπλασιασμός των αλλογενών Τ κυττάρων. Η μορφολογία των BM-DCs δεν άλλαξε. Προκαλώντας την ενεργοποίηση των BM-DCs και την έκκριση φλεγμονωδών κυτοκινών in vitro, το ανοσοενισχυτικό WPCD μπορεί να αυξήσει σημαντικά την ποσότητα του αντιγόνου και τον αριθμό των APCs και να διεγείρει τα Τ κύτταρα να εκκρίνουν IFN-, η οποία συμβάλλει στην ενίσχυση της ανοσοτροποποιητικής δραστηριότητας.

ΔιάφοροςΚινεζικοί ποώδεις πολυσακχαρίτεςείναι ικανά να ενεργοποιούν το ανοσοποιητικό σύστημα και διαθέτουν εξαιρετικές επικουρικές ικανότητες μέσω της διέγερσης της ωρίμανσης DC μέσω της οδού TLR4 [33,28]. Έτσι, υποθέτουμε ότι το TLR4 συμμετέχει στο μονοπάτι σηματοδότησης της επαγόμενης από το WPCD ωρίμανσης DCs. Όπως αναμενόταν, οι θεραπείες με αναστολέα TLR4 είχαν ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση του TNF-a και της IL-12. Επιπλέον, η αναστολή της οδού TLR4 εμπόδισε επίσης την έκφραση των CD40 και CD80 στα DCs, υποδεικνύοντας ότι η ωρίμανση των DCs εξαρτάται από το TLR4. Επομένως, είναι προφανές ότι το TLR4 συμμετέχει στην επαγόμενη από το WPCD ωρίμανση DCs.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Η βέλτιστη δόση ανοσοενισχυτικών και η σύνθεση εμβολίου προσδιορίζεται εμπειρικά σε πολλά πειράματα. Για να διερευνήσουμε τη σχέση δόσης-απόκρισης του ανοσοενισχυτικού WPCD και των αντιγόνων OVA σε ποντικούς, επιλέξαμε διαφορετικές δόσεις WPCD με βάση προηγουμένως αναφερθέντα δεδομένα από BM-DCs in vitro για να χορηγηθούν υποδορίως ποντίκια ICR δύο φορές. Βρήκαμε ότι το WPCD αύξησε σημαντικά την απόδοση των ειδικών για την OVA αντισωμάτων και προκάλεσε μια ισορροπημένη ανοσοαπόκριση Th1/Th2 με ενίσχυση των επιπέδων IgG1 και IgG2a. Ειδικά, το επίπεδο IgG2a ήταν υψηλότερο από αυτό που έλαβαν θεραπεία με στυπτηρία στη βέλτιστη δόση. Επομένως, το WPCD είχε ως αποτέλεσμα υψηλότερα επίπεδα ειδικών αντισωμάτων και υψηλότερη αποτελεσματικότητα με τις χαμηλότερες ενέσεις.

Τα νέα εμβόλια απαιτούν την επαγωγή ισχυρών κυτταρικών αποκρίσεων, οι οποίες περιλαμβάνουν αντισώματα, Τ βοηθητικά κύτταρα (Th) και κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTL). Το θεραπευτικό εμβόλιο στοχεύει να προκαλέσει ισχυρότερες αποκρίσεις Τ-λεμφοκυττάρων. Το ιδανικό ανοσοενισχυτικό ενισχύει την ισχύ του εμβολίου και προάγει την κυτταρική ανοσία χωρίς να προκαλεί τοξικές επιδράσεις [34]. Μεταξύ των παρατηρήσεων σε μοντέλα ανοσοποιημένων ποντικών, το WPCD οδήγησε σε αύξηση του πολλαπλασιασμού σπληνοκυττάρων ειδικού και μη ειδικού για την OVA σε σύγκριση με το Alum. Ορισμένα ανοσοενισχυτικά ρυθμίζουν προς τα πάνω τις κυτοκίνες και το ανοσοποιητικό σύστημα. Για παράδειγμα, οι σαπωνίνες μπορεί να διεγείρουν κυτταρομεσολαβούμενες ανοσοαποκρίσεις σε ένα αντιγόνο που κανονικά επάγει μόνο αντισώματα. Επιλέξαμε το IL-4 και το IFN- ως δείκτες για να αξιολογήσουμε έμμεσα τα επίπεδα ανοσίας σε ποντίκια. Το WPCD θα μπορούσε να προκαλέσει περισσότερες εκκρίσεις IL-4 και IFN- από το Alum. Έτσι, ισχυρές αποκρίσεις βοηθητικών Τ-κυττάρων και εκκρίσεις κυτοκίνης παρατηρήθηκαν ως αποτέλεσμα του εμβολιασμού WPCD, υποδηλώνοντας ότι το WPCD θα μπορούσε να διεγείρει πιο αποτελεσματικά τα λεμφοκύτταρα να εκκρίνουν την κυτοκίνη τύπου Th1-και την κυτοκίνη τύπου Th{{2- Στυπτηρία.

Τα ανοσοενισχυτικά που επηρεάζουν την παρουσίαση αντιγόνου μπορούν να επηρεάσουν πολύπλοκες ανοσολογικές διεργασίες. Τα κύτταρα Treg μπορούν να διαμορφώσουν τις αποκρίσεις Th1 και Th2 [35]. Μια κατάλληλη δόση WPCD μπορεί να προάγει την ωρίμανση των DCs σε ποντικούς αυξάνοντας τα επίπεδα έκφρασης των CD80 και CD40 και ενισχύοντας την ικανότητα παρουσίασης αντιγόνου OVA στην πρώιμη ανοσοαπόκριση. Τα πειραματικά αποτελέσματα της ενεργοποίησης των DCs και της συχνότητας Treg έδειξαν ότι το WPCD προκάλεσε την ωρίμανση των DCs και μείωσε τη συχνότητα Treg στον σπλήνα σε ποντίκια. Αυτά τα αποτελέσματα απέδειξαν ότι το WPCD ενίσχυσε την αποτελεσματικότητα των εμβολίων OVA αυξάνοντας τη στόχευση κυττάρων που παρουσιάζουν αντιγόνο και προάγοντας την ειδική ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων.

Στην ανάπτυξη ανοσοενισχυτικών, είναι δύσκολο να προκληθεί επιλεκτικά η κατάλληλη ανοσοαπόκριση έναντι της αντίστοιχης μόλυνσης. Το κατάλληλο ανοσοενισχυτικό θα πρέπει να έχει χαμηλές παρενέργειες και τοξικότητα σε ανθρώπους ή ζώα. Επομένως, θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η ασφάλεια του WPCD, συμπεριλαμβανομένων των άμεσων και μακροπρόθεσμων παρενεργειών. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την οξεία τοξικότητα του WPCD και την αρνητική επίδραση του WPCD στην απόδοση ανάπτυξης των ποντικών για 110 ημέρες. Τα αποτελέσματα της οξείας τοξικότητας του WPCD έδειξαν ότι το σωματικό βάρος, ο δείκτης θύμου ή ο δείκτης σπλήνας δεν είχαν σημαντική διαφορά. Η τιμή LD50 του WPCD ήταν μεγαλύτερη από 5000 mg ανά kg σωματικού βάρους. Κατά τη διάρκεια της πειραματικής επακόλουθης παρατήρησης των ποντικών, δεν βρέθηκαν παρενέργειες ή ανώμαλη συμπεριφορά σε ποντίκια. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το WPCD ήταν ασφαλές.

Συμπερασματικά, σε αυτή τη μελέτη, ο WPCD, ένας ακατέργαστος πολυσακχαρίτης που εξάγεται από το C. deserticola από το Xinjiang, έδειξε ορισμένες ιδιότητες ανοσοενισχυτικών. Για παράδειγμα, το WPCD ενίσχυσε τις αποκρίσεις Th1 και Th2 ενεργοποιώντας τα DCs, αυξάνοντας τις αποκρίσεις αντισωμάτων και βελτιώνοντας την παραγωγή κυτοκίνης. Επιπλέον, διερευνήσαμε τον μηχανισμό της αποτελεσματικότητας του WPCD αναλύοντας την ωρίμανση και τη λειτουργία των DCs μέσω της οδού TLR4 in vitro. Στα ποντίκια που έλαβαν μόνο θεραπεία με WPCD, δεν παρατηρήθηκε εμφανής παρενέργεια. Ως εκ τούτου, το WPCD κατείχε υψηλότερη ανοσοδιεγερτική δραστηριότητα σε κυτταρικές και χυμικές ανοσοαποκρίσεις. Τα ανοσοενισχυτικά είναι ένα μείγμα πολλών ενώσεων. Ένα μείγμα πολλών ακατέργαστων εκχυλισμάτων μπορεί να έχει μεγαλύτερα ευεργετικά αποτελέσματα από ένα μόνο φυτικό εκχύλισμα. Είναι απαραίτητο να διερευνηθούν συστηματικά τα εκχυλίσματα WPCD, να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα και η ασφάλειά τους και να διευκρινιστούν οι μηχανισμοί των επιδράσεών τους.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ PHGS75% ECH 30% ACT 12%