Συζεύγματα αντισωμάτων που διεγείρουν το ανοσοποιητικό σύστημα προκαλούν ισχυρή μυελοειδή ενεργοποίηση και ανθεκτική κατά του όγκου ανοσία (Μέρος 1)

Για περισσότερες πληροφορίες, παρακαλώ επικοινωνήστεdavid.wan@wecistanche.com

Αφηρημένη

Οι έμφυτοι υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων που μοιάζουν με διόδια (TLRs), μπορούν να αλλάξουν το μικροπεριβάλλον του όγκου και να πρωταρχήσουν προσαρμοστική ανοσία κατά του όγκου.Ωστόσο, οι αγωνιστές TLR δεν έχουν γίνει καλά ανεκτοί λόγω τοξικοτήτων που σχετίζονται με ευρεία ανοσολογική ενεργοποίηση μετά από συστηματική χορήγηση.Να σχεδιάσει ένα θεραπευτικό που είναι κατάλληλο για συστηματική παράδοση καιικανοί να προκαλέσουν μια στοχευόμενη στον όγκο απόκριση, αναπτύξαμε μια νέα κατηγορία ανοσοδιεγερτικών συζευγμάτων αντισωμάτων (ISACs) που περιλαμβάνουν έναν αγωνιστή TLR7/8 συζευγμένο με αντισώματα στόχευσης όγκου.Τα συστηματικά χορηγούμενα anti-HER2 ISAC ήταν καλά ανεκτά in vivo και προκάλεσαν ισχυρή ενεργοποίηση ενδοογκικών μυελοειδών κυττάρων, με αποτέλεσμα την κάθαρση του όγκου και την επακόλουθη ανοσολογική μνήμη.Η in vitro ισχύς και η in vivo αποτελεσματικότητα απαιτούσαν διαδοχική δραστηριότητα που καθοδηγείται από ανέπαφη λειτουργικότητα Fc και αγωνιστισμό TLR για να καταστεί δυνατή η φαγοκυττάρωση και η προκαλούμενη από Τ κύτταρα αντικαρκινική ανοσία.Η ανοσολογική μνήμη με τη μεσολάβηση ISAC δεν περιοριζόταν στο HER2, καθώς τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ISAC προστατεύτηκαν από την εκ νέου πρόκληση με έναν αρνητικό όγκο HER2-.Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν ένα ισχυρό σκεπτικό για την κλινική ανάπτυξη των ISAC και δείχνουν ότι η συνέργεια μεταξύ της σηματοδότησης Fc R και TLR7/8 συμβάλλει στον μηχανισμό της αντικαρκινικής ανοσίας με τη μεσολάβηση ISAC.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα για το Cistanche

Εισαγωγή

Πριν από το τέλος του 20ου αιώνα, οι ασθενείς με καρκίνο είχαν γενικά τρεις διαθέσιμες μεθόδους θεραπείας: χειρουργική εκτομή, ακτινοβολία και χημειοθεραπεία. Η εμφάνιση της ανοσοθεραπείας του καρκίνου πρόσθεσε μια ισχυρή τέταρτη μέθοδο που επέκτεινε σημαντικά το ογκολογικό ρεπερτόριο ξεκινώντας με την έγκριση του rituximab για το λέμφωμα non-Hodgkin και επεκτείνοντας την ευρεία υιοθέτηση αναστολέων σημείων ελέγχου 1,2. Ωστόσο, οποιαδήποτε θεραπεία, συμπεριλαμβανομένης της ανοσοθεραπείας, είναι προσωρινά περιορισμένη, εκτός εάν προκαλεί ανθεκτικές βιολογικές και ανοσολογικές αποκρίσεις που ξεπερνούν την ετερογένεια του όγκου και το μεταλλακτικό φορτίο 3-5. Οι αναστολείς σημείων ελέγχου όπως τα αντισώματα αντι-PD-1 και PD-L1 βελτιώνουν δραματικά τα αποτελέσματα σε πολλές ενδείξεις, συμπεριλαμβανομένων ασθενών με υψηλό φορτίο μετάλλαξης όγκου ή μικροδορυφορική αστάθεια, και ένας καθοριστικός παράγοντας της ευαισθησίας του όγκου στην ανοσοθεραπεία σημείου ελέγχου είναι η έκταση της προ -υπάρχουσα διήθηση Τ κυττάρων. Οι ασθενείς με «ψυχρούς» όγκους που έχουν αραιή διήθηση Τ-κυττάρων ανταποκρίνονται λιγότερο στον αποκλεισμό των σημείων ελέγχου και έχουν χειρότερη πρόγνωση σε σύγκριση με ασθενείς με «θερμούς» όγκους όπου υπάρχουν ανοσοκατασταλμένα Τ κύτταρα αντιδρώντα σε όγκους στο μικροπεριβάλλον του όγκου (TME) 6,7 . Η βιοψία όγκου και η ανοσοϊστοχημεία υποδεικνύουν ότι τα επαγγελματικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APC) όπως τα δενδριτικά κύτταρα (DCs) είναι συχνά πιο συχνά εντός του ΤΜΕ από τα Τ κύτταρα, αν και εξακολουθούν να είναι επιρρεπή σε ανοσοκατασταλτικούς μηχανισμούς 8,9. Δεδομένης της παρουσίας μυελοειδών κυττάρων στο ΤΜΕ και του ρόλου τους στην προώθηση της ενεργοποίησης των Τ κυττάρων, έχει γίνει μια αυξανόμενη προσπάθεια για την ανάπτυξη θεραπειών που ενεργοποιούν APC που σχετίζονται με όγκους για να προκαλέσουν εκτεταμένη ανοσία Τ κυττάρων και αποτελεσματική αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση.

Figure 1: ISAC Design and Characterization. (a) Chemical structure of T785 (b) HEK-Blue-TLR7 or TLR8 reporter cells were cultured for 18 hours in the presence of T785, R848, or Poly-ICLC before the assessment of NF-κB- induced SEAP activity. Data shown are from 8 experiments and EC50 values are calculated as mean with SEM. (c) Freshly isolated human myeloid APCs were stimulated with 1 μM of T785 or R848 for 18 hours before the assessment of myeloid activation by flow cytometry. Data are from 1 experiment with 3 donors and are representative of >9 δωρητές. (δ) Το rituximab αντέδρασε με SATA μέσω υπολειμμάτων λυσίνης για να μετατραπούν οι ελεύθερες αμίνες σε προστατευμένες σουλφυδρυλικές ομάδες πριν από την αποακετυλίωση με υδροξυλαμίνη και την επακόλουθη αντίδραση με T785-MCC για να δώσει το rituximab-ISAC. (ε) Ανάλυση LC-MS του rituximab-ISAC μετά από θεραπεία με PNGase F. Το DAR υπολογίστηκε με βάση την προσθήκη μάζας συνδέτη-αγωνιστή 606 g/mol. (στ) Επισημασμένη με φθορισμό rituximab ή rituximab-ISAC επωάστηκε με κύτταρα όγκου CD20 συν Toledo στους 4 βαθμούς για 2 ώρες πριν από την ανάλυση μέσω κυτταρομετρίας ροής. Τα δεδομένα προέρχονται από 1 πείραμα με δείγματα εις τριπλούν και είναι αντιπροσωπευτικά 2 πειραμάτων.(gh) Τα πρόσφατα απομονωμένα ανθρώπινα μυελοειδή APC καλλιεργήθηκαν με rituximab, T785, rituximab και T785 ή το rituximab-ISAC παρουσία σημασμένων με CFSE καρκινικών κυττάρων CD20 συν Toledo σε αναλογία τελεστή προς στόχο 3:1. Η συγκέντρωση του rituximab απεικονίζεται στον άξονα Χ με τη συγκέντρωση του T785 σε αυτές τις αναλύσεις να είναι σύμφωνη με την ποσότητα του T785

conjugated to the rituximab-ISAC. (g) Hoffman modulation contrast microscopy showed at 40X magnification after (g) 18 hours following stimulation with 80 nM of rituximab-ISAC. Data are representative of >10 donors. (h) Myeloid APCs were analyzed via flow cytometry 18 hours after stimulation. Data shown are from 3 donors and are representative of >10 δότες (μέσος όρος και SEM). *Π<0.05,><0.01,><0.001,><>

Είναι πλέον καλά τεκμηριωμένο ότι η τοπική παροχή ανοσοδιεγερτικών παραγόντων σε προκλινικά μοντέλα μπορεί να επαναπρογραμματίσει κατασταλμένα μόνιμα APCs όγκου σε ενεργοποιημένα κύτταρα ικανά να επεξεργάζονται και να παρουσιάζουν αντιγόνα που σχετίζονται με τον όγκο, συμπεριλαμβανομένων νεοαντιγόνων, σε Τ κύτταρα που στη συνέχεια μεσολαβούν στην αντικαρκινική ανοσία–1310 . Μια τέτοια στρατηγική που πρωτοστάτησε από τους Carmi et al έδειξε ότι η ενδοογκική παροχή αλλογενών αντισωμάτων στόχευσης όγκου με αγωνιστή υποδοχέα τύπου Toll (TLR)-3 ή με TNF και CD40L λειτουργικά διασωθέντα APC που σχετίζονται με όγκο και οδηγεί σε ενισχυμένη πρόσληψη αντιγόνου και επακόλουθη επαγωγή της ανοσίας των Τ κυττάρων κατά του όγκου. Αυτή η στρατηγική συνδυασμού, η οποία αύξησε τη λειτουργία του τελεστή αντισωμάτων με αγωνιστή TLR, οδήγησε στην εξάλειψη των πρωτογενών όγκων και των μεταστατικών βλαβών και προστάτευσε τον ξενιστή από την υποτροπή του όγκου 11,14. Ομοίως, ένα αγωνιστικό αντίσωμα αντι-ΟΧ40 σε συνδυασμό με έναν αγωνιστή TLR9, CpG, ενεργοποίησε APCs και Τ κύτταρα εντός του όγκου, με αποτέλεσμα την εντυπωσιακή αποτελεσματικότητα έναντι πολλαπλών τύπων όγκων σε ποντικούς 13. Η αποτελεσματική μετάφραση των στρατηγικών ενεργοποίησης APC στην κλινική γίνεται διερευνήθηκε σε πολλαπλές ενδείξεις με κλινικά δεδομένα σε ασθενείς με μελάνωμα που υποδηλώνουν ότι η ενδοκαρκινική χορήγηση αγωνιστών TLR9 σε συνδυασμό με αντίσωμα αντι-PD{20}} μπορεί να οδηγήσει σε συρρίκνωση του όγκου και κοιλιακές αποκρίσεις σε αλλοιώσεις που δεν έχουν λάβει ένεση 15. Ομοίως, αρκετές ομάδες επιδιώκουν αγωνιστές TLR7/8 για ανοσοθεραπεία όγκου, καθώς το πρότυπο έκφρασης του TLR7/8 σε ανθρώπινα APCs αντικατοπτρίζει περισσότερο το πρότυπο έκφρασης των TLR7 και TLR9 σε APCs16-18 ποντικού. Τελικά, η υιοθέτηση στρατηγικών ενδο-ογκικής χορήγησης, εάν είναι αποτελεσματική, θα περιοριστεί από την προσβασιμότητα του όγκου, καθώς η συστημική χορήγηση ανοσοαγωνιστών που στοχεύουν τα APCs έχει περιοριστεί λόγω τοξικότητας, σύντομων χρόνων ημιζωής και υποβέλτιστης παροχής στις θέσεις-στόχους.Ο στόχος μας ήταν να σχεδιάσουμε ένα ανοσοδιεγερτικό συζυγές αντισώματος (ISAC) που περιλαμβάνει ένα μονοκλωνικό αντίσωμα στόχευσης όγκου συζευγμένο με έναν ανοσοαγωνιστή ως μια νέα θεραπευτική προσέγγιση για την πρόκληση ανθεκτικής ανοσίας κατά του όγκου. Η συστηματική χορήγηση του ISAC προκάλεσε εντοπισμένη ενεργοποίηση APC στο TME που εξαρτιόταν από το Fcλειτουργία τελεστή και ενεργοποίηση TLR ενώ παρακάμπτονται οι τυπικές τοξικότητες που σχετίζονται με τη συστηματική χορήγηση αγωνιστών TLR. Επιπλέον, η συστημική χορήγηση αυτών των συζυγών σε ποντίκια που φέρουν όγκο επέτρεψε την επεξεργασία αντιγόνου και την παρουσίαση στα Τ κύτταρα οδηγώντας σε παρατεταμένη ανοσία κατά του όγκου σε πολλαπλά μοντέλα που είναι ανθεκτικά στο μη συζευγμένο αντίσωμα στόχευσης όγκου.

Αποτελέσματα

Σχεδιασμός και Χαρακτηρισμός ISAC Για να καταστεί δυνατή η σύζευξη ενός αγωνιστή TLR με ένα αντίσωμα, χρησιμοποιήθηκαν εργαλεία μοριακής σύνδεσης για να σχεδιαστεί ένας νέος αγωνιστής TLR7/8 (T785) με μια βουτυλ-αμίνη που χρησίμευε ως ένα προσβάσιμο από διαλύτη σημείο σύνδεσης στο αντίσωμα. Εικόνα 1Α, Συμπληρωματικό Σχήμα 1A–C). Το T785 δέσμευσε ανθρώπινο TLR7 με EC50 0,643 μM και ανθρώπινο TLR8 με EC50 1,60 μM σε κυτταρικές σειρές HEK293 που συνεκφράζουν έναν επαγόμενο από NF-κB εκκρινόμενο ανταποκριτή αλκαλικής φωσφατάσης και είτε TLR7 είτε TL (Εικόνα 1 ). Η ειδικότητα του T785 για το TLR7/8 επιβεβαιώθηκε από την αδυναμία του T785 να επάγει δραστηριότητα NF-κB σε κύτταρα αναφοράς HEK293 που στερούνται έκφρασης TLR7/8 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2Α). Για να επιβεβαιωθεί η αγωνιστική δραστηριότητα στα πρωτογενή κύτταρα, πρόσφατα απομονωμένα μονοκύτταρα και DCs, που ονομάζονται μυελοειδή APC (~96 τοις εκατό μονοκύτταρα, 4 τοις εκατό DC, Συμπληρωματικό Σχήμα 3Α), τα οποία εκφράζουν τόσο TLR7 όσο και TLR8, διεγέρθηκαν κατά τη διάρκεια της νύχτας με 1 μΜ T785 ή R848, καλά εγκατεστημένος και χαρακτηρισμένος αγωνιστής TLR7/8 19. Τα T785 και R848 διέγερσαν μυελοειδή APC σε παρόμοιο βαθμό (Εικόνα 1Γ) 20,21. Η δραστηριότητα του T785 επιβεβαιώθηκε επίσης σε πρόσφατα απομονωθέντα ανθρώπινα πλασματοκυτταροειδή DCs (pDCs), τα οποία εκφράζουν TLR7 αλλά όχι TLR8 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2Β). Για τη διερεύνηση των επιδράσεων των ISAC σε ανθρώπινες in vitro καλλιέργειες, δημιουργήθηκε ένα ISAC με rituximab (Εικόνα 1D), ένα κλινικά επικυρωμένο μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-CD20 που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία κακοηθειών των Β κυττάρων, με σύζευξη με T785 σε μια αντίδραση πολλαπλών σταδίων με συμβατούς ετεροδιλειτουργικούς σταυροσυνδέτες 22. Η αποτελεσματικότητα της σύζευξης T785-ISAC μετρήθηκε με LC-MS μετά από απογλυκοζυλίωση με PNGase F, με αποτέλεσμα μια μέση αναλογία φαρμάκου προς αντίσωμα (DAR) 1,71 (Εικόνα 1Ε). Επιβεβαιώσαμε ότι το ISAC διατήρησε συγκρίσιμη δέσμευση με το CD20 μετά από πειράματα κυτταρομετρίας ροής με την κυτταρική γραμμή όγκου Toledo που εκφράζει το CD20-, μια καλά χαρακτηρισμένη κυτταρική σειρά που προέρχεται από έναν ασθενή με διάχυτο λέμφωμα μεγάλων κυττάρων (Εικόνα 1ΣΤ) 23. T 785-Η δέσμευση ISAC με τους ανθρώπινους υποδοχείς Fc (FCGR3A, FCGR2A, FCGR2B, FCGR1) αξιολογήθηκε από το Biacore και ήταν συγκρίσιμη με το rituximab (Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Τα ISACs ενεργοποιούν τα ανθρώπινα μυελοειδή APCsΤο ανοσοδιεγερτικό δυναμικό του rituximab }}Το ISAC αξιολογήθηκε μετά από συγκαλλιέργεια πρόσφατα απομονωμένων ανθρώπινων μυελοειδών APC με σημασμένα με CFSE κύτταρα CD20 συν Toledo για 18 ώρες. Τα μυελοειδή APC που καλλιεργήθηκαν με rituximab T785-ISAC υπέστησαν γρήγορες μορφολογικές αλλαγές σύμφωνα με τη μορφολογία των DCs, ενώ η μορφολογία DC δεν ήταν παρατηρήθηκε σε συγκαλλιέργειες που επωάστηκαν με rituximab, T785 ή ένα ισομοριακό μείγμα rituximab και T785 (Εικόνα 1G). Τα APC που διεγέρθηκαν με rituximab T785-ISAC παρέμειναν βιώσιμα και δενδριτικά στη μορφολογία για έως και οκτώ ημέρες, ενώ τα APC που διεγέρθηκαν με το μείγμα ήταν ως επί το πλείστον μη βιώσιμα την όγδοη ημέρα (Εικόνα 1Η). Πολύχρωμη ανάλυση κυτταρομετρίας ροήςμετά από 18 ώρες έδειξαν ότι τα APC που διεγείρονται με το rituximab T785-Το ISAC ρυθμίζει προς τα κάτω τα CD14 και CD16 και ταυτόχρονα ρυθμίζει προς τα πάνω το CD123, ένας δείκτης κυτταρικής επιφάνειας που φαίνεται νανα ρυθμιστεί προς τα πάνω σε ενεργοποιημένα μυελοειδή DC 24. Αντίθετα, τα APC που διεγείρονται με rituximab,Το T785 ή το μείγμα δεν τροποποίησε την έκφραση αυτών των δεικτών (Σχήμα 1 Ι, Συμπληρωματικό Σχήμα 4Α, στρατηγική πύλης που περιγράφεται στα Συμπληρωματικά Σχήματα 3BC).

Τα ανθρώπινα APC που διεγείρονται με rituximab T785-ISAC επίσης ρύθμισαν προς τα πάνω το συνδιεγερτικό μόριο CD86 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, με παρόμοιες τάσεις που παρατηρήθηκαν με ανοδική ρύθμιση CD40 και HLA-DR σύμφωνη με τον φαινότυπο των ενεργοποιημένων APCs (Εικόνα 1I & Συμπληρωματικό Σχήμα 4Β). Οι δοσοεξαρτώμενες αλλαγές στην έκφραση του επιφανειακού δείκτη ήταν συνεπείς είτε αξιολογήθηκαν ως διάμεση ένταση φθορισμού (MFI, Εικόνα 1) είτε ως το ποσοστό του συνολικού πληθυσμού κυττάρων που είναι θετικό για τον αντίστοιχο δείκτη (Συμπληρωματικό Σχήμα 5). Η επακόλουθη ανάλυση υπερκειμένων χωρίς κύτταρα έδειξε ότι τα APC που διεγείρονται από το rituximab T785-ISAC εκκρίνουν μεγαλύτερες ποσότητες TNF και IL-1 (Εικόνα 2J και Συμπληρωματικό Σχήμα 4C). Το ανοσοδιεγερτικό δυναμικό των Τ785-ISACs δεν περιοριζόταν στη ριτουξιμάμπη, καθώς ένα Τ785-ISAC που δημιουργήθηκε με την τραστουζουμάμπη προκάλεσε επίσης ενισχυμένη μυελοειδή ενεργοποίηση (Συμπληρωματικό Σχήμα 4D). Η ικανότητα των διεγερμένων από ISAC APC να προκαλούν παρουσίαση αντιγόνου και διασταυρούμενη εκκίνηση των CD8 συν Τ κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα αντιγόνου μοντέλου ωοαλβουμίνης (OVA) 25,26. Τα σπληνικά CD11c συν DC που απομονώθηκαν από ποντίκια άγριου τύπου καλλιεργήθηκαν όλη τη νύχτα με ανοσοσύμπλοκα που σχηματίστηκαν με OVA και είτε με το αντίσωμα αντι-ΟνΑ είτε με ISAC. Τα φορτωμένα με OVA DCs ποσοτικοποιήθηκαν και επωάστηκαν με ΟΤ-Ι CD8 συν Τ κύτταρα που φέρουν εξειδίκευση TCR για το πεπτίδιο OVA, SIINFEKL, συμπλοκοποιημένο με MHC-I. Ενισχυμένη διασταυρούμενη παρουσίαση με τη μεσολάβηση Anti-OVA ISAC, όπως μετράται με την ποσότητα MHC-I, δεσμευμένου πεπτιδίου SIINFEKL και ενισχυμένη διασταυρούμενη εκκίνηση όπως μετράται με πολλαπλασιασμό κυττάρων CD8 συν Τ (Συμπληρωματικά Σχήματα 6Α & 6Β). Τα ISAC προκαλούν ενισχυμένο TLR και Fc R-σχετιζόμενη ενδοκυτταρική σηματοδότηση σε ανθρώπινο μυελοειδές APCs Η ενεργοποίηση των Fc Rs και TLRs προκαλεί έναν σύνθετο καταρράκτη σηματοδότησης φωσφο, και το μέγεθος και τα χαρακτηριστικά αυτών των αποκρίσεων διαφέρουν μεταξύ των διαφόρων υποσυνόλων ανοσοκυττάρων 27. Ερευνήσαμε τα κατάντη ενδοκυτταρικά σήματα κυτταρικοί τύποι σε συγκαλλιέργειες PBMC-όγκων που διεγείρονται με το rituximab T785-ISAC σε σύγκριση με μάρτυρες ισομοριακού μείγματος χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία μάζας (CyTOF) 28. Οι υποομάδες λευκοκυττάρων (δηλ. μονοκύτταρα, CD4 συν Τ κύτταρα) αναγνωρίστηκαν μέσω ομαδοποίησης SPADE χρησιμοποιώντας δείκτες γενεαλογίας με κύτταρα στόχους που περιλαμβάνουν και CD20 και κύτταρα όγκου Toledo και υγιή Β κύτταρα 29. Συμβάντα φωσφορυλίωσης που σχετίζονται με τη σηματοδότηση TLR (pIRF7) και Fc R (pERK1/2) αυξήθηκαν 15 λεπτά μετά τη διέγερση με το T{52}}ISAC σε μονοκύτταρα και cDC, σε σύγκριση με το μείγμα μεμονωμένων συστατικών 30,31. Η ενδοκυτταρική σηματοδότηση περιοριζόταν σε μεγάλο βαθμό σε κύτταρα μυελοειδούς προέλευσης (μονοκύτταρα και cDCs) καθώς και σε pDC, τα οποίαόλα εκφράζουν τα απαιτούμενα Fc Rs και TLR7 ή/και TLR8. Στα μονοκύτταρα και τα cDC, η διέγερση που προκλήθηκε από το ISAC οδήγησε επίσης σε σημαντικά υψηλότερη φωσφορυλίωση των MAPKAPK2, p38, CREB και ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6 (RPS6), μια απαίτηση για την έναρξη της κατάντη πρωτεϊνικής σύνθεσης (Εικόνα 2A-C & Συμπληρωματικό Σχήμα 7Α). Τα CD141 plus cDCs και CD1c plus cDCs έδειξαν συγκρίσιμα επίπεδα pIRF7 και στα δύο υποσύνολα CDC, ενώ τα επίπεδα των RPS6 και pERK1/2 παρουσίασαν υψηλότερη τάση στα CD141 plus cDCs, τα οποία υπερέχουν στην εκκίνηση των CD8 συν Τ κυττάρων και τη διασταυρούμενη παρουσίαση αντιγόνου, σε σύγκριση με το CD1c συν cDC (Συμπληρωματικό Σχήμα 7Β).

Η κινητική της διέγερσης T{0}}ISAC ήταν σύμφωνη με την αναμενόμενη δυναμική σηματοδότησης: η φωσφορυλίωση ERK1/2 κορυφώθηκε μετά από 5 λεπτά, ενώ ο κατάντη συνεργάτης του RPS6 δεν έφτασε στη μέγιστη φωσφορυλίωση μέχρι το {{5}λεπτό χρονικό σημείο (Συμπληρωματικό Εικόνα 7Γ). Αυτή η κινητική υποστηρίζει την αναμενόμενη δυναμική καθώς η σηματοδότηση διαδίδεται με την πάροδο του χρόνου και υποδηλώνει ότι υπάρχει μια παρατεταμένη και ενισχυμένη απόκριση σηματοδότησης στη διέγερση ISAC των APC. Δεδομένης της ενισχυμένης απόκρισης που παρατηρήθηκε μετά από διέγερση ISAC που σχετίζεται με μονοπάτια σηματοδότησης Fc R και TLR, χρησιμοποιήσαμε στη συνέχεια τους αλγόριθμους υπό όρους-Density Resampled Estimate of Mutual Information (DREMI) και Resampled-Density Visualization (DREVI) για να ποσοτικοποιήσουμε την ισχύ των σχέσεων ανά ζεύγη οι οδοί σηματοδότησης Fc R και TLR 32. Αυτοί οι αλγόριθμοι δημιουργούν διαγράμματα DREVI για οπτικοποίηση, όπου η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) είναι δείκτης της συνολικής έντασης σήματος, το σημείο καμπής (IP) είναι ένα μέτρο του ορίου ενεργοποίησης και Η βαθμολογία DREMI ποσοτικοποιεί την κατά ζεύγη εξάρτηση των δύο εν λόγω φωσφοπρωτεϊνών. Αυτή η ανάλυση εντόπισε αυξημένες βαθμολογίες DREMI ενδεικτικές ενισχυμένης κατά ζεύγη εξάρτησης μεταξύ πρωτεϊνών που σχετίζονται με μονοπάτια σηματοδότησης Fc R και TLR μετά από διέγερση T{10}}ISAC σε σύγκριση με τους μάρτυρες ισομοριακού μείγματος (Εικόνα 2D). Μια ισχυρή αλληλεξάρτηση μεταξύ pERK1/2 και pIRF7 παρατηρήθηκε μοναδικά μετά από διέγερση με T785-ISAC, αλλά όχι μείγμα, όπως υποδεικνύεται από αυξημένη βαθμολογία DREMI, ενισχυμένη ένταση σήματος και μειωμένο όριο ενεργοποίησης που απαιτείται για τη φωσφορυλίωση IRF7 (Εικόνα 2D ). Αυτή η ανάλυση έδειξε επίσης ένα μειωμένο όριο ενεργοποίησης που απαιτείται για την έναρξη της μετάφρασης πρωτεΐνης (φωσφορυλίωση RPS6) μετά από διέγερση ISAC, όπως ποσοτικοποιήθηκε από αυξημένες βαθμολογίες DREMI και μειωμένες IP για τους συνδυασμούς pERK1/2-pRPS6 και pIRF7-pRPS6 ανά ζεύγη . Περαιτέρω, το επίπεδο φωσφορυλίωσης RPS6 ενισχύθηκε ως αποτέλεσμα φωσφορυλίωσης ERK1/2 ή IRF7 όπως προσδιορίστηκε από αυξημένα AUC ανά ζεύγη (Εικόνα 2D). Αυτά τα συνδυασμένα αποτελέσματα όχι μόνο επιβεβαιώνουν τη σηματοδότηση του ISAC μέσω των αναμενόμενων μονοπατιών Fc R και TLR αλλά επιπλέον υποστηρίζουν τη συνέργεια μεταξύ των δύο οδών με αποτέλεσμα μειωμένα κατώφλια ενεργοποίησης και ενισχυμένες εντάσεις σήματος.

Σχήμα 3: Τα ISAC απαιτούν λειτουργία Fc τελεστή και αγωνιστή TLR για να μεσολαβήσει η μυελοειδής ενεργοποίηση. Τα πρόσφατα απομονωμένα ανθρώπινα μυελοειδή APC καλλιεργήθηκαν για 18 ώρες παρουσία καρκινικών κυττάρων CD20 συν Toledo σε αναλογία τελεστή προς στόχο 3:1 και (α) 80 nM του rituximab-ISAC με ή χωρίς 1 μM R406, (β) rituximab-ISACs στον υποδεικνυόμενο ισότυπο αντισώματος, (γ) rituximab-ISAC ή απογλυκοσυλιωμένο rituximab-ISAC (ISAC-απογλυκοζυλιωμένο). (γ) Τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής και τα δεδομένα αναφέρονται ως διάμεση ένταση φθορισμού. (δ) Κύτταρα αναφοράς HEK-Blue-TLR7 ή TLR8 καλλιεργήθηκαν για 18 ώρες παρουσία T785 ή TLRnull πριν από την αξιολόγηση της επαγόμενης από NF-κΒ δραστικότητας SEAP. Τα δεδομένα που εμφανίζονται είναιαπό 1 πείραμα και αντιπροσωπευτικό τουλάχιστον 3 πειραμάτων. (ε) Πρόσφατα απομονωμένα ανθρώπινα μυελοειδή APC καλλιεργήθηκαν για 18 ώρες παρουσία καρκινικών κυττάρων CD20 συν Toledo και των ενδεικνυόμενων rituximab-ISACs και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (τα δεδομένα παρουσιάζονται ως διάμεσοςένταση φθορισμού). (αε) Τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι αντιπροσωπευτικά 1-4 πρόσθετων πειραμάτων και Περισσότερα από ή ίσα με 3 δότες για κάθε πείραμα (μέσος όρος και SEM). Η στατιστική σημασία ορίζεται ως *P<0.05,><0.01,><0.001,><>

Τα ISAC απαιτούν τη λειτουργία του τελεστή Fc για να μεσολαβήσει στην ενεργοποίηση των μυελοειδών APCs. Η συμβολή της δραστηριότητας Fc στη λειτουργία ISAC διερευνήθηκε μετά από κατάλυση της σηματοδότησης προς τα κάτω Fc R με R406, έναν αναστολέα κινάσης μικρού μορίου του Syk που εμποδίζει τη μεταγωγή σήματος προς τα κάτω του ενεργοποιούμενου Fc Rs 333, . Η προσθήκη του R406 ακύρωσε την ενεργοποίηση του μυελοειδούς με τη μεσολάβηση του Τ785-ISAC όπως αποδεικνύεται από την έλλειψη ρύθμισης προς τα πάνω του συνδιεγερτικού μορίου CD86 αλλά δεν άλλαξε την κυτταρική απόκριση στην ενεργοποίηση του TLR7/8 από το T785 (Εικόνα 3Α & Συμπληρωματικό Σχήμα 8). Η αναστολή Syk με το R406 επίσης καταργήθηκε η σηματοδότηση παρατηρήθηκε σε μονοκύτταρα μετά από διέγερση Τ785-ISAC, μεμειωμένα σημαντικά επίπεδα φωσφορυλιωμένου MAPKAPK-2, ERK1/2 και IRF7 που μετρήθηκαν (Συμπληρωματικό Σχήμα 7D).Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα δεδομένα, τα rituximab T785-ISAC διαμορφώθηκαν με συγκρίσιμα DAR σε καθένα από τους τέσσερις φυσικούς ισότυπους για να καθοριστεί ο βαθμός στον οποίο η δραστηριότητα T{1}}ISAC ποικίλλει με τις γνωστές συγγένειες δέσμευσης Fc R 35,36. Τα αγλυκοζυλιωμένα και φουκοζυλιωμένα ISAC rituximab διερευνήθηκαν επίσης, καθώς η γλυκοζυλίωση αφαιρεί τη δέσμευση Fc R ενώ η φουκοζυλίωση αυξάνει τη συγγένεια δέσμευσης για το FCGR3A 37. Η ανοσοδιεγερτική ικανότητα του rituximab T785-ISAC συσχετίζεται με τον τύπο του αντισώματος Fc R. 3Β). Αντίθετα, τα φουκοζυλιωμένα IgG1 (IgG1-AF), άγριου τύπου IgG1 και IgG3 T785-ISAC προκάλεσαν μυελοειδή ενεργοποίηση, με το IgG1-AF T785-ISAC να προκαλεί την υψηλότερη επίπεδα ανοδικής ρύθμισης CD86 (Εικόνα 3Β). Η απογλυκοζυλίωση του άγριου τύπου rituximab T785-ISAC με PNGase F, η οποία μειώνει τη συγγένεια δέσμευσης Fc-Fc R οδήγησε σε μειωμένη ανοσοδιεγερτική δραστηριότητα ISAC in vitro, υποστηρίζοντας τη σημασία μιας λειτουργικά ενεργής περιοχής Fc (Εικόνα 3C).

Τα ISAC απαιτούν αγωνιστικό TLR για να μεσολαβήσει η μυελική ενεργοποίηση. τσέπες TLR7 και TLR8 38 (TLRnull, Εικόνα 3D). Η ένωση TLRnull συζεύχθηκε με rituximab (TLRnull ISAC) και αξιολογήθηκε για δυναμικό ενεργοποίησης μυελοειδούς παρουσία CD20 συν καρκινικών κυττάρων in vitro. Το TLRnull ISAC δεν προκάλεσε ανοδική ρύθμιση του συνδιεγερτικού μορίου CD{86 ούτε τροποποίησε την έκφραση του CD14 ή του CD123, υποδεικνύοντας ότι απαιτείται αγωνιστισμός TLR για τον φαινότυπο ενεργοποίησης που παρατηρείται με τα Τ785-ISAC (Εικόνα 3Ε). Επιπλέον, το TLRnull ISAC δεν προκάλεσε φωσφορυλίωση του IRF-7 σε μονοκύτταρα, σύμφωνα με την αδυναμία του να εμπλέξει το TLR7/8 (Συμπληρωματικό Σχήμα 7Ε). Η συστηματική χορήγηση trastuzumab T785-ISAC εξαλείφει τους όγκους απουσία Δραστηριότητα κυττάρων Β, Τ ή ΝΚ σε μοντέλα ανθρώπινου ξενομοσχεύματος Η ικανότητα των ISAC να επάγουν καταστροφή συμπαγών όγκων με τη μεσολάβηση μυελοειδούς και ουδετερόφιλου απουσία δραστικότητας κυττάρων Β, Τ και ΝΚ, χρησιμοποιώντας μοντέλα ανθρώπινου ξενομοσχεύματος 39,40. Η τραστουζουμάμπη, ένα κλινικά επικυρωμένο αντίσωμα στόχευσης HER2-, επιλέχθηκε για τη διερεύνηση για να προσδιοριστεί εάν η τραστουζουμάμπη Τ785-ISAC θα μπορούσε να ξεπεράσει την αντίσταση του όγκου στην τραστουζουμάμπη σε μοντέλα HER2 συν συμπαγών όγκων (Εικόνα 4 και Συμπληρωματικό Σχήμα 9 ) 41,42. Πρώτον, η συστηματική χορήγηση τραστουζουμάμπης Τ785-ISAC συγκρίθηκε με την ενδοκαρκινική χορήγηση ενός μείγματος τραστουζουμάμπης και Τ785. Το trastuzumab T785-ISAC προκάλεσε υποχώρηση του όγκου και κάθαρση, ενώ η χορήγηση ενός ισομοριακού μείγματος συστατικών παρείχε ελάχιστο θεραπευτικό όφελος σε σύγκριση με το trastuzumab μόνο του (Εικόνα 4Α). Μεταγενέστερες μελέτες που συνέκριναν ISAC με στόχο τον όγκο με τους κατάλληλους μάρτυρες ισοτύπου επιβεβαίωσαν ότι η αντικαρκινική δραστηριότητα απαιτούσε στόχευση όγκου (Εικόνα 4Β και Συμπληρωματικό Σχήμα 10). Είναι σημαντικό ότι η συστηματική χορήγηση του trastuzumab T785- ISAC και ο έλεγχος του ισοτύπου του ήταν καλά ανεκτή, με ελάχιστη επίδραση στο σωματικό βάρος (Συμπληρωματικό Σχήμα 11).Για να προσδιοριστεί εάν ο μηχανισμός δράσης που συμβάλλει στην αποτελεσματικότητα του ISAC in vivo είναι παρόμοιος με αυτόν που περιγράφεται in vitro, τα Fc-incompetent (trastuzumab N297A-ISAC) και trastuzumab TLRnull-ISAC δοκιμάστηκαν στο ίδιο μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου μαστού στοπαράλληλα με ένα άγριου τύπου τραστουζουμάμπη T785-ISAC.Ενώ η τραστουζουμάμπη T785-ISAC οδήγησε σε υποχώρηση του όγκου και κάθαρση, τόσο τα Fc-incompetent όσο και τα TLRnull ISACs απέτυχαν να προκαλέσουν αντικαρκινική δραστηριότητα (Εικόνα 4C).Μαζί αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν μια απαίτηση για στόχευση όγκου και εμπλοκή Fc R και TLR για αντικαρκινική δραστηριότητα ISAC.

Η διαφορική συνεισφορά των ουδετερόφιλων έναντι άλλων μυελοειδών κυττάρων στη μεσολάβηση των αντικαρκινικών επιδράσεων αξιολογήθηκε με ειδικές κυτταρικές μειώσεις.Τα ουδετερόφιλα εξαντλήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα Ly6G, ενώ η εξάντληση τόσο των ουδετερόφιλων όσο και των ανώριμων APC (μονοκυττάρων)επιτεύχθηκε με ένα αντίσωμα αντι-Gr1.Τα φαγοκυτταρικά κύτταρα εξαντλήθηκαν χρησιμοποιώντας λιποσώματα φορτωμένα με clodronate.Βρήκαμε ότι τα φαγοκυτταρικά κύτταρα, πιθανώς τα μακροφάγα, συνέβαλαν σημαντικά στη μεσολάβηση της αντικαρκινικής δραστηριότητας μετά από θεραπεία με ISAC (Εικόνα 4D).Ωστόσο, η μείωση των ουδετερόφιλων με το anti-Ly6G δεν είχε καμία επίδραση στην αποτελεσματικότητα του ISAC.Η εξάντληση του Gr1 δεν επηρέασε άμεσα την αποτελεσματικότητα που προκαλείται από το ISAC, αλλά μείωσε τη διάρκεια του ελέγχου του όγκου (Εικόνα 4Δ).Για να διερευνήσει την ικανότητα των Τ785-ISAC να ελέγχουν την ανάπτυξη όγκου σε μοντέλα με χαμηλότεροΈκφραση HER2, στη συνέχεια μοντελοποιήσαμε την αποτελεσματικότητα στο ανθεκτικό στην τραστουζουμάμπη, HER2-μοντέλο όγκου που εκφράζει μέσο, ​​JIMT-1.Η καρκινική κυτταρική σειρά JIMT-1 εκτιμάται ότι έχει περίπου 6,5 x 105 αντίγραφα της επιφάνειας HER2 και εκφράζει μειωμένο επίπεδοHER2 σε σύγκριση με την κυτταρική γραμμή όγκου HCC1954 με κυτταρομετρία ροής 43.Ενώ τοΗ τραστουζουμάμπη Τ785-Το ISAC επιβράδυνε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με τον ισότυπο ISAC ή τους ελέγχους τραστουζουμάμπης, δεν παρατηρήθηκε υποχώρηση ή κάθαρση του όγκου (Εικόνα 4Ε).Υποθέσαμε ότι η περτουζουμάμπη, η οποία δεσμεύει έναν επίτοπο HER2 διαφορετικό από τη θέση δέσμευσης της τραστουζουμάμπης, θα αύξανε τη συστάδα Fc και στη συνέχεια θα ενίσχυε το ADCP και την αποτελεσματικότητα του ISAC στο μοντέλο JIMT-1.Ο συνδυασμός του trastuzumab T785-ISAC με το pertuzumab οδήγησε σε σημαντικά ενισχυμένη αποτελεσματικότητα και σημαντική υποχώρηση του όγκου (Εικόνα 4F).Χωρίς την ανοσολογική διέγερση του trastuzumab T785-ISAC, ο συνδυασμός pertuzumab με trastuzumab δεν παρείχε κανένα όφελος.

Στη συνέχεια, διερευνήσαμε τα μοριακά και κυτταρικά συμβάντα που προκαλούνται από την τραστουζουμάμπη T785-ISAC που τελικά καταλήγουν σε αποτελεσματικότητα κατά του όγκου.Πρώιμες αλλαγές γονιδιακής έκφρασης σε όγκουςμετρήθηκαν με το πάνελ ανοσολογικού προφίλ ποντικιού NanoString, αποκαλύπτοντας σημαντική ανοδική ρύθμιση 13,7 τοις εκατό των γονιδίων εντός 24 ωρών από τη θεραπεία, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων που σχετίζονται με τη σηματοδότηση και την ενεργοποίηση TLR7 (γονίδια που σχετίζονται με IRF-7, NF-kB)σε σύγκριση με το 0-0.1 τοις εκατό μετά από θεραπεία με τραστουζουμάμπη ή ισότυπο Τ785-ISAC (Εικόνα 4G) 44.Η ανάλυση των μονοπατιών γονιδιακής έκφρασης που αξιολογήθηκαν από το nSolver Advanced Analysis Pathway Score αποκάλυψε σημαντική αύξηση των βασικών γονιδιακών υπογραφών που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό (Λειτουργίες Μακροφάγων, Λειτουργίες DC, Επεξεργασία Αντιγόνου & Παρουσίαση) που ήτανσύμφωνα με τα in vitro και in vivo ευρήματα ότι οι αλληλεπιδράσεις Fc-Fc R είναι κρίσιμες για τη μεσολαβούμενη από ISAC δραστηριότητα (Εικόνα 4Η και Συμπληρωματικό Σχήμα 12).Οι βαθμολογίες γονιδιακής υπογραφής που σχετίζονται με χημειοκίνες και κυτοκίνες ήταν πολύ αυξημένες μετά από θεραπεία με trastuzumab T785-ISAC, σε συμφωνία με την ποσοτικοποίηση πρωτεΐνης που πραγματοποιήθηκε μέτρηση της κυτοκίνης και της έκκρισης χημειοκίνης εντός του όγκου 24 ώρες μετά τη χορήγηση (Εικόνα 4Ηκαι Συμπληρωματικό Σχήμα 13).Αυτά τα ευρήματα, σε συμφωνία με τα in vitro και in vivo δεδομένα αποτελεσματικότητας, υποδεικνύουν ότι μια ισχυρή απόκριση που προκαλείται από TLR και Fc R προκαλείται από το ISAC.

Η κυτταρομετρία ροής και η IHC χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί εάν η αυξημένη ενεργοποίηση με τη μεσολάβηση του Τ785-ISAC και η έκφραση χημειοκίνης οδήγησαν τελικά στη στρατολόγηση ανοσοενεργών κυττάρων.Τα μυελοειδή ανοσοδιηθήματα καταγράφηκαν με κυτταρομετρία ροής 24 ώρες και 7 ημέρες μετά τη χορήγηση μιας εφάπαξ δόσης τραστουζουμάμπης Τ785-ISAC ή τραστουζουμάμπης και συγκρίθηκαν με μάρτυρες χωρίς θεραπεία.Η ανάλυση των όγκων 24 ώρες μετά τη θεραπεία αποκαλύφθηκεδιήθηση CD11b συν Ly6C συν μονοκύτταρα και CD11b συν Ly6G συν κοκκιοκύτταρα στους όγκους που έλαβαν θεραπεία με τραστουζουμάμπη ή τραστουζουμάμπη Τ785-ISAC σε σύγκριση με τους μάρτυρες που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία (Εικόνα 4Ι).Επτά ημέρες μετά τη θεραπεία, το CD11b συν CD11c συν F4/80 συν θετικά μυελοειδή APC αυξήθηκαν σημαντικά στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με trastuzumab T785-ISAC σε σύγκριση μετραστουζουμάμπη ή μάρτυρες χωρίς θεραπεία (Εικόνα 4I) 45,46.Αυτή η αύξηση στα μυελοειδή APC μπορεί να είναιαποδίδεται στη σημαντική αύξηση της παραγωγής χημειοκινών που σχετίζονται με μυελοειδή μετά από θεραπεία με trastuzumab T785-ISAC.Αν και δεν υπήρξε σημαντική αύξηση στη συχνότητα των μυελοειδών APC στο χρονικό σημείο της ώρας 24-, τα κύτταρα αυτού του φαινοτύπου ενεργοποιήθηκαν μετά από θεραπεία με trastuzumab T785-ISAC, όπως μετρήθηκε με ανοδική ρύθμιση του CD40 στην κυτταρική επιφάνεια , σε σύγκριση με τον ίδιο πληθυσμό από τραστουζουμάμπη ή μάρτυρες χωρίς θεραπεία (Εικόνα 4I).Αυτό το εύρημα, μαζί με τα δεδομένα NanoString, καταδεικνύει περαιτέρω την ικανότητα του trastuzumab T785-ISAC να εμπλέκεται και να ενεργοποιεί μυελοειδή κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου.Δεδομένης της θετικότητας CD11b των μυελοειδών APC που παρατηρήθηκε μία εβδομάδα μετά τη θεραπεία, η πρώιμη διήθηση μονοκυττάρων μπορεί να είναι πρόδρομοι του πληθυσμού των μυελοειδών APC που ωριμάζουν στους όγκους που έλαβαν ISAC αλλά όχι σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με τραστουζουμάμπη.Ωστόσο, απομένει να καθοριστεί πώς τα προφλεγμονώδη εγγύτερα συμβάντα που μετρήθηκαν 24 ώρες μετά τη διέγερση ISAC από το NanoString και το MSD επηρέασαν τελικά τα περιφερικά συμβάντα όπως η ωρίμανση μυελοειδών κυττάρων στο μετασχηματιζόμενο μικροπεριβάλλον όγκου στο μεταγενέστερο 6-ημέρο χρονικό σημείο και, τελικά, επηρέασε την υποχώρηση και την κάθαρση του όγκου.
Τέλος, πραγματοποιήθηκε IHC για την αξιολόγηση της παρουσίας και της θέσης βασικών πληθυσμών ανοσοκυττάρων στον όγκο μετά από θεραπεία με το trastuzumab T785-ISAC σε σύγκριση με τους ελέγχους του.Σε συμφωνία με την κυτταρομετρία ροής 7ης ημέρας, τα κύτταρα που εκφράζουν F4/80ο όγκος και η περιογκική περιοχή αυξήθηκαν την ημέρα 9 μετά από μία μόνο θεραπεία με trastuzumab T785-ISAC (Εικόνα 4J).Επιπλέον, η στοχευμένη θεραπεία ISAC είχε ως αποτέλεσμα μια δραματική αύξηση στα CD11c συν κύτταρα στην περιογκική περιοχή που δεν φάνηκε μετά από θεραπεία με αντίσωμα rHER2 ή θεραπεία με ισότυπο ή ισότυπο-ISAC (Εικόνα 4J).Η αύξηση στα κύτταρα CD11c plus τόσο με κυτταρομετρία ροής όσο και με IHC αποδείχθηκε επίσης στα δεδομένα NanoString, στα οποία η έκφραση mRNA του ITGAX ήταν σημαντικά αυξημένη τις ημέρες 6 και 9 μετά τη χορήγηση τραστουζουμάμπης T785-ISAC (Συμπληρωματικό Σχήμα 14).

Εικόνα 5: Τα T785-ISAC προκαλούν ισχυρά αντικαρκινικά αποτελέσματα στο μοντέλο συγγενούς όγκου MMC. (α) Ποντίκια FVB/N-TgN (MMTV-Erbb2) εμφυτεύτηκαν με την κυτταρική σειρά όγκου MMC. (α) Τα θηλυκά ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν όταν ο όγκος του όγκου έφτασε περίπου τα 500 mm3. Στη συνέχεια, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία μέσω ενδοπεριτοναϊκής ένεσης με 5 mg/kg q5d x 2 αντισώματος HER2 ποντικού αντι-ποντικού, HER2 T{16}}ISAC κατά ποντικού ή ισότυπου T785-ISAC (TA99) (n =4-7 ποντίκια ανά βραχίονα). (β, γ) Τα αρσενικά ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν όταν ο όγκος του όγκου έφτασε περίπου τα 500 mm3 και υποβλήθηκαν σε προ-θεραπεία ξεκινώντας μία ημέρα πριν από την αρχική ημερομηνία θεραπείας με λιποσώματα φορτωμένα με clodronate ή μάρτυρες για εξάντληση φαγοκυττάρων (6 κύκλοι, έως την Ημέρα 15) ή αντι -CD8 depleting antibody (rIgG2b control) for CD8 T cell depletion (8 cycles, through Day 21). Animals were treated with 5 mg/kg rHER2 T785-ISAC q5d x 2 (n=6 mice per group) intraperitoneally. For phagocyte depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC treatment with clodronate or control liposomes, while for CD8 T cell depletion, statistics reflect a comparison of T785-ISAC with T785-ISAC + CD8 Depletion or T785-ISAC + rat isotype IgG2b. (d) Anti-rHER2 T785-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >60 ημέρες μετά την τελευταία τους θεραπεία προκλήθηκαν με την κυτταρική σειρά όγκου MMC. Τα ποντίκια χωρίς όγκο χρησίμευσαν ως έλεγχοι εμφύτευσης (n=5 ποντίκια ανά ομάδα). (δ) Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον 2 πειραμάτων. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ανθρώπινη ευθανασία όταν εμφανίστηκαν όγκοιέφτασε τα 2,000 mm3. Δείχνονται δεδομένα για εκείνες τις ομάδες στις οποίες δεν είχαν φτάσει όγκοι2,000 mm3. (ei) Κοκόρτες ποντικών τυχαιοποιήθηκαν όταν οι όγκοι όγκων MMC έφτασαν περίπου τα 500 mm3 και υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 5 mg/kg ISAC ή αντισώματα ελέγχου που χορηγήθηκαν την ημέρα 0 και την ημέρα 5. Οι όγκοι υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για μέτρηση κυτοκίνης με MSD , ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, ποσοτικοποίηση mRNA NanoString ή σταθεροποιημένη με φορμαλίνη και ενσωματωμένη σε παραφίνη γιαανοσοϊστοχημεία στους χρόνους που φαίνονται. (ε) Οι γραφικές παραστάσεις ηφαιστείου απεικονίζουν log2 φορές αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης σε όγκους που υποβλήθηκαν σε θεραπεία έναντι ισοτύπου ελέγχου που μετρήθηκαν με NanoString στις 24 ώρες (n=5 ποντίκια ανά ομάδα). Οι αλλαγές με προσαρμοσμένη τιμή p < 0.05="" εμφανίζονται="" με="" κόκκινο="" χρώμα.="" (στ)="" οι="" βαθμολογίες="" γονιδιακής="" υπογραφής="" ποσοτικοποιήθηκαν="" από="" το="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" για="" όγκους="" που="" αναλύθηκαν="" 24="" ώρες="" μετά="" τη="" θεραπεία="" (n="5" ποντίκια="" ανά="" ομάδα).="" (ζ,="" η)="" ανάλυση="" κυτταρομετρίας="" ροής="" της="" κυτταρικής="" σύνθεσης="" του="" όγκου="" και="" της="" κατάστασης="" ενεργοποίησης="" 24="" ώρες="" και="" 6="" ημέρες="" μετά="" την="" έναρξη="" της="" θεραπείας="" (n="4" ποντίκια="" ανά="" ομάδα).="" τα="" δεδομένα="" είναι="" αντιπροσωπευτικά="" τουλάχιστον="" 2="" πειραμάτων.="">Αντιπροσωπευτικές εικόνες καθώς και ποσοτικοποίηση των F4/80, CD11c και CD8 IHC όγκων που συλλέχθηκαν 6 ημέρες μετά από κάθε ενδεικνυόμενη θεραπεία. Οι ράβδοι κλίμακας είναι 50 μm. (ai) Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος και SEM. *Π<0.05,><0.01,><0.001,><>

Τα στοχευμένα σε όγκο T785-ISAC προκαλούν υποχώρηση όγκου στο μοντέλο συγγενούς όγκου MMC
Για να αξιολογήσουμε την ικανότητα των ISAC να μεσολαβούν στην αντικαρκινική αποτελεσματικότητα παρουσία Β, Τ και ΝΚ κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε μια συγγενή κυτταρική σειρά καρκινώματος μαστού ποντικού (MMC) που εκφράζει το HER2 αρουραίου (rHER2) που προέρχεται από ένα αυθόρμητο μαστικό καρκίνωμα σε ποντίκια rHER2- που εκφράζουν FVB.Για να ελαχιστοποιηθεί η ανοσογονικότητα μεταξύ των ειδών που σχετίζεται με την έκφραση rHER2 σε MMC, διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν ενδογενώς Her2 επίμυος υπό τον έλεγχοτου προαγωγέα MMTV χρησιμοποιήθηκαν ως ξενιστής (Συμπληρωματικό Σχήμα 15) 47. Αξιοποιώντας την παρουσία ενός πλήρως άθικτου ανοσοποιητικού συστήματος, στοχεύσαμε να αξιολογήσουμε την ικανότητα του ISAC να καταπολεμά όγκους με μεγάλο όγκο όγκου 500 mm3, καθώς οι μεγαλύτεροι όγκοι είναι γενικά πιο δύσκολο να αντιμετωπιστεί σε προκλινικά μοντέλα 48. Η συστηματική χορήγηση όλων των θεραπειών, συμπεριλαμβανομένου του rHER2 T785-ISAC, ήταν καλά ανεκτή, με ελάχιστη επίδραση στο σωματικό βάρος (Συμπληρωματικό Σχήμα 16Α). Μόνο το rHER2 T785-ISAC, ωστόσο, μπόρεσε να θεραπεύσει ποντίκια που έφεραν μεγάλους, εγκατεστημένους όγκους (Εικόνα 5Α). Όπως φάνηκε στο μοντέλο ξενομοσχεύματος, οι μελέτες εξάντλησης κυττάρων έδειξαν ότι χάθηκε σημαντική αντινεοπλασματική δραστηριότητα όταν τα φαγοκυτταρικά κύτταρα εξαντλήθηκαν με λιποσώματα φορτωμένα με clodronate (Εικόνα 5Β). Ενώ το ISAC δεν αναμένεται να δράσει απευθείας στα Τ κύτταρα, τα ποντίκια που είχαν λάβει προηγουμένως ένα αντίσωμα που εξαντλούσε το CD έχασαν την ικανότητα να καθαρίζουν όγκους μετά από δύο χορηγήσεις rHER2 T785-ISAC (Εικόνα 5Γ). Αυτό υποδηλώνει ότι τα ISAC που στοχεύουν τον όγκο μπορούν να δράσουν έμμεσα μέσω των Τ κυττάρων, μετά την παρουσίαση αντιγόνων που σχετίζονται με τον όγκο. Συνεπής με την παρουσία ανοσολογικής μνήμης, ποντίκιαπου θεραπεύτηκαν από όγκους MMC μετά από θεραπεία με rHER2 T785-ISAC προστατεύτηκαν από την εκ νέου πρόκληση όγκου (Εικόνα 5Δ).

Για να διερευνήσουμε περαιτέρω τον μηχανισμό που κρύβεται πίσω από την αποτελεσματικότητα του ISAC στο συγγενετικό μοντέλο, διερευνήσαμε στη συνέχεια τις κυτταρικές, μεταγραφικές και κυτοκινικές αλλαγές στο μικροπεριβάλλον του όγκου μετά τη χορήγηση ISAC. Δύο ομάδες ποντικών που έφεραν μεγάλους όγκους MMC υποβλήθηκαν σε θεραπεία με rHER2 T785-ISAC ή μάρτυρες. Οι όγκοι από την πρώτη κοόρτη συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά τη χορήγηση της δόσης (Ημέρα 1) όταν όλοι οι όγκοι ήταν παρόμοιου μεγέθους (Συμπληρωματικό Σχήμα 16Β). Στην άλλη κοόρτη χορηγήθηκε μια δεύτερη δόση 5 ημέρες μετά την πρώτη, στη συνέχεια συλλέχτηκε 24 ώρες αργότερα (Ημέρα 6), οπότε οι όγκοι σε όλες τις ομάδες θεραπείας είχαν αναπτυχθεί μετρήσιμα εκτός από αυτές που έλαβαν θεραπεία με T785-ISAC (Συμπληρωματικό Σχήμα 16Β ). Οι όγκοι αναλύθηκαν με IHC, έκφραση mRNA και έκκριση κυτοκίνης σε προϊόντα λύσης πρωτεΐνης. Υποστηρίζοντας περαιτέρω τις παρατηρήσεις μας στα μοντέλα ξενομοσχευμάτων ότι η στόχευση όγκου απαιτείται για τη δραστηριότητα ISAC, η ανάλυση mRNA των όγκων 24 ώρες μετά τη θεραπεία με rHER2 T{12}}ISAC έδειξε δραματική ρύθμιση προς τα πάνω του 34,1 τοις εκατό των γονιδίων στο NanoString ποντικίσιο ανοσοποιητικό κατά του καρκίνου πάνελ προφίλ σε σύγκριση με όγκους που έλαβαν ισότυπο. Το αντίσωμα αντι-rHER2 από μόνο του είχε μόνο μια μικρή επίδραση στη γονιδιακή έκφραση (3,5 τοις εκατό των γονιδίων που αναλύθηκαν) ενώ ο μη στοχευμένος ισότυπος Τ785-ISAC δεν επηρέασε την έκφραση γονιδίου (Εικόνα 5Ε). Όπως φαίνεται στο μοντέλο ξενομοσχεύματος HCC1954, τα γονίδια που σχετίζονται με τη μεσολάβηση σηματοδότησης και ενεργοποίησης του TLR7-ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω από το rHER2 T{28}}ISAC που στοχεύει τον όγκο, ενδεικτικό μιας ισχυρής απόκρισης που προκαλείται από TLR (Εικόνα 5Ε). Η ανάλυση μονοπατιού γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε και πάλι σημαντική ανοδική ρύθμιση των βασικών γονιδιακών υπογραφών που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό, συμπεριλαμβανομένων των υπογραφών για ανάλυση μονοπατιού γονιδιακής έκφρασης, αποκάλυψε σημαντική ανοδική ρύθμιση των βασικών γονιδιακών υπογραφών που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό μετά από θεραπεία με rHER2 T785-ISAC, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που σχετίζονται με χημειοκίνες και κυτοκίνες (Εικόνα 5F). Η ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε στους ίδιους όγκους που αναλύθηκαν από το NanoString και σύμφωνα με τα ευρήματα της γονιδιακής υπογραφής, μετρήθηκαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα προφλεγμονωδών κυτοκινών και χημειοκινών σε 24 ώρες μετά τη θεραπεία με rHER2 T{39}}ISAC (Συμπληρωματικό Σχήμα 17 ). Οι βαθμολογίες γονιδιακής υπογραφής ήταν επίσης σημαντικά αυξημένες για την επεξεργασία και παρουσίαση αντιγόνου, τη λειτουργία δενδριτικών κυττάρων και τη λειτουργία των μακροφάγων, υποστηρίζοντας περαιτέρω την απόκριση με τη μεσολάβηση anFc-Fc R και την καθοδηγούμενη από φαγοκυττάρωση 24 ώρες μετά το rHER2 T{45}}ISACθεραπεία (Εικόνα 5ΣΤ και Συμπληρωματικό Σχήμα 18). Εκτός από τις σημαντικά αυξημένες βαθμολογίες γονιδιακής υπογραφής που σχετίζονται με μια ισχυρή απόκριση με τη μεσολάβηση TLR και Fc, η βαθμολογία γονιδιακής υπογραφής για Λειτουργίες Τ κυττάρων αυξήθηκε επίσης σημαντικά μέσα σε 24 ώρες από τη θεραπεία με rHER2 T785-ISAC, υποστηρίζοντας περαιτέρω την διαπιστώνοντας ότι τα Τ κύτταρα απαιτούνται για την αποτελεσματικότητα που προκαλείται από ISAC (Εικόνα 5ΣΤ και Συμπληρωματικό Σχήμα 18).

Για να χαρακτηριστούν τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που μπορεί να συμβάλλουν στην πρώιμη αύξηση της προφλεγμονώδους παραγωγής κυτοκίνης και χημειοκίνης, οι όγκοι αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής 24 ώρες μετά την πρώτη δόση του rHER2 T785-ISAC ή τους ελέγχους και 6 ημέρες μετά την έναρξη της θεραπεία, 24 ώρες μετά τη δεύτερη δόση. Η ανάλυση των όγκων την Ημέρα 1 αποκάλυψε διήθηση CD11b συν Ly6C συν μονοκύτταρα στους όγκους που έλαβαν θεραπεία με rHER2 T785-ISAC και CD11b συν Ly6G συν κοκκιοκύτταρα στους όγκους που έλαβαν θεραπεία με rHER2 mAb ή rHER2 T{14}ISAC , αλλά όχι τους μάρτυρες ισοτύπου ISAC ή ισοτύπου αντισώματος (Εικόνα 5G). Τα επίπεδα των μονοκυττάρων αυξήθηκαν ακόμη περισσότερο σε όγκους που έλαβαν rHER2 T{17}}ISAC μετά από 6 ημέρες. Παρόμοια με αυτό που παρατηρήσαμε στο μοντέλο ξενομοσχεύματος HCC1954, τα μυελοειδή APC (CD11b συν CD11c συν F4/80 plus ) ήταν σημαντικά αυξημένα την 6η ημέρα μετά τη θεραπεία με rHER2 T{26}}ISAC σε σύγκριση με τους ελέγχους (Εικόνα 5G και Συμπληρωματικό Σχήμα 19 ). Επιπλέον, τα μυελοειδή APC βρέθηκαν να ενεργοποιούνται ειδικά στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με rHER2 T{30}} ISAC και στα δύο χρονικά σημεία, όπως μετρήθηκε με ανοδική ρύθμιση του CD40 στην κυτταρική επιφάνεια (Εικόνα 5Η). Είναι σημαντικό ότι δεν μετρήθηκε αύξηση στα καρκινικά μυελοειδή APC μετά την εξάντληση των φαγοκυττάρων χρησιμοποιώντας λιποσώματα φορτωμένα με clodronate (Συμπληρωματικό Σχήμα 20). Τέλος, πραγματοποιήθηκε IHC για να αξιολογηθεί η παρουσία και η θέση βασικών πληθυσμών ανοσοκυττάρων στο μοντέλο MMC μετά από θεραπεία με το rHER2 T785-ISAC. Όπως φάνηκε στο μοντέλο ξενομοσχεύματος HCC1954, η θεραπεία με το rHER2 T785-ISAC είχε ως αποτέλεσμα μια δραματική αύξηση των κυττάρων CD11c plus και F4/80 plus στην περιογκική περιοχή που δεν παρατηρήθηκε μετά από θεραπεία με αντίσωμα rHER2 ή θεραπεία με ισότυπο ή ισότυπος Τ785-ISAC (Εικόνα 5I). Σε συμφωνία με την πρώιμη έκφραση των χημειοκινών των Τ κυττάρων και την αυξημένη βαθμολογία γονιδιακής υπογραφής για τη λειτουργία Τ κυττάρων, σημαντική διήθηση των κυττάρων CD8 plus παρατηρήθηκε από IHC εντός των όγκων των ποντικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με rHER2 T{48}}την ημέρα 6, ενώ Η χρώση CD8 σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με αντίσωμα αντι-rHER2 ή μάρτυρες ισοτύπου παρέμεινε χαμηλή (Εικόνα 5Ι). Η αυξημένη χρώση CD8 συν IHC, μαζί με ενισχυμένη γονιδιακή έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με τη λειτουργία των Τ κυττάρων και η εξαρτώμενη από CD{56}}κάθαρση όγκου, υποστηρίζουν τη δυνατότητα του T785-ISAC να μετατρέψει έναν ψυχρό όγκο ζεστό.CL{ {58}}Τα ISAC προκαλούν παλινδρόμηση όγκου στο μοντέλο ξενομοσχεύματος HER{59}}με μέσο έκφρασης για να δείξουμε ότι τα ISAC είναι μια ισχυρή πλατφόρμα σε πολλαπλά ωφέλιμα φορτία που διεγείρουν το ανοσοποιητικό σύστημα, αναπτύξαμε ένα ISAC χρησιμοποιώντας έναν πολύ γνωστό αγωνιστή TLR7, τον CL264 με DAR συγκρίσιμο με το trastuzumab T785-ISAC (Εικόνα 6Α και Συμπληρωματικό Σχήμα 21). Η ικανότητα των ISACs trastuzumab που παράγονται με CL264 ή T785 να μεσολαβούν στην ενδοογκική μυελοειδή ενεργοποίηση αξιολογήθηκε στο μοντέλο ξενομοσχεύματος HCC1954 24 ώρες μετά από μία μόνο χορήγηση trastuzumab, trastuzumab CL264-ISAC ή trastuzumab T{73} . Ενισχυμένη μυελοειδής ενεργοποίηση παρατηρήθηκε με το trastuzumab CL264-ISAC όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη έκφραση CD40 στο CD11b που διεισδύει στον όγκο συν CD11c συν F4/80 συν μυελοειδή APC σε σύγκριση με το trastuzumab ή το trastuzumab T785-ISAC (Εικόνα 6Β ).Για να προσδιοριστεί εάν η ενισχυμένη ικανότητα ενεργοποίησης μυελοειδούς του CL264-ISAC μεταφράστηκε σε μεγαλύτερη αντικαρκινική δραστηριότητα in vivo, το trastuzumab CL264-ISAC συγκρίθηκε με τοT785-ISAC στα μοντέλα όγκου HER2High HCC1954 και HER2Med JIMT-1. Ενώ και οι δύοΤα ISAC της τραστουζουμάμπης μεσολάβησαν στην πλήρη υποχώρηση του όγκου στο μοντέλο HCC1954 HER2High, το CL264-ISAC έδειξε αυξημένη αντικαρκινική δραστηριότητα στο μοντέλο JIMT-1 HER2Med υποδηλώνοντας ότι η ισχύς ISAC και η ικανότητα στόχευσης όγκων χαμηλότερης πυκνότητας αντιγόνου μπορεί να συνδέονται (Εικόνα 6Γ–Δ).

Και τα δύο ISAC ήταν καλά ανεκτά, αλλά παρατηρήσαμε παροδική απώλεια σωματικού βάρους 5-10 τοις εκατό σε ζώα που έλαβαν θεραπεία είτε με τραστουζουμάμπη CL264-ISAC είτε με ριτουξιμάμπη CL264-ISAC, με το σωματικό βάρος να επανέρχεται σε ή πάνω από την αρχική τιμή κατά την τρίτη δόση (Συμπληρωματικό Σχήμα 16Α). Η συστηματική έκκριση κυτοκίνης μετρήθηκε μετά από θεραπεία με T785-ISAC ή CL264-ISAC. Τα χαμηλά επίπεδα TNF μετρήθηκαν στον ορό των ζώων τέσσερις ώρες μετά τη χορήγηση του T785-ISAC, ενώ τόσο τα στοχευόμενα όσο και τα ισοτύπου CL264-ISAC προκάλεσαν υψηλότερα επίπεδα έκκρισης TNF συστηματικά (Συμπληρωματικό Σχήμα 11) . Είναι απίθανο αυτές οι επιδράσεις μεταξύ των T785 και CL264 ISAC να οφείλονταν σε άμεσο αντίκτυπο του ISAC στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, καθώς το ISAC δεν ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων in vitro (Συμπληρωματικό Σχήμα 9).

Τα CL264-Τα ISAC προκαλούν κάθαρση όγκου και ανοσολογική μνήμη σε μοντέλα συγγενών όγκων Δεδομένης της αυξημένης ισχύος και αποτελεσματικότητας που παρατηρείται με το CL264-ISAC σε μοντέλα ξενομοσχευμάτων ανθρώπινου όγκου με ποικίλη πυκνότητα αντιγόνου HER2, στη συνέχεια χαρακτηρίσαμε τη δραστηριότητα του CL 264-ISACs σε μοντέλα συγγενών όγκων. Παρόμοια με το T{4}}ISAC στο μοντέλο MMC, το CL264-ISAC οδήγησε σε υποχώρηση του όγκου και κάθαρση με τρόπο που εξαρτάται από τα Τ κύτταρα, οδηγώντας σε ανθεκτική ανοσολογική μνήμη (Συμπληρωματικό Σχήμα 22Α). Για να αξιολογήσουμε την αποτελεσματικότητα του ISAC σε ένα μοντέλο συγγενούς όγκου με μειωμένη έκφραση αντιγόνου, αναπτύξαμε μια κυτταρική σειρά CT26 που εκφράζει σταθερά το HER2 επίμυος (CT26-rHER2). Είναι σημαντικό ότι περίπου το 8,5 τοις εκατό των κυττάρων CT26 δεν εκφράζουν rHER2 μετά την εμφύτευση όγκου (Εικόνα 6Ε). Τα ποντίκια Wildtype Balb/c που έλαβαν θεραπεία με rHER2 CL264-ISAC εμφάνισαν σημαντική αντικαρκινική ανοσία καθώς το 75 τοις εκατό (6 στα 8) των ποντικών καθάρισαν τους όγκους τους και παρέμειναν χωρίς όγκο για τη διάρκεια του πειράματος, ενώ κανένα από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με το αντίσωμα αντι-rHER2 δεν είχε πλήρη παλινδρόμηση (Εικόνα 6F). Παρατηρήθηκε παροδική απώλεια βάρους περίπου 10 τοις εκατό του σωματικού βάρους μετά τη θεραπεία με rHER2 CL264-ISAC, με το σωματικό βάρος να ανακτά οκτώ ημέρες μετά την έναρξη της μελέτης (Συμπληρωματικό Σχήμα 22Β). Αξιολογήσαμε εάν το rHER2 CL264-ISAC μεσολάβησε στην ανοσολογική μνήμη έναντι ενός όγκου που δεν είχε έκφραση του στοχευόμενου αντιγόνου, rHER2, προκαλώντας ποντίκια που είχαν προηγουμένως θεραπευτεί από όγκους CT{26-rHER2 με τη γονική κυτταρική σειρά CT26 που δεν είχε rHER2 έκφραση. Τα ποντίκια που είχαν προηγουμένως θεραπευτεί από όγκους CT26-rHER2 με rHER2 ISAC προστατεύτηκαν πλήρως από την πρόκληση με τη γονική κυτταρική σειρά CT26 (Εικόνα 6I). Η εξάντληση των CD4 και CD8 Τ κυττάρων πριν από την επαναπρόκληση του όγκου έδειξε ότι τα Τ κύτταρα απαιτούνται για προστασία. Τέλος, δοκιμάσαμε εάν η ανοσολογική μνήμη που αναπτύχθηκε σε ποντίκια που είχαν προηγουμένως θεραπευτεί με το ISAC ήταν ειδική για τα σχετιζόμενα με τον όγκο αντιγόνα του πρωτοπαθούς όγκου που υποβλήθηκε σε θεραπεία. Κατά τη διάρκεια της γονικής επαναπρόκλησης του όγκου CT26, τα ποντίκια προκλήθηκαν ταυτόχρονα με έναν διαφορετικό όγκο, τον 4Τ1, που εμφυτεύτηκε στον ετερόπλευρο πλευρό. Τα δεδομένα δείχνουν ότι η ανάπτυξη της ανοσολογικής μνήμης ήτανειδικά για τα σχετιζόμενα με τον όγκο αντιγόνα CT26 διαφορετικά από το rHER2, καθώς η ανάπτυξη όγκου των όγκων 4T1 δεν επηρεάστηκε (Εικόνα 6G).