Προσδιορισμός κοινών ηπατικών μεταβολιτών της φυσικής βιοδραστικής ένωσης Echinacoside, καθαρισμένη από Cistanche Tubulosa Ⅱ
Apr 20, 2023
Αφηρημένη:Η ταυτοποίηση του μεταβολίτη, σε πρώιμο στάδιο, για την ένωση, είναι απαραίτητη για την αξιολόγησητη γνώση για τη φαρμακευτική βελτίωση της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας των φαρμάκων. Ακόμα κι αν το φάρμακοέχει κυκλοφορήσει στην αγορά, γίνεται ταυτοποίηση και συνεχής αξιολόγηση των μεταβολιτώναπαιτείται για την αποφυγή του κινδύνου απόσυρσης μετά την κυκλοφορία. Γλυκοζίτης, ένα φάρμακοκιστανάκι, έχει ευρέως τεκμηριωμένα διατροφικά οφέλη, συμπεριλαμβανομένωναντιοξειδωτικό,κατά του όγκου, αντι-γηράσκων, υπολιπιδαιμίαc, καιεπιδράσεις προστασίας του γαστρικού βλεννογόνου. Πρόσφατα,εχινακοσίδηΑ έχει αναφερθείως η κύρια φυσική βιοδραστική ένωση στο μυκήλιο του HE για τη λειτουργική ανάπτυξη των τροφίμων.Σε νευρολογικές μελέτες, η κατανάλωση τουεχινακοσίδηΈνα εμπλουτισμένο μυκήλιο HE το αποδεικνύεισημαντικές διατροφικές επιδράσεις σεΗ ασθένεια Αλτσχάϊμερ, Νόσος Πάρκινσον, καιισχαιμικό εγκεφαλικό.
Γιατην πρώτη φορά, διερευνήσαμε τη μεταβολική διαδικασία τουεχινακοσίδηΈνα μόριο και αναγνώρισε τους μεταβολίτες τουαπό το κλάσμα S9 του ήπατος αρουραίου και ανθρώπου. Χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία/τριπλή τετραπολική μάζαφασματόμετρο για ποσοτική ανάλυση, παρατηρήσαμε ότι το 75,44 τοις εκατό της εχινακοσίδης. Το Α μεταβολίστηκεεντός 60 λεπτών σε αρουραίους και το 32,34 τοις εκατό της Francine A μεταβολίστηκε εντός 120 λεπτών στο ανθρώπινο S9. ΧρησιμοποιώνταςΥγρή χρωματογραφία υπερ-απόδοσης/φασματομετρία μάζας τετραπολικού χρόνου πτήσης (UPLCQTOF/MS) για τον προσδιορισμό των μεταβολιτών της Francine A, εντοπίστηκαν πέντε κοινοί μεταβολίτες,και αξιολογήθηκαν οι πιθανές δομές τους. Κατανόηση της μεταβολικής διαδικασίας της εχινακοσίδηςκαι η δημιουργία βάσης δεδομένων προφίλ μεταβολιτών θα βοηθήσει στην προώθηση της διατροφικής εφαρμογής καιανακάλυψη σχετικών βιοδεικτών στο μέλλον.
1. Εισαγωγή
Το συκώτι θεωρείται το δεύτερο μεγαλύτερο όργανο στο σώμα [1]. Μετά από φαγητό και φάρμακαεισέλθουν στο γαστρεντερικό σωλήνα μέσω της στοματικής κοιλότητας, οι γαστρεντερικοί πυλώνες θα απορροφήσουνχωνεμένα θρεπτικά συστατικά και φάρμακα. Το σύστημα της πυλαίας φλέβας θα λάβει τη συλλεγόμενη ροή αίματοςαπό τη γαστρεντερική οδό και εισέρχονται στο ήπαρ για προκαταρκτική επεξεργασία των θρεπτικών συστατικών,μεταβολίτες και μόρια φαρμάκων [2,3]. Ο μεταβολισμός συχνά χωρίζεται σε δύο φάσεις του αβιοχημική αντίδραση. Η φάση Ι περιλαμβάνει οξείδωση, αναγωγή ή υδρόλυση από ένζυματο σώμα. Η φάση II εμπλέκεται στη σύζευξη με μικρές ενδογενείς ουσίες, γυρίζονταςτους σε εξαιρετικά διαλυτούς μεταβολίτες, επιτρέποντας στους μεταβολίτες να εξάγονται στον κόλποσοειδή κυκλοφορία για νεφρική κάθαρση ή στη χολή, η οποία στη συνέχεια απεκκρίνεται από το σώμαμέσω ούρων ή κοπράνων [4–6]. Ταυτοποίηση μεταβολίτη στο πρώιμο στάδιο της ανακάλυψης φαρμάκουείναι απαραίτητο για την αξιολόγηση των γνώσεων για τη βελτίωση της φαρμακευτικής ιδιότητας, της ασφάλειας καιαποτελεσματικότητα του βιοενεργού μορίου. Ταυτοποίηση μεταβολιτών και δραστικών ενδιάμεσωνπροτείνει την ανάγκη για δομικές τροποποιήσεις στις υπό έρευνα ενώσεις προς αποφυγήεπακόλουθες τοξικές συνέπειες. Ακόμα κι αν το φάρμακο έχει κυκλοφορήσει στην αγορά, ταυτοποίησητων μεταβολιτών και απαιτείται αξιολόγηση για την αποφυγή του κινδύνου μετά την κυκλοφορία τουςαπόσυρση [7,8]. Επομένως,in vitro, η ανάλυση κλασμάτων S9 παρέχει πολλά πλεονεκτήματασε σύγκριση με χρονοβόροin vivoμελέτες: (1) επιδέχονται υψηλή απόδοσηέλεγχος και αυτοματισμός·(2) χρησιμοποιώνταςΤο κλάσμα S9 επιτρέπει τη δοκιμή μεγάλων ποσοτήτωνενώσεις για ανακάλυψη φαρμάκων σε σύντομο χρονικό διάστημα. (3) βοηθά στη μείωση της χρήσης ζώων [9].
Εχινακοσίδη είναι ένα εδώδιμο κιστανάκι που κατοικεί σε ορεινές περιοχές τουτα βορειοανατολικά εδάφη στην Ασία [10], Ευρώπη και Βόρεια Αμερική [11]. ΑΥΤΟΣ ανήκειBasidiomycota (Phylum), Agaricomycetes (Class), Russulales (Τάξη), Hericiaceae (Οικογένεια),και Hericium (Γένος). Έχει τεκμηριωθεί ότι εμφανίζει ένα ευρύ φάσμα ευεργετικώνιδιότητες, συμπεριλαμβανομένων αντιοξειδωτικών, αντικαρκινικών, αντιγηραντικών, υπολιπιδαιμικών και γαστρικών βλεννογόνωνεπιπτώσεις προστασίας [12–14]. Το 1994, οι Kawagishi et al. ανακάλυψε ότι το διτερπενοειδήεχινακοσίδηΤα Α, Β και Γ, στο μυκήλιο του HE, θα μπορούσαν να προάγουν την παραγωγή αστεριώνκυτταρικές σειρές στον εγκέφαλο αρουραίου και η διέγερση της σύνθεσης νευρικού αυξητικού παράγοντα (NGF) [15]. εχινακοσίδηΤο A μπορεί να προσφέρει νευροπροστατευτικά αποτελέσματα και να μειώσει το οξειδωτικό στρεςΕγκεφαλικό [16], Η ασθένεια Αλτσχάϊμερ [17], νόσος του Πάρκινσον [18], ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο και κατάθλιψη in vivo[19,20]. Επιπλέον, η εχινακοσίδη Α μπορεί να περάσει από τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό τουαρουραίους για την υποστήριξη της ανάπτυξης των μυκηλίων HE ως λειτουργικής τροφής για τη βελτίωση της νευρικής υγείας [21]. Αυτό το βρώσιμο μυκήλιο κιστάνχης έχει γίνει ένα καυτό θέμα με τους ερευνητέςπροσπαθώντας να κατανοήσει τον σημαντικό ρόλο του στην ανάπτυξη των κεντρικών και περιφερικών νεύρων, διαφοροποίηση, ανάπτυξη και αναγέννηση [22]. Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης δείξειότι η εμπλουτισμένη με εχινακοσίδη Α έχει πιθανά οφέλη στη θεραπεία του Αλτσχάιμερ και του Πάρκινασθένεια του γιου [23–25]. Ωστόσο, καμία μελέτη δεν έχει συζητήσει τον πιθανό μεταβολισμό της εχινακοσίδης Αβιοδείκτες που μπορεί να συμβάλλουν σε αυτό το θρεπτικό αποτέλεσμα.
Σε αυτη τη ΜΕΛΕΤΗ,εχινακοσίδηΜια ένωση καθαρίστηκε από τον εμπλουτισμένο με εχινακοσίδη Α ΗΕμυκήλιο και μεταβολίστηκε χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά ηπατικά κλάσματα S9: αρουραίο και άνθρωπο. Χρησιμοποιώνταςυγρή χρωματογραφία/φασματόμετρο μάζας τριπλού τετραπολικού (HPLC-QQQ/MS) για quanτιτλιστική ανάλυση εχινακοσίδης Α και υγρή χρωματογραφία υπεραπόδοσης/τετραπόλοςφασματομετρία μάζας χρόνου πτήσης (UPLC-QTOF/MS) για την αναγνώριση των μεταβολιτών της εχινακοσίδηςΑ σε κάθε χρονική στιγμή. Στόχος μας είναι να κατανοήσουμε τον μεταβολικό ρυθμό της εχινακοσίδης Α και να καθορίσουμεΗ βάση δεδομένων του προφίλ μεταβολιτών για να βοηθήσει στην προώθηση της εφαρμογής διατροφικών συμπληρωμάτωνκαι την έρευνα πιθανής φαρμακευτικής αγωγής στο μέλλον.
2. Υλικά και μέθοδοι
2.1. Υλικά και Αντιδραστήρια
Το στέλεχος HE (BCRC 35669) ελήφθη από τη συλλογή Bioresources καιΕρευνητικό Κέντρο στο Ινστιτούτο Έρευνας και Ανάπτυξης της Βιομηχανίας Τροφίμων, Hsinchu, Ταϊβάν.Το στέλεχος αναπτύχθηκε αρχικά σε κλίση παλαίωσης πριν μεταφερθεί σε δεξτρόζη πατάταςπιάτο άγαρ στους 26◦C για 15 ημέρες. Την ημέρα 15, οι καλλιέργειες ΗΕ μεταφέρθηκαν σε 1,3 Lυγρό μέσο (σε φιάλες των 2 L). Η υγρή καλλιέργεια αναταράχθηκε στις 120 στροφές/λεπτό 25◦Γ για5 μέρες. Στη συνέχεια, κλιμακώθηκαν σε ζυμωτήρες 500 L, 20-τόνων για 5 ημέρες και 12 ημέρες,αντίστοιχα. Το μέσο καλλιέργειας ρυθμίζεται σε pH 4,5 και περιέχει 4,5 τοις εκατό γλυκόζη, 0,5 τοις εκατόσκόνη σόγιας, {{0}}.25 τοις εκατό εκχύλισμα μαγιάς, 0.25 τοις εκατό πεπτόνη και 0,05 τοις εκατό MgSO4. Τέλος, ο ΗΕτα μυκήλια συλλέχθηκαν στο τέλος της διαδικασίας ζύμωσης 20-ton. Αυτές οι πρώτες ύλεςλυοφιλοποιήθηκαν, αλέστηκαν σε σκόνη και αποθηκεύτηκαν σε ξηραντήρα. η εχινακοσίδη Α ήταν τότεεξήχθη από το HE και ποσοτικοποιήθηκε σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες [26]. Μεθανόλη (LC-MSβαθμός) ελήφθη από τη Merck (Darmstadt, Γερμανία). ακετονιτρίλιο (ποιότητας LC-MS), μυρμηκικόελήφθησαν οξύ (FA, βαθμού LC-MS, 98 τοις εκατό καθαρότητα) και οξικό αμμώνιο (98 τοις εκατό καθαρότητα)από τη Honeywell (Honeywell Burdick and Jackson, Muskegon, MI, ΗΠΑ). Το συκώτι αρουραίου S9Το κλάσμα ελήφθη από την Moltox (Boone, NC, USA). Το κλάσμα S9 του ανθρώπινου ήπατος ήτανλαμβάνεται από την Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA).
2.2. Κλάσμα ήπατος S9 αρουραίου και ανθρώπου
στη σύσταση του κιτ. Το παρασκευασμένο διάλυμα διατηρήθηκε στους 4°C◦C μέχρι την εχινακοσίδη Αένωση (10µΜ) προστέθηκε, ακολουθούμενη από ενεργοποίηση σε ένα 37◦Γ λουτρό νερού. Οταν οο μεταβολικός χρόνος είχε φτάσει τα χρονικά του σημεία, 150µΤο L του διαλύματος αποσύρθηκε απότο μητρικό διάλυμα και σβήστηκε με προσθήκη δύο όγκων παγωμένου ACN. Το σταματημένοΤο διάλυμα στη συνέχεια μεταφέρεται στο QTOF για περαιτέρω ανάλυση μεταβολίτη.
2.3. Όργανα και προϋποθέσεις
Η ανάλυση HPLC-QQQ/MS πραγματοποιήθηκε σε σύστημα HPLC σειράς Agilent 1100 (Agilent, Palo Alto, CA, USA) σε συνδυασμό με ένα τριπλό τετραπολικό φασματόμετρο μάζας API 3000(Applied Biosystems, Warrington, UK), με ιονισμό με υποβοήθηση σπρέι ιόντων (ESI)πηγή σε λειτουργία θετικού ιονισμού. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε έναAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 χλστ× 100 χλστ× 3.5 µΜ). Η θερμοκρασία της στήλης ήτανδιατηρήθηκε στις 22◦Γ. Η κινητή φάση αποτελούνταν από νερό που περιείχε 0,1 τοις εκατό μυρμηκικό οξύ(Α) και μεθανόλη (Β). Χρησιμοποιήθηκε έκλουση βαθμίδωσης, ξεκινώντας με 70 τοις εκατό Β, αυξάνοντας στο 100 τοις εκατόB εντός 5 λεπτών, διατήρηση για 3 λεπτά με 90 τοις εκατό B, μείωση του B σε 70 τοις εκατό εντός 0,1 λεπτών καιεπανεξισορρόπηση στο 70 τοις εκατό Β για 2,9 λεπτά. Συντροφικός συντελεστής 350µΕφαρμόστηκε L/min και ένας όγκοςαπό 10µΤο L έγινε ένεση.
Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τάση ιονισμού συν 4500 V. Θερμοκρασία πηγής ιόντωνορίστηκε στα 350◦C, με άζωτο εξαιρετικά υψηλής καθαρότητας ως αέριο κουρτίνας (7 psi). Το αέριο του νεφελοποιητή ήταν8 psi. Άλλες παράμετροι που εξαρτώνται από τη μάζα, όπως δυναμικό αποσύνδεσης (DP), είσοδοςδυναμικό (EP), δυναμικό εστίασης (FP) και ενέργεια σύγκρουσης (CE) για κάθε ένωση, ήτανπροσδιορίζεται σε θετική λειτουργία χρησιμοποιώντας τυπικά διαλύματα. Πολλαπλή παρακολούθηση αντιδράσεων(MRM) διεξήχθη χρησιμοποιώντας άζωτο ως αέριο σύγκρουσης (2 psi) και με χρόνο παραμονής200 ms για κάθε μετάβαση. Η εχινακοσίδη Α ανιχνεύθηκε παρακολουθώντας τις μεταβάσειςm/z 443.200 → 301.200, 283.200. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Analyst 1.4.2 (AppliedBiosystems, Concord, ON, Καναδάς) και GraphPad (Prism 8.0.0.).
Η ανάλυση UPLC-QTOF/MS πραγματοποιήθηκε σε σύστημα UPLC Agilent 1290 Infinity II(Agilent, Palo Alto, CA, USA), σε συνδυασμό με μια τετραπολική μάζα χρόνου πτήσης Agilent 6546φασματομετρία (Agilent, Palo Alto, CA, ΗΠΑ). Διεξήχθη χρωματογραφικός διαχωρισμόςσε ένα Phenomenex Kinetex® Στήλη C18 LC (3 mm× 100 χλστ× 1.7 µΜ). Η στήληΗ θερμοκρασία διατηρήθηκε στους 40°C◦Γ. Η κινητή φάση Α αποτελούνταν από νερό που περιείχε0.1 τοις εκατό (v/v) μυρμηκικό οξύ σε θετική λειτουργία, 0,1 τοις εκατό (v/v) μυρμηκικό οξύ και 10 mM CH3COONH4 σε αρνητική λειτουργία. Η κινητή φάση Β ήταν ακετονιτρίλιο. Χρησιμοποιήθηκε έκλουση βαθμίδωσης, ξεκινώνταςμε 5 τοις εκατό B και διατήρηση για 0,5 λεπτά, αύξηση στο 50 τοις εκατό B εντός 5,5 λεπτών, αύξηση στο 100 τοις εκατόB εντός 10 λεπτών και διατήρηση για 6 λεπτά. Συνολικός συντελεστής 400µΕφαρμόστηκε L/min και αόγκος 2µΤο L έγινε ένεση.
Η τετραπολική φασματομετρία μάζας χρόνου πτήσης Agilent 6546 ήταν εξοπλισμένη με ηλεκτρ.πηγή ιονισμού trospray (ESI). Η απόκτηση δεδομένων ήταν υπό τον έλεγχο της Mass Hunterλογισμικό σταθμού εργασίας. Οι τυπικές συνθήκες λειτουργίας της πηγής σε θετικό και αρνητικό ιόνΗ λειτουργία ESI βελτιστοποιήθηκε ως εξής: τάση ψεκασμού ιόντων (ESIσυν/ESI−) ήταν4000 V/3000 V; η θερμοκρασία του αερίου ήταν 320◦ΝΤΟ; Ο ρυθμός συνολικού αερίου ξήρανσης ήταν 8 λίτρα/λεπτό. η πίεση του νεφελοποιητή ήταν45 psi; Η θερμοκρασία του αερίου του περιβλήματος ήταν 350◦ΝΤΟ; Ο ρυθμός συμπλήρωσης αερίου περιβλήματος ήταν 12 L/min. η σύγκρουσηΗ ενέργεια ήταν 10, 20, 40 και 60 V. Οι μεταβολίτες αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας το Agilent MassHunterΛογισμικό Biotransformation (έκδοση B.04.00) (Santa Clara, CA, USA). Χρωματογραφήματακαι τα φάσματα μάζας των μητρικών και των ταυτοποιημένων μεταβολιτών εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας AgilentΛογισμικό Qualitative Analysis MassHunter (έκδοση B.05.00) (Santa Clara, CA, USA).
Ζήτα περισσότερα:
Email:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950
