Αναγνώριση και λειτουργική ανάλυση ενός Bifavone ως νέου αναστολέα των δυνητικών παθογόνων παθογόνων διεργασιών εξαρτώμενων από βανιλλοειδές 4 υποδοχέα

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comγια να μάθετε περισσότερα

Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei &Shaik O. Rahaman

Η αθηροσκλήρωση, μια προοδευτική φλεγμονώδης νόσος των μεγάλων αρτηριών, αποτελεί τον κύριο παράγοντα που συμβάλλει στην αυξανόμενη επιβάρυνση της θνησιμότητας και της νοσηρότητας που σχετίζεται με καρδιαγγειακά νοσήματα παγκοσμίως1. Το βασικό συμβάν έναρξης που οδηγεί σε αθηροσκλήρωση περιλαμβάνει τη διατήρηση τροποποιημένων σωματιδίων λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας (oxLDL) στους εσώτερους χώρους της υποενδοθηλιακής αορτής, κυρίως σε σημεία αρτηριακού κλάδου2. Κατά τη διάρκεια της πρώιμης αθηρογένεσης, μετά από ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, τα κυκλοφορούντα μονοκύτταρα του αίματος μεταναστεύουν στις περιοχές του εσωτερικού χιτώνα και διαφοροποιούνται σε μακροφάγα ιστού3. Στους αορτικούς εσωτερικούς χώρους, η δέσμευση και η πρόσληψη της oxLDL από μακροφάγους υποβοηθούμενους από υποδοχείς σαρωτής όπως SRA και CD36 δημιουργεί έναν αθηρο-φλεγμονώδη βρόχο τροφοδοσίας με αποτέλεσμα την ανάπτυξη αφρωδών κυττάρων φορτωμένων με λιπίδια, μια κρίσιμη διαδικασία στην αθηροσκλήρωση2-8. Οι καταρράκτες των φλεγμονωδών γεγονότων που προκαλούνται από αφρώδη κύτταρα οδηγούν στο σχηματισμό μιας πρώιμης λιπαρής ράβδου και τελικά στην εμφάνιση προχωρημένων βλαβών αθηροσκλήρωσης που χαρακτηρίζονται από την παρουσία ινώδους καλύμματος, ασβεστοποιημένου ιστού, ανοσοκυττάρων, πρωτεϊνών μήτρας και λιπιδίων2-10. Το βανιλλοειδές παροδικού υποδοχέα 4 (TRPV4) της υποοικογένειας TRPV, ένα μη εκλεκτικό, πολυτροπικό κανάλι κατιόντος διαπερατό στο Ca2 plus εκφράζεται πανταχού παρόν σε διάφορους τύπους κυττάρων συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων11-24. Παλαιότερα γνωστό ως οσμωτικό αισθητήρα, το TRPV4 είναι πλέον γνωστό ότι ανταποκρίνεται σε ποικίλα βιοχημικά και εμβιομηχανικά ερεθίσματα, όπως θερμότητα, ακαμψία μήτρας, ωσμωτικότητα, αυξητικούς παράγοντες, pH και 4 εστέρες φορβόλης11-24. Το TRPV4 αναφέρεται ότι μεσολαβεί σε διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες όπως αίσθηση πόνου στη φλεγμονή και νευροπάθειες18,22,23, διαφοροποίηση και μετανάστευση μυοϊνοβλαστών 17,25,26 και διαφοροποίηση οστεοκλαστών στο οστό27. Οι μεταλλάξεις του TRPV4 έχουν συσχετιστεί με αρκετές διαύλους28-31. Πρόσφατες μελέτες από την ομάδα μας και άλλους έχουν ενοχοποιήσει έναν πιθανό ρόλο αυτού του καναλιού σε μυριάδες παθολογικές καταστάσεις όπως τραυματισμοί πνεύμονα22,32, σχηματισμός αφρωδών κυττάρων14,16, ίνωση ιστών17,33, απόκριση ξένου σώματος13 και καρκίνος34,35. Προηγουμένως, είχε δειχθεί ένας αθηροπροστατευτικός ρόλος του TRPV4, στον οποίο η επαγόμενη από χημικούς αγωνιστές λειτουργία TRPV4 στα ενδοθηλιακά κύτταρα είχε αποδειχθεί ότι σχετίζεται με την ενεργοποίηση του eNOS και την αναστολή της προσκόλλησης μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα36. Αντίθετα, οι ελλείψεις στις λειτουργίες του TRPV4 έχουν συνδεθεί με πολυάριθμες αθηροφλεγμονώδεις αποκρίσεις, συμπεριλαμβανομένης της ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας, της μειωμένης δημιουργίας αφρωδών κυττάρων μακροφάγου και των αγγειακών παθήσεων14,16,37-39. Το εργαστήριό μας εντόπισε πρόσφατα έναν προαθηρογονικό ρόλο του TRPV4 με τον οποίο ρυθμίζει το σχηματισμό αφρωδών κυττάρων μακροφάγων που προκαλείται από oxLDL. Μηχανιστικά, δείξαμε ότι το TRPV4 επηρεάζει την πρόσληψη αλλά όχι τη δέσμευση της oxLDL στα μακροφάγα με τρόπο ανεξάρτητο από CD36-14. Σε άλλη μελέτη, αναφέραμε μια εξαρτώμενη από το TRPV4-παρόξυνση του σχηματισμού αφρωδών κυττάρων που προκαλείται από oxLDL παρουσία λιποπολυσακχαρίτη και αυξανόμενης ακαμψίας της μήτρας, παρέχοντας έτσι μια σύνδεση μεταξύ της μηχανοαισθητοποίησης και του κινδύνου αθηροσκλήρωσης16. Λαμβάνοντας υπόψη όλα μαζί, αυτά τα ευρήματα προτείνουν το TRPV4 ως ελκυστικό στόχο στην αθηροσκλήρωση και άλλες ασθένειες, δίνοντας έτσι κίνητρο για την ανακάλυψη μικρών μορίων αναστολέων του TRPV4 που μπορούν να μεταφραστούν σε κλινικά αποτελεσματικά θεραπευτικά μέσα. Οι χρήσεις των φυσικών ενώσεων στη θεραπευτική έχουν κερδίσει εξέχουσα θέση, κυρίως λόγω της ανάγκης για οικονομικά αποδοτικές και βιοσυμβατές ενώσεις σε σύγκριση με τα υπάρχοντα συνθετικά φάρμακα. Φυσικές ενώσεις όπωςφλαβονοειδή, αλκαλοειδή,πολυφαινόλεςκαι τα κουρκουμινοειδή, επηρεάζουν τις καρδιαγγειακές παθήσεις μέσω διαφόρων μηχανισμών, όπως η αναστολήπροφλεγμονώδηςσήματα, ευαισθητοποίηση στην ινσουλίνη και βελτίωση των λιπιδικών προφίλ του αίματος στοχεύοντας τις οδούς AMPK, COX1/2, eNOS και Nrf240–45. Πρόσφατες μελέτες από πολλαπλές ομάδες έχουν εντοπίσει δύο φλαβονοειδή, τη βερβερίνη και την απιγενίνη, ως πιθανούς ρυθμιστές της δραστηριότητας του TRPV446,47. Αναπτύξαμε και χρησιμοποιήσαμε μια μέθοδο διαλογής ημι-υψηλής απόδοσης για τον εντοπισμό πιθανών ανταγωνιστών του TRPV4 από μια βιβλιοθήκη φυσικών ενώσεων χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό εισροής Ca2 plus που βασίζεται σε Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR). Εδώ, αναφέρουμε την ταυτοποίηση και τη λειτουργική ανάλυση του Linkedin, μιας φλαβόνης, ως νέου αναστολέα των αθηρογόνων διεργασιών που εξαρτώνται από TRPV4- σε μακροφάγα, θέτοντας έτσι τα θεμέλια για περαιτέρω μελέτες αυτής της φυσικής ένωσης ως φυσικής αντιαθηροσκληρωτικής μικρής μοριακή ένωση. Το Linkedin έχει αναφερθεί ότι εμφανίζει νευροπροστατευτικό,αντικαρκινογόνο, καιαντιφλεγμονώδηρόλοι48,49. Αναφέρουμε τον μηχανισμό δράσης του Linkedin έναντι του TRPV4 στο πλαίσιο του σχηματισμού αφρωδών κυττάρων μακροφάγου χρησιμοποιώντας πολυάριθμες βιοχημικές και κυτταρικές αναλύσεις.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Υλικά και μέθοδοι Καλλιέργεια ζώων και κυττάρων

Αγοράσαμε συγγενή ποντίκια άγριου τύπου C57BL/6 (WT) από τα εργαστήρια Charles River (Wilmington, Μασαχουσέτη, ΗΠΑ). Οι οδηγίες της Επιτροπής περίθαλψης και χρήσης ζώων του Πανεπιστημίου του Μέριλαντ ακολουθήθηκαν για όλα τα πειράματα σε ζώα και οι συγγραφείς συμμορφώθηκαν με τις οδηγίες του ARRIVE. Για την απομόνωση μακροφάγων που κατοικούν σε ποντικό (MRM) που προκαλούνται από θειογλυκολικά, συλλέχθηκε περιτοναϊκή πλύση μετά από 4 ημέρες ενδοπεριτοναϊκής ένεσης θειογλυκολικού και τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) που περιείχε DMEM7,14,16. Μια κυτταρική σειρά μακροφάγου ποντικού (RAW264.7) και ανθρώπινοι δερματικοί ινοβλάστες (HDF) αγοράστηκαν από την ATCC (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν, αντίστοιχα, με DMEM ή ΜΕΜ (Gibco, Waltham, ΜΑ). Μακροφάγα που προέρχονται από μυελό των οστών ποντικού (BMDMs) συλλέχθηκαν από 6- σε ποντίκια ηλικίας 7-εβδομάδων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως14,50,51. Εν συντομία, συλλέχθηκαν μηριαία οστά από ποντίκια WT και TRPV4 KO και ο μυελός των οστών των μηριαίων οστών ξεπλύθηκε με πλήρες μέσο DMEM με 10 τοις εκατό FBS. Τα αιωρούμενα κύτταρα μυελού των οστών διηθήθηκαν μέσω φίλτρου 70 μm (BD bioscience), φυγοκεντρήθηκαν και διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM συμπληρωμένο με M-CSF (25 ng/mL) για 7-8 ημέρες στους 37 βαθμούς για να επιτραπεί η διαφοροποίηση σε μακροφάγα.

Αντιδραστήρια

Το Linkedin και το GSK1016790A (GSK101) αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ) και το κιτ ανάλυσης FLIPR Calcium 6 ελήφθη από την Molecular Device (Sunnyvale, CA). Η ανθρώπινη φυσική LDL (VLDL) αγοράστηκε από την Stemcell Technologies (Βανκούβερ, Καναδάς). Επωάσαμε την LDL με 5 μΜ CuSO4 για 12 ώρες στους 37 βαθμούς για να παρασκευάσουμε οξειδωμένη με χαλκό LDL (oxLDL) 7,14,16. Φθορίζουσα χρωστική επισημασμένη, DiI-oxLDL, αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA) και MCSF από την R&D (Minneapolis, MN). Τα αντισώματα για ανάλυση FACS ήταν: TRPV4 (Milipore; Burlington, ΜΑ), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 και TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). Τα συζευγμένα με ΡΕ δευτερογενή αντισώματα ήταν από την R&D (Minneapolis, MN) και οι μάρτυρες ισοτύπου συζευγμένα με ΡΕ ήταν από την BD (Franklin Lake, NJ). Για την ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qRT-PCR), χρησιμοποιήσαμε το κιτ RNeasy από την QIAGEN (Redwood City, CA). Όλοι οι εκκινητές αγοράστηκαν από την Bio-Rad (Hercules, CA). Μέσα κυτταρικής καλλιέργειας, προϊόντα που σχετίζονται με κυτταροκαλλιέργεια και αντιδραστήρια στυπώματος western ελήφθησαν από την Thermo Fischer Scientific (Waltham, ΜΑ).

Cistanche για κατά της κούρασης

Έλεγχος ημι-υψηλής απόδοσης

Πραγματοποιήσαμε έναν έλεγχο ημι-υψηλής απόδοσης για ανταγωνιστές του Trpv4 από μια βιβλιοθήκη 2000 φυσικών ενώσεων (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) χρησιμοποιώντας μια ανάλυση εισροής ασβεστίου που βασίζεται σε φθορομετρική συσκευή ανάγνωσης απεικόνισης (FLIPR)14,17. Προσδιορίσαμε την γκινγκετίνη (GGT), ως νέο ανταγωνιστή του TRPV4. Ο πρωτογενής και δευτερογενής έλεγχος διενεργήθηκε με RAW264.7, HDF και BMDM για να αξιολογηθεί η ικανότητα του Linkedin και άλλων υποψηφίων να αναστέλλουν το Ca2 συν εισροή14,17 που προκαλεί το TRPV{10}}. Ως μάρτυρες, χρησιμοποιήσαμε A23187, ένα ιονοφόρο ασβεστίου, TRPV4 null BMDMs και GSK219, έναν εκλεκτικό ανταγωνιστή TRPV417. Μετά τη δευτερεύουσα διαλογή, εντοπίσαμε έξι ενώσεις που έδειχναν περισσότερο από τριπλάσια αναστολή της εισροής Ca2 που προκαλείται από το TRPV4- σε σύγκριση με τον έλεγχο του φορέα. Το Linkedin αναγνωρίστηκε ως ο πιο ισχυρός αναστολέας της δραστηριότητας του TRPV4. Τα BMDMs (5×104 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε επικαλυμμένα με κολλαγόνο (10 μg/ml) 96-μαύρες πλάκες καλά διαυγούς πυθμένα και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς, 5 τοις εκατό CO2. Την ημέρα του πειράματος, τα κύτταρα φορτώθηκαν με χρωστική ασβεστίου 6 σε HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM προβενεσίδης και επωάστηκαν για 45 λεπτά στους 37 βαθμούς. Μετά την επώαση, οι ενώσεις της βιβλιοθήκης προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο σε τελική συγκέντρωση 2 μΜ. Οι πλάκες επωάστηκαν για άλλα 45 λεπτά στους 37 βαθμούς. Η εισροή Ca2 συν προκλήθηκε με την προσθήκη 10 ηΜ αγωνιστή TRPV4 GSK1016790A σε κύτταρα προεπεξεργασμένα με όχημα ή ένωση και καταγράφηκε με μέτρηση ΔF/F (Max-Min), όπως περιγράφηκε προηγουμένως17. Τα δεδομένα εμφανίζονται ως μονάδες σχετικού φθορισμού (RFU).

Ανοσοκηλίδες

Περιτοναϊκά μακροφάγα που προκλήθηκαν από θειογλυκολικό σπάρθηκαν σε 10 τοις εκατό FBS που περιείχε DMEM και επωάστηκαν όλη τη νύχτα. Τα μη προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν και 1 τοις εκατό αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) που περιέχει DMEM προστέθηκε στην πλάκα και επωάστηκε για 3 ώρες πριν από τη θεραπεία με Linkedin. Για να προσδιοριστεί η έκφραση των πρωτεϊνών CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6 και GAPDH, παρασκευάστηκαν προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων από κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όλη τη νύχτα με Linkedin (1 και 5 μΜ) ή φορέα παρουσία ή απουσία oxLDL (25 μg/ml ). Για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης των p-JNK και JNK που προκαλούνται από LPS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με Linkedin (5 και 10 μΜ) για 3 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με E. coli LPS για 30 λεπτά. Τα προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν από κύτταρα που είχαν πλυθεί δύο φορές (ψυγμένο με πάγο PBS) χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα RIPA με προσθήκη κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Thermo Scientific, ΜΑ). Οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν με αντι-TRPV4 κουνελιού (Alomone Lab, Ιερουσαλήμ, Ισραήλ), CD36 αντι-ποντικού (R&D, Minneapolis, MN), κουνελιού αντι-TLR4, κουνελιού αντι-TLR6, κουνελιού αντι-JNK και κουνελιού αντι-ρ- Πρωτεύοντα αντισώματα JNK (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ) ακολουθούμενα από δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με HRP κατά κουνελιού και αντι-ποντικού (R&D, Minneapolis, MN). Οι κηλίδες αφαιρέθηκαν και επανεξετάστηκαν με αντι-GAPDH IgG (1:2000, Santa Cruz, Dallas, ΤΧ) για έλεγχο φόρτωσης.

Σχηματισμός αφρωδών κυττάρων.MRM που ενεργοποιήθηκε από θειογλυκολικό σπάρθηκε σε γυάλινες καλυπτρίδες σε μια πλάκα 12 φρεατίων με DMEM, 10 τοις εκατό FBS και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς, 5 τοις εκατό CO2 για 2 ώρες. GGT (1 ή 10 μΜ) προστέθηκε στα κύτταρα και μετά από 3 ώρες επώασης, προστέθηκε oxLDL (50 μg/ml) και οι καλλιέργειες επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 37 βαθμούς. Φυσική LDL (50 μg/ml) προστέθηκε στα φρεάτια της ομάδας ελέγχου και επωάστηκε όλη τη νύχτα. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη και ακολούθησε χρώση Oil Red O για να ποσοτικοποιηθεί η παραγωγή αφρωδών κυττάρων.

Μεταβίβαση φορέα αδενοϊού.Συλλέξαμε κατασκευές αδενοϊού για την έκφραση Ad(RGD)-ποντικού TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml) και κενό φορέα αδενοϊού, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), από Vector Biolabs, Malvern, PA. Χρησιμοποιήσαμε 1×108 pfu/ml για όλα τα πειράματα. Για μελέτες δημιουργίας αφρωδών κυττάρων, περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού επωάστηκαν με Ade-TRPV4 ή Ade-Vec σε μέσα DMEM για 72 ώρες πριν από την προσθήκη oxLDL για τη δημιουργία αφρωδών κυττάρων μακροφάγου.

Σύνδεση και πρόσληψη ox-LDL.Για την αξιολόγηση της δέσμευσης, τα περιτοναϊκά μακροφάγα υποβλήθηκαν σε αγωγή με δύο δόσεις (1 ή 10 μΜ) Linkedin ή φορέα για 3 ώρες και επωάστηκαν με DiI-oxLDL στους 4 βαθμούς για μία ώρα. Μετά από προκατεργασία με Linkedin ή φορέα, τα κύτταρα επωάστηκαν με DiI-oxLDL στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά για να εκτιμηθεί η πρόσληψη. Οι εικόνες καταγράφηκαν με μικροσκοπία φθορισμού (63x) και η εικόνα J χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.Περιτοναϊκά μακροφάγα που προκλήθηκαν από θειογλυκολικό καλλιεργήθηκαν σε DMEM, 10 τοις εκατό FBS για 24 ώρες. Τα μη προσκολλημένα κύτταρα ξεπλύθηκαν, προστέθηκε μέσο χωρίς ορό και τα κύτταρα επωάστηκαν για 2 ώρες ακολουθούμενα από την προσθήκη 5 μΜ GGT ή φορέα και η επώαση συνεχίστηκε για 3 ώρες. Τα επεξεργασμένα κύτταρα αποξέστηκαν από την πλάκα και επαναιωρήθηκαν σε PBS, 2 τοις εκατό BSA. Τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα για 45 λεπτά και ακολούθησε επώαση 30 λεπτών με δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με ΡΕ. Για τη λήψη δεδομένων χρησιμοποιήθηκε ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCantoII (BD Bioscience, Οντάριο, Καναδάς). Όλα τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJo.

qRT-PCR.Τα μακροφάγα που προκλήθηκαν από θειογλυκολικό υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ Linkedin ή φορέα για 3 ώρες. 25 μg/ml oxLDL προστέθηκαν στο όχημα ή στα κύτταρα που υπέστησαν επεξεργασία με Linkedin και η επώαση συνεχίστηκε όλη τη νύχτα. Το RNeasy Micro Kit (#74,004) από την QIAGEN χρησιμοποιήθηκε για την εξαγωγή ολικού RNA και ένα Universal SYBR Green One-Step Kit από την Bio-Rad χρησιμοποιήθηκε για την αντιστροφή της μεταγραφής του RNA. Για τη λήψη δεδομένων χρησιμοποιήθηκε ένας θερμικός κύκλος αφής C1000 (Bio-Rad). Η έκφραση ενός γονιδίου προσδιορίστηκε ως η ποσότητα του ειδικού για το γονίδιο mRNA σε σχέση με το GAPDH mRNA χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο CT που περιγράφεται στο δελτίο χρήστη του συστήματος qRT-PCR Bio-Rad.

Στατιστική ανάλυση.Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος±SEM βιολογικών τριπλών. Χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό GraphPad Prism 7.0 και οι υπολογισμοί διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Student's t-test για δύο ομάδες ή μια μονόδρομη ANOVA για πολλές ομάδες.

Ηθική έγκριση.Όλα τα πειράματα σε ποντίκια διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Επιτροπής Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων (IACUC) και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Αναθεώρησης του Πανεπιστημίου του Maryland-College Park.

Αποτελέσματα in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>τριπλός; Π<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Σχήμα 1. Ταυτοποίηση του Linkedin ως νέου αναστολέα TRPV4 από μια βιβλιοθήκη φυσικών ενώσεων βάσει διαλογής ημι-υψηλής απόδοσης. (Α) Διάγραμμα ροής που δείχνει τη ροή εργασίας που έχει ως αποτέλεσμα την αναγνώριση της γκινγκετίνης ως δυνητικού αναστολέα TRPV4 από μια βιβλιοθήκη 2000 φυσικών ενώσεων. (Β) Αντιπροσωπευτική καταγραφή FlexStation 3 που δείχνει την ανασταλτική επίδραση 6 φυσικών ενώσεων στον αγωνιστή TRPV4 (GSK1016790A) που προκαλείται από Ca2 συν εισροή σε BMDM φορτωμένα με βαφή ασβεστίου 6 κατά τη δευτερογενή εξέταση. Η προεπεξεργασία και με τις 6 ενώσεις έδειξε ανασταλτικά αποτελέσματα στην εξαρτώμενη{15}}εισροή Ca2 plus από TRPV σε σύγκριση με κύτταρα που υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με φορέα (αρνητικός έλεγχος· όχημα συν GSK1016790A (10 nM)) ή ιονοφόρο ασβέστιο (A23187, 2 μM). Χρησιμοποιήσαμε εκλεκτικό ανταγωνιστή TRPV4, GSK2193874 (10 nM), ως αρνητικό έλεγχο. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές εις τετραπλούν. RFU: σχετική μονάδα φθορισμού.

Η αναστολή του TRPV4 από το GGT καταργεί το σχηματισμό αφρωδών κυττάρων μακροφάγου που προκαλείται από το oxLDL.Οι προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι η εισροή Ca2 συν που προκαλείται από το TRPV4- εμπλέκεται στον σχηματισμό αφρωδών κυττάρων που προκαλείται από oxLDL 14,16. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε την πιθανότητα ο σχηματισμός αφρωδών κυττάρων να αναστέλλεται από τον ανταγωνισμό της δραστηριότητας TRPV4 με τη μεσολάβηση GGT. Περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού άγριου τύπου επωάστηκαν με oxLDL για να προκληθεί σχηματισμός αφρωδών κυττάρων παρουσία ή απουσία GGT και αναλύθηκαν με χρώση Oil Red O. Όπως ήταν αναμενόμενο, διαπιστώσαμε ότι η δημιουργία αφρωδών κυττάρων αυξήθηκε κατά πενταπλάσια σε μακροφάγα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με oxLDL σε σύγκριση με τη φυσική LDL (Εικ. 2Α, Β). Ωστόσο, η επεξεργασία των μακροφάγων με GGT (1 ή 10 μΜ) πριν από τη διέγερση με oxLDL μείωσε σημαντικά το ποσοστό των αφρωδών κυττάρων (Εικ. 2Α, Β). Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν μια ανασταλτική επίδραση της GGT στον σχηματισμό αφρωδών κυττάρων μακροφάγου που πιθανώς στοχεύει την εισροή Ca2 συν το TRPV{12}}. Επιπλέον, υπερεκφράσαμε το TRPV4 σε μηδενικά μακροφάγα TRPV4 χρησιμοποιώντας κατασκεύασμα αδενοϊού και στη συνέχεια προκαλέσαμε σχηματισμό αφρωδών κυττάρων χρησιμοποιώντας oxLDL παρουσία GGT. Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του TRPV4 αύξησε τον σχηματισμό αφρωδών κυττάρων που μπλοκαρίστηκε όταν προεπεξεργαστήκαμε το κύτταρο με GGT, υποδηλώνοντας ότι η αναστολή του σχηματισμού προαθηρογονικών κυττάρων αφρού από το GGT εξαρτάται από το TRPV4 (Εικ. 2C, D).

Το GGT δεν μπλοκάρει το βασικό επίπεδο έκφρασης του TRPV4 και των φλεγμονωδών υποδοχέων.Ο υποδοχέας σαρωτής CD36 παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόσληψη και δέσμευση της oxLDL και στο σχηματισμό αφρικών κυττάρων, κρίσιμες διαδικασίες στην αθηροσκλήρωση4–7,54,55. Πρόσφατα, ένας αυξανόμενος όγκος στοιχείων υποδηλώνει τη συμμετοχή υποδοχέων που μοιάζουν με διόδια στην αθηροσκλήρωση2,4,56. Για να διερευνήσουμε εάν το GGT εμπόδισε τον σχηματισμό αφρωδών κυττάρων μέσω της επίδρασης της έκφρασης των CD36, TLR4, TLR6 και TRPV4, πραγματοποιήσαμε ανάλυση ανοσοστύπωσης σε δύο συγκεντρώσεις GGT (1 ή 5 μΜ). Βρήκαμε παρόμοια επίπεδα έκφρασης των CD36, TRPV4, TLR6 και TLR4 σε σύγκριση με τον μάρτυρα χωρίς θεραπεία (Εικ. 3A-D). Η κυτταρομετρική ανάλυση ροής δεν αποκάλυψε επίσης καμία σημαντική διαφορά στην έκφραση της κυτταρικής επιφάνειας των πρωτεϊνών με ή χωρίς επεξεργασία GGT (Εικ. 3E-H, I-L). Λαμβάνοντας υπόψη όλα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το GGT μπλοκάρει τον σχηματισμό αφρωδών κυττάρων μακροφάγου χωρίς να αναστέλλει τα βασικά επίπεδα έκφρασης της επιφάνειας των TRPV4, CD36, TLR4 και TLR6.

Σχήμα 2. Η αναστολή του TRPV4 από το Linkedin ακυρώνει τον επαγόμενο από oxLDL σχηματισμό αφρωδών κυττάρων μακροφάγου. (Α) Περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού που προκλήθηκαν από θειογλυκολικό υποβλήθηκαν σε αγωγή κατά τη διάρκεια της νύχτας με 50 μg/ml oxLDL, ακολουθούμενη από προεπώαση 3 ωρών με φορέα ή 1 ή 10 μΜ Linkedin. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μg/mL φυσικής LDL (VLDL) ως ελέγχου. Αρχική μεγέθυνση: 40x. (Β) Η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων φαίνεται στο (Α). n=500 κελιά/συνθήκη. Student's t-test; ***Π<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Πρόσληψη oxLDL, αλλά η μη δέσμευση από τα μακροφάγα καταστέλλεται από το GGT. Επειδή το TRPV4 έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι παίζει ρόλο στην πρόσληψη oxLDL και στο σχηματισμό αφρωδών κυττάρων14,16, αξιολογήσαμε εάν η θεραπεία με GGT προκάλεσε βλάβη στη δέσμευση της oxLDL στην επιφάνεια των μακροφάγων. Τα περιτοναϊκά μακροφάγα WT υποβλήθηκαν σε αγωγή με GGT πριν από την επώαση με DiI-oxLDL στους 4 βαθμούς και η δέσμευση αξιολογήθηκε. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η δέσμευση της oxLDL στην επιφάνεια των μακροφάγων δεν παρεμποδίστηκε σημαντικά από την επεξεργασία GGT (1 ή 10 μΜ) σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα (Εικ. 5A-C). Έχοντας διαπιστώσει ότι η GGT δεν αναστέλλει τη δέσμευση της oxLDL, στη συνέχεια στοχεύσαμε να προσδιορίσουμε εάν η πρόσληψη της oxLDL στα μακροφάγα επηρεάστηκε από τη θεραπεία με GGT. Είναι ενδιαφέρον ότι τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι υπήρχε σημαντική αναστολή στην πρόσληψη oxLDL σε μακροφάγους σε κύτταρα που είχαν υποστεί προεπεξεργασία GGT σε σύγκριση με την ομάδα που υποβλήθηκε σε αγωγή με όχημα (Εικ. 6Α, Β). Λαμβάνοντας υπόψη όλα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η GGT εμποδίζει την πρόσληψη της oxLDL, αλλά όχι τη δέσμευση, στα μακροφάγα.

Το GGT εμποδίζει την επαγόμενη από το oxLDL έκφραση του TRPV4 σε μακροφάγους.

Καθώς οι προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες μας έδειξαν ότι το Ca2 plus που προκαλείται από το TRPV4-διαδραματίζει ρόλο στον σχηματισμό αφρωδών κυττάρων μακροφάγου με τη μεσολάβηση oxLDL14,16, προσπαθήσαμε να προσδιορίσουμε εάν η GGT εμπόδισε το σχηματισμό αφρωδών κυττάρων μέσω καταστολής της επαγόμενης από oxLDL έκφρασης του CD36. TLR2, TLR4, TLR6 ή TRPV4. Βρήκαμε ότι η ολονύκτια διέγερση των μακροφάγων με oxLDL είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αύξηση της έκφρασης των πρωτεϊνών TRPV4 σε σύγκριση με την LDL, ενώ η έκφραση άλλων υποδοχέων (CD36, TLR2, TLR4 και TLR6) παρέμεινε αμετάβλητη (Εικ. 4A-F). Η προεπεξεργασία των κυττάρων με GGT πριν από τη διέγερση με oxLDL μείωσε επιλεκτικά το επίπεδο έκφρασης των πρωτεϊνών TRPV4 σε σύγκριση με τη θεραπεία με φορέα (Εικ. 4A–F). Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν μια ανασταλτική επίδραση της GGT στην έκφραση της πρωτεΐνης TRPV4, η οποία μπορεί εν μέρει να εμπλέκεται στην καταστολή του σχηματισμού αφρωδών κυττάρων από την GGT.

Εικόνα 3. Η θεραπεία με λινκεδίνη δεν μεταβάλλει τη συνολική πρωτεΐνη ή την επιφανειακή έκφραση των TRPV4, CD36 και TLR σε μακροφάγους. (A–D) Ανοσοκηλιδώματα προϊόντων λύσης ολόκληρων κυττάρων μακροφάγων μετά από ολονύκτια θεραπεία με 1 ή 5 μΜ Linkedin ή φορέα. Αντιπροσωπευτικά ανοσοστυπώματα δείχνουν ολική πρωτεϊνική έκφραση των CD36 (Α), TRPV4 (Β), TLR6 (C) και TLR4 (D) σε κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με Linkedin και χωρίς θεραπεία. Πραγματοποιήθηκαν τρία ανεξάρτητα βιολογικά αντίγραφα και 3 πειραματικές επαναλήψεις για κάθε σετ πειραμάτων. (E-H) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής μακροφάγων που υποβλήθηκαν σε αγωγή κατά τη διάρκεια της νύχτας με 5 μΜ Linkedin ή χωρίς θεραπεία, δείχνοντας επιφανειακή έκφραση των TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) και TLR6 (G) σε κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή και σε αγωγή με Linkedin. Αναλύθηκαν τρία ανεξάρτητα βιολογικά αντίγραφα και 30,000 κύτταρα ανά συνθήκη. (I–L) Ποσοτική ανάλυση των αποτελεσμάτων από (E–H). Αναλύθηκε με Two-tailed t-test με 99 τοις εκατό διάστημα εμπιστοσύνης. Κύτταρα μετρημένα ανά πείραμα, 30,000; δύο πειραματικές επαναλήψεις.

Το GGT αναστέλλει την προαθηρογονική ενεργοποίηση και τη φλεγμονή του JNK2 στα μακροφάγα. Δημοσιευμένες αναφορές από το εργαστήριό μας και άλλα έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση του JNK2 παίζει κρίσιμο ρόλο στον σχηματισμό αφρωδών κυττάρων και στην αθηροσκλήρωση7,57. Για να προσδιοριστεί εάν το GGT θα μπορούσε να αναστείλει την ενεργοποίηση του JNK1/2, τα μακροφάγα υποβλήθηκαν σε αγωγή με GGT ακολουθούμενη από διέγερση με LPS ή oxLDL. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση ανοσοστύπωσης έδειξαν ότι η θεραπεία με GGT κατέστειλε σημαντικά την επαγόμενη από oxLDL ή LPS φωσφορυλίωση του JNK1/2 σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο ή εγγενή μάρτυρα που υποβλήθηκε σε αγωγή με LDL (Εικ. 7A-D). Έχει αποδειχθεί ότι η ενεργοποίηση της JNK σε μακροφάγους επάγει τη μεταγραφή των προφλεγμονωδών μεσολαβητών που σχετίζονται με την αθηροσκλήρωση58-60. Για να προσδιοριστεί εάν η GGT θα μπορούσε δυνητικά να μπλοκάρει την έκφραση αυτών των προφλεγμονωδών ρυθμιστών σε μακροφάγους, τα προκατεργασμένα με GGT κύτταρα διεγέρθηκαν με oxLDL και τα επίπεδα έκφρασης mRNA των TNF, IL 6, IL12, IL1 και MCP1 ποσοτικοποιήθηκαν με ανάλυση qRT-PCR. Ανιχνεύσαμε σημαντική καθοδική ρύθμιση στα επαγόμενα από oxLDL επίπεδα έκφρασης του TNF, IL12, IL1 και MCP1 mRNA σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με GGT σε σύγκριση με μάρτυρες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα (Εικ. 7Ε-Ι). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το GGT αναστέλλει την προαθηρογόνο ενεργοποίηση JNK2 και την έκφραση του φλεγμονώδους γονιδίου σε απόκριση στη διέγερση της oxLDL σε μακροφάγα. Συζήτηση Φυσικές ενώσεις όπως τα φλαβονοειδή και οι πολυφαινόλες είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν τις καρδιαγγειακές αποκρίσεις μέσω διαφορετικών μηχανισμών, όπως η αναστολή των προφλεγμονωδών σημάτων, η ευαισθητοποίηση στην ινσουλίνη, η οξειδωτική κατάσταση και η βελτίωση του λιπιδικού προφίλ του αίματος40-45. Στο παρόν, αναφέρουμε την ταυτοποίηση και τον λειτουργικό χαρακτηρισμό της Linkedin, μιας φλαβόνης, με βάση τον έλεγχο ημι-υψηλής απόδοσης, ως νέου αναστολέα των εξαρτώμενων από TRPV{32}}προθερογονικές/φλεγμονώδεις διεργασίες σε μακροφάγα. Δείξαμε συγκεκριμένα ότι i) η γκινγκετίνη μπλοκάρει το TRPV4-μεσολαβεί την εισροή Ca2 συν στα μακροφάγα, ii) ο αποκλεισμός της λειτουργίας του TRPV4 με την γκινγκετίνη μείωσε σημαντικά τον σχηματισμό αφρωδών κυττάρων που προκαλείται από το oxLDL καταστέλλοντας την πρόσληψη oxLDL στα μακροφάγα και τους αποκλεισμούς ginkgetin) Προκαλούμενη από LPS και oxLDL φωσφορυλίωση του JNK1/2, έκφραση πρωτεϊνών TRPV4 και έκφραση φλεγμονώδους γονιδίου. Συνολικά, τα αποτελέσματα της μελέτης μας έδειξαν ότι η γκινγκετίνη αναστέλλει την προαθηρογόνο/φλεγμονώδη λειτουργία των μακροφάγων με τρόπο που εξαρτάται από το TRPV{42}}. Η αθηροσκλήρωση, μια ασθένεια της αορτής, τροφοδοτείται αρχικά από τη φλεγμονή και τη διόγκωση των μακροφάγων με oxLDL, προκαλώντας το σχηματισμό αφρωδών κυττάρων μακροφάγων, τα οποία στη συνέχεια εξελίσσονται σε σχηματισμό αθηρώματος 2-10. Δεδομένου ότι ο σχηματισμός αφρωδών κυττάρων είναι μια κρίσιμη διαδικασία στην αθηρογένεση, η κατανόηση και ο χειρισμός του σχηματισμού αφρωδών κυττάρων μπορεί να έχει θεραπευτική δυνατότητα. Τα μακροφάγα είναι γνωστό ότι εκφράζουν μια σειρά διαύλων και αντλιών ιόντων που διεισδύουν στη μεμβράνη, συμπεριλαμβανομένου του TRPV4, ενός μηχανοευαίσθητου πολυτροπικού διαύλου Ca2 συν διαπερατού ιόντος, που ενεργοποιείται τόσο από φυσικά όσο και από βιοχημικά ερεθίσματα11-24. Δημοσιευμένες μελέτες από το εργαστήριό μας και άλλους έχουν εντοπίσει το ρόλο του TRPV4 στη φλεγμονή των μακροφάγων και στο σχηματισμό αφρωδών κυττάρων που προκαλείται από oxLDL14–16,26. Το TRPV4 μπορεί έτσι να χρησιμεύσει ως βιώσιμος στόχος για την εξασθένηση των προαθηρογόνων διεργασιών.

Εικόνα 5. Το Linkedin δεν καταστέλλει τη σύνδεση DiI-oxLDL με μακροφάγα. Τα μακροφάγα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με φορέα ή Linkedin (1 ή 10 μΜ) για 3 ώρες ακολουθούμενη από επώαση με σημασμένη με DiI oxLDL (2,5 μg/mL) για 1 ώρα στους 4 βαθμούς. (Α) Αντιπροσωπευτικές μικροσκοπικές εικόνες φθορισμού (αρχική μεγέθυνση, 63×) της δέσμευσης DiI-oxLDL στην επιφάνεια της μεμβράνης των μακροφάγων (n=20 κύτταρα/κατάσταση). (Β) Τα αποτελέσματα από το πείραμα Α φαίνονται ως προφίλ γραφικής παράστασης χρησιμοποιώντας το λογισμικό NIH ImageJ. (Γ) Ποσοτική ανάλυση των αποτελεσμάτων από Α. n=20 κύτταρα/συνθήκη. στη βελτίωση της αθηροσκλήρωσης με τη μείωση των MMP-2 και MMP-9 και αύξηση των επιπέδων NO και NOS στη θωρακική αορτή του αρουραίου52. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η γκινγκετίνη μπλοκάρει το TRPV4-προκαλούσε εισροή Ca2 συν στα μακροφάγα. Μηχανιστικά, δείξαμε ότι η γκινγκετίνη εμποδίζει την πρόσληψη της oxLDL, αλλά όχι τη δέσμευση, στα μακροφάγα. Μελέτες που έγιναν in vivo και in vitro πρότειναν έναν κρίσιμο ρόλο του CD36 ως του κύριου υποδοχέα σαρωτής στην πρόσληψη της oxLDL και του σχηματισμού αφρωδών κυττάρων μακροφάγου2–7. Φάνηκε ότι τα CD36 null ποντίκια που δεν έχουν ApoE ή LDLR είναι λιγότερο επιρρεπή στην ανάπτυξη αθηροσκληρωτικών βλαβών5,6. Προηγούμενες μελέτες από την ομάδα μας εντόπισαν έναν ουσιαστικό ρόλο του καταρράκτη σηματοδότησης CD36-JNK στον σχηματισμό αφρωδών κυττάρων μακροφάγου7. Οι υποδοχείς τύπου Toll TLR2, TLR4 και TLR6 δρουν ως συνυποδοχείς αλληλεπιδρώντας με το CD36 και έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται στην αθηρογένεση2,56,63. Εξετάσαμε την πιθανότητα ότι η έλλειψη σχηματισμού αφρωδών κυττάρων που παρατηρείται σε μακροφάγα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Linkedin οφειλόταν στη μειωμένη έκφραση των πρωτεϊνών CD36, TRPV4, TLR2, TLR4 ή TLR6. Είναι ενδιαφέρον ότι η θεραπεία με Linkedin δεν μείωσε σημαντικά την έκφραση των πρωτεϊνών CD36, TLR2, TLR4 ή TLR6 σε βασικά επίπεδα ή υπό συνθήκες διεγέρσεως oxLDL. Ωστόσο, το Linkedin εμπόδισε ειδικά την επαγόμενη από το oxLDL ανοδική ρύθμιση της έκφρασης των πρωτεϊνών TRPV4, ενώ η έκφρασή του σε βασικά επίπεδα παρέμεινε αμετάβλητη. Λαμβάνοντας υπόψη όλα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η γκινγκετίνη μπλοκάρει τον σχηματισμό αφρωδών κυττάρων που προκαλείται από oxLDL μέσω ενός μηχανισμού ανεξάρτητου από την έκφραση CD36 και TLR, αλλά εξαρτώμενο από το TRPV4. Προηγούμενες μελέτες από την ομάδα μας και άλλες έδειξαν ότι η ενεργοποίηση του JNK2 εμπλέκεται στο σχηματισμό αφρωδών κυττάρων και στην ανάπτυξη αθηρωματικών αλλοιώσεων7,57. Αναφέρθηκε επίσης ότι η JNK εμπλέκεται στη διαμόρφωση των MMP{-9 και MMP-13, οι οποίες υπερεκφράζονται σε αθηροσκληρωτικές βλάβες64-68. Δεδομένης της αναγνωρισμένης σύνδεσης του JNK στις αθηρογόνες διεργασίες, θέλαμε να προσδιορίσουμε εάν η γκινγκετίνη θα μπορούσε να αναστείλει την ενεργοποίηση της JNK. Σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές, τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι η γκινγκετίνη αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της JNK2 που προκαλείται από φλεγμονώδη ερεθίσματα σε μακροφάγα. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει έναν πιθανό μηχανισμό με τον οποίο το Linkedin εμποδίζει το σχηματισμό αφρωδών κυττάρων. Επιπλέον, βρήκαμε μια σημαντική μείωση της μείωσης της επαγόμενης από oxLDL έκφραση των TNF, IL12, IL1 και MCP1 mRNA σε κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με γκινγκετίνη σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα, υπογραμμίζοντας τους πιθανούς αντιφλεγμονώδεις ρόλους της γκινγκετίνης σε απόκριση στην oxLDL. Συνοπτικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η γκινγκετίνη αναστέλλει την προαθηρογόνο και φλεγμονώδη λειτουργία των μακροφάγων με τρόπο που εξαρτάται από το TRPV4-. Αυτά τα ευρήματα ενισχύουν έτσι το σκεπτικό για τη χρήση φυσικών ενώσεων στην ανάπτυξη πιθανών θεραπευτικών ή/και χημειοπροληπτικών αντιδραστηρίων.

βιβλιογραφικές αναφορές
1. Barquera, S. et al. Παγκόσμια επισκόπηση της επιδημιολογίας της αθηροσκληρωτικής καρδιαγγειακής νόσου. Αψίδα. Med. Res. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Te cellular biology of macrophages in atherosclerosis. Cell 145, 341-355 (2011).
3. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Κυτοκίνες, μεταβολισμός λιπιδίων μακροφάγων και αφρώδη κύτταρα: επιπτώσεις για τη θεραπεία καρδιαγγειακών παθήσεων. Επαιτώ. Lipid Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, Μ. et al. Η στοχευμένη διαταραχή του υποδοχέα σαρωτής κατηγορίας Β CD36 προστατεύει από την ανάπτυξη αθηροσκληρωτικής βλάβης σε ποντίκια. J. Clin. Επενδύω. 105, 1049–1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV et al. Οι υποδοχείς σαρωτής κατηγορίας AI/II και CD36 είναι οι κύριοι υποδοχείς που είναι υπεύθυνοι για την πρόσληψη τροποποιημένης λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας που οδηγεί σε φόρτωση λιπιδίων στα μακροφάγα. J. Biol. Chem. 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO et al. Ένας καταρράκτης σηματοδότησης που εξαρτάται από το CD{1}}είναι απαραίτητος για το σχηματισμό αφρωδών κυττάρων μακροφάγου. Cell Metab. 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Αθηροσκλήρωση-μια φλεγμονώδης νόσος. N Engl J Med. 340(2), 115-126 (1999).
9. Libby P. Te μοριακοί μηχανισμοί των θρομβωτικών επιπλοκών της αθηροσκλήρωσης. J. Intern. Med. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Αθηροσκλήρωση. Nature 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD et al. Εξαιρετικά γρήγορη ενεργοποίηση των διαύλων ιόντων TRPV4 από μηχανικές δυνάμεις που εφαρμόζονται στις βήτα1 ιντεγκρίνες της κυτταρικής επιφάνειας. Ακέραιος αριθμός. Biol. (Καμπ). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-Άξονας σηματοδότησης μηχανομετατροπής TAZ σε ακαμψία μήτρας και επαγόμενη από TGF 1-επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση. Cell ΜοΙ. Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Το δυναμικό παροδικού υποδοχέα 4 βανιλλοειδές απαιτείται για την απόκριση ξένου σώματος και το σχηματισμό γιγαντιαίων κυττάρων. Είμαι. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. Το διαπερατό από ασβέστιο κανάλι TRPV4 είναι ένας νέος ρυθμιστής του σχηματισμού αφρωδών κυττάρων μακροφάγου που προκαλείται από οξειδωμένη LDL. Free Radic. Biol. Med. 110, 142–150 (2017).