Η υπεροσίδη μειώνει τη φλεγμονή στα κύτταρα HT22 μέσω της ανοδικής ρύθμισης του SIRT1 σε δραστηριότητες Wnt/ -Catenin And Sonic Hedgehog Pathways Μέρος 1

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Η νευροφλεγμονή παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση και την εξέλιξη της αλλοιωμένης νευροανάπτυξης, της νευροαισθητηριακής απώλειας ακοής και ορισμένων νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Η υπεροσίδη (κερκετίνη-3-Ο- -D-γαλακτοσίδη) είναι μια δραστική ένωση που απομονώνεται από φυτά Hypericum. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνούμε την προστατευτική επίδραση του υπεροξειδίου στη νευροφλεγμονή και τον πιθανό μοριακό μηχανισμό του. Λιποπολυσακχαρίτης (LPS) και υπεροσίδη χρησιμοποιήθηκαν για τη θεραπεία κυττάρων ΗΤ22. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Ο ρυθμός κυτταρικής απόπτωσης μετρήθηκε με δοκιμασία κυτταρομετρίας ροής. Τα επίπεδα έκφρασης mRNA της ιντερλευκίνης-1 (IL-1 ), της ιντερλευκίνης-6(IL-6), της ιντερλευκίνης-8(IL-8), και ο παράγοντας νέκρωσης όγκου- (TNF-a) προσδιορίστηκαν με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση ανάστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης. Τα επίπεδα των δεικτών οξειδωτικού στρες της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD), των δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), της καταλάσης (CAT), της γλουταθειόνης (GSH) και της μηλονοδιαλδεΰδης (MDA) μετρήθηκαν από τα κιτ. Η έκφραση του νευροτροφικού παράγοντα και η σχέση μεταξύ της υπεροσίδης, του ομόλογου ρύθμισης πληροφοριών τύπου σιωπηλού ζευγαρώματος 2-1(SIRT1) και της Wnt/ -κατενίνης και του ηχητικού σκαντζόχοιρου εξετάστηκε με στύπωμα Western. Στα κύτταρα HT22 που προκαλούνται από LPS, η υπεροσίδη προάγει την κυτταρική επιβίωση. ανακουφίζει το επίπεδο IL-1, IL-6, IL{-8, TNF-, ROS, MDA, Bax και κασπάσης-3. και αυξάνει την έκφραση των CAT, SOD, GSH, Bcl-2, BDNF, TrkB και NGF. Επιπλέον, η hvperoside ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση του SIRT1. Περαιτέρω μηχανιστική έρευνα έδειξε ότι η υπεροσίδη ανακούφισε την επαγόμενη από LPS φλεγμονή, το οξειδωτικό στρες και την απόπτωση ρυθμίζοντας προς τα πάνω το SIRTl για να ενεργοποιήσει τις οδούς Wnt/-κατενίνης και ηχητικού hedgehog. Συνολικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η υπεροσίδη δρα ως προστατευτικός στη νευροφλεγμονή.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

1. Εισαγωγή

Η νευροφλεγμονή είναι μια χρόνια φλεγμονή του εγκεφαλικού ιστού, η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση και την εξέλιξη της αλλοιωμένης νευροανάπτυξης, της νευροαισθητηριακής απώλειας ακοής και ορισμένων νευροεκφυλιστικών ασθενειών[1-5]. Στα πρώιμα στάδια της κεντρικής ακουστικής οδού, η απώλεια ακοής που προκαλείται από το θόρυβο και η απώλεια ακοής με αγώγιμο σχετίζονται με τη νευροφλεγμονή [6]. Επιπλέον, η νευροφλεγμονή συμβάλλει στον νευρωνικό θάνατο και τη νευρολογική επιδείνωση αυξάνοντας την παραγωγή προφλεγμονωδών παραγόντων και οξειδωτικού στρες[7]. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι οι νευρώνες του ιππόκαμπου είναι ευαίσθητοι σε νευροφλεγμονώδεις και προκαλούν νευρολογικές επιπλοκές [8]. Ωστόσο, δεν υπάρχουν ακόμη αποτελεσματικοί παράγοντες ή μέθοδοι για την αποκατάσταση και την πρόληψη νευρωνικής βλάβης που προκαλείται από νευροφλεγμονή. Έτσι, η αναγνώριση αποτελεσματικών φλεγμονωδών προστατευτικών υποψήφιων παραγόντων είναι ζωτικής σημασίας.

Η υπεροσίδη (κερκετίνη3-Ο- -D-γαλακτοσίδη) είναι μια δραστική ένωση που απομονώνεται από φυτά Hypericum. Έχει αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση, μειώνοντας την υπερφόρτωση ασβεστίου και αναστέλλοντας την απόπτωση [9, 10]. Προηγούμενες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι η υπεροσίδη προλαμβάνει αποτελεσματικά τις νευρολογικές επιπλοκές που προκαλούνται από τη νευροφλεγμονή. Στο μοντέλο οξειδωτικού στρες και φλεγμονής που προκαλείται από υπεργλυκαιμία οξέος διαβήτη, η χορήγηση υπεροσίδης απέτρεψε τη γνωστική δυσλειτουργία, τη νευροφλεγμονή και το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από ΣΔ μέσω της οδού σηματοδότησης TNF-/NF-Bx/κασπάση-3 [11]. Σε ασθένειες όπως η νόσος του Πάρκινσον, η υπεροσίδη δρα ως προστατευτικός παράγοντας εξασθενώντας την επαγόμενη από το LPS ενεργοποίηση της μικρογλοίας [12]. Μέχρι στιγμής, υπάρχουν λίγες μελέτες σχετικά με την προστατευτική δράση της υπεροσίδης στη νευροφλεγμονή και ο μηχανισμός δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως.

Ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS) χρησιμοποιείται ευρέως για την ενεργοποίηση του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το LPS χρησιμοποιείται συνήθως για την προετοιμασία μοντέλων νευροφλεγμονής που προκαλούνται από φλεγμονώδεις αποκρίσεις [13,14]. Σε αυτή τη μελέτη, εκθέσαμε κύτταρα HT22 σε LPS για να μιμηθούν ένα κυτταρικό μοντέλο νευροφλεγμονής. Ταυτόχρονα, μέσω αυτού του μοντέλου μελετήθηκε η προστατευτική επίδραση της υπεροσίδης στη νευροφλεγμονή και ο πιθανός μοριακός μηχανισμός της. Βρήκαμε ότι η υπεροσίδη προστατεύει τα κύτταρα HT22 από φλεγμονή που προκαλείται από LPS. Το οξειδωτικό στρες και η απόπτωση σχετίζονται στενά με τα επίπεδα SIRT1. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι η υπεροσίδη ανακούφισε τη φλεγμονή που προκαλείται από LPS, το οξειδωτικό στρες και την απόπτωση ρυθμίζοντας προς τα πάνω το SIRT1 για να ενεργοποιήσει τις οδούς Wnt/-κατενίνης και ηχητικού hedgehog.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Αντιδραστήρια και φάρμακα. LPS, υπεροσίδη και 3-(4,5- βρωμιούχο διμεθυλ-2-θειαζολύλιο)-2,5-διφαινυλτετραζόλιο

(MTT) αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Το τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco που περιέχει 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) αγοράστηκε από την Gibco (Carls-bad, ΗΠΑ). 100 U/ml πενικιλλίνη και 100 mg/ml στρεπτομυκίνη αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Το LiCl και ο sonic hedgehog αγωνιστής SAg αγοράστηκαν από τη Merck (San Diego, CA, USA). Πρωτογενή αντισώματα κατά Bcl-2, Bax, κασπάσης-3, BDNF, NGF, SIRT1, Wnt1, -κατενίνης, Shh, Patch και GAPDH και δευτερογενή αντισώματα αγοράστηκαν όλα από την Cell Signaling (Βοστώνη, MA, ΗΠΑ). 2.2. Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπείες. Η νευρωνική κυτταρική σειρά ποντικού HT22 αγοράστηκε από την Kunming Cell Bank της Chi-nese Academy of Sciences (Kunming, Κίνα). Τα κύτταρα HT22 σπάρθηκαν σε 2×104 κύτταρα/φρεάτιο σε ένα τρυβλίο 6-φρεάτιου και καλλιεργήθηκαν στο DMEM με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 U/ml πενικιλλίνη και 100 μg/ml στρεπτομυκίνη στους 37 C σε 5 τοις εκατό CO, υγροποιημένο εκκολαπτήριο. Όταν το HT22 έφτασε στο 70 τοις εκατό συρροή μετά από 24 ώρες, πραγματοποιήθηκε μορφομετατροπή κυττάρων που υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις υπεροσίδης και LPS (1 μg/ml).

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει την ανοσία

2.3. Βιωσιμότητα κυττάρων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ.

Εν συντομία, τα κύτταρα HT22 σπάρθηκαν σε τρυβλία 24-πηγαδιών σε πυκνότητα 2x104 κύτταρα/ml για 24 ώρες. Τα κύτταρα έμειναν ασιτισμένα όλη τη νύχτα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις υπεροσίδης για 24 ώρες ακολουθούμενη από επώαση με LPS (1 μg/ml) για άλλες 24 ώρες. Το μέσο ανανεώθηκε και επωάστηκε με 50 μΐ ΜΤΤ (5 mg/ml που παρασκευάστηκε σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά) για 4 ώρες στους 37 C. Στη συνέχεια, το διάλυμα απομακρύνθηκε και προστέθηκε DMSO στις πλάκες. Η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλακών.

2.4.Western Blotting.

Ρυθμιστικό διάλυμα RIPA προστέθηκε σε κύτταρα ΗΤ22 (Invitrogen, USA) για τη συλλογή της συνολικής πρωτεΐνης. Στη συνέχεια οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν και αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο BCA (Invitrogen, USA).

Τα δείγματα πρωτεΐνης αναμίχθηκαν με ένα ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης 5 φορές και μετουσιώθηκαν στο σημείο βρασμού. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με 15 τοις εκατό SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες φθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτογενή αντισώματα (Bcl-2, Bax, κασπάση-3, BDNF, NGF, SIRT1, Wntl, -κατενίνη, Shh, Patch και GAPDH) σε 4 Covernight. Στη συνέχεια, την επόμενη μέρα, οι μεμβράνες πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα για 1 ώρα. Τέλος, οι ζώνες πρωτεΐνης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

2.5.qRT-PCR. Ολικό RNA των κυττάρων HT22 απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ εξαγωγής RNA TRIZol (Invitrogen, Grand Island, NY, ΗΠΑ) και το απομονωμένο ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ ανάστροφης μεταγραφής (Takara, Kyoto, Ιαπωνία). Το SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Kyoto, Japan) χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση της ενίσχυσης qRT-PCR. Οι εκκινητές ενίσχυσης IL-1, I-6 και TNF ήταν οι εξής: IL-1 ,5'-GATGGTCGCATTAGCTCC-3'και 5'-GGCTGTAGCTGTAGCGTC{{15} }';IL-6,5'-ATTG CGGCGGCTGACGCGTAG-3'και 5'-GTCTGTTGCGC GAGCTGGTA-3';IL-8,5'-GTCGAGCTGCCGCGTAGCG T{26} }'και 5'-CGCGATGCGTGCAGC-3'; και TNF-a,5'-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3'και5'-CGGACTCCG CAAAGTCTAAG-3'. Η σχετική έκφραση του mRNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-Act.

2.6. Προσδιορισμός SOD, GSH και MDA. Μετρήσαμε τη δραστηριότητα των επιπέδων ειδών οξυγόνου (ROS), καταλάσης (CAT), δισμουτάσης υπεροξειδίου (SOD), γλουταθειόνης (GSH) και μηλονοδιαλδεΰδης (MDA) χρησιμοποιώντας τα αντίστοιχα κιτ ανάλυσης (Nanjing Jian-cheng Bio Company, Κίνα).

2.7.Κυτταρομετρία ροής.

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του ρυθμού απόπτωσης των κυττάρων σύμφωνα με προηγούμενη αναφορά [15]. Τα κύτταρα ΗΤ22 σε κάθε ομάδα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν. Τα αποπτωτικά κύτταρα επισημάνθηκαν διπλά με αννεξίνη V-FITC και ΡΙ χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης απόπτωσης αννεξίνης V-FITC/PI (Beyotime Biotechnology, Κίνα) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, η ένταση φθορισμού των κυττάρων προσδιορίστηκε ποσοτικά με κυτταρομετρία ροής.

2.8. Στατιστική ανάλυση.

Σε αυτή τη μελέτη, η διαφορά μεταξύ δύο ομάδων συγκρίθηκε με τη χρήση t-test, και αυτή μεταξύ των ομάδων αναλύθηκε με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσες τιμές±

Εικόνα 1: Η υπεροσίδη ανακούφισε την απόπτωση και τη φλεγμονή στα κύτταρα HT22 που προκαλούνται από LPS. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ΗΤ22 μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων παρατηρήθηκε με μικροσκόπιο (100x)(a, b). Η έκφραση των Bcl-2, Bax και κασπάσης-3 σε κύτταρα HT22 μετρήθηκε με στύπωμα western(c). Ο ρυθμός απόπτωσης κυττάρων HT22 μετρήθηκε με δοκιμασία κυτταρομετρίας ροής (d). Τα επίπεδα IL-1 ,IL-6. Το IL-8 και το TNF-mRNA σε κύτταρα HT22 μετρήθηκαν με art-PCR(e);* θεωρήθηκε σημαντικό σε σύγκριση με τον έλεγχο (*Ρ<0.05);# was="" considered="" significant="" compared="" to="" lps="" ("p=""><>

Αυτό το άρθρο εξάγεται από Hindawi Neural Plasticity Volume 2021, Article ID 8706400, 10 σελίδες https://doi.org/10.1155/2021/8706400