Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Βελτίωση της παραγωγής φαινυλαιθανοειδών γλυκοσιδών από μυκητιακό διεγέρτη σε καλλιέργεια κυτταρικού εναιωρήματος Cistanche deserticola

Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-guo Mei²

Λέξεις-κλειδιά Cistanche deserticola, διεγέρτης μυκήτων,φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο, καλλιέργεια φυτικών κυττάρων

Αφηρημένη
Όταν, τη 15η ημέρα της ανάπτυξης, ένας προκλητής απόFusarium solaniπροστέθηκε στα 40 mg l^-1 προς τηνCistanche deserticolaκαλλιέργειες κυτταρικού εναιωρήματος, τα περιεχόμενα εχινακοσίδης, ακτεοσίδης και ολικήςφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες(PeGs) στα καλλιεργημένα κύτταρα όλα αυξήθηκαν τις επόμενες 27 ημέρες κατά περισσότερο από 100 τοις εκατό σε 15 mg g^-1ξηρό βάρος, 9 mg g-1 ξηρό βάρος και 57 mg g^-1 ξηρό wt, αντίστοιχα. Η τελική βιομάζα (1,3 mg ξηρού wt ml^-1) δεν επηρεάστηκε.

Cistanche deserticola

Εισαγωγή

Cistanche deserticolaΜαμά. (Orobanchaceae), ένα εγγενές βότανο της Κίνας χρησιμοποιείται ευρέως στην παραδοσιακή ιατρική για διάφορες θεραπείες, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης ως ηρεμιστικό ή ως ενισχυτικό της ανοσολογικής απόκρισης (Hsu et al. 1995, Chang et al. 1995).Φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες(PeGs) είναι οι κύριοι βιοενεργοί μεταβολίτες σεCistanche deserticola(Xiong et al. 2000) και αποτελούνται από πολλά συστατικά όπως εχινακοσίδη, ακτεοσίδη, σισακτεοσίδη, ισοακτεοσίδη, 2-ακετυλακτεοσίδη, κιστανοσίδη Α και οσμανθουσίδη Β (Wang et al. 2000). Με την αυξανόμενη ζήτηση για αυτά τα προϊόντα και τη ραγδαία μείωση τουCistanche deserticolaφυτά, η κυτταρική καλλιέργεια θα ήταν ένα ελκυστικό εναλλακτικό μέσο παραγωγής. Πολλοί διεγέρτες (ιδιαίτερα διεγέρτες μυκήτων) μπορούν να ενισχύσουν την παραγωγή μεταβολιτών σε καλλιέργεια φυτικών κυττάρων (Wang et al. 2001). Οι Li et al. (1998) βρήκε ότι ένας μυκητιασικός παράγοντας του Fusarium solani που απομονώθηκε από ριζικά συστήματα και των δύοCistanche deserticolaκαι ο ξενιστής του, το Halaxylon ammodendron, θα μπορούσε να βελτιώσει την περιεκτικότητα σε αμινοξέα στους κάλουςCistanche deserticolaΑλλά οι αλλαγές της περιεκτικότητας των PeGs σε αυτή τη γραμμή κάλων δεν αναφέρθηκαν στη μελέτη τους. Σε αυτό το άρθρο, μελετήθηκαν οι επιδράσεις ενός διεγέρτη από το F. solani στη βιοσύνθεση των ολικών PeG και δύο κύριων βιοδραστικών PeG (εχινακοσίδη και ακτεοσίδη) και στις αλλαγές της κυτταρικής ανάπτυξης στην καλλιέργεια εναιωρήματοςCistanche deserticola.

Υλικά και μέθοδοι

Καλλιέργειες φυτικών κυττάρων
Ο κάλος προκλήθηκε από κλίμακες τουCistanche deserticolaκαι διατηρήθηκε σε μέσο Gamborg's B5 (1968) συμπληρωμένο με 0.5 mg ινδόλη-3-οξικό οξύ l^-1, 2 mg κινετίνης l^-1,και 1 g υδρόλυσης καζεΐνης l^-1. Το ρΗ ρυθμίστηκε στο 6 πριν από την αποστείρωση. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε αναδευόμενες φιάλες των 250 ml, καθεμία από τις οποίες περιείχε 100 ml μέσου σε περιστροφικό αναδευτήρα (120 rpm και 25 μοίρες) κάτω από το σκοτάδι. Το εμβόλιο ήταν περίπου 100 g φρέσκου wt l^-1.

αποτελεσματικό περιεχόμενο cistanche deserticola--φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο

Παρασκευή μυκητιασικού διεγέρτη

Ο διαχωρισμός του στελέχους του μύκητα, του Fusarium solani και η παρασκευή του διεγέρτη μυκήτων πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Li et al. 1998, Yu et al. 2001). Διάφορες ποσότητες (ισοδύναμα υδατάνθρακα) διεγέρτη μυκήτων προστέθηκαν στις καλλιέργειες της φιάλης ανακίνησης την 15η ημέρα (η συνολική περίοδος καλλιέργειας ήταν 42 ημέρες).

Δοκιμασία συσσώρευσης βιομάζας και βιωσιμότητας
Τα κύτταρα από μια φιάλη ανακίνησης πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό και λυοφιλοποιήθηκαν σε σταθερό βάρος. Το ξηρό βάρος προσδιορίστηκε έτσι. Η κυτταρική βιωσιμότητα (ποσοστό βιώσιμων κυττάρων σε έναν κυτταρικό πληθυσμό) προσδιορίστηκε με την αναγωγή του χλωριούχου 2,3,5-τριφαινυλτετραζολίου (Towill & Mazur 1975).

φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιοτουcistanche deserticola

Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε εχινακοσίδη, ακτεοσίδη και ολικήφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες(PeGs)
Η εκχύλιση των PeG πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Du & Liu (1993). λυοφιλοποιημένοCistanche deserticolaΤα κύτταρα εκχυλίστηκαν με 70 τοις εκατό (ο/ο) αιθανόλη. Το κλάσμα αιθανόλης συμπυκνώθηκε, απολιπάνθηκε με κεκορεσμένο με νερό οξικό αιθυλεστέρα και στη συνέχεια εκπλύθηκε με κορεσμένη με νερό η-βουτανόλη. Το κλάσμα η-βουτανόλης συμπυκνώθηκε, διαλύθηκε σε νερό, φορτώθηκε σε στήλη ρητίνης μακροπόρων (ΑΒ-8, χημικό προϊόν του Πανεπιστημίου Nankai, Tianjin, Κίνα) και εκλούστηκε με νερό και μεθανόλη, διαδοχικά. Το κλάσμα μεθανόλης συλλέχθηκε και η συνολική περιεκτικότητα σε PeGs προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας εχινακοσίδη ως πρότυπο στα 334 nm. Η εχινακοσίδη και η ακτεοσίδη προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη στήλη Nova Pak C18 (250 χ 4,6 mm) σε σύστημα HPLC (νερά) με ανιχνευτή UV (334 nm).

Αποτελέσματα

Επίδραση του διεγέρτη μυκήτων στη συσσώρευση βιομάζας και στη συνολική βιοσύνθεση των PeGs. Επιδράσεις του διεγέρτη μυκήτων στην κυτταρική βιομάζα και τη συνολική συσσώρευση PeG εξαρτήθηκαν από τη δόση που προστέθηκε (ισοδύναμα υδατανθράκων). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, χαμηλότερες δόσεις διεγέρτη ήταν ευνοϊκές για το ξηρό βάρος τουCistanche deserticolaκύτταρα. Η κορυφή ήταν με τον διεγέρτη στα 20 mg l^-1(δίνοντας 1,76 mg ξηρού wt ml^-1).
Η συνολική συσσώρευση PeGs ενισχύθηκε σημαντικά από τον διεγέρτη μυκήτων μεταξύ 20 mg l^-1και 80 mg l^-1. Ο διεγέρτης στα 40 mg l-1 έλαβε την υψηλότερη απόδοση (57 mg g^-1), το οποίο ήταν υπερδιπλάσιο από αυτό που λήφθηκε στην καλλιέργεια μάρτυρα μη διεγέρτη. Το περαιτέρω πείραμα χρησιμοποίησε τον διεγέρτη μυκήτων στα 40 mg1^-1.

Εικ. 1. Βάρος ξηρού κυττάρου και συνολική συσσώρευση PeGs σε κυτταρική καλλιέργεια εναιωρήματοςCistanche deserticolaσε απόκριση σε διάφορες δόσεις μυκητιασικού διεγέρτη. Ένας διεγέρτης μυκήτων προστέθηκε στο μέσο την 15η ημέρα. Τα δείγματα ελήφθησαν μετά από άλλες 27 ημέρες. ▲, Τελικό ξηρό βάρος κυττάρων. ◆, το συνολικό περιεχόμενο του PeG. Οι τιμές είναι μέσοι τριπλών αποτελεσμάτων και οι γραμμές σφαλμάτων αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις.

Χρονική πορεία κυτταρικής ανάπτυξης και βιοσύνθεσης PeGs
Το Σχήμα 2 δείχνει τη χρονική πορεία της κυτταρικής βιωσιμότητας και της βιοσύνθεσης των PeGs (εχινακοσίδη και ακτεοσίδη) των κυττάρων σε εναιώρημα αφού οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε 40 mg l^-1μυκητίαση το 15ο δ. Στις επόμενες 27 ημέρες καλλιέργειας, η εχινακοσίδη και η ακτεοσίδη, τα δύο κύρια βιοδραστικά PeGs σεCistanche deserticola, και τα δύο αυξήθηκαν σημαντικά. Την 39η ημέρα επιτεύχθηκαν και οι δύο μέγιστες συσσωρεύσεις, φτάνοντας τα 14,7 mg g^-1ξηρό βάρος και 8,9 mg g^-1 ξηρό wt, αντίστοιχα. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στη βιωσιμότητα των κυττάρων μεταξύ των καλλιεργειών που υποβλήθηκαν σε αγωγή με διεγέρτη και του ελέγχου.

Εικ. 2. Κυτταρική βιωσιμότητα και βιοσύνθεση εχινακοσίδης και ακτεοσίδης σε κυτταρική καλλιέργεια εναιωρήματοςCistanche deserticolaμετά τη θεραπεία κατά 40 mg l^-1μυκητιασικός διεγέρτης. Μυκητιακός διεγέρτης προστέθηκε στο μέσο την 15η ημέρα. ◇, εχινακοσίδη-έλεγχος; ●, αγωγή με ακτεοσίδη με διεγέρτη·○,

ακτεοσίδη-έλεγχος; ▲, κυτταρική βιωσιμότητα-κατεργασία με διεγέρτη·△, κυτταρική βιωσιμότητα-έλεγχος. Οι τιμές είναι μέσοι τριπλών αποτελεσμάτων και οι γραμμές σφαλμάτων αντιπροσωπεύουν τυπικές αποκλίσεις.

Συζήτηση

Πολλά συστατικά που προέρχονται από μύκητες (θραύσματα κυτταρικού τοιχώματος, πολυσακχαρίτες, ολιγοσακχαρίτες, γλυκοπρωτεΐνες, κ.λπ.) έχουν χρησιμοποιηθεί ως διάφοροι διεγέρτες μυκήτων στη δευτερογενή παραγωγή μεταβολιτών με πολλά είδη φυτικών κυττάρων. Στην παρούσα εργασία, το ομογενοποίημα (που αποτελείται κυρίως από πολυσακχαρίτες) από το στέλεχος μύκητα Fusarium solani που απομονώθηκε από ριζικά συστήματαCistanche deserticolaκαι το Halaxylon ammodendron αποδείχθηκε ότι είναι αποτελεσματικός διεγέρτης για τη βιοσύνθεση των PeGs στην κυτταρική καλλιέργειαCistanche deserticola. Η χρήση αυτού του διεγέρτη για τη διέγερση της σύνθεσης των PeGs στα κύτταρα δεν ήταν μόνο σημαντική αλλά παρουσιάστηκε αμέσως μετά την πρόκληση. Αυτό το συμπέρασμα συμφωνούσε με ορισμένες προηγούμενες μελέτες για την καλλιέργεια φυτικών κυττάρων (Wang et al. 2001).

Στην προηγούμενη μελέτη των Li et al. (1998), όταν ένας διεγέρτης μυκήτων από το F. solani προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας, προκλήθηκε κάλος από τους σπόρους τουCistanche deserticolaθα μπορούσε να παραμείνει ζωντανή στην επακόλουθη μακροπρόθεσμη υποκαλλιέργεια και η παραγωγή ιριδοειδών θα μπορούσε να ενισχυθεί. Έδειξε ότι τα καλλιεργημένα κύτταρα μπορούσαν να συνθέσουν δευτερογενείς μεταβολίτες ανθεκτικότητας σε ασθένειες όταν προσβληθούν από μικροοργανισμούς. Αν και τα ιριδοειδή δεν προσδιορίστηκαν στο πείραμά μας, δείξαμε ότι οι πολυσακχαρίτες από το F. solani θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως αποτελεσματικοί διεγέρτες μυκήτων στην παραγωγή PeGs μεCistanche deserticolaκύτταρα.

αποτελεσματικό περιεχόμενο cistanche deserticola--φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο

Από: ' Βελτίωση τουφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδεςπαραγωγή από έναν διεγέρτη μυκήτων σε καλλιέργεια κυτταρικού εναιωρήματοςCistanche deserticolaτου Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-Guo Mei²

----Biotechnology Letters 25: 1437–1439, 2003. © 2003 Kluwer Academic Publishers. Τυπώθηκε στην Ολλανδία.

βιβλιογραφικές αναφορές

Chang Y, Wu H, Wang SN, Cheng HC (1995) Μελέτη των ισχυρών επιπτώσεων τουCistanche deserticolaMa., Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. και Cistanche tubulosa (Schenk) R Wight. China J. Chin. Μητήρ. Med. 26: 143–146.
Du NS, Liu JL (1993) Determination ofφαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδεςσεCistanche deserticolaμε φασματοφωτομετρία μακροφυσαλιδικής ρητίνης. Nat. Κέντρο. Res. Αναπτύσσω. 5: 30–33.

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Απαιτήσεις θρεπτικών στοιχείων αιωρηματικών καλλιεργειών κυττάρων ρίζας σόγιας. Exp. Cell Res. 50: 151–158.

Hsu WH, Chu SH, Sheng LC, Yuan KW, Mao CN (1995) Μελέτη των χημικών συστατικών και των φαρμακολογικών επιδράσεων τουCistanche deserticolaΜαμά. και Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. Πηγούνι. Παράδοση. Βότανο. Drugs 26: 143–146.

Li S, Wu X, Dong XC, Zheng X, Zheng JH, Lou ZC (1998) Effect of elicitor of Fusarium solani on the amino acid contents ofCistanche deserticolaκάλος. China J. Northwest Pharm. 13: 247–248.
Towill LE, Mazur P (1975) Μελέτες της αναγωγής του χλωριούχου 2,3,5-τριφαινυλτραζολίου ως δοκιμασία βιωσιμότητας για καλλιέργειες φυτικού ιστού. Μπορώ. J. Bot. 53: 1097–1102.
Wang CG, Wu JY, Mei XG (2001) Ενίσχυση της παραγωγής και της απέκκρισης ταξόλης σε κυτταρική καλλιέργεια Taxus Chinensis με δημιουργία μυκήτων και ανανέωση του μέσου. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55: 404–410.
Wang YM, Zhang SJ, Luo GA, Hu YN, Hu JP, Liu L, Zhu Y, Wang HJ (2000) Analysis ofφαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιοστο εκχύλισμα βοτάνων Cistanchis της LC/ESI- MS/MS. Acta Pharm. Αμαρτία. 35: 839–842.
Xiong QB, Yasuhiro Tezukay, Takuji Kaneko, Li HY, Le Quan Tran, Koji Hase, Tsuneo Namba, Shigetoshi Kadota (2000) Αναστολή του μονοξειδίου του αζώτου από φαινυλαιθανοειδή σε ενεργοποιημένα μακροφάγα. Ευρώ. J. Pharm. 400: 137–144.
Yu LJ, Lan WZ, Qin WM, Xu HB (2001) Επιδράσεις του σαλικυλικού οξέος στην υπεροξείδωση μεμβράνης-λιπιδίου που προκαλείται από μύκητες και παραγωγή ταξόλης σε καλλιέργειες κυτταρικού εναιωρήματος του Taxus Chinensis. Proc. Biochem. 37: 477–482.