Πώς ο πολυσακχαρίτης Cistanche μειώνει τη μελανογένεση και μειώνει το οξειδωτικό στρες;

Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε με:Joanna.jia@wecistanche.com

Ο πολυσακχαρίτης Cistanche deserticola προκαλεί μελανογένεση στα μελανοκύτταρα και μειώνει το οξειδωτικό στρες

1 Τμήμα Δερματολογίας, Τρίτο Νοσοκομείο Xiangya, Central South University, Changsha, Κίνα

2 Τμήμα Ουρολογίας, Τρίτο Νοσοκομείο Xiangya, Central South University, Changsha, Κίνα

Πειραματικό Κέντρο 3Medicine, Τρίτο Νοσοκομείο Xiangya, Central South University, Changsha, Κίνα

Cistanchedeserticolaέχει πολλά αποτελέσματα, κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Αφηρημένη: Ως το κύριο μέρος των διαταραχών της μελάγχρωσης, οι ασθένειες αποχρωματισμού του δέρματος όπως η λεύκη και ο αχρωματικός σπίλος είναι πολύ συχνές και τραβούν τώρα περισσότερη προσοχή. Η παθογένεση της αποχρωματισμού περιλαμβάνει δυσλειτουργία και απώλεια μελανοκυττάρων, που πιθανώς προκαλούνται από κληρονομικότητα, αυτοάνοση και οξειδωτικό στρες. Ανάμεσα τους,οξειδωτικό στρεςπαίζει βασικό ρόλο. Ωστόσο, λίγες κλινικές θεραπείες μπορούν να αντιμετωπίσουν το οξειδωτικό στρες. Όπως αναφέρθηκε,Cistanchedeserticola πολυσακχαρίτης(CDP) είναι ένα αποτελεσματικό αντιοξειδωτικό. Με βάση αυτό, αξιολογήσαμε τον ρόλο του στα μελανοκύτταρα και αποκαλύψαμε περαιτέρω τους μηχανισμούς. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το CDP θα μπορούσε να προάγει τη μελανογένεση σε ανθρώπινα επιδερμικά μελανοκύτταρα (HEMs) και κύτταρα μελανώματος ποντικού B16F10, ενώ προκάλεσε επίσης μελάγχρωση σε ζέβρα. Επιπλέον, το CDP θα μπορούσε να ενεργοποιήσει το μονοπάτι σήματος της ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάσης (MAPK) και στη συνέχεια να ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία (MITF) και τα κατάντη γονίδια TYR, TRP1, TRP2 και RAB27A. Διαφορετικά, διαπιστώσαμε ότι το CDP θα μπορούσε να μειώσει την επαγόμενη από H2O2-κυτταροτοξικότητα και την απόπτωση στα μελανοκύτταρα. Περαιτέρω στοιχεία αποκάλυψαν ότι το CDP θα μπορούσε να ενισχύσει την αντιοξειδωτική οδό NRF2/HO{11}} και να καθαρίσει τα ενδοκυτταρικά ROS. Συνοπτικά, το CDP μπορεί να προάγει τη μελανογένεση και να αποτρέψει τα μελανοκύτταρα από τραυματισμό από οξειδωτικό στρες, υποδηλώνοντας ότι το CDP βοηθά στη διατήρηση της φυσιολογικής κατάστασης των μελανοκυττάρων. Έτσι, το CDP μπορεί να είναι ένα νέο φάρμακο για τη θεραπεία ασθενειών αποχρωματισμού.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ:

Cistanche deserticola πολυσακχαρίτης, νόσος αποχρωματισμού, μελανοκύτταρα, μελανογένεση, NRF2,οξειδωτικό στρες

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Οι ασθένειες αποχρωματισμού του δέρματος, όπως η λεύκη και ο αχρωματικός αφίς, χαρακτηρίζονται από αποσπασματική ή εκτεταμένη αποχρωματισμό του δέρματος.1 Αν και οι δερματικές βλάβες σπάνια προκαλούν σοβαρό σωματικό τραυματισμό, επηρεάζουν την εμφάνιση του ασθενούς και δημιουργούν σοβαρή ψυχολογική επιβάρυνση, ακόμη και διαταραχές ψυχικής υγείας.2 Οι κύριες παθολογικές αλλαγές στην αποχρωματισμό περιλαμβάνουν δυσλειτουργία και απώλεια μελανοκυττάρων, η οποία επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό τη σύνθεση και τη μεταφορά της μελανίνης3, οδηγώντας έτσι σε ανεπαρκή συσσώρευση μελανίνης στο δέρμα.

Οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην αποχρωματισμό είναι προς το παρόν άγνωστοι, αλλά μελέτες έχουν εντοπίσει ορισμένους σχετικούς παράγοντες. Αφενός, η λειτουργία των μελανοκυττάρων εξαρτάται εν μέρει από τον παράγοντα μεταγραφής που σχετίζεται με τη μικροφθαλμία (MITF), ο οποίος είναι ευρέως γνωστός για την προώθηση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με τη μελανογένεση, συμπεριλαμβανομένης της τυροσινάσης (TYR), της πρωτεΐνης 1 που σχετίζεται με τυροσινάση (TRP1), της σχετιζόμενης με την τυροσινάση πρωτεΐνη 2 (TRP2), σχετιζόμενη με ras πρωτεΐνη Rab-27a (RAB27A) και πρωτεΐνη δέσμης ακτίνης fascin 1 (FSCN1).4 Μεταξύ αυτών των γονιδίων, το TYR παίζει βασικό ρόλο στη σύνθεση μελανίνης μέσω της οξείδωσης της l-dopa σε ντοπακινόνη.5 Από την άλλη πλευρά, οι μελέτες προτείνουν έναν συνδυασμό πολλών παραγόντων που μπορεί να ευθύνονται για την απώλεια μελανοκυττάρων, συμπεριλαμβανομένης της κληρονομικότητας, του περιβάλλοντος, της αυτοανοσίας και του οξειδωτικού στρες.6-9 Μεταξύ αυτών των παραγόντων, το οξειδωτικό στρες θεωρείται ο πιο σημαντικός .

Οι μηχανισμοί τωνοξειδωτικό στρεςπου προκαλούν αποχρωματισμό έχουν αποκαλυφθεί εν μέρει. Η υπερφόρτωση των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) είναι ένας βασικός παράγοντας.10 Η υπερφόρτωση ROS στην αποχρωματισμό περιλαμβάνει μια ανισορροπία μεταξύ των προ- και αντιοξειδωτικών συστημάτων.11 Ένα από τα στοιχεία που συμμετέχουν σε αυτή την ανισορροπία είναι ο πυρηνικός παράγοντας ερυθροειδούς 2-που σχετίζεται παράγοντας 2/στοιχείο αντιοξειδωτικής απόκρισης (NRF2/ARE) διαταραχή της αντιοξειδωτικής οδού.12 Η οδός αποτελείται από NRF2 και αντιοξειδωτικά ένζυμα όπως η οξυγενάση της αίμης-1 (HMOX-1, HO{-1) , καταλάση (CAT), υπεροξειδάση γλουταθειόνης 1 (GPX1) και NAD(P)H κινόνη αφυδρογονάση 1 (NQO1).13 Όταν τα μελανοκύτταρα εκτίθενται σε υπερβολικό ROS, το NRF2 μπορεί να μετατοπιστεί στον πυρήνα και να συνδεθεί με το διατηρημένο ARE και στη συνέχεια να προωθήσει την έκφραση των αντιοξειδωτικών ενζύμων. Ωστόσο, σε ορισμένες ασθένειες αποχρωματισμού, όπως η λεύκη, μια εξασθενημένη αντιοξειδωτική οδός NRF2/ARE δεν μπορεί να καθαρίσει αποτελεσματικά το ROS. , 308-nm excimer light, αυτόλογη επιδερμική μεταμόσχευση και θεραπεία παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής (TCM). Τα κορτικοστεροειδή και οι αναστολείς καλσινευρίνης μπορούν να μειώσουν την ανώμαλη ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού,15 ενώ οι φωτοθεραπείες χρησιμοποιούνται ως θεραπείες πρώτης γραμμής. Ειδικότερα, το NBUVB διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των μελανοκυττάρων και την καταστροφή των Τ-κυττάρων,16 ενώ το φως διεγερτικό nm διεγείρει την απόπτωση των Τ κυττάρων.17 Επιπλέον, τα αποτελέσματα των θεραπειών TCM σχετίζονται με την προαγωγή της μελανογένεσης.18 Σε κάποιο βαθμό, αυτές οι μέθοδοι είναι χρήσιμα για τη βελτίωση της αποχρωματισμού, αλλά ο έλεγχος της εξέλιξης της νόσου παραμένει πρόκληση. Είναι απαραίτητο να αναπτυχθούν νέες θεραπείες, ειδικά για το οξειδωτικό στρες, το οποίο παλαιότερα είχε παραμεληθεί.

Cistanche deserticolaΕίναι γνωστό ως «τζίνσενγκ της ερήμου».19 Τα συστατικά του είναι χρήσιμα σε ηπατική βλάβη που προκαλείται από αιθανόλη και εντερική φλεγμονώδη υπερπλασία. μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως αντιδραστήριο κατά της κόπωσης, αντιφλεγμονώδους και κατά του όγκου.20-22 Πρόσφατα, οι Guo et al ανέφεραν ότιCistanche deserticola πολυσακχαρίτης(CDP), ένα από τα κύρια συστατικά του, διέθετε αντιοξειδωτική και ηπατοπροστατευτική δράση20. άλλες δύο μελέτες προσδιόρισαν τον ρόλο του στην προστασία των κυττάρων από τραυματισμό σε καταστάσεις στέρησης/επαναδιάχυσης οξυγόνου-γλυκόζης και οστεοπόρωσης.23,24 Ωστόσο, ο ρόλος του CDP στις ασθένειες αποχρωματισμού δεν έχει διευκρινιστεί. Εδώ, στοχεύσαμε να επιβεβαιώσουμε εάν το CDP γοξειδωτικό στρεςθα μπορούσε να επηρεάσει τη μελανογένεση και να προστατεύσει τα μελανοκύτταρα από το οξειδωτικό στρες.

2.|ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1|Χημικά και αντισώματα

Cistanche deserticolaπολυσακχαρίτης(CDP) και l-dopa αγοράστηκαν από τη Yuanye Biotec (καθαρότητα μεγαλύτερη ή ίση με 98 τοις εκατό, Σαγκάη, Κίνα). Υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2), διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), NaOH, Triton X-100, 4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ-2,5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο ( MTT), και ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V-FITC αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich. 4 τοις εκατό ουδέτερη παραφορμαλδεΰδη αγοράστηκε από την Biosharp (Hefei, Κίνα). και ένα κιτ χρώσης ανοσοφθορισμού (Alexa Fluor 488) και 2,7-διοξεική διχλωροφλουορεσκεΐνη (DCFH-DA) αγοράστηκαν από την Beyotime Biotec (Σαγκάη, Κίνα). Ένα κιτ χρώσης Fontana-Masson και ένα κιτ εξαγωγής νουκλεοπλασματικής πρωτεΐνης αγοράστηκαν από τη Sloarbio (Πεκίνο, Κίνα). Συμπλήρωμα ανάπτυξης ανθρώπινου μελανοκυττάρου (HMGS), το τροποποιημένο μέσο Eagle Dulbecco (DMEM) και το μέσο 254 αγοράστηκαν από την Gibco. Ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) αγοράστηκε από την ΒΙ (Kibbutz Beit-Haemek, Ισραήλ). Πρωτογενή αντισώματα για -ακτίνη, TYR, TRP2, RAB27A, FSCN1, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK,

p38, p-p38, NRF2 και HO-1 αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology, ένα πρωτογενές αντίσωμα για το MITF αγοράστηκε από το St John's Laboratory, ένα πρωτογενές αντίσωμα για το p-MITF αγοράστηκε από την Affinity Biosciences, ένα πρωτογενές αντίσωμα για το GAPDH αγοράστηκε από την Bioworld και το πρωτογενές αντίσωμα για το TRP1 αγοράστηκε από την EMD Millipore.

2.2| Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία

Κύτταρα μελανώματος ποντικού B16F10 καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS και 1 τοις εκατό μίγμα αντιβιοτικών πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης. Τα ανθρώπινα επιδερμικά μελανοκύτταρα (HEM) διαχωρίστηκαν από την ανθρώπινη ακροποσθία (ανατρέξτε στην προηγούμενη μελέτη μας25) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο 254 συμπληρωμένο με HMGS, 5 τοις εκατό FBS και 1 τοις εκατό μίγμα αντιβιοτικών πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υγρό επωαστήρα στους 37 βαθμούς με 5 τοις εκατό CO2. Το CDP διαλύθηκε σε DMSO και αραιώθηκε

με το μέσο πριν από τη χρήση, η τελική συγκέντρωση του DMSO ήταν χαμηλότερη από 0,1 τοις εκατό . Το H2O2 αραιώθηκε με το μέσο πριν από τη χρήση.

2.3|Καλλιέργεια και θεραπεία ζέβρα

Τα έμβρυα και το μέσο ψαριού ζέβρα αγοράστηκαν από την EzeRinka Biotech. Το πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Central South University. Τα ψάρια ζέβρα καλλιεργήθηκαν σε 12-πλάκες φρεατίου σε 37 μοίρες μακριά από το φως και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CDP. Ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκε για την παρατήρηση και την καταγραφή των μελανινών στα κεφάλια και τις ουρές του ψαριού ζέβρα καθημερινά. Μετά από παρατήρηση, αλλάξαμε το μέσο και προσθέσαμε ξανά το CDP. Η πυκνότητα μελανίνης στις ουρές του ψαριού ζέβρα μετρήθηκε με την εικόνα J και οι τιμές παρουσιάζονται ως ολοκληρωμένες οπτικές πυκνότητες (IOD).

2.4| Βιωσιμότητα κυττάρων

Η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ΜΤΤ. Για τη διερεύνηση της κυτταροτοξικότητας του CDP, τα HEMs και τα B16F10 κύτταρα εμφυτεύθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων με πυκνότητα 2 × 1{{30}}3 κύτταρα/φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν μέχρι τα κύτταρα προσαρτήθηκαν σε πλάκες. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 και 320 ug/mL) CDP για 24, 48 ή 72 ώρες. Πριν από τη μέτρηση, προστέθηκαν 20 μL MTT σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 4 ώρες. Μετά από αυτό, πετάξαμε το υπερκείμενο και προσθέσαμε 160 μL DMSO σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης. Η τιμή απορρόφησης στα 490 nm μετρήθηκε με συσκευή ανάγνωσης πλακών πολλαπλών λειτουργιών (PerkinElmer). Για τη διερεύνηση της επίδρασης του CDP στην επαγόμενη από H2O{2- συνθήκη κυτταροτοξικότητας, τα κύτταρα HEM και B16F10 τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 96-πηγαδιών σε πυκνότητα 4 × 103 κύτταρα/φρεάτιο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CDP (0, 20, 40 ή 80 ug/mL) για 24 ώρες, οπότε προσθέσαμε H2O2 (τελικές συγκεντρώσεις: 500 μm για τα κύτταρα HEM και 1,0 mm για τα κύτταρα B16F10) σε κάθε φρεάτιο και επώασαν τα κύτταρα για άλλες 24 ώρες. Δημιουργήσαμε ομάδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CDP και αρνητικούς ελέγχους (NC). Τα βήματα ανίχνευσης ήταν τα ίδια με αυτά που περιγράφηκαν προηγουμένως.

2,5|Δοκιμασία NaOH της περιεκτικότητας σε μελανίνη

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία Petri {{0}}mm και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CDP σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 20, 40 και 80 ug/mL) για 48 ώρες, στη συνέχεια χωνεύτηκαν με θρυψίνη και συλλέχθηκαν σε 1. 5-σωλήνες mL. Πλύσαμε τα κύτταρα δύο φορές με διπλά απεσταγμένο νερό, τα επαναιωρήσαμε σε 1 mL αιθανόλης και τα στροβιλίσαμε για να απελευθερωθεί η μελανίνη. Στη συνέχεια φυγοκεντρήσαμε (200 g, 5 λεπτά) το μείγμα και απορρίψαμε το υπερκείμενο, προσθέσαμε 1 mL 10 τοις εκατό DMSO (αραιωμένο με 1 mm διάλυμα NaOH) σε κάθε σωλήνα και εναιωρήσαμε το ίζημα. Επωάσαμε το εναιώρημα σε λουτρό νερού στους 80 βαθμούς για 1 ώρα για να διαλυθεί η μελανίνη. Τέλος, μεταφέραμε 200 μL του υγρού σε μια πλάκα 96-πηγαδιού και χρησιμοποιήσαμε μια συσκευή ανάγνωσης πλακών πολλαπλών λειτουργιών για να μετρήσουμε την τιμή απορρόφησης στα 470 nm.

2.6|Μετρήσεις δραστηριότητας τυροσινάσης

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία Petri {{0}}mm και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CDP πριν από τη μέτρηση, υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη και συλλέχθηκαν σε σωλήνες 1.5-mL και πλύθηκαν δύο φορές με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) ). Μετακινήσαμε 106 κύτταρα από κάθε δείγμα σε έναν νέο σωλήνα και απορρίψαμε το υπερκείμενο μετά τη φυγοκέντρηση, στη συνέχεια προσθέσαμε 1 ml 0.5 τοις εκατό Triton X-100 στο σφαιρίδιο κυττάρων και αποθηκεύσαμε το μίγμα σε 0 βαθμό για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, προσθέσαμε 1 mL l-dopa (1 mm, αραιωμένο με 0.1 M ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών) ως υπόστρωμα και αναμείξαμε το διάλυμα, μετακινήσαμε 200 μL του μείγματος σε μια πλάκα 96-πηγαδιού αμέσως, και μέτρησε την τιμή απορρόφησης (Α0) στα 475 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλακών πολλαπλών λειτουργιών, επαναλαμβάνοντας τη μέτρηση στα 10 λεπτά (Α10). Η δραστικότητα τυροσινάσης υπολογίστηκε με (Α10-Α0)/105 και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό (%) έναντι του αρνητικού ελέγχου.

2.7| Χρώση μελανίνης Fontana-Masson

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 12-πλάκες φρεατίων μέχρι να επιτευχθεί πυκνότητα 50 τοις εκατό. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4 τοις εκατό ουδέτερη παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά και πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια προσθέσαμε 500 μL διαλύματος αμμωνίας-αργύρου Fontana σε κάθε φρεάτιο και αποθηκεύσαμε τις πλάκες στο σκοτάδι για 16 ώρες για να βάψουμε τη μελανίνη. Στη συνέχεια, πλύναμε τα κύτταρα με απεσταγμένο νερό πέντε φορές (1 λεπτό κάθε φορά) και τα εμποτίσαμε σε 500 μL υποθειώδους για 5 λεπτά. Τέλος, αφαιρέσαμε το υποθειώδες και ξεπλύναμε ξανά τα κύτταρα με απεσταγμένο νερό για 1 λεπτό. Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο για να παρατηρήσουμε και να καταγράψουμε τις μελανίνες.

2,8|Εκχύλιση RNA και ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 6-πλάκες φρεατίων. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα χωνεύτηκαν με θρυψίνη και συλλέχθηκαν σε σωλήνες 1.5-mL. Πλύσαμε τα κύτταρα δύο φορές με PBS, στη συνέχεια προσθέσαμε σε 1 mL ρυθμιστικού λύσης, στροβιλίσαμε το μείγμα και τοποθετήσαμε τους σωλήνες σε πάγο για 5 λεπτά για να λυθούν πλήρως τα κύτταρα. Το RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας κιτ Ολικού RNA (Omega Bio-Tek) και μεταγράφηκε αντίστροφα (RT) χρησιμοποιώντας ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (TOYOBO). Πραγματοποιήθηκε ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση ανάστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας KODSYBR qPCR Mix (TOYOBO). Ο όγκος αντίδρασης του μίγματος RT ήταν 20 μL, ενώ ο όγκος αντίδρασης του μίγματος PCR ήταν 20 μL (cDNA 1-8 μL, MIX 10 μL, εκκινητής F 1 μL, εκκινητής R 1 μL, προσθέστε DEPC H2O σε 20 μL ). Τα πειράματα έγιναν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα. Οι αλληλουχίες των εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα S1.

2,9|Εκχύλιση πρωτεΐνης και Western blotting/ανοσοφθορισμός

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία Petri 100-mm. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα χωνεύτηκαν με θρυψίνη και συλλέχθηκαν σε σωλήνες 1.5-mL. Πλύσαμε τα κύτταρα δύο φορές με PBS και στη συνέχεια προσθέσαμε 500 μL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης RIPA (Thermo Fisher) συμπληρωμένο με 1 mm φαινυλμεθυλσουλφονυλοφθορίδιο (Thermo Fisher) και αραιωμένο κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης 1:100 (Roche). Η πυρηνική πρωτεΐνη και η πρωτεΐνη του κυτταροπλάσματος εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ εξαγωγής πρωτεϊνών νουκλεοπλασματικής σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τοποθετήσαμε τα σωληνάρια σε πάγο για 30 λεπτά και τα στροβιλίζαμε κάθε 5 λεπτά για να λυθούν πλήρως τα κύτταρα. Φυγοκεντρίσαμε τα κύτταρα (200 g, 4 μοίρες, 15 λεπτά), μετακινήσαμε το υπερκείμενο σε έναν νέο σωλήνα και μετρήσαμε τη συγκέντρωση της ολικής πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (KeyGEN Biotec). Βράσαμε τις πρωτεΐνες με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης 5x (Beyotime Biotec, Κίνα) στους 100 βαθμούς για 10 λεπτά και στη συνέχεια τις αποθηκεύσαμε στους -80 βαθμούς. Η μέθοδος ηλεκτροφόρησης γέλης πολυακρυλαμιδίου (PAGE) χρησιμοποιήθηκε σε στύπωμα Western και 20 ug πρωτεΐνης κάθε ομάδας διαχωρίστηκαν και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Μετά τον αποκλεισμό του αντιγόνου, επωάσαμε τη μεμβράνη σε ένα πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο 1:1000 για 16 ώρες στους 4 βαθμούς, στη συνέχεια πλύναμε τη μεμβράνη με PBST και την επωάσαμε σε 1:10 000 αραιωμένο δευτερεύον αντίσωμα φθορισμού για 1 ώρα στους 37 βαθμούς . Η ένταση του φθορισμού ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα Odyssey CLx Imaging System (LI-COR). Ο ανοσοφθορισμός πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ χρώσης ανοσοφθορισμού (Alexa Fluor

488) με αραίωση 1:100 του πρωτογενούς αντισώματος.

2.10|Μέτρηση κυτταρικής απόπτωσης

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία Petri {{0}}mm και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 20, 40 και 80 ug/mL) CDP για 24 ώρες και προστέθηκε H2O2 ( τελικές συγκεντρώσεις: 500 μm για HEMs, 1,0 mm για κύτταρα B16F10) σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται για άλλες 24 ώρες. Δημιουργήσαμε επίσης ομάδες που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CDP και NC. Μετά την επεξεργασία, χωνέψαμε τα κύτταρα με θρυψίνη χωρίς EDTA και τα συλλέξαμε σε σωλήνες, στη συνέχεια πλύναμε τα κύτταρα δύο φορές με PBS και τα επαναιωρήσαμε σε 100 μL PBS. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V-FITC σύμφωνα με το πρωτόκολλο και ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FCM). Το λογισμικό FlowJo χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του ρυθμού απόπτωσης.

2.11| Ενδοκυτταρική μέτρηση ROS

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία {{0}}και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0, 20, 40 και 80 ug/mL) CDP για 24 ώρες, στο οποίο προσθέσαμε H2O2 (τελικές συγκεντρώσεις: 500 μm για HEM,

1.0 mm για κύτταρα B16F10) σε κάθε φρεάτιο, επωάστηκαν για ένα άλλο

24 ώρες και δημιούργησε ομάδες με θεραπεία CDP και NC. Μετά την επεξεργασία, πλύναμε τα κύτταρα δύο φορές με PBS για να αφαιρέσουμε όλο το μέσο και το FBS, στη συνέχεια αραιώσαμε τον ανιχνευτή DCFH-DA σε 1:1000 με μέσο και τον προσθέσαμε σε κάθε φρεάτιο. Επωάσαμε τα κύτταρα στους 37 βαθμούς για 30 λεπτά και τα πλύναμε τρεις φορές με ένα μέσο χωρίς ορό. Χρησιμοποιήσαμε ένα

ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού για την παρατήρηση και την καταγραφή του φθορισμού και στη συνέχεια χρησιμοποίησε το ImageJ για να μετρήσει την ένταση του φθορισμού.

2.12|Στατιστική και ανάλυση

Τα δεδομένα σε αυτήν την εργασία παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) και η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (έκδοση 7.0) ή SPSS (έκδοση 22.0) και Student's Χρησιμοποιήθηκε t-test ή ανάλυση διακύμανσης μονής κατεύθυνσης (ANOVA) για συγκρίσεις πολλαπλών ομάδων. Η γκρι τιμή των ζωνών πρωτεΐνης WB τυποποιήθηκε με GAPDH ή -ακτίνη. Οι τιμές του P <,05 θεωρήθηκαν="" σημαντικές.="" όλα="" τα="" πειράματα="" επαναλήφθηκαν="" τουλάχιστον="" τρεις="">

3|ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

3.1|Η CDP προκάλεσε μελανογένεση σε κύτταρα HEM και B16F10

Πριν ξεκινήσουμε, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία MTT για να διερευνήσουμε την πιθανή κυτταροτοξικότητα του CDP σε κύτταρα HEM και μελανώματος ποντικού B16F10. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CDP σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 24, 48 ή 72 ώρες. Η δοκιμή βιωσιμότητας HEM έδειξε ότι όταν οι συγκεντρώσεις ήταν χαμηλότερες από 320 ug/mL, το CDP δεν είχε καμία επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Ωστόσο, η βιωσιμότητα μειώθηκε σημαντικά καθώς η συγκέντρωση έφτασε τα 320 ug/mL στις 24, 48 και 72 ώρες (Ρ < 0,05,="" εικόνα="" 1α).="" η="" βιωσιμότητα="" των="" κυττάρων="" b16f10="" μειώθηκε="" επίσης="" στις="" 48="" και="" 72="" ώρες="" όταν="" η="" cdp="" έφτασε="" τα="" 320="" ug/ml="" (ρ="">< 0,01)="" αλλά="" δεν="" παρατηρήθηκε="" αλλαγή="" σε="" χαμηλότερες="" συγκεντρώσεις="" (εικόνα="" 1β).="" στη="" συνέχεια,="" διερευνήσαμε="" προκαταρκτικά="" τον="" ρόλο="" του="" cdp="" στη="" μελανογένεση="" και="" συγκρίναμε="" τα="" αποτελέσματά="" του="" με="" εκείνα="" της="" ορμόνης="" διέγερσης="" των="" μελανοκυττάρων="" (-msh,="" συγκεντρώσεις:="" 20,="" 100="" και="" 400="" nm)="" και="" του="" dmso="" (0,1="" τοις="" εκατό)="" σε="" hems.="" τα="" αποτελέσματα="" των="" αναλύσεων="" χρώσης="" μελανίνης,="" δραστικότητας="" τυροσινάσης="" και="" περιεκτικότητας="" σε="" μελανίνη="" έδειξαν="" ότι="" το="" cdp="" ήταν="" συγκρίσιμο="" με="" το="" -msh="" για="" την="" προαγωγή="" της="" μελανογένεσης,="" ενώ="" η="" θεραπεία="" με="" 0,1="" τοις="" εκατό="" dmso="" δεν="" έκανε="" καμία="" διαφορά="" (εικόνα="">

Αναλόγως βελτιώσαμε περαιτέρω την εξερεύνηση μας. Τα ΗΕΜ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CDP σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (20, 40 και 80 ug/mL) για 48 ώρες. Διεξήχθησαν αναλύσεις χρωστικής μελανίνης, περιεκτικότητας σε μελανίνη και δραστηριότητας τυροσινάσης, και όλες έδειξαν σημαντικές αυξήσεις μετά τη θεραπεία με CDP με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση που κορυφώθηκε στην ομάδα των 80 ug/mL (P < 0,05,="" εικόνα="" 2a-c)="" .="" στη="" συνέχεια="" μετρήσαμε="" τα="" επίπεδα="" mrna="" και="" πρωτεΐνης="" των="" γονιδίων="" που="" σχετίζονται="" με="" τη="" μελανογένεση="" (mitf,="" tyr,="" trp1,="" trp2,="" rab27a="" και="" fscn1).="" το="" cdp="" αύξησε="" σημαντικά="" τα="" επίπεδα="" mrna="" αυτών="" των="" γονιδίων="" σε="" ηεμ="" (ρ="">< 0,05,="" εικόνα="" s2a).="" επιπλέον,="" τα="" επίπεδα="" των="" πρωτεϊνών="" mitf,="" tyr,="" trp1="" και="" rab27a="" αυξήθηκαν,="" όπως="" και="" η="" αναλογία="" φωσφορυλιωμένου="" mitf="" προς="" το="" συνολικό="" mitf="" (p="">< 0,05),="" ενώ="" τα="" trp2="" και="" fscn1="" δεν="" έδειξαν="" διαφορά="" (εικόνα="" 2d,="" e).="" τα="" αποτελέσματα="" έδειξαν="" ότι="" το="" cdp="" μπορεί="" να="" προάγει="" τη="" μελανογένεση="" και="" να="" ρυθμίζει="" προς="" τα="" πάνω="" την="" έκφραση="" των="" γονιδίων="" που="" σχετίζονται="" με="" τη="" μελανογένεση="" στα="" ανθρώπινα="">

Επιπλέον, επαληθεύσαμε ξανά τα αποτελέσματα του CDP με τα κύτταρα B16F10 και βρήκαμε ότι η περιεκτικότητα σε μελανίνη των κυττάρων B16F10 αυξήθηκε σημαντικά (P < 0,01,="" εικόνα="" s2b).="" εκτός="" αυτού,="" cdp="">

3.2|Το CDP προώθησε τη μελανογένεση σε ζέβρα

Να διερευνηθεί εάν το CDP θα μπορούσε να προωθήσειμελανογένεσηin vivo, χρησιμοποιήσαμε έμβρυα ζέβρα. Τα έμβρυα zebrafish χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες και υποβλήθηκαν σε συνεχή επεξεργασία μόνο με μέσο (NC) ή CDP σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (20, 40 και 80 ug/mL). η πυκνότητα και η κατανομή των κόκκων μελανίνης παρατηρούνταν και καταγράφονταν κάθε μέρα. Καθώς τα έμβρυα zebrafish μεγάλωναν, διαπιστώσαμε ότι η πυκνότητα της μελανίνης σταδιακά αυξήθηκε στα κεφάλια και τις ουρές. Την 3η ημέρα, οι διαφορές μεταξύ των ομάδων ήταν διακριτές και η διαφορά συνέχισε να αυξάνεται μέχρι να τελειώσουμε το πείραμα την 6η ημέρα (Εικόνα 3Α). Χρησιμοποιήσαμε την εικόνα J για να μετρήσουμε την πυκνότητα μελανίνης στις ουρές του ζέβρα. η πυκνότητα μελανίνης στις ομάδες που έλαβαν CDP ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη στην ομάδα ελέγχου (Ρ < 0,05,="" εικόνα="">

3.3|Ενεργοποιημένη από το CDP μονοπάτι σήματος MAPK σε κύτταρα HEM και B16F10

Να αποκαλυφθούν οι μηχανισμοί με τους οποίους προωθούσε το CDPμελανογένεση, αντιμετωπίσαμε HEM με CDP σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (20, 40 και

80 ug/mL) για 48 ώρες και στη συνέχεια διερεύνησαν τα φωσφορυλιωμένα και τα ολικά επίπεδα των πρωτεϊνών ERK, JNK και p38 στο μονοπάτι σηματοδότησης MAPK. Όπως μετρήθηκε με στύπωμα Western, τα επίπεδα p-ERK, p-JNK και p-p38 αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία με CDP (Ρ < 0,05),="" ενώ="" τα="" συνολικά="" επίπεδα="" αυτών="" δεν="" άλλαξαν="" (εικόνα="" 4α,="" β).="" τα="" πειράματα="" επαναλήφθηκαν="" με="" κύτταρα="" b16f10="" και="" τα="" φωσφορυλιωμένα="" επίπεδα="" των="" πρωτεϊνών="" erk,="" jnk="" και="" p38="" αυξήθηκαν="" (p="">< 0,05),="" αλλά="" τα="" συνολικά="" επίπεδα="" mapk="" δεν="" άλλαξαν="" (εικόνα="" 4c,="" d),="" σύμφωνα="" με="" τα="" αποτελέσματα="" στα="" hems="">

3.4|CDP εξασθενημένο H2O2-επαγόμενο

κυτταροτοξικότητα και απόπτωση σε HEM και κύτταρα B16F10

Χρησιμοποιήσαμε H2O2 για την προσομοίωση τουοξειδωτικό στρεςπεριβάλλον και διερεύνησε περαιτέρω τον ρόλο του CDP στα μελανοκύτταρα υπόοξειδωτικό στρες. Η τελική συγκέντρωση H2O2 που χρησιμοποιήθηκε στα HEM ήταν 500 μm, ενώ στα κύτταρα B16F10 ήταν 1,0 mm. Για να διερευνήσουμε την επίδραση του CDP στην επαγόμενη από H2O2-κυτταροτοξικότητα, προκατεργάσαμε HEMs και κύτταρα B16F10 με CDP σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (20, 40 και 80 ug/mL) για 24 ώρες, στη συνέχεια προσθέσαμε H2O2 και συνεχίσαμε να τα θεραπεύουμε για 24 ώρες πριν από την εκτέλεση της παρατήρησης και του προσδιορισμού ΜΤΤ.

Το H2O2 προκάλεσε εμφανή φυσαλίδες μεμβράνης και συρρίκνωση των κυττάρων στα HEMs, στις ομάδες που είχαν υποστεί προεπεξεργασία CDP, η κατάσταση μετριάστηκε. Η θεραπεία μόνο με CDP δεν είχε αποτέλεσμα (Εικόνα 5Α). Η ανάλυση MTT έδειξε παρόμοιο αποτέλεσμα στο ότι η θεραπεία με H2O2 μείωσε τη βιωσιμότητα HEM, ενώ η CDP βελτίωσε σημαντικά αυτήν την επιβλαβή επίδραση

3,5|Το CDP δέσμευσε το H2O2-επαγόμενο ενδοκυτταρικό ROS σε κύτταρα HEM και B16F10

Για να διερευνήσουμε τους μηχανισμούς της CDP για τη μείωση της επαγόμενης από H2O2-κυτταροτοξικότητας και της απόπτωσης, ανιχνεύσαμε περαιτέρω τα ενδοκυτταρικά ROS σε κύτταρα HEM και B16F10 χρησιμοποιώντας φθορισμό DCFH-DA

4|ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τον ρόλο της CDP στα HEM και τα κύτταρα B16F10. Για πρώτη φορά, διαπιστώσαμε ότι το CDP μπορούσε να προωθήσειμελανογένεσηστα μελανοκύτταρα και προάγουν τη μελάγχρωση στα ζέβρα. Ένα επόμενο πείραμα έδειξε ότι η οδός σηματοδότησης MAPK ενεργοποιήθηκε υπό θεραπεία CDP. Ερευνήσαμε περαιτέρω τον ρόλο του σεοξειδωτικό στρεςκαι διαπίστωσε ότι το CDP θα μπορούσε να μειώσει την επαγόμενη από H2O2- κυτταροτοξικότητα και απόπτωση στα μελανοκύτταρα. Εν τω μεταξύ, το CDP θα μπορούσε να ενεργοποιήσει το αντιοξειδωτικό μονοπάτι NRF2/HO-1 και να καθαρίσει τα ενδοκυτταρικά ROS υπόοξειδωτικό στρεςσυνθήκες.

Η ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση είναι μια ζωτική οδός που εμπλέκεται στη ρύθμιση του MITF, ενός βασικού μεταγραφικού παράγοντα που προάγει την έκφρασημελανογένεση-σχετικά γονίδια και στη συνέχεια επηρεάζει τη σύνθεση και τη μεταφορά της μελανίνης.26,27 Στη μελέτη μας, η ενεργοποίηση των ERK, JNK και p38 στα μελανοκύτταρα αυξήθηκε σημαντικά μετά τη θεραπεία με CDP. εν τω μεταξύ, οι εκφράσεις των MITF/p-MITF και MITF-driven TYR, TRP1, TRP2 και RAB27A

ρυθμίστηκαν ανάλογα. Έτσι, προτείνουμε ότι το CDP μπορεί

προάγωμελανογένεσημέσω της ενεργοποίησης της οδού MAPK, αλλά το πώς το CDP ενεργοποιεί τα MAPK παραμένει άγνωστο. Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες, ο υποδοχέας 4 (TLR4) εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στα μελανοκύτταρα και εμπλέκεται στη μελανογένεση.28,29 Το TLR4 είναι μια σημαντική διαμεμβρανική πρωτεΐνη που μπορεί να δεσμεύσει ειδικά τον λιποπολυσακχαρίτη (LPS)30. μελέτες ανέφεραν ότι το LPS μπορεί να προκαλέσει μελανογένεση.29 Είναι ενδιαφέρον ότι αρκετέςπολυσακχαρίτεςπου εξήχθη από φυτά ή μανιτάρια φέρεται να ενεργοποιεί TLR και κατάντη οδούς σηματοδότησης όπως MAPK και πυρηνικό παράγοντα κάπα βήτα (NF-κB). μονοπάτι ling και προάγειμελανογένεση. Επιπλέον, οι υποδοχείς που μοιάζουν με περιοχή ολιγομερισμού που δεσμεύουν νουκλεοτίδια (NLRs) είναι γνωστό ότι αναγνωρίζουν ενδοκυτταρικούς συνδέτες και οδηγούν την ενεργοποίηση των μονοπατιών σηματοδότησης MAPK και NF-κB.33,34 Όπως αναφέρθηκε, πολυσακχαρίτες που εξάγονται από το Ganoderma lucidum και το Astragalus μπορούν να εισέλθουν στα κύτταρα και επηρεάζουν τους NLRs.35,36 Έτσι, είναι πιθανό ότι το CDP μπορεί να εισέλθει στα μελανοκύτταρα και να ρυθμίσει το μονοπάτι σηματοδότησης MAPK μέσω των NLRs. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για την επαλήθευση αυτής της υπόθεσης.

Μερικές μελέτες μέχρι σήμερα ανέφεραν την εφαρμογή βοτάνωνπολυσακχαρίτεςστη μελανογένεση για την αναστολή της παραγωγής μελανίνης.37,38 Ωστόσο, σε αυτή τη μελέτη, η CDP προώθησε τη μελανογένεση σε

μελανοκύτταρα, και αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε περαιτέρω μετά από σύγκριση με -MSH. Το CDP είναι επίσης ένα είδοςπολυσακχαρίτηςπου εξάγεται από βότανα, υποπτευόμαστε ότι το αντίθετο αποτέλεσμα του CDP μπορεί να σχετίζεται με τις δομικές διαφορές μεταξύ του CDP και άλλωνπολυσακχαρίτες. Οι πολυσακχαρίτες σχηματίζονται με πολυμερισμό μονοσακχαριτών αλλά ποικίλλουν σε τύπο μονοσακχαρίτη, σύνθεση μονοσακχαρίτη, γλυκοσιδικό δεσμό, δομή πλευρικής αλυσίδας και μοριακό βάρος39,40. Αυτοί οι παράγοντες πιστεύεται ότι καθορίζουν τις βιολογικές τους λειτουργίες.41 Υπάρχουσες μελέτες έχουν προτείνει τη δομή του CDP και προτείνουν ότι η δομή του CDP επηρεάζει στη συνέχεια τη λειτουργία του.42 Επομένως, χρειάζονται περισσότερες αποδείξεις για την πλήρη κατανόηση του CDP και την επιβεβαίωση της υπόθεσής μας.

Η μελανογένεση είναι ένας σημαντικός προστατευτικός μηχανισμός αντίστασης

βλάβη από την υπεριώδη ακτινοβολία και διατήρηση της ομοιόστασης του σώματος43. στο ίδιο

χρόνο, τα μελανοκύτταρα εκτίθενται εύκολα σε δυσμενή περιβάλλοντα όπως η υπερφόρτωση ROS.11 Είναι γνωστό ότι τα ROS συμμετέχουν στην προώθησημελανογένεση, ένας από τους μηχανισμούς είναι η ενεργοποίηση των MAPK.44 Αλλά οι μελέτες αποκάλυψαν επίσης ότι αυτή η επίδραση υπάρχει μόνο σε ένα συγκεκριμένο επίπεδο ROS, ενώ η υπερφόρτωση ROS επηρεάζει σημαντικά τη μελανογένεση.45 Η σχέση μεταξύ ROS, MAPK και μελανογένεσης είναι μεταβλητή υπό διαφορετικές συνθήκες, επομένως, Η ισορροπία μεταξύ προ- και αντιοξειδωτικών συστημάτων είναι προφανώς σημαντική. Σε ασθένειες αποχρωματισμού όπως η λεύκη, ένα ανισορροπημένο αντιοξειδωτικό σύστημα και η ανεξέλεγκτη υπερφόρτωση ROS θα καταστρέψει τα μελανοκύτταρα και θα μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. H2O2 από τα κύτταρα B16F10. Όταν τα μελανοκύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με H2O2, η βιωσιμότητά τους και ο ρυθμός απόπτωσης χειροτέρεψαν, αλλά

Η προεπεξεργασία CDP θα μπορούσε να αναστρέψει εν μέρει την τάση. Ταυτόχρονα, το ROS σκουπίστηκε. Όπως αναφέρθηκε, η ενεργοποίηση της αντιοξειδωτικής οδού NRF2/ARE είναι μια κύρια μέθοδος σάρωσης ROS στα κύτταρα του δέρματος.14 Στα πειράματά μας, τα επίπεδα πρωτεΐνης του NRF2 και του HO-1 στα μελανοκύτταρα ρυθμίστηκαν προς τα πάνω μετά από θεραπεία με H2O2 χωρίς CDP. αυτό σημαίνει ότι το H2O2-επάγεταιοξειδωτικό στρεςμπορεί να ενεργοποιήσει το μονοπάτι NRF2/HO-1, αλλά είναι ανεπαρκές για τη διατήρηση μιας ισορροπίας οξειδοαναγωγής και την προστασία του κυττάρου από τραυματισμό. Ωστόσο, η προεπεξεργασία CDP ενίσχυσε την αντιοξειδωτική οδό NRF2/HO-1 και αποκατέστησε την ισορροπία. Έτσι, προτείνουμε ότι το CDP μπορεί να προστατεύσει τα μελανοκύτταρα από τον τραυματισμό του οξειδωτικού στρες μέσω της ενεργοποίησης της αντιοξειδωτικής οδού NRF2/HO-1 και της δέσμευσης των ROS.

Βρήκαμε ότι η θεραπεία με CDP από μόνη της δεν έχει καμία επίδραση στο ROS ή το NRF2/HO-1 στα μελανοκύτταρα. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι το CDP μπορεί να επηρεάσει την ισορροπία οξειδοαναγωγής υπό οξειδωτικό στρες, αλλά όχι σε κανονικές συνθήκες. Επιπλέον, η αντιοξειδωτική οδός NRF2/HO-1 φέρεται να ρυθμίζεται από τα μονοπάτια σηματοδότησης PI3K, NF-κB και MAPK.47,48 Στη μελέτη μας, το CDP μπόρεσε να ενεργοποιήσει το μονοπάτι σηματοδότησης MAPK. Είναι πιθανό το CDP να μπορεί να ενεργοποιήσει το μονοπάτι NRF2/HO-1 μέσω των MAPK που ρυθμίζουν προς τα πάνω. Όπως ανέφερε ο Slominski, τα μελανοκύτταρα είναι αισθητήρες στρες που εμπλέκονται σε ένα ρυθμιστικό δίκτυο και οι λειτουργίες τους μπορούν να αλλάξουν γρήγορα ανάλογα με το περιβάλλον.49 Προτείνουμε ότι ο ρόλος του CDP επηρεάζεται από την κατάσταση των μελανοκυττάρων, μπορεί να προάγει τη μελανογένεση χωρίς να επηρεάζει το αντιοξειδωτικό σύστημα υπό κανονικές συνθήκες αλλά επαναφέρετε την ισορροπία οξειδοαναγωγής υπόοξειδωτικό στρεςσυνθήκες. Επομένως, η λειτουργία και η επιβίωση των μελανοκυττάρων μπορούν να διατηρηθούν με δύο διαφορετικούς τρόπους από το CDP. Το CDP βοηθά τα μελανοκύτταρα να διατηρήσουν την ομοιόσταση, η οποία είναι επίσης μια σημαντική λειτουργία της μελανογένεσης.50,51

Συμπερασματικά, το CDP μπορεί να προωθήσει τομελανογένεσητων μελανοκυττάρων

μέσω ενεργοποίησης της οδού σηματοδότησης MAPK. Το CDP μπορεί να βελτιώσει την επιβίωση των μελανοκυττάρων μέσω της ενεργοποίησης της αντιοξειδωτικής οδού NRF2/HO-1 και της σάρωσης των ενδοκυτταρικών ROS υπό συνθήκες οξειδωτικού στρες. Τα ευρήματά μας είναι σημαντικά επειδή αποδεικνύουν ότι το CDP μπορεί να προωθήσει και τα δύομελανογένεσηκαι προστατεύουν τα μελανοκύτταρα απόοξειδωτικό στρεςτραυματισμό, ο οποίος είναι πιθανώς υπεύθυνος για τη δυσλειτουργία και την απώλεια μελανοκυττάρων. Τα ευρήματα αυτής της μελέτης υποδεικνύουν ότι το CDP θα μπορούσε να είναι ένα νέο φάρμακο στη θεραπεία ασθενειών αποχρωματισμού.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (No. 81703101), τα New Xiangya Talent Projects of the Third Xiangya Hospital of Central South University (No. JY201623 and No. 20170301), το Natural Science Foundation of Hunan Province ( No. 2018JJ3788 και No. 2018JJ3793) και το Project of Hunan Health Commission (Αρ. C2019173). Ο Δρ. Yibo Hu πραγματοποίησε το κύριο μέρος της μελέτης και έγραψε το χειρόγραφο. Ο καθηγητής Jing Chen και ο Qinghai Zeng σχεδίασαν τη μελέτη και καθοδήγησαν τη συγγραφή του χειρογράφου. Οι καθηγητές Jinhua Huang, Lihua Huang και Hong Xiang παρείχαν τεχνική υποστήριξη και ανέλυσαν τα δεδομένα. Οι Δρ. Yixiao Li, Ling Jiang, Yujie Ouyang, Yumeng Li, Lun Yang και Xiaojiao Zhao συνέβαλαν σε μέρος των πειραμάτων.

ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ ΣΥΜΦΕΡΟΝΤΩΝ

Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι δεν υπάρχουν συγκρούσεις συμφερόντων.

ΔΗΛΩΣΗ ΔΙΑΘΕΣΙΜΟΤΗΤΑΣ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ

Τα δεδομένα που υποστηρίζουν τα ευρήματα αυτής της μελέτης είναι διαθέσιμα από τον αντίστοιχο συγγραφέα κατόπιν εύλογου αιτήματος.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

1. Bleuel R, Eberlein B. Θεραπευτική αντιμετώπιση της λεύκης. J Dtsch Dermatol Ges. 2018;16:1309-1313.

2. Taieb A, Meurant JM. Πρέπει να δώσουμε προτεραιότητα στις ψυχολογικές παρεμβάσεις στη διαχείριση της λεύκης; J Eur Acad Dermatol Venereol. 2018;32:2053-2054.

3. Picardo Μ, Dell'Anna ML, Ezzedine Κ, et αϊ. Λεύκη. Nat Rev Dis Primers. 2015; 1:15011.

4. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J. Μελάγχρωση μελανίνης στο δέρμα θηλαστικών και η ορμονική του ρύθμιση. Physiol Rev. 2004;84:1155-1228.

5. Slominski Α, Zmijewski ΜΑ, Pawelek J. L-τυροσίνη και L-διυδροξυφαινυλαλανίνη ως ορμονοειδείς ρυθμιστές των λειτουργιών των μελανοκυττάρων. Pigment Cell Melanoma Res. 2012;25:14-27.

6. Spritz RA. Κοινές γενετικές σχέσεις που υποκρύπτουν τη γενικευμένη λεύκη και την αυτοάνοση νόσο του θυρεοειδούς. Θυροειδής. 2010;20:745-754.

7. Lin X, Tang LY, Fu WW, Kang KF. Παιδική λεύκη στην Κίνα: κλινικά προφίλ και ανοσολογικά ευρήματα σε 620 περιπτώσεις. Am J Clin Dermatol. 2011;12:277-281.

8. Boehncke WH, Brembilla NC. Αυτοαντιδραστικά Τ-λεμφοκύτταρα σε φλεγμονώδεις ασθένειες του δέρματος. Front Immunol. 2019; 10:1198.

9. Iannella G, Greco A, Didona D, et al. Λεύκη: Παθογένεση, κλινικές παραλλαγές και θεραπευτικές προσεγγίσεις. Autoimmun Rev. 2016;15:335-343.

10. Forrester SJ, Kikuchi DS, Hernandes MS, et αϊ. Αντιδραστικά είδη οξυγόνου στη μεταβολική και φλεγμονώδη σηματοδότηση. Circ Res. 2018;122:877-902.

11. Denat L, Kadekaro AL, Marrot L, et al. Τα μελανοκύτταρα ως υποκινητές και θύματα οξειδωτικού στρες. J Invest Dermatol. 2014;134:1512-1518.

12. Qiu L, Song Z, Setaluri V. Οξειδωτικό στρες και λεύκη: το Nrf2-ARE

σύνδεση σηματοδότησης. J Invest Dermatol. 2014;134:2074-2076.

13. Hayes JD, Dinkova-Kostova AT. Το ρυθμιστικό δίκτυο Nrf2 παρέχει μια διεπαφή μεταξύ οξειδοαναγωγής και ενδιάμεσου μεταβολισμού. Trends Biochem Sci. 2014;39:199-218.

14. Marrot L, Jones C, Perez P, Meunier JR. Η σημασία του Nrf2

μονοπάτι στην απόκριση (φωτο)-οξειδωτικού στρες στα μελανοκύτταρα και τα κερατινοκύτταρα της ανθρώπινης επιδερμίδας. Pigment Cell Melanoma Res. 2008;21:79-88.

15. van Geel Ν, Speeckaert R, Mollet Ι, et αϊ. In vivo μοντέλο επαγωγής και θεραπείας λεύκης: μια διπλή-τυφλή, τυχαιοποιημένη κλινική δοκιμή. Pigment Cell Melanoma Res. 2012;25:57-65.

16. Νικολαΐδου Ε, Αντωνίου Γ, Στρατηγός Α, Κατσάμπας Α.Δ. Φωτοθεραπεία στενής ζώνης υπεριώδους Β και 308-nm excimer laser στη θεραπεία της λεύκης: μια ανασκόπηση. J Am Acad Dermatol. 2009;60:470-477.

17. Novak Z, Bonis B, Baltas E, et al. Λέιζερ υπεριώδους Β χλωριούχου ξένου

είναι πιο αποτελεσματικό στη θεραπεία της ψωρίασης και στην πρόκληση απόπτωσης Τ-λεμφοκυττάρων από το υπεριώδες στενής ζώνης B. J Photochem Photobiol B Biol. 2002;67:32-38.

18. Xu P, Su S, Tan C, et al. Επιδράσεις των υδατικών εκχυλισμάτων του Eclipse herba, του παρασκευαστή ρίζας Polygoni multiflora και του παρασκευαστή ρίζας Rehmanniae στη μελανογένεση και τη μετανάστευση ανθρώπινων μελανοκυττάρων. J Ethnopharmacol. 2017;195:89-95.

19. Wang T, Zhang X, Xie W.Cistanche deserticolaYC Ma, "Desertginseng": μια κριτική. Am J Chin Med. 2012;40:1123-1141.

20. Guo Y, Cao L, Zhao Q, et αϊ. Προκαταρκτικοί χαρακτηρισμοί, η αντιοξειδωτική και ηπατοπροστατευτική δράση τουπολυσακχαρίτηςαπόCistanche deserticola. Int J Biol Macromol. 2016;93:678-685.

21. Cai RL, Yang ΜΗ, Shi Y, et αϊ. Αντικαταθλιπτική δράση εκχυλίσματος πλούσιου σε φαινυλαιθανοειδή απόCistanche deserticola. Phytother Res. 2010;24:313-315.

22. Zhang Η, Xiang Ζ, Duan Χ, et αϊ. Αντικαρκινικές και αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις ολιγοσακχαριτών απόCistanche deserticolaεκχύλισμα για τραυματισμό του νωτιαίου μυελού. Int J Biol Macromol. 2019;124:360-367.

23. Liu Y, Wang Η, Yang Μ, et αϊ.Cistanche deserticola πολυσακχαρίτεςπροστατεύουν τα κύτταρα PC12 από τραυματισμό που προκαλείται από OGD/RP. Biomed Pharmacother. 2018;99:671-680.

24. Song D, Cao Z, Liu Z, et al.Cistanche deserticola πολυσακχαρίτηςεξασθενεί την οστεοκλαστογένεση και την οστική απορρόφηση μέσω της αναστολής της σηματοδότησης RANKL και της παραγωγής αντιδραστικών ειδών οξυγόνου. J Cell Physiol. 2018;233:9674-9684.

25. Fu C, Chen J, Lu J, et αϊ. Η μείωση του TUG1 προάγει τη μελανογένεση και τη μελανογένεση που προκαλείται από την UVB. Exp Dermatol. 2019;28:730-733.

26. Johannessen CM, Johnson LA, Piccioni F, et al. Ένα πρόγραμμα γενεαλογίας μελανοκυττάρων προσδίδει αντίσταση στην αναστολή της οδού κινάσης MAP. Φύση. 2013;504:138-142.

27. Vachtenheim J, Borovansky J. "Transcription physiology" of pigment formation in melanocytes: κεντρικός ρόλος του MITF. Exp Dermatol. 2010;19:617-627.

28. Yu N, Zhang S, Zuo F, et αϊ. Τα καλλιεργημένα ανθρώπινα μελανοκύτταρα εκφράζουν λειτουργικούς υποδοχείς 2-4, 7 και 9. J Dermatol Sci. 2009;56:113-120.

29. Ahn JH, Park TJ, Jin SH, Kang HY. Τα ανθρώπινα μελανοκύτταρα εκφράζουν λειτουργικό υποδοχέα τύπου Toll 4. Exp Dermatol. 2008;17:412-417.

30. Reed SG, Carter D, Casper C, et al. Συσχετισμοί δραστηριοτήτων επικουρικών της οικογένειας GLA. Semin Immunol. 2018;39:22-29.

31. Guo MZ, Meng Μ, Feng CC, et αϊ. Μία νουβέλαπολυσακχαρίτηςπου λαμβάνεται από το Craterellus cornucopiioides ενισχύει την ανοσοτροποποιητική δραστηριότητα σε μοντέλα ανοσοκατασταλτικών ποντικών μέσω της ρύθμισης της οδού TLR4-NF-kappaB. Λειτουργία Τροφίμων. 2019;10(8):4792-4801.

32. Wei W, Xiao HT, Bao WR, et al. Το TLR-4 μπορεί να μεσολαβεί σε μονοπάτια σηματοδότησης του AstragalusπολυσακχαρίτηςΤο RAP προκάλεσε έκφραση κυτοκίνης των κυττάρων RAW264.7. J Ethnopharmacol. 2016;179:243-252.

33. Chen Η, Yang D, Han F, et al. Ο βακτηριακός τελεστής T6SS EvpPΑποτρέπει την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 αναστέλλοντας την εξαρτώμενη από το Ca(2 plus) μονοπάτι MAPK-Jnk. Μικρόβιο ξενιστή κυττάρων. 2017;21:47-58.

34. Levy M, Shapiro H, Thaiss CA, Elinav E. NLRP6: ένας πολύπλευρος ανοσιακός αισθητήρας in-Nate. Trends Immunol. 2017;38:248-260.

35. Chen YS, Chen QZ, Wang ZJ, Hua C. Αντιφλεγμονώδη και ηπατοπροστατευτικά αποτελέσματα του Ganoderma lucidumπολυσακχαρίτεςκατά της ηπατικής βλάβης που προκαλείται από τετραχλωράνθρακα σε ποντικούς Kunming. Φαρμακολογία. 2019;103:143-150.

36. Tian Z, Liu Y, Yang Β, et al. Αστράγαλοςπολυσακχαρίτηςεξασθενεί την κολίτιδα ποντικού μέσω της αναστολής του φλεγμονώδους NLRP3. Planta Med. 2017;83:70-77.

37. Jiang L, Huang J, Lu J, et αϊ. Ganoderma lucidumπολυσακχαρίτηςμειώνει τη μελανογένεση αναστέλλοντας τις παρακρινικές επιδράσεις των κερατινοκυττάρων και των ινοβλαστών μέσω της οδού IL-6/STAT3/FGF2. J Cell Physiol. 2019;234:22799-22808.

38. Cai ZN, Li W, Mehmood S, et al. Επίδραση τουπολυσακχαρίτηςFMP-1 από τη Morchella esculenta για τη μελανογένεση σε κύτταρα B16F10 και ζέβρα. Λειτουργία Τροφίμων. 2018; 9:5007-5015.

39. Zhang C, Li Z, Zhang CY, et αϊ. Μοριακά χαρακτηριστικά και βιοδραστηριότητες τουπολυσακχαρίτεςαπό μηδική (Medicago sativa L.). ΘΡΕΠΤΙΚΕΣ ουσιες. 2019; 11:1181.

40. Coconi Linares Ν, Di Falco Μ, Benoit-Gelber Ι, et al. Η παρουσία ιχνοστοιχείων διευρύνει σημαντικά τη μοριακή απόκριση του Aspergillus niger στο κόμμι γκουάρ. Νέα Βιοτεχνολογία. 2019;51:57-66.

41. Ma Η, Zhang Κ, Jiang Q, et αϊ. Χαρακτηρισμός φυτούπολυσακχαρίτεςαπό το Dendrobium officinale με πολλαπλές χρωματογραφικές και φασματομετρικές τεχνικές μάζας. J Chromatogr A. 2018;1547:29-36.

42. Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. Δομικός χαρακτηρισμός και ανοσολογική δραστηριότητα δύο εκχυλίσιμων με κρύο νερόπολυσακχαρίτεςαπόCistanche deserticolaYC Ma. Carbohydr Res. 2007;342:1343-1349.

43. Slominski ΑΤ, Zmijewski ΜΑ, Plonka PM, et al. Πώς το υπεριώδες φως αγγίζει τον εγκέφαλο και το ενδοκρινικό σύστημα μέσω του δέρματος και γιατί. Ενδοκρινολογία. 2018;159:1992-2007.

44. Schalke S. Νέα δεδομένα για τις διαταραχές υπερμελάγχρωσης. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2017;31(Παράρτημα 5):18-21.

45. Glassman SJ. Λεύκη, αντιδραστικά είδη οξυγόνου και Τ-κύτταρα. Clin Sci. 2011;120:99-120.

46. ​​Ristow M. Αποκαλύπτοντας την αλήθεια για τα αντιοξειδωτικά: η mitohormesis εξηγεί τα οφέλη για την υγεία που προκαλούνται από το ROS. Nat Med. 2014;20:709-711.

47. Balogun Ε, Hoque Μ, Gong P, et al. Η κουρκουμίνη ενεργοποιεί το γονίδιο της οξυγενάσης της αιμίας-1 μέσω της ρύθμισης του Nrf2 και του στοιχείου που ανταποκρίνεται στα αντιοξειδωτικά. Biochem J. 2003;371:887-895.

48. Paine A, Eiz-Vesper B, Blasczyk R, Immenschuh S. Signaling to

Η οξυγενάση της αίμης-1 και η αντιφλεγμονώδης θεραπευτική της δυνατότητα.

Biochem Pharmacol. 2010;80:1895-1903.

49. Slominski A, Paus R, Schadendorf D. Μελανοκύτταρα ως «αισθητηριακά» και ρυθμιστικά κύτταρα στην επιδερμίδα. J Theor Biol. 1993;164:103-120.

50. Slominski RM, Zmijewski MA, Slominski AT. Ο ρόλος της χρωστικής μελανίνης στο μελάνωμα. Exp Dermatol. 2015;24:258-259.

51. Slominski Α, Kim TK, Brozyna ΑΑ, et αϊ. Ο ρόλος της μελανογένεσης στη ρύθμιση της συμπεριφοράς του μελανώματος: η μελανογένεση οδηγεί σε διέγερση της έκφρασης του HIF-1άλφα και των συνοδών οδών που εξαρτώνται από τον HIF. Arch Biochem Biophys. 2014;563:79-93.