Υψηλή πρόσληψη αλατιού και οι επιδράσεις της στο φυσικό μικροβίωμα του εντέρου σε άγρια ​​ποντίκια

1. Εισαγωγή

Το έντερο των θηλαστικών αποικίζεται από μια πολύπλοκη και ποικιλόμορφη βακτηριακή κοινότητα, η οποία μαζί με τον ξενιστή δημιουργεί μια λεπτή συμβιωτική σχέση [1,2]. Αυτή η βακτηριακή κοινότητα ασκεί πολλές λειτουργίες χρήσιμες για τον ξενιστή, συμπεριλαμβανομένων μεταβολικών, ανοσοτροποποιητικών και τροφικών λειτουργιών [3-7] και η σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου θα μπορούσε να αλλάξει κατά τη διάρκεια της ζωής, σύμφωνα με τις ειδικές ανάγκες και τη φυσιολογία του ξενιστή [1,8, 9]. Πολλές ευεργετικές λειτουργίες των βακτηρίων που προάγουν την υγεία του εντέρου διαμεσολαβούνται από μεταβολίτες που προέρχονται από αναερόβια ζύμωση [10-13] και οι δυσβιοτικές καταστάσεις θα μπορούσαν να επηρεάσουν σημαντικά την υγεία του ξενιστή [2,11,14,15]. Η αυξανόμενη ανησυχία για τον αντίκτυπο του τρόπου ζωής στην υγεία έχει οδηγήσει σε αυξημένο επιστημονικό ενδιαφέρον για τη συμμετοχή της μικροχλωρίδας του εντέρου και τις μεταφραστικές της επιπτώσεις [16,17]. Πράγματι, η μικροχλωρίδα του εντέρου διαμορφώνεται τόσο από εξωγενείς (π.χ. τρόπος ζωής, διατροφή και ιατρικές θεραπείες) όσο και από εγγενείς (π.χ. γενετική του ξενιστή, ανοσολογικές και μεταβολικές ρυθμίσεις) παράγοντες [8,18-20]. Είναι γενικά αναγνωρισμένο ότι τα εξωτερικά στοιχεία θα μπορούσαν να προκαλέσουν επιδράσεις, με τη διατροφή ως έναν από τους κύριους παράγοντες που συμβάλλουν στην επίδραση της σύνθεσης και της λειτουργίας της μικροχλωρίδας του εντέρου [1,2,21]. Τα δυτικά διατροφικά συστατικά, όπως η υψηλή πρόσληψη αλατιού, είναι γνωστό ότι βλάπτουν την ομοιόσταση του ξενιστή επηρεάζοντας το ανοσοποιητικό σύστημα και μεταβάλλοντας τη μικροχλωρίδα του εντέρου και τις ασθένειες [18,22-37]. Στη μικροχλωρίδα του εντέρου του ποντικού, μια δίαιτα με υψηλή περιεκτικότητα σε αλάτι (HSD) σχετίζεται με τη μείωση των βακτηρίων που προάγουν την υγεία, γνωστά ως παραγωγοί λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας (SCFA) όπως Lactobacillus spp., Bifidobacterium, Blautia και Faecalibaculum [28, 29,38-41], παράλληλα με την αύξηση της αφθονίας του Akkermansia, ενός άλλου ευκαιριακού παραγωγού SCFA που έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει την ανοσία και τη νόσο του ξενιστή σε διαφορετικά συστήματα μοντέλων [42,43]. Τα μοντέλα ζώων ποντικού χρησιμοποιούνται συχνά για τη μελέτη του τρόπου με τον οποίο οι διατροφικοί παράγοντες θα μπορούσαν να διαμορφώσουν τη μικροχλωρίδα του εντέρου, το ανοσοποιητικό σύστημα και την ασθένεια [29,44-46]. Παρόλο που η χρήση συμβατικών εργαστηριακών ποντικιών (CLM) εξακολουθεί να είναι μια έγκυρη επιλογή για πολλές μελέτες, μερικές φορές αποτυγχάνει να μεταφράσει σωστά τις εφαρμογές που εστιάζονται στη μικροβία του εντέρου [47-49]. Για παράδειγμα, η ανοσολογική και η μεταβολομική έρευνα σε μοντέλα ποντικών της φλεγμονώδους νόσου του εντέρου (IBD) και της παχυσαρκίας φάνηκε να προβλέπουν ελάχιστα τα μεταφραστικά αποτελέσματα των μελετών για τη μικροχλωρίδα του εντέρου [50]. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε πολλές εγγενείς διαφορές σε αυτά τα συστήματα μοντέλων, όπως η διαφορετική ανατομία του εντέρου, η γενετική και η φυσιολογία [16,50]. Ωστόσο, ένα άλλο πρόβλημα χρήσης του CLM για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων μικροβίου-άνοσης είναι η εξημέρωση της βακτηριακής σύνθεσης του εντέρου στο CLM, η οποία αντικατοπτρίζεται στη μείωση της πολυπλοκότητας και της ανθεκτικότητας της μικροχλωρίδας του εντέρου CLM σε σύγκριση με τα άγρια ​​ποντίκια [51]. Η ανάγκη για απολυμανμένα και ελεγχόμενα περιβάλλοντα αντιμετωπίζει μειωμένη παρουσία πιθανών παθογόνων και παρασίτων, γεγονός που πιστεύεται ότι οδηγεί κατά συνέπεια σε λιγότερο «μορφωμένο» ανοσοποιητικό σύστημα στο CLM σε σύγκριση με τα άγρια ​​ποντίκια [51-53]. Για να αντιμετωπιστεί αυτό το πρόβλημα, το μοντέλο άγριου ποντικού αναπτύχθηκε με μεταφορά εμβρύου που προέρχεται από ποντίκια C57BL/6 σε άγρια ​​ποντίκια για να ληφθεί μια άγριας προέλευσης μικροχλωρίδα του εντέρου, για να ξεπεραστεί το μεταφραστικό ζήτημα των μελετών ανοσολογικής μικροχλωρίδας του εντέρου [54]. Πρόσφατες μελέτες που αφορούσαν αυτό το μοντέλο ποντικού έδειξαν ανώτερα αποτελέσματα στην πρόβλεψη της μεταφραστικής αξίας των πειραματικών ανοσοθεραπειών σε σύγκριση με το CLM [54,55]. Επιπλέον, η άγρια ​​μικροχλωρίδα του εντέρου ήταν πιο ανθεκτική και ανθεκτική στη θεραπεία με αντιβιοτικά και στη δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά σε σύγκριση με την CLM, συγκρίσιμη με την πιο περίπλοκη κατάσταση στους ανθρώπους [54,55]. Ωστόσο, παρά τις καθιερωμένες επιδράσεις της HSD στη μικροχλωρίδα του εντέρου, στο ανοσοποιητικό σύστημα και σε διάφορα μοντέλα ασθενειών στο CLM, οι επιπτώσεις της υψηλής πρόσληψης αλατιού στη φυσική μικροχλωρίδα του εντέρου που προέρχεται από άγρια ​​​​προέλευση είναι άγνωστες. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε την επίδραση του HSD σε διαφορετικές συνθέσεις βακτηριακών οικοσυστημάτων του εντέρου και τις προγνωστικές λειτουργίες του CLM σε σύγκριση με τα άγρια ​​ποντίκια.

2. Υλικά και Μέθοδοι

2.1. Ζώα και Διατροφή

Ποντίκια άγριου τύπου C57BL/6 (θηλυκά 7–8 εβδομάδων, n=20) αγοράστηκαν από τον ποταμό Charles και στεγάστηκαν στις εγκαταστάσεις ζώων του Πανεπιστημίου του Hasselt υπό τυποποιημένες συνθήκες. Άγρια ποντίκια (C57BL/6 γενετικό υπόβαθρο, αρσενικά n=12 και θηλυκά n=11) [54] στεγάστηκαν στις εγκαταστάσεις ζώων του UHasselt υπό τυποποιημένες συνθήκες. Οι μελέτες σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας για Πειράματα σε Ζώα (ECAE) στο Πανεπιστήμιο Hasselt (ID201618A4V1, ID202235). Τα ποντίκια στεγάστηκαν (4 ποντίκια/κλουβί) σε δωμάτιο ελεγχόμενης θερμοκρασίας (21–23 ◦C) με κύκλο φωτός/σκότους 12:12 ωρών. Οι ακόλουθες καθαρισμένες δίαιτες αγοράστηκαν από τη Ssniff (Soest, Γερμανία): 0,5% NaCl/δίαιτα ελέγχου (Ε15430-04) και 4% NaCl/HSD (Ε15431-34). Για την HSD, τα ζώα τρέφονταν με 1% NaCl στο πόσιμο νερό επιπλέον του E15431-34, όπως περιγράφεται στο [28]. Τα ποντίκια CLM κατανεμήθηκαν εξίσου μεταξύ της ομάδας ελέγχου (n=10) και της HSD (n=10). Για τα άγρια ​​ποντίκια, τα αρσενικά και τα θηλυκά άτομα κατανεμήθηκαν επίσης εξίσου στις διατροφικές ομάδες ελέγχου και HSD (6 αρσενικά για τον έλεγχο, 6 αρσενικά για το HSD, 5 θηλυκά για τον έλεγχο και 6 θηλυκά για τον έλεγχο HSD).

φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα

2.2. Εξαγωγή DNA

Η εξαγωγή μικροβιακού DNA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο [28], χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο του QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία). Εν συντομία, σφαιρίδια κοπράνων προστέθηκαν σε ένα 2-mL Eppendorf που περιείχε 0,5 mm γυάλινες χάντρες και 1,5 mL ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (ASL) (Qiagen, Hilden, Γερμανία). Το χτύπημα με σφαιρίδια χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση μηχανικής ομογενοποίησης των σφαιριδίων. Η πλήρης εκχύλιση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με μικρές τροποποιήσεις (παράταση του χρόνου επώασης πρωτεϊνάσης Κ σε 2 ώρες στους 70 ◦C). Οι συγκεντρώσεις DNA αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, ΗΠΑ) και αποθηκεύτηκαν στους -20 ◦C πριν από την ενίσχυση του γονιδίου 16S rRNA.

2.3. Ενίσχυση και προσδιορισμός αλληλουχίας γονιδίου 16S rRNA

Η αλληλουχία γονιδίου 16S rRNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας έναν εκκινητή ειδικό για την περιοχή V4 (F515/R806), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [56]. Εν συντομία, χρησιμοποιήθηκαν 25 ng DNA ανά αντίδραση PCR (30 μL) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix, Roche, Basel, CH, USA) αρχικής μετουσίωσης για 30 δευτερόλεπτα στους 98 ◦C, ακολουθούμενοι από 25 κύκλους (10 δευτ. στους 98 ◦ C, 20 δευτ. στους 55 ◦C και 20 δευτ. στους 72 ◦C). Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, συγκεντρώθηκαν ανά δείγμα και καθαρίστηκαν με σύστημα καθαρισμού με βάση μαγνητικά σφαιρίδια (Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Η προετοιμασία της βιβλιοθήκης πραγματοποιήθηκε με PCR περιορισμένου κύκλου για τη λήψη της ευρετηριασμένης βιβλιοθήκης χρησιμοποιώντας την τεχνολογία Nextera (Nextera XT Index Kit, Illumina, San Diego, CA, USA), ακολουθούμενη από ένα δεύτερο βήμα καθαρισμού μαγνητικών σφαιριδίων AMPure XP. Τα δείγματα με ευρετήριο κανονικοποιήθηκαν στη συνέχεια στην ίδια συγκέντρωση 4nM, συγκεντρώθηκαν και αναλύθηκαν η αλληλουχία τους σε μια πλατφόρμα Illumina MiSeq PE300 με πρωτόκολλο ζευγαριού άκρου 2 × 300 bp σύμφωνα με το εταιρικό πρωτόκολλο (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA).

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Επεξεργασία και Στατιστική Ανάλυση Δεδομένων Αλληλουχίας Γονιδίου 16S rRNA

Οι ακατέργαστες αλληλουχίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας έναν αγωγό QIIME 2 [57]. Μετά το φιλτράρισμα μήκους και ποιότητας (προεπιλεγμένες παράμετροι), οι αναγνώσεις φιλτραρίστηκαν και εκχωρήθηκαν σε λειτουργικές ταξινομικές μονάδες (OTU) χρησιμοποιώντας το DADA2 [58]. Η ταξινομική εκχώρηση πραγματοποιήθηκε από τον αλγόριθμο VSEARCH (https://github.com/torognes/vsearch; πρόσβαση στις 9 Νοεμβρίου 2022) και τη βάση δεδομένων Silva v128 (https://www.arb-silva.de /; προσπελάστηκε στις 9 Νοεμβρίου 2{{4{42}}}}22). Ο πίνακας ASV στη συνέχεια κανονικοποιήθηκε με αραίωση σε βάθος 6,147, έτσι ώστε κάθε δείγμα να φτάσει στο οροπέδιο στο τέλος της καμπύλης αραίωσης. Η άλφα ποικιλομορφία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές μετρήσεις: οικολογικούς δείκτες πλούτου OTUs (Παρατηρήθηκε), Chao1, Shannon, Simpson, Inverse Simpson (InvSimpson). Για τη βήτα ποικιλομορφία, η ανομοιότητα Bray−Curtis, η ομοιότητα Jaccard και οι μετρήσεις σταθμισμένου και μη σταθμισμένου UniFrac [59] υπολογίστηκαν και σχεδιάστηκαν από την ανάλυση αρχικών συντεταγμένων (PCoA) για να απεικονιστεί η πραγματική απόσταση μεταξύ των δειγμάτων. Για να ομαλοποιηθεί ο πίνακας μέτρησης OTU, η αραίωση πραγματοποιήθηκε σε βάθος 6305 ακολουθιών ανά δείγμα 100 φορές. Η έξοδος που προέκυψε από την ανάθεση ταξινόμησης OTU, ως πίνακας ταξινόμησης, χρησιμοποιήθηκε για τη σύμπτυξη του κανονικοποιημένου πίνακα OTU σε πίνακες για τα επίπεδα ταξινόμησης L2 (Phylum), L5 (Οικογένεια) και L6 (Genus). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το R (https://www.R-project.org/; πρόσβαση στις 25 Νοεμβρίου 2022; Έκδοση 4.2.0). Το πακέτο R "vegan" (Έκδοση 2.6-4) [60] χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία μετρήσεων βήτα-ποικιλομορφίας για τη σύγκριση των διαφορών σύνθεσης των ομάδων ανά PCoA ή με ανάλυση κύριου συστατικού (PCA). Τα πακέτα και ο διαχωρισμός δεδομένων δοκιμάστηκαν με δοκιμή μετάθεσης με αναλογίες ψευδο-F (συνάρτηση "Adonis" σε "vegan"). Ο διαχωρισμός ως προς τη βήτα ποικιλομορφία μεταξύ των ομάδων δοκιμάστηκε με μεταβλητή πολυμεταβλητή ανάλυση διακύμανσης με χρήση πίνακες αποστάσεων (PERMANOVA, συνάρτηση "Adonis" στο "vegan"), ενώ οι διαφορές για τη διασπορά εντός των ομάδων δοκιμάστηκαν με τη δοκιμή πολυμεταβλητής ομοιογένειας διασπορών ομάδων (PERMDISP , συνάρτηση "betadisper" σε "vegan"). Ταξίνες που δεν υπήρχαν σε τουλάχιστον 4 δείγματα εξαιρέθηκαν από την ανάλυση. Οι διαφορές ως προς τις σχετικές αφθονίες των ταξινομικών κατηγοριών αξιολογήθηκαν αρχικά με την προκαταρκτική δοκιμή Kruskal-Wallis μεταξύ 4 ομάδων και στη συνέχεια αξιολογήθηκαν περαιτέρω με τη δοκιμή Wilcoxon μεταξύ των ακόλουθων ζευγών σύγκρισης: CLM Control vs. CLM HSD, Wildling Control vs. wildling HSD, CLM Control vs. wildling Control, CLM HSD vs. wildling HSD. Για την αξιολόγηση των ταξινομικών διαφορών μεταξύ wildling και CLM, χρησιμοποιήθηκε γραμμική διάκριση ανάλυσης μεγέθους (LEfSe: https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/; πρόσβαση στις 25 Νοεμβρίου 2022) για τη διάκριση των κύριων χαρακτηριστικών σε επίπεδο γένους [ 61]. Τα αποτελέσματα LEfSe στη συνέχεια εμφανίστηκαν ως ραβδόγραμμα, με όριο βαθμολογίας Γραμμικής Διακριτικής Ανάλυσης (LDA) υψηλότερο από 1,0. Όποτε ήταν απαραίτητο, οι τιμές p πολλαπλών συγκρίσεων προσαρμόστηκαν με τη μέθοδο Benjamini–Hochberg. Ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης (FDR) Μικρότερο ή ίσο με 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντικό: * p Μικρότερο ή ίσο με 0,05. ** p Μικρότερο ή ίσο με 0,01; *** p Μικρότερο ή ίσο με 0,001. Οι λειτουργικές διαφορές μεταξύ μικροβιωμάτων διαφορετικής περιεκτικότητας σε NaCl στα τρόφιμα (0,5% και 4% περιεκτικότητα σε NaCl σε τρόφιμα) αναλύθηκαν από το PICRUSt2, ένα πακέτο λογισμικού βιοπληροφορικής για την πρόβλεψη του λειτουργικού περιεχομένου μεταγονιδιώματος από δεδομένα αλληλουχίας γονιδίου 16s rDNA (https://huttenhower.sph. harvard.edu/picrust/, πρόσβαση στις 29 Νοεμβρίου 2022, PICRUSt2 2. Η διοχέτευση PICRUSt2 εφαρμόστηκε σε αντιπροσωπευτικές ακολουθίες και στον πίνακα αφθονίας τους από το DADA2 χρησιμοποιώντας τυπικές παραμέτρους (https://github.com/ picrust/picrust2/wiki/Full-pipeline-script, πρόσβαση στις 29 Νοεμβρίου 2022). Από την πλήρη έξοδο του αγωγού, η μεταγονιδιωματική πρόβλεψη για τα μονοπάτια KEGG Orthology και MetaCyc δημιουργήθηκαν ως πίνακες, με προγνωστικές συναρτήσεις ως σειρές και δείγματα ως στήλες, και χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση των λειτουργιών της μικροχλωρίδας του εντέρου στην άγρια ​​φύση και του CLM σε καθεστώς HSD. Οι λειτουργίες πρόβλεψης της μικροβιακής κοινότητας που συνέβαλαν περισσότερο στη διακύμανση μεταξύ wildling και CLM κατά το πρώτο (PC1), το δεύτερο (PC2) και το τρίτο κύριο συστατικό (PC3) επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση σχετικά με την κατανάλωση HSD στα δύο μοντέλα. Ο πίνακας με τις αφθονίες των προγνωστικών συναρτήσεων στη συνέχεια κανονικοποιήθηκε, μετασχηματίστηκε σε τιμές Κεντρικού Λόγου Καταγραφής (CLR) και υπολογίστηκε ο μέσος λόγος log2 (HSD/Έλεγχος) τόσο για το wildling όσο και για το CLM. Τέλος, οι λογαριθμικές μέσες αναλογίες συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων με δοκιμή Wilcoxon και απεικονίστηκαν ως σφηνοειδής γραφική παράσταση. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων συγκρίθηκαν στατιστικά στο λογισμικό R χρησιμοποιώντας συναρτήσεις δοκιμής Wilcoxon-test και Kruskal-Wallis και τιμές p προσαρμοσμένες με τη μέθοδο Holm ή Benjamini-Hochberg.

3. Αποτελέσματα

3.1. Το HSD Επηρεάζει την Ποικιλομορφία και τη Σύνθεση του CLM και του Wildling Gut Microbiota

Για να διερευνήσουμε τον αντίκτυπο της HSD σε ένα άγριο μικροβιακό οικοσύστημα του εντέρου σε ποντίκια, ταΐσαμε HSD ή δίαιτες ελέγχου σε άγρια ​​ποντίκια και CLM. Τα ποντίκια διατηρήθηκαν σε διατροφικά σχήματα για δύο εβδομάδες και η σύνθεση της μικροχλωρίδας του εντέρου των κοπράνων διερευνήθηκε στη συνέχεια με προσδιορισμό αλληλουχίας γονιδίου 16S RNA από σφαιρίδια κοπράνων που συλλέχθηκαν την ημέρα 14 (Εικόνα 1Α). Σύμφωνα με μια προηγούμενη αναφορά, δεν ανιχνεύθηκαν ισχυρές διαφορές όσον αφορά το σωματικό βάρος μεταξύ των ομάδων ελέγχου και HSD των CLM και άγριων ποντικών [29]. Για να αξιολογήσουμε τη διαφορετική μικροχλωρίδα του εντέρου μεταξύ των δύο μοντέλων CLM και άγριων ποντικών κατά την έναρξη, υπολογίσαμε την άλφα ποικιλομορφία (δείκτες Observed or Richness, Chao1, Shannon, Simpson και Inverse Simpson), τη βήτα ποικιλομορφία (ανομοιότητα Bray-Curtis) και την κύρια ταξινομικές διαφορές. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες [54], η άγρια ​​μικροχλωρίδα του εντέρου χαρακτηρίστηκε από μεγαλύτερο μικροβιακό πλούτο (Εικόνα 1Β, όλοι οι δείκτες άλφα ποικιλομορφίας), καθώς και από μια ξεχωριστή και πιο ετερογενή μικροβιακή σύνθεση από το CLM (Εικόνα 1C, PERMANOVA p {{9} }.001 & PERMDISP p=0.0009, wildling vs. CLM και Εικόνα S1). Όσον αφορά τις μικροβιακές υπογραφές, η μικροχλωρίδα του εντέρου του CLM και των άγριων ποντικών χαρακτηρίστηκε από διαφορετικά βακτηριακά είδη (Εικόνα S1). Σύμφωνα με τους Rosshart et al. [54], τα βακτηριακά είδη από άγρια ​​ποντίκια ανήκουν στα Intestinomonas, Desulfovibrio, Tuzzerella, Oscillobacter, Orodibacter και το παθογόνο γένος Helicobacter, το οποίο χαρακτήρισε το μη εξημερωμένο προφίλ αυτού του μοντέλου που προέρχεται από άγρια ​​φύση (Εικόνα S1).

Σχήμα 1. Η επίδραση του HSD στη βακτηριακή σύνθεση του CLM (n=10/ομάδα) και των άγριων ποντικιών (n=11 για το άγριο Ctrl και n=12 για το άγριο HSD). (Α) Πειραματικό σχέδιο. Τα ποντίκια C57BL/6 CLM ή άγρια ​​ζώα τράφηκαν με 0,5% NaCl (μάρτυρας, Ctrl) ή υψηλό αλάτι 4% NaCl (HSD) και έντερο της βακτηριακής κοινότητας του εντέρου που χαρακτηρίστηκε από αλληλουχία αμπλικόνιου γονιδίου 16S rRNA. (Β) Δείκτες για την άλφα ποικιλομορφία της μικροχλωρίδας του εντέρου των κοπράνων του CLM και της άγριας φύσης. από αριστερά προς τα δεξιά, εμφανίζονται τα ακόλουθα ευρετήρια: Παρατηρήθηκε (Πλούτος ΕΞΩ), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Αντίστροφο Simpson). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογούνται στατιστικά με το Wilcoxon-test. (Γ) Κύρια γραφική παράσταση ανάλυσης συντεταγμένων της διάταξης βήτα ποικιλομορφίας από τη μέτρηση ανομοιότητας Bray−Curtis μεταξύ CLM έναντι wildling (πάνω), ελέγχου CLM έναντι CLM HSD (κάτω αριστερά) και wildling control έναντι wildling HSD (κάτω δεξιά). Ο διαχωρισμός και η ομοιογένεια μεταξύ των ομάδων υπολογίστηκαν με τα τεστ PERMANOVA και PERMDISP αντίστοιχα. * p Μικρότερο ή ίσο με 0.05; ** p Μικρότερο ή ίσο με 0.01; **** p Μικρότερο ή ίσο με 0.0001. Σχήμα 1. Επίδραση HSD στη βακτηριακή σύνθεση του CLM (n=10/ομάδα) και των ποντικιών άγριας φύσης (n=11 για την εκτόξευση Ctrl και n {= 12 για την εκτόξευση HSD). (Α) Πειραματικό σχέδιο. Τα ποντίκια C57BL/6 CLM ή άγρια ​​ζώα τράφηκαν με 0,5% NaCl (μάρτυρας, Ctrl) ή υψηλό αλάτι 4% NaCl (HSD) και το έντερο της βακτηριακής κοινότητας του εντέρου που χαρακτηρίστηκε από αλληλουχία αμπλικονίου γονιδίου 16S rRNA. (Β) Δείκτες για την άλφα ποικιλομορφία της μικροχλωρίδας του εντέρου των κοπράνων του CLM και της άγριας φύσης. από αριστερά προς τα δεξιά, εμφανίζονται τα ακόλουθα ευρετήρια: Παρατηρήθηκε (Πλούτος ΕΞΩ), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Αντίστροφο Simpson). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογούνται στατιστικά με το τεστ Wilcoxon. (Γ) Κύρια γραφική παράσταση ανάλυσης συντεταγμένων της διάταξης βήτα ποικιλομορφίας από τη μέτρηση ανομοιότητας Bray−Curtis μεταξύ CLM έναντι wildling (πάνω), ελέγχου CLM έναντι CLM HSD (κάτω αριστερά) και wildling control έναντι wildling HSD (κάτω δεξιά). Ο διαχωρισμός και η ομοιογένεια μεταξύ των ομάδων υπολογίστηκαν με τα τεστ PERMANOVA και PERMDISP αντίστοιχα. * p Μικρότερο ή ίσο με 0,05; ** p Μικρότερο ή ίσο με 0,01; **** p Μικρότερο ή ίσο με 0,0001.

Η HSD προκάλεσε σημαντική μείωση στη βακτηριακή ποικιλότητα (Εικόνα 1Β, όλοι οι δείκτες ποικιλότητας άλφα) καθώς και μια σημαντική μικροβιακή μετατόπιση στη σύνθεση του CLM (Εικόνα 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0 .1, CLM Ctrl έναντι CLM HSD). Αντίθετα, η μικροχλωρίδα του εντέρου των άγριων ποντικών χαρακτηρίστηκε από υψηλότερη ποικιλομορφία στους HSD (Εικόνα 1Β, δείκτες Observed & Chao1), με απόκλιση από το CLM, και χαρακτηρίστηκαν επίσης από λιγότερο έντονη μεταβολή της μικροβιακής σύνθεσης κατά την HSD σε σύγκριση με το CLM (Εικόνα 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0.5, wildling Ctrl vs. wildling HSD).

3.2. Η μικροβιακή σύνθεση του εντέρου των άγριων ποντικών είναι πιο ανθεκτική στο HSD από το CLM

Οι διαφορές στη βακτηριακή σύνθεση μεταξύ wildling και CLM χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω ταξινομικά. Σε επίπεδο φυλής, οι πιο άφθονες φυλές από άποψη σχετικής αφθονίας ήταν: Firmicutes (CLM: 52 ± 12%, wildling: 32 ± 34%), Bacteroidota (CLM: 24 ± 23%, wildling: 57 ± 19%), Actinobacteriota (CLM: 1{{10}} ± 7%, wildling: 0,7 ± 1,3%) και Verrucomicrobiota (CLM: 24 ± 23%, wildling: 0%/δεν ανιχνεύθηκε) (Εικόνα 2). Το μικροβιακό προφίλ του εντέρου έδειξε περαιτέρω διαφορετικές αφθονίες για όλες τις φυλές που ανιχνεύθηκαν σε δείγματα κοπράνων μεταξύ άγριων ποντικών και CLM (Εικόνα 2). Ειδικότερα, τα core microbiota phyla Firmicutes, Bacteroidota και Verrucomicrobiota διέφεραν σημαντικά μεταξύ των δύο μοντέλων (Εικόνα 2). Πιο συγκεκριμένα, σε επίπεδο οικογένειας, παρατηρήθηκε διαφορετική συμβολή στη μικροχλωρίδα του εντέρου άγριας φύσης έναντι του CLM για τα περισσότερα από τα βακτήρια που αναφέρθηκαν προηγουμένως ως ευαίσθητα στην HSD [28], συμπεριλαμβανομένων των Lactobacillaceae, Clostridiaceae, Peptostreptococcaceae και Akkermansiaceae (Εικόνα 3). Σύμφωνα με αυτό, παρόμοιες τάσεις επιβεβαιώθηκαν σε επίπεδο γένους μεταξύ δειγμάτων άγριας ζωής και CLM για τα κύρια μέλη των προαναφερόμενων οικογενειών. μεταξύ αυτών, τα πιο αντιπροσωπευτικά ήταν τα Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, Faecalibaculum και Akkermansia (Εικόνες S1 και 4). Για να χαρακτηρίσουμε περαιτέρω τον αντίκτυπο της HSD στις συνθέσεις CLM και άγριων μικροβίων του εντέρου, αναλύσαμε επίσης την επίδραση του διατροφικού σχήματος σε διαφορετικά επίπεδα ταξινόμησης. Σε επίπεδο φυλής, η μικροχλωρίδα του εντέρου CLM που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με HSD χαρακτηρίστηκε από σημαντική εξάντληση των Firmicutes και εμπλουτισμό της Verrucomicrobiota (Εικόνα 2), αλλά κανένας από τους κύριους φυλές δεν επηρεάστηκε από HSD σε δείγματα άγριας φύσης (Εικόνα 2). Σε επίπεδο οικογένειας, η μικροχλωρίδα του εντέρου CLM χαρακτηρίστηκε από σημαντική εξάντληση των βακτηρίων που παράγουν γαλακτικό οξύ, όπως οι Lactobacillaceae, καθώς και των παραγωγών SCFA όπως τα Peptostreptococcaceae και Clostridiaceae (Εικόνα 3). Επιπλέον, στο CLM που τροφοδοτείται με HSD, παρατηρήσαμε αυξήσεις στα Akkermansiaceae, Sutterellaceae, Defluvitaleaceae και Eggerthellaceae (Εικόνα 3). Αντίθετα, η HSD επηρέασε διαφορετικές οικογένειες βακτηρίων σε άγρια ​​μικροχλωρίδα του εντέρου, μεταξύ των οποίων τα δύο σε μεγάλη αφθονία Muribaculaceae και Prevotellaceae, τα οποία και τα δύο αυξήθηκαν κατά την HSD (Εικόνα 3). Η βακτηριακή διαμόρφωση που συνέβαλε περισσότερο στο φαινόμενο HSD στο CLM περιελάμβανε την αύξηση των γενών Akkermansia, Parasutterella και Enterorhabdus, καθώς και τη μείωση των Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, (Eubacterium) oxidoreducens ομάδας, Muribaculum και Anaerovorax (Εικόνα 4). Εκτός από το Roseburia, κανένα από τα προαναφερθέντα γένη δεν επηρεάστηκε από HSD σε άγρια ​​μικροχλωρίδα του εντέρου, ενώ το γένος Anaerovorax παρουσίασε αντίθετη τάση από αυτή του CLM (Εικόνα 4).

Εικόνα 2. Επίδραση HSD σε βακτηριακή φυλή από μικροχλωρίδα του εντέρου CLM (n=10/ομάδα) και άγριων ποντικών (n=11 για άγρια ​​Ctrl και n=12 για άγρια ​​HSD). Η συνολική σύνθεση από την άποψη της σχετικής αφθονίας των φυλών εμφανίζεται με διάγραμμα ράβδων ανά άτομο (επάνω) και τετραγωνίδιο για συγκεκριμένες φυλές (κάτω). Πραγματοποιήθηκαν στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων με Wilcoxon-test. * p Μικρότερο ή ίσο με 0.05; ** p Μικρότερο ή ίσο με {{10}}.01; *** p Μικρότερο ή ίσο με 0,001; **** p Μικρότερο ή ίσο με 0,0001.

Σχήμα 3. Επίδραση της κατανάλωσης τροφής με υψηλή περιεκτικότητα σε αλάτι σε βακτηριακές οικογένειες CLM (n=10/ομάδα) και άγριων ποντικών (n=11 για άγρια ​​Ctrl και n=12 για άγρια ​​HSD). Η συνολική σύνθεση σε επίπεδο οικογένειας αντιπροσωπεύεται από οικόπεδο ράβδων ανά άτομο (πάνω) και κουτί για συγκεκριμένες οικογένειες (κάτω). Πραγματοποιήθηκαν στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων με Wilcoxon-test. * p Μικρότερο ή ίσο με 0.05; ** p Μικρότερο ή ίσο με {{10}}.01; *** p Μικρότερο ή ίσο με 0,001; **** p Μικρότερο ή ίσο με 0,0001.

Εικόνα 4. Αλλαγές στα βακτηριακά γένη σε CLM (n=10/ομάδα) και άγρια ​​ποντίκια (n=11 για wildling Ctrl και n=12 για wildling HSD). Η συνολική σχετική συνεισφορά αφθονίας σε επίπεδο γένους απεικονίζεται ως γραφική παράσταση κυκλικής ράβδου για κάθε άτομο (επάνω) και τετραγωνίδιο για συγκεκριμένα γένη (κάτω). Πραγματοποιήθηκαν στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων με Wilcoxon-test. * p Μικρότερο ή ίσο με 0.05; ** p Μικρότερο ή ίσο με 0.01; *** p Μικρότερο ή ίσο με 0,001; **** p Μικρότερο ή ίσο με 0,0001.

3.3. Το HSD επηρεάζει τις προγνωστικές μικροβιακές λειτουργίες σε CLM αλλά όχι σε άγρια ​​ποντίκια

Η έξοδος PICRUSt 2 δεν ανίχνευσε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των λειτουργιών της μικροβιακής κοινότητας άγριων ποντικών HSD έναντι μη θεραπευμένων άγριων ποντικών τόσο για τους σχολιασμούς της οδού KEGG Orthology όσο και για τους σχολιασμούς του μονοπατιού MetaCyc, με τη μόνη εξαίρεση της επαγόμενης από HSD αυξημένης λειτουργίας στο γονίδιο recG για μια εξαρτώμενη από ATP ελικάση από την Ορθολογία KEGG (Εικόνα 5Α). Ο αντίκτυπος της HSD στο CLM χαρακτηρίστηκε από μια σημαντική μείωση των προγνωστικών λειτουργιών για την Ορθολογία KEGG, μεταξύ των οποίων το γονίδιο spp (σακχαρόζη-6-φωσφατάση) και pfkA (φωσφοφρουκτοκινάση 1), και τα δύο που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του αμύλου και της σακχαρόζης, ο οποίος είναι σύμφωνος με προηγούμενα ευρήματα [28] (Εικόνα 5Α). Επιπλέον, η μικροχλωρίδα του εντέρου του CLM που τροφοδοτείται με HSD χαρακτηρίστηκε από μειωμένες προγνωστικές λειτουργίες γονιδίων που εμπλέκονται στη μεταφορά μεμβράνης (feoB για μεταφορά σιδήρου, πρωτεΐνη περμεάσης AB 2P AB 2, πρωτεΐνη δέσμευσης AB 2A AB 2 ATP), βιοσύνθεση γλουταμίνης (glnA) , μεταγραφικός ρυθμιστής οικογένειας LacI (lacI, galR) και τρανσκετολάση (tktA, tktB) (Εικόνα 5Α). Για τις οδούς MetaCyc, η HSD εμπλούτισε σημαντικά τη μικροχλωρίδα του εντέρου CLM σε προγνωστικές λειτουργίες που σχετίζονται με τη μείωση των νιτρικών (οδός απονιτροποίησης), την αποδόμηση γαλακτόζης (αποδόμηση D-γαλακταρικού, σούπερ οδός αποικοδόμησης D-γλυκαρικού και D-γαλακταρικού), αποικοδόμηση φαινυλ-προπανοϊκού λίπους, διάσωση οξέος, αποικοδόμηση ηλεκτρικού σε βουτανοϊκό οξύ και αποικοδόμηση αμινοξέων (αποδόμηση αρωματικής αμίνης, αποικοδόμηση L-λευκίνης) (Εικόνα 5Β). Επιπλέον, σύμφωνα με προηγούμενα ευρήματα [28], η μικροχλωρίδα του εντέρου HSD στο CLM έχασε τις λειτουργίες πρόβλεψης για τη βιοσύνθεση αμινοξέων (σούπερ οδός βιοσύνθεσης L-αλανίνης, βιοσύνθεση L-λυσίνης), μικτή όξινη ζύμωση, με επιπλέον νέα νέα υπογραφή που χάνεται όπως το N- Αποικοδόμηση ακετυλογλυκοζαμίνης/Ν-ακετυλ-μαννοζαμίνης/Ν-ακετυλνεουραμινικού εστέρα και αποικοδόμηση δεοξυριβονουκλεοσιδίων (αποικοδόμηση πυριμιδίνης και πουρίνης, βιοσύνθεση 5φωσφορικής ινοσίνης III) (Εικόνα 5Β).

Εικόνα 5. Συνέχεια.

Εικόνα 5. Επίδραση του HSD στις προγνωστικές μεταγονιδιωματικές λειτουργίες του εντέρου στο μικροβίωμα του εντέρου CLM (n=10/ομάδα) και wildling (n=11 για wildling Ctrl και n=12 για wildling HSD). Η έξοδος PICRUSt2 σχεδιάστηκε ως σφηνοειδής γραφική παράσταση για τον σχολιασμό ορθολογίας KEGG (A) και τις οδούς MetaCyc (B) που εκφράζεται ως μέσος λόγος log2 των μετρήσεων των προγνωστικών συναρτήσεων μεταξύ δειγμάτων HSD έναντι Ctrl. Όλες οι στατιστικές συγκρίσεις πραγματοποιήθηκαν μεταξύ ομάδων Ctrl έναντι HSD με Wilcoxon-test.

4. Συζήτηση

Η σύνθετη και ποικιλόμορφη άγρια ​​μικροχλωρίδα του εντέρου είναι γνωστό ότι είναι πιο ανθεκτική σε ορισμένα μοντέλα ασθενειών [51] και διατροφικά σχήματα, όπως η πρόσληψη υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά [54,55]. Ωστόσο, καμία προηγούμενη μελέτη δεν έχει αξιολογήσει τις επιδράσεις της υψηλής πρόσληψης νατρίου στο μικροβιοχλωρίδα του εντέρου που προέρχεται από άγρια ​​​​προέλευση ποντικού. Εδώ, διερευνήσαμε για πρώτη φορά πώς η HSD επηρεάζει την άγρια ​​μικροχλωρίδα του εντέρου σε σύγκριση με την CLM. Είναι ενδιαφέρον ότι τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι σε σύγκριση με το CLM, το άγριο μικροβίωμα είναι πιο ανθεκτικό στη διαταραχή της HSD τόσο σε επίπεδο σύνθεσης όσο και σε προγνωστικά λειτουργικά επίπεδα. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η υψηλή πρόσληψη αλατιού θα μπορούσε να επιδεινώσει τον κίνδυνο διαφόρων ασθενειών, όπως καρδιαγγειακά ή αυτοάνοσα νοσήματα, αλλάζοντας τη σύνθεση του μικροβιώματος του εντέρου και την ομοιόσταση του ανοσοποιητικού [25,29,31,34,63-65]. Σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές, οι μετατοπίσεις που προκαλούνται από την HSD στη μικροχλωρίδα του εντέρου στο CLM χαρακτηρίστηκαν από σημαντικές αλλαγές στη μικροβιακή ποικιλομορφία, τη σύνθεση και τις προγνωστικές λειτουργίες [28]. Τα βακτήρια που προάγουν την υγεία όπως η οικογένεια Peptostreptococcaceae και τα γένη Lactobacillus, Roseburia και Tuzzerella μειώθηκαν ως προς τη σχετική αφθονία στο CLM, ενώ το Akkermansia αυξήθηκε σημαντικά στις ομάδες που έλαβαν HSDfed. Ανιχνεύσαμε επίσης υψηλότερη σχετική αφθονία HSD ​​σε Defluvitaleaceae, Enterorhabdus και Parasutterella. Είναι ενδιαφέρον ότι το γένος Parasutterella είναι ένα βασικό συστατικό της μικροχλωρίδας του εντέρου τόσο του CLM όσο και του ανθρώπου, όπου συμπεριφέρεται ως ασακχαρολυτικό και ως παραγωγός ηλεκτρικού [66]. Τόσο το Enterorhabdus από την οικογένεια Eggerthellaceae όσο και το Parasutterella από την οικογένεια Sutterellaceae είναι γνωστό ότι εμπλουτίζονται σε ασθενείς με IBD [67,68], υποδεικνύοντας περαιτέρω πώς η HSD μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη της νόσου. Ωστόσο, είναι ενδιαφέρον ότι τα άγρια ​​ποντίκια δεν εμφάνισαν παρόμοια οντότητα μικροβιακών μετατοπίσεων που προκαλούνται από HSD, όπως το CLM. Παρόλα αυτά, η ποικιλομορφία της άγριας φύσης αυξήθηκε σημαντικά στο HSD για τις παρατηρούμενες μετρήσεις OTU και Chao1, και μόνο λίγα taxa ενεπλάκησαν στη διαταραχή HSD της άγριας μικροχλωρίδας του εντέρου, μεταξύ αυτών η αύξηση του Anaerovorax, σε συνδυασμό με μια μείωση των Erysipelatoclostridium, Roseburia και Lachnospiraceae UCG-004 γένος. Η Roseburia ήταν η μόνη βακτηριακή υπογραφή που κοινοποιήθηκε συνήθως μεταξύ των ομάδων HSD σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους, παρά το γεγονός ότι το CLM που τρέφεται με HSD εξακολουθεί να χαρακτηρίζεται από υψηλότερη αφθονία αυτού του βακτηρίου σε σύγκριση με τα άγρια ​​ποντίκια που τρέφονται με HSD. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα βακτήρια που παράγουν βουτυρικό άλας όπως το Roseburia αποδείχθηκε ότι έχουν χαμηλότερη σχετική αφθονία σε ασθενείς με ελκώδη κολίτιδα [69] και αυτή η μείωση παρατηρήθηκε επίσης να συσχετίζεται με τον γενετικό κίνδυνο IBD για τα ανθρώπινα άτομα [70]. Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενα ευρήματα, όπου οι μετατοπίσεις σε βακτηριακά γένη όπως το Roseburia ή ο Lactobacillus βρέθηκαν να σχετίζονται με κίνδυνο υπέρτασης, που πιθανώς προωθείται από μια δυτική δίαιτα [71]. Η βακτηριακή σύνθεση του εντέρου σχετίζεται επίσης με την κινητικότητα και τη φυσιολογία του εντέρου [72].

Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα

Το γένος Anaerovorax έχει παρατηρηθεί στο παρελθόν σε ποντίκια με μη φυσιολογική φυσιολογία του εντέρου και μειωμένη κινητικότητα [73]. Ωστόσο, ο εμπλουτισμός του Anaerovorax σε HSD για άγρια ​​ποντίκια μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικό ρόλο αυτής της κατηγορίας στο πλαίσιο της ομοιόστασης του εντέρου και της σωστής λειτουργίας. Σύμφωνα με προηγούμενα ευρήματα, παρατηρήσαμε μια αύξηση στο γένος Akkermansia στην ομάδα HSD ​​του CLM [28], ενώ η μικροχλωρίδα του εντέρου των άγριων ποντικών είχε εξαντληθεί από αυτό το γένος, κάτι που είναι επίσης συνεπές με προηγούμενες μελέτες σε αυτό το μοντέλο [51, 53–55]. Αν και το γένος Akkermansia είναι ένα πιθανό προβιοτικό λόγω της θετικής του επίδρασης στη βελτίωση των ανοσολογικών και μεταβολικών προφίλ του ξενιστή (π.χ. στην παχυσαρκία και τον διαβήτη τύπου 2) [42,74-77], ο ρόλος αυτού του γένους είναι ακόμα ασαφής λόγω του αρνητικού του συσχέτιση με κλινικά αποτελέσματα σε καρκίνο του παχέος εντέρου [78], νόσο του Πάρκινσον [79,80] και ασθενείς με σκλήρυνση κατά πλάκας [81]. Σε συμφωνία με τα προηγούμενα αποτελέσματά μας που ελήφθησαν με τα μονοπάτια MetaCyc [28], το CLM μετά την HSD έδειξε μειωμένες προγνωστικές μικροβιακές λειτουργίες που σχετίζονται με το μεταβολισμό του αμύλου και της σακχαρόζης για την ορθολογία KEGG. Ωστόσο, οι μικρές αλλαγές στη βακτηριακή σύνθεση του εντέρου άγριων ποντικών που τρέφονταν με HSD απέτυχαν να προκαλέσουν σημαντικές διακυμάνσεις στις προγνωστικές βακτηριακές λειτουργίες, υποδεικνύοντας ότι η μικροχλωρίδα του εντέρου που προέρχεται από άγρια ​​φύση και τα μεταβολικά/οικολογικά δίκτυα είναι πολύ πιο σταθερά και μπορεί να προσαρμοστούν πολύ πιο εύκολα σε Διατροφικές παραλλαγές που προκαλούνται από HSD σε σύγκριση με τα οικοσυστήματα του εντέρου CLM, γεγονός που απαιτεί περαιτέρω έρευνα. Αξίζει επίσης να αναφερθεί η πιθανή επίδραση της κοινότητας των μυκήτων του εντέρου στο βακτηριακό δίκτυο του εντέρου σε διαφορετικά διατροφικά σχήματα. Προηγούμενες μελέτες έχουν ήδη προτείνει πώς οι πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ βακτηρίων και μυκήτων εμπλέκονται στην ομοιόσταση του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή και στην ανάπτυξη της νόσου [82-85]. Σε αυτό το πλαίσιο, το CLM περιορίζεται περαιτέρω λόγω της χαμηλότερης βακτηριακής πολυπλοκότητάς τους σε σύγκριση με τα άγρια ​​ποντίκια, τα οποία μπορεί να εμποδίσουν τη δημιουργία μιας ποικιλόμορφης μυκοβίωσης του εντέρου [54]. Μελλοντικές μελέτες θα είναι σε θέση να προσδιορίσουν τη συμβολή των μυκητιακών κοινοτήτων του εντέρου σε περιβάλλοντα της μικροχλωρίδας του εντέρου και της ανοσίας του ξενιστή χρησιμοποιώντας το μοντέλο wildling. Συνοπτικά, η μελέτη μας παρέχει δεδομένα σχετικά με το πώς η υψηλή πρόσληψη νατρίου επηρεάζει ένα φυσικό μικροβιακό οικοσύστημα του εντέρου που προέρχεται από άγρια ​​φύση σε σύγκριση με μια εξημερωμένη βακτηριακή κοινότητα του εντέρου CLM. Η μελέτη μας έδειξε ότι η HSD δεν επηρεάζει τα βακτηριακά είδη και τη μικροχλωρίδα του εντέρου σε άγρια ​​ποντίκια με τον ίδιο τρόπο που επηρεάζει ένα εξημερωμένο εντερικό μικροβίωμα από CLM. Αυτή η απόκλιση, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως για άλλα διατροφικά σχήματα ή καταστάσεις όπως οι δίαιτες με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά [54,55], υποδεικνύει ότι απαιτείται μελλοντική έρευνα σε συστήματα φυσικών μοντέλων ποντικών για να ανακεφαλαιωθεί και να εκτιμηθεί ο αντίκτυπος των διατροφικών παρεμβάσεων σε πιο περίπλοκα οικοσυστήματα του εντέρου. όπως στους ανθρώπους.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος