Πράσινη σύνθεση και χαρακτηρισμός νανοσωματιδίων σιδήρου που συντίθενται από υδατικό εκχύλισμα φύλλων Vitex Leucoxylon και οι βιοϊατρικές εφαρμογές του

Αφηρημένη:Η μέθοδος ψυχρής εκχύλισης χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί το υδατικό εκχύλισμα τουVitex leucoxylonφύλλα σε αναλογία 1:10. Τα νανοσωματίδια σιδήρου (FeNPs) συντέθηκαν χρησιμοποιώντας υδατικό εκχύλισμα φύλλωνV. leucoxylonως αναγωγικός παράγοντας. Η προσέγγιση της φυτοϊατρικής χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή FeNPs με ανάμειξη 1 mL φυτικού εκχυλίσματος με 1 mM θειικού σιδήρου. Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM), υπέρυθρη φασματοσκοπία μετασχηματισμού Fourier (FTIR), φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατής (UV-Vis) και φασματοσκοπία ακτίνων Χ διασποράς ενέργειας χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση των συντιθέμενων FeNPs. Η αναγωγική αντίδραση φάνηκε από μια αλλαγή στο χρώμα του διαλύματος και ο σχηματισμός μαύρου χρώματος επιβεβαιώνει ότι έχουν σχηματιστεί FeNPs. Η μεγαλύτερη κορυφή απορρόφησης (max) βρέθηκε στα 395 nm στη φασματική ανάλυση UV-Vis. Τα φάσματα FTIR τουV. leucoxylonΤο υδατικό εκχύλισμα φύλλων έδειξε μετατοπίσεις σε ορισμένες κορυφές, συγκεκριμένα 923,96 cm−1 και 1709,89 εκ−1, με λειτουργικές ομάδες καρβοξυλικά οξέα, ακόρεστες αλδεΰδες και κετόνες, οι οποίες έλειπαν από τα φάσματα FTIR των FeNPs και είναι υπεύθυνες για το σχηματισμό FeNPs. FeNPs με διαμέτρους μεταξύ 45 και 100 nm παρατηρήθηκαν σε εικόνες SEM. Η δημιουργία των FeNP επιβεβαιώθηκε από το EDX, το οποίο δείχνει ένα ισχυρό σήμα στην περιοχή του μεταλλικού σιδήρου στα 6-8 Kev. Το XRD αποκάλυψε μια κρυσταλλική φύση και μια μέση διάμετρο 136,43 nm.Αντιοξειδωτικό,αντιφλεγμονώδη, κυτταροτοξική, καιτην επούλωση των πληγώνin vitro δοκιμές ανέφεραν σημαντική δραστηριότητα των FeNP. Τα σωρευτικά ευρήματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η πράσινη σύνθεση των FeNPsενισχύει τη βιολογική του δραστηριότητακαι μπορεί να χρησιμεύσει ωςένας πιθανός παράγοντας επούλωσης δερματικών πληγώνκαικυτταροτοξικός παράγοντας κατά του καρκίνου. Απαιτείται μελλοντική μελέτη για τον προσδιορισμό των μηχανισμών που εμπλέκονται στη σύνθεση των FeNP απόV. leucoxylonκαι τις βιοϊατρικές εφαρμογές του.

Λέξεις-κλειδιά:Vitex λευκοξυλόνη; νανοσωματίδια σιδήρου; SEM; την επούλωση των πληγών; κυτταροτοξική

ΟΦΕΛΗ CISTANCHE ΓΙΑΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ,ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΤΙΚΟ, ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΟ, ΚΑΙΤΗΝ ΕΠΟΥΛΩΣΗ ΤΩΝ ΠΛΗΓΩΝ

1. Εισαγωγή

Η εφαρμογή της νανοτεχνολογίας στην επιστήμη και την τεχνολογία για την κατασκευή νέων υλικών σε επίπεδο νανοκλίμακα είναι ένα ταχέως αναπτυσσόμενο πεδίο [1]. Η νανοτεχνολογία ασχολείται με την κατασκευή υλικών σε ατομικό επίπεδο για να αποκτήσει διακριτικές ιδιότητες, τις οποίες μπορούν να χειριστούν για προτιμώμενες εφαρμογές. Αυτός ο τομέας αναπτύσσεται ταχέως με τις εφαρμογές του στην επιστήμη και την τεχνολογία για την κατασκευή νέων υλικών σε επίπεδο νανοκλίμακα [2]. Διάφοροι βιομηχανικοί τομείς έχουν αγκαλιάσει τη νανοτεχνολογία τα τελευταία χρόνια λόγω των εφαρμογών της στους τομείς των ηλεκτρονικών συστημάτων αποθήκευσης [3], της βιοτεχνολογίας [4], του μαγνητικού διαχωρισμού και προσυγκέντρωσης των αναλυτών στόχων, της στοχευμένης διανομής φαρμάκων [5] και των φορέων για γονίδια και φάρμακα παράδοση [3,5,6]. Κατά συνέπεια, αυτά τα σωματίδια έχουν τη δυνατότητα να έχουν ουσιαστικό αντίκτυπο στην κοινωνία ως αποτέλεσμα του ευρέος φάσματος εφαρμογών για τις οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν. Τα νανοσωματίδια (NPs) είναι μάζες σωματιδίων που έχουν μέγεθος μικρότερο από εκατό νανόμετρα και θεωρούνται βασικές δομικές μάζες στον τομέα της νανοτεχνολογίας. Η υψηλότερη δραστηριότητα των NP είναι τόσο το καθοριστικό τους χαρακτηριστικό όσο και η ποιότητα για την οποία διακρίνονται περισσότερο [7]. Τα οργανικά και τα ανόργανα NPs είναι οι δύο κύριες ταξινομήσεις που μπορούν να εφαρμοστούν στα νανοσωματίδια. Τα ανόργανα νανοσωματίδια μπορεί να περιλαμβάνουν μαγνητικά NP, NP ευγενών μετάλλων (όπως χρυσός και ασήμι) και NP ημιαγωγών (όπως το διοξείδιο του τιτανίου και το οξείδιο του ψευδαργύρου). Τα οργανικά νανοσωματίδια μπορεί να περιλαμβάνουν NPs άνθρακα. Τα ανόργανα νανοσωματίδια προσελκύουν τεράστια προσοχή επειδή προσφέρουν ανώτερες ιδιότητες υλικού μαζί με λειτουργική ευελιξία. Έχουν διερευνηθεί ως πιθανά εργαλεία για ιατρική απεικόνιση καθώς και για τη θεραπεία ασθενειών λόγω των χαρακτηριστικών μεγέθους που διαθέτουν [8]. Οι ποικίλες χημικές, φυσικές και βιολογικές ιδιότητες των NPs επηρεάζονται σε μεγάλο βαθμό από μια ποικιλία παραμέτρων, συμπεριλαμβανομένου του μεγέθους και της μορφολογίας των νανοσωματιδίων, καθώς και της επικάλυψης της επιφάνειας, που κανονικά καθορίζονται κατά τη σύνθεση των νανοσωματιδίων. Η απώλεια της επιδιωκόμενης βιολογικής δραστηριότητας προκαλείται από τη μείωση της κολλοειδούς σταθερότητας. Το pH, η ιοντική ισχύς και μια σειρά πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με AgNPs υπό σχετικές συνθήκες έχουν όλα αντίκτυπο στην κολλοειδή σταθερότητα. Ως αποτέλεσμα, η σωστή επιλογή τεχνικής σύνθεσης είναι κρίσιμη για την απόκτηση των επιθυμητών χαρακτηριστικών σωματιδίων για συγκεκριμένες εφαρμογές [9].

Επί του παρόντος, υπάρχει μια μεγάλη ποικιλία NP που μπορούν να συντεθούν χρησιμοποιώντας μια ποικιλία φυσικών, χημικών, βιολογικών και υβριδικών διεργασιών. Σύμφωνα με τα ευρήματα μεγάλου αριθμού ερευνητικών μελετών, οι φυσικές και χημικές διεργασίες για την παραγωγή νανοσωματιδίων περιλαμβάνουν τη χρήση οργανικών διαλυτών, επικίνδυνων ενώσεων, σημαντικών ποσοτήτων ενέργειας και σταθεροποιητικών παραγόντων που δεν είναι βιοαποδομήσιμα [10]. Ως εκ τούτου, στον τομέα της πράσινης νανοτεχνολογίας, η σύνθεση NPs χρησιμοποιώντας φυσικά διαθέσιμα υλικά όπως φυτικά εκχυλίσματα, διάφορους μικροοργανισμούς, τους μεταβολίτες τους και μερικές φυσικές χουμικές ουσίες [11,12] ως αναγωγικούς και καλύπτοντες παράγοντες γίνεται όλο και πιο δημοφιλής. Μέθοδοι σύνθεσης που είναι φιλικές προς το περιβάλλον έχουν χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή μιας ευρείας ποικιλίας μεταλλικών νανοσωματιδίων, όπως ασήμι, χρυσός, σίδηρος, χαλκός και ψευδάργυρος. Η ανάπτυξη εύκολων και περιβαλλοντικά αποδεκτών μεθόδων για τη σύνθεση NPs είναι ένα από τα βασικά σημεία εστίασης της νανοτεχνολογίας. Βιοϋλικά όπως μικροοργανισμοί και φυτικά εκχυλίσματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη διαδικασία παρασκευής μιας μεγάλης ποικιλίας NPs [13,14]. Ωστόσο, επειδή ορισμένοι οργανισμοί είναι παθογόνοι μικροοργανισμοί, είναι επικίνδυνος ο χειρισμός τους. Για να ευδοκιμήσουν, οι μικροοργανισμοί πρέπει να διατηρούνται σε καλλιέργεια και να υποβάλλονται σε προσεκτικά ελεγχόμενες συνθήκες, συμπεριλαμβανομένων της θερμοκρασίας, του pH και άλλων παραμέτρων. Επειδή εξαλείφει την επίπονη διαδικασία διατήρησης της μικροβιακής καλλιέργειας, η σύνθεση NPs χρησιμοποιώντας μέρη φυτών μπορεί μερικές φορές να αποδειχθεί πιο πλεονεκτική από άλλες βιολογικές διεργασίες [15]. Ως αποτέλεσμα, έχει συγκεντρώσει μεγάλη προσοχή λόγω των εγγενών χαρακτηριστικών του, που περιλαμβάνουν την αξιοποίηση των φυσικών πόρων, την ταχύτητα, την φιλικότητα προς το περιβάλλον και την καλοσύνη. Αυτά τα δελεαστικά χαρακτηριστικά είναι απολύτως απαραίτητα για χρήση σε ιατρικές εφαρμογές. Τα νανοσωματίδια που παράγονται από την πράσινη σύνθεση έχουν μέγεθος που είναι καλά καθορισμένο και υπό έλεγχο, είναι απαλλαγμένα από ρύπους και η μέθοδος είναι απλή στην κλιμάκωση. Αυτά είναι μερικά από τα πρόσθετα οφέλη της πράσινης σύνθεσης [16]. Η βιολογική δραστηριότητα των συντιθέμενων νανοσωματιδίων προσδιορίζεται και ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό από τα πράσινα υλικά που χρησιμοποιούνται για τη σταθερότητα και τη μείωση των μεταλλικών ιόντων. Μία από τις ιδανικές ιδιότητες των NPs θα πρέπει να είναι ότι πρέπει να έχει εξαιρετική ικανότητα να κάνει διάκριση μεταξύ πιθανών στόχων (παθογόνων) και κυττάρων θηλαστικού (ξενιστή) [17].

Εξαιτίας αυτού, το υδατικό εκχύλισμα των φύλλων V. leucoxylon διερευνήθηκε για τη δυνατότητά του να διευκολύνει το σχηματισμό νανοσωματιδίων σιδήρου (FeNPs) στην τρέχουσα έρευνα. Ο σίδηρος είναι ένα από τα στοιχεία που μπορεί να βρεθεί στη μεγαλύτερη αφθονία στη Γη. Πρόσφατα, έχει αναγνωριστεί ως μια νέα κατηγορία σημαντικών NP λόγω του γεγονότος ότι διαθέτει μια ποικιλία μοναδικών ιδιοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της υψηλής καταναγκασμού και του υπερπαραμαγνητισμού. Cataly sis, ηλεκτρονικές συσκευές, αποθήκευση πληροφοριών, αισθητήρες, τεχνολογία παράδοσης φαρμάκων, βιοϊατρική, συσκευές μαγνητικής καταγραφής και περιβαλλοντικός καθαρισμός είναι μερικές μόνο από τις πολλές ενδιαφέρουσες εφαρμογές που έχουν κάνει χρήση των FeNPs [18]. Επιπλέον, σύμφωνα με μια σειρά από μελέτες, τα FeNPs μπορούν να δημιουργηθούν από διάφορα φυτικά εκχυλίσματα. Αυτά τα φυτικά εκχυλίσματα περιλαμβάνουν το φύλλο Eucalyptus globulus [19], το φύλλο ροδιού [20] και τη στάχτη φλούδας μπανάνας [21]. Το φυτό V. leucoxylon, το οποίο χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη, είναι μέλος της οικογένειας Verbenaceae. Είναι επίσης γνωστό ως το πεντάφυλλο αγνό δέντρο (Κανάντα: Sengeni, Holenekki, Hollalakki) και μπορεί να βρεθεί στην περιοχή κατά μήκος όχθες ποταμών σε αειθαλή και ημιαειθαλή δάση και υγρά φυλλοβόλα δάση κατά μήκος των ρεμάτων. Μπορεί να φτάσει σε ύψος έως και 20 m και χαρακτηρίζεται ως μέτριο έως μεγάλο φυλλοβόλο δέντρο. Κατά μήκος των δασών των Δυτικών Γκατς της Ινδίας, μπορεί να βρεθεί σε μεγάλους αριθμούς. Η έγχυση εκχυλίσματος φύλλων V. leucoxylon έχει αναφερθεί ότι διαθέτει μεγάλη ποικιλία φαρμακολογικών δράσεων όπως αντιφλεγμονώδεις, αντιοξειδωτικές, αντιψυχωσικές, αντικαταθλιπτικές, αντιπαρκινσονικές και αντιυπερλιπιδαιμικές δραστηριότητες [22]. Τα φυσικά προϊόντα, σε όλη την ιστορία και ιδιαίτερα στη λαϊκή ιατρική, έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία μιας μεγάλης ποικιλίας παθήσεων και ασθενειών. Αυτή η πρακτική χρονολογείται από την αρχαιότητα. Οι μέθοδοι χημείας φυσικών προϊόντων που υπάρχουν εδώ και πολύ καιρό έχουν κάνει δυνατή την εύρεση μιας τεράστιας ποικιλίας βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών που προέρχονται από χερσαίες και θαλάσσιες πηγές. Ένας σημαντικός αριθμός αυτών των φυσικών ουσιών εξετάζεται τώρα για χρήση ως πιθανά φαρμακευτικά προϊόντα [23].

Υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός φυσικών χημικών και θρεπτικών ουσιών που δεν έχουν ακόμη αποκαλυφθεί και είναι χρήσιμες για την ανθρωπότητα. Ως συνέπεια αυτού, υπάρχει άμεση ζήτηση για έρευνα και ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών επιλογών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν με επιτυχία σε θεραπευτικές παρεμβάσεις, δημιουργώντας παράλληλα ένα ελάχιστο ποσό ανεπιθύμητων ενεργειών.

Η τρέχουσα προτεινόμενη διαδικασία πράσινης σύνθεσης για FeNPs είναι διακριτή και οικονομικά αποδοτική. Στην παρούσα μελέτη, έγινε προσπάθεια δημιουργίας νανοσωματιδίων σε θερμοκρασία δωματίου χωρίς τη χρήση χημικών ή φυσικών τεχνικών. Το φυτό Vitex leucoxylon επιλέχθηκε σε μια προσπάθεια σύνθεσης νανοσωματιδίων σιδήρου και πραγματοποιήθηκαν ολοκληρωμένα συστηματικά μοντέλα in vitro για την αξιολόγηση της ισχύος των νανοσωματιδίων σιδήρου. Μόνο ένας περιορισμένος αριθμός ερευνητικών μελετών σχετικά με την έννοια των νανοσωματιδίων και τις βιοϊατρικές εφαρμογές τους έχει δημοσιευθεί σε αυτό το φυτό. Ως αποτέλεσμα, αποφασίσαμε ότι θα ήταν ωφέλιμο να πραγματοποιήσουμε αυτήν την έρευνα έχοντας κατά νου τους ακόλουθους στόχους: έλεγχος για φυτοχημικά και μέτρηση του αριθμού των δευτερογενών μεταβολιτών στο V. leucoxylon. πράσινο σύνθεση και χαρακτηρισμός FeNPs από V. leucoxylon; Συγκριτική μελέτη των αντιοξειδωτικών και αντιφλεγμονωδών επιδράσεων του V. leucoxylon και των FeNP του in vitro. in vitro κυτταροτοξική δράση του υδατικού εκχυλίσματος φύλλων του V. leucoxylon και των FeNP του κατά του καρκίνου του δέρματος, του καρκίνου του πνεύμονα και του καρκίνου του στόματος. in vitro επουλωτική δράση τραυμάτων του υδατικού εκχυλίσματος φύλλων του V. leucoxylon και των συνθετικών FeNP του με δοκιμασία γρατσουνίσματος.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Συλλογή Φυτικού Υλικού

Τον Μάρτιο του 2022, μαζεύτηκαν φρέσκα φύλλα του V. leucoxylon από τη δασική περιοχή Anshi των Δυτικών Ghats στην περιοχή Uttar Kannada της πολιτείας Karnataka στην Ινδία. Τα φύλλα ταυτοποιήθηκαν και επικυρώθηκαν από τον Δρ. Kotresha K., Ταξονομολόγο, Τμήμα Βοτανικής, Κολλέγιο Επιστημών Karnataka, Dharwad. Karnataka, αναφερόμενος στο δείγμα κουπονιού που κατατέθηκε στο Τμήμα Βοτανικής, Karnataka Science College, Dharwad, Karnataka. Αφού συλλέχθηκε, το φρέσκο ​​υλικό των φύλλων του φυτού πλύθηκε με τρεχούμενο νερό βρύσης, ξηράνθηκε στον ήλιο και στη συνέχεια αλέστηκε σε χονδροειδή σκόνη χρησιμοποιώντας μηχανικό μύλο. Η σκόνη διατηρήθηκε σε δοχεία που ήταν σφραγισμένα σε θερμοκρασία δωματίου, ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί αργότερα στη διαδικασία εκχύλισης ακατέργαστου διαλύτη.

2.2. Παρασκευή Φυτικού Εκχυλίσματος

Χρησιμοποιώντας μια συσκευή Soxhlet, 25 g κονιοποιημένων φύλλων εκχυλίστηκαν για 48 ώρες με 250 mL απεσταγμένου νερού. Το υδατικό εκχύλισμα συμπυκνώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας έναν περιστροφικό εξατμιστή και στη συνέχεια ξηράνθηκε σε ξηραντήρες πριν διατηρηθεί σε κλειστή φιάλη στους 4°C μέχρι τη χρήση. Για τη σύνθεση των FeNPs, το υδατικό εκχύλισμα χρησιμοποιήθηκε ως αναγωγικός και σταθεροποιητικός παράγοντας.

2.3. Διαλύτες και Αντιδραστήρια

Όλα τα χρησιμοποιούμενα χημικά και διαλύτες ήταν αναλυτικής ποιότητας και αγοράστηκαν από την Hi-media (Hubli, Ινδία).

2.4. Φυτοχημική Ανάλυση

Ακολουθώντας τη διαδικασία που περιγράφεται από τους Deepti et al. (2012), το ακατέργαστο υδατικό εκχύλισμα φύλλων V. leucoxylon δοκιμάστηκε ποιοτικά για την παρουσία διαφόρων φυτοχημικών συστατικών όπως φλαβονοειδή, αλκαλοειδή, φαινόλες, γλυκοσίδες, στερόλες, λιγνίνες, σαπωνίνες, ανθρακινόνες, τανίνες [24].

2.5. Σύνθεση Νανοσωματιδίων Σιδήρου

Αρχικά, 1 mL υδατικού εκχυλίσματος φύλλων V. leucoxylon προστέθηκε σε 10 mL υδατικού διαλύματος FeS04 0,05 mM και το μίγμα ανακινήθηκε. Σε θερμοκρασία δωματίου και σε σκοτεινό περιβάλλον, διεξήχθη η πλήρης διαδικασία του μίγματος αντίδρασης. Η αντίδραση οξείδωσης/αναγωγής ήταν καθαρά ορατή μετά την επώαση του άχρωμου μίγματος αντίδρασης και την αντίδραση για το απαιτούμενο χρονικό διάστημα [25]. Προκειμένου να αφαιρεθούν τυχόν ίχνη υδατικού εκχυλίσματος από τα πρόσφατα συντιθέμενα FeNP, τα οποία αφέθηκαν να στεγνώσουν σε σκόνη μετά από φυγοκέντρηση στις 10,{7}} rpm για δέκα 10 λεπτά κατά τη διάρκεια της επιθυμητής περιόδου αντίδρασης, το υδατικό μίγμα που περιείχε FeNP φυγοκεντρήθηκε δεύτερη φορά και επαναδιασκορπίστηκε σε διπλά αποσταγμένο νερό και ξηράνθηκε [26].

2.6. Χαρακτηρισμός των FeNPs

Διάφορες μέθοδοι, όπως η φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατής (UV-Vis), η υπέρυθρη φασματοσκοπία μετασχηματισμού Fourier (FTIR), η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης και η φασματοσκοπία ακτίνων Χ διασποράς ενέργειας, η περίθλαση ακτίνων Χ (XRD), ο αναλυτής μεγέθους σωματιδίων και η ζήτα δυναμικό, χρησιμοποιήθηκαν για τον χαρακτηρισμό των FeNPs.

2.6.1. Ανάλυση με βάση την υπεριώδη ακτινοβολία-ορατή-φασματοσκοπία

Αρχικά, υποπολλαπλάσιο δείγμα 1 mL κολλοειδούς διαλύματος FeNPs σε κυψελίδες χαλαζία αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία UV-ορατής (U-3310, Hitachi, Τόκιο, Ιαπωνία), χρησιμοποιώντας απεσταγμένο νερό ως αναφορά και 0.05 mM FeSO4 ως τυφλό, για την επικύρωση της αναγωγής των ιόντων σιδήρου στο κολλοειδές διάλυμα [27].

2.6.2. Ανάλυση με βάση το FTIR

Οι ομάδες λειτουργίας (ομάδες) που δεσμεύτηκαν στην επιφάνεια του σιδήρου και συμμετείχαν στη σύνθεση των FeNPs αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία FTIR (S700, Nicolet, MA, ΗΠΑ), [28]. Μετά από 72 ώρες επώασης, τα FeNPs απομονώθηκαν με επαναλαμβανόμενη φυγοκέντρηση (3-4 φορές) των μιγμάτων της αντίδρασης στις 10,000 rpm για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο αντικαταστάθηκε από απιονισμένο νερό και το ίζημα αποθηκεύτηκε ως σκόνη. Μετά την ξήρανση, τα FeNP υποβλήθηκαν σε ανάλυση FTIR χρησιμοποιώντας τη διαδικασία σφαιροποίησης βρωμιούχου καλίου σε αναλογία 1:100.

2.6.3. Σάρωση-Ηλεκτρονική-Μικροσκοπική Ανάλυση

Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, USA), χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση των νανοσωματιδίων και τον καθορισμό του σχήματος της επιφάνειάς τους. Τα υποστρώματα παρασκευάστηκαν σε ένα καθαρό υπόστρωμα Si 5 χλστ. χ 5 χλστ. αποκομμένο από γκοφρέτα διαμέτρου 100 χλστ. Το υπόστρωμα αφέθηκε να αντιδράσει για 2 ώρες έως 6 ώρες και το δείγμα παρασκευάστηκε με φυγοκέντρηση ενός κολλοειδούς διαλύματος στις 10,{8}} rpm για 5 λεπτά. Το ίζημα ξηράνθηκε αφού επαναφυγοκεντρήθηκε πολλές φορές, μετά επαναδιασπάρθηκε σε απιονισμένο νερό και η διαδικασία επαναλήφθηκε. Τέλος, ελήφθη το ξηρό σφαιρίδιο, το οποίο υποβλήθηκε περαιτέρω στον δομικό χαρακτηρισμό με ανάλυση SEM σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Προτύπων και Τεχνολογίας, NIST-2007 [29].

2.6.4. Ακτινογραφία διασποράς ενέργειας

Μετά από ξήρανση σε χάλκινο πλέγμα επικαλυμμένο με άνθρακα, τα ανηγμένα FeNP αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας EDX (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, USA), το οποίο επέτρεψε επίσης να προσδιοριστεί η στοιχειακή σύνθεση.

2.6.5. Δυνατότητα Ζέτα

Παρατηρήσεις των NP Το δυναμικό ζήτα είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την απόκτηση πρόσθετων γνώσεων σχετικά με τη σταθερότητα των κολλοειδών NPs. Το πλάτος του δυναμικού ζήτα παρέχει μια υπόδειξη ως προς την πιθανή σταθερότητα του κολλοειδούς. Σύμφωνα με τους Meléndrez et al. (2010), τα σωματίδια θεωρούνται σταθερά εάν οι τιμές ζήτα δυναμικού τους είναι είτε θετικότερες από συν 30 mV είτε πιο αρνητικές από 30 mV [30]. Αυτό το γεγονός θα πρέπει να ληφθεί υπόψη. Ο μετρητής ζήτα λέιζερ χρησιμοποιήθηκε για να ληφθούν μετρήσεις των δυναμικών ζήτα της επιφάνειας (Malvern zeta seizer 2000, Malvern, UK). Τα υγρά δείγματα των νανοσωματιδίων, συνολικού ύψους 5 χιλιοστόλιτρων, αραιώθηκαν με 50 χιλιοστόλιτρα διπλής απεσταγμένου νερού και χρησιμοποιήθηκαν 2 χιλιοστά ανά τετραγωνικό μέτρο χλωριούχου νατρίου ως διάλυμα ηλεκτρολύτη αιώρησης. Μετά από αυτό, το pH τροποποιήθηκε μέχρι να φτάσει στο επιθυμητό επίπεδο. Τα δείγματα αναδεύτηκαν για συνολικά 30 λεπτά. Μετά την ανακίνηση του δοχείου, σημειώθηκε το ρΗ σε ισορροπία και προσδιορίστηκε το δυναμικό ζήτα των μεταλλικών σωματιδίων. Για τον προσδιορισμό του επιφανειακού δυναμικού των FeNPs, χρησιμοποιήθηκε το δυναμικό ζήτα. Σε κάθε περίπτωση, η δηλωθείσα τιμή ήταν ο μέσος όρος των αποτελεσμάτων τριών μεμονωμένων μετρήσεων. Όταν οι τιμές του δυναμικού ζήτα κυμαίνονταν από υψηλότερες από συν 30 mV έως χαμηλότερες από 30 mV, προσδιορίστηκαν τα κριτήρια για τη σταθερότητα των NPs [31].

2.6.6. Αναλυτής μεγέθους σωματιδίων

Προκειμένου να προσδιοριστεί το μέγεθος των σωματιδίων του δείγματος, πραγματοποιήθηκε δοκιμή PSA σε αυτό αφού είχε λυοφιλοποιηθεί και στη συνέχεια διασκορπίστηκε με τη χρήση υπερήχων (SZ-100, Horiba, Kyoto, Ιαπωνία).

2.6.7. Ανάλυση περίθλασης ακτίνων Χ (XRD) Ανάλυση

Τα συντιθέμενα νανοσωματίδια σιδήρου από υδατικό εκχύλισμα φύλλων του V. leucoxylon υποβλήθηκαν σε ανάλυση XRD (Smart Lab SE, Rigaku, Τόκιο, Ιαπωνία) για να προσδιοριστεί η φύση καθώς και το μέσο μέγεθος των νανοσωματιδίων.

2.7. Προσδιορισμός της Αντιοξειδωτικής Δραστικότητας με τη χρήση μεθόδων in vitro

2.7.1. Δοκιμασία αντιοξειδωτικής ισχύος που μειώνει τα ιόντα σιδήρου (FRAP)

Σύμφωνα με τον Oyaizu (1986), με μια μικρή τροποποίηση, αξιολογήθηκε η αναγωγική ισχύς των ιόντων σιδήρου [32]. Για 30 λεπτά στους 50 ◦C, 2,5 mL ρυθμιστικού φωσφορικού διαλύματος 20 mM και 2,5 mL σιδηροκυανιούχου καλίου 1 τοις εκατό προστέθηκαν σε 2,5 mL εκχυλίσματος φύλλων V. leucoxylon και αναμίχθηκε το συνθετικό του με FeNPs ο συνδυασμός. Μετά την περίοδο επώασης, το μίγμα συμπληρώθηκε με 2,5 mL 10 τοις εκατό β/ο τριχλωροξικού οξέος και 0,5 ml 0,1 τοις εκατό β/β χλωριούχου σιδήρου πριν επωαστεί για επιπλέον 10 λεπτά. Τέλος, χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο UV-V για την ανίχνευση της απορρόφησης στα 700 nm. Ως πρότυπο, χρησιμοποιήθηκε ασκορβικό οξύ. Κάθε δείγμα δοκιμάστηκε τρεις φορές.

2.7.2. Δοκιμασία καθαρισμού υπεροξειδίου του υδρογόνου

Με βάση την ικανότητα του υδατικού εκχυλίσματος φύλλων του V. leucoxylon και των συνθετικών του FeNPs να καθαρίζουν το υπεροξείδιο του υδρογόνου, αξιολογήθηκε η αντιοξειδωτική δράση αυτών των ενώσεων. Αρχικά, {{0}},6 mL ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (pH-7,4) που περιέχει 4 mM H2O2 προστέθηκε σε 0,5 mL τυπικού ασκορβικού οξέος σε γνωστή συγκέντρωση, καθώς και σωλήνες που περιείχαν φυτικά εκχυλίσματα σε διάφορες συγκεντρώσεις που κυμαίνεται από 100 µL έως 500 µL (pH—7,4). Χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών και τυφλό διάλυμα χωρίς υπεροξείδιο του υδρογόνου, αξιολογήσαμε την απορρόφηση του διαλύματος στα 230 nm μετά από 10 λεπτά. Χρησιμοποιήθηκε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών για τη δημιουργία του ελέγχου αντί του δείγματος ή του προτύπου [33]. Κάθε δείγμα δοκιμάστηκε τρεις φορές. Η προσέγγιση του τύπου χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του ποσοστού αναστολής.

2.7.3. DPPH Free-Radical-Scavenging

Δοκιμασία Το εκχύλισμα φύλλων V. leucoxylon και τα συντιθέμενα FeNP δοκιμάστηκαν για την ικανότητά τους να καθαρίζουν τις ελεύθερες ρίζες χρησιμοποιώντας τη ρίζα DPPH ως αντιδραστήριο [34]. Τα δείγματα συνδυάστηκαν με διάλυμα ρίζας DPPH (60 Μ) σε αιθανόλη (100 μL) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (β/ο). Χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο UV-Vis για τη μέτρηση της απορρόφησης του μίγματος στα 517 nm μετά από 30 λεπτά επώασης στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Ως πρότυπο για το πείραμα χρησιμοποιήθηκε ασκορβικό οξύ. Η ακόλουθη εξίσωση χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας καθαρισμού DPPH κάθε δείγματος:

όπου το Ac αντιπροσωπεύει την απορρόφηση της αντίδρασης ελέγχου, η οποία πραγματοποιείται με ανάμειξη 100 L αιθανόλης με 100 L του διαλύματος DPPH, και το At αντιπροσωπεύει την απορρόφηση του δείγματος δοκιμής. Τα πειράματα έγιναν σε τρίδυμα. Η τιμή IC50 υπολογίστηκε για κάθε δείγμα. Ένα υψηλότερο επίπεδο δραστικότητας ελεύθερων ριζών υποδείχθηκε από το μίγμα της αντίδρασης που είχε χαμηλότερη απορρόφηση.

2.7.4. Δοκιμασία φωσφομολυβδαινίου (PM).

Η ολική αντιοξειδωτική δράση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την τυπική τεχνική Prieto et al., 1999. Κάθε δοκιμαστικός σωλήνας που περιείχε 3 mL απεσταγμένου νερού και 1 mL διαλύματος αντιδραστηρίου μολυβδαινικού έλαβε ένα υδατικό εκχύλισμα φύλλων από V. leucoxylon και τα FeNP του σε ποικίλες συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 100 µL έως 500 µL. Αυτοί οι σωλήνες επωάστηκαν για 90 λεπτά στους 95 ◦C. Η απορρόφηση του μίγματος της αντίδρασης μετρήθηκε στα 695 nm αφού αυτοί οι σωλήνες ρυθμίστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 20-30 λεπτά μετά την επώαση. Το πρότυπο αναφοράς ήταν το ασκορβικό οξύ [35].

2.8. Αξιολόγηση In Vitro Αντιφλεγμονώδους Δραστηριότητας

Η αντιφλεγμονώδης δράση του υδατικού εκχυλίσματος φύλλων του V. leucoxylon και των παραγόμενων FeNPs του αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μετουσίωσης πρωτεΐνης που περιγράφεται από τους Elias et al., 1988, με ελαφρές τροποποιήσεις [36]. Ως τυπικό φάρμακο, χρησιμοποιήθηκε νατριούχος δικλοφενάκη. Μίγμα αντίδρασης που περιελάμβανε 2 mL γνωστής συγκέντρωσης παρασκευασμένων FeNPs (100 g/mL) με πρότυπο νατριούχο δικλοφενάκη (100 g/mL) και 2,8 mL φυσιολογικού ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά (pH 6,4) αναμίχτηκε με 2 mL φρέσκου αυγού κότας αλβουμίνη (1 mM) και επωάστηκε στους 27 ± 1 °C για 15 λεπτά. Η μετουσίωση προκλήθηκε τοποθετώντας το μίγμα της αντίδρασης σε λουτρό νερού στους 70°C για 10 λεπτά. Μετά την ψύξη, η απορρόφηση στα 660 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας διπλά απεσταγμένο νερό ως τυφλό. Κάθε δοκιμή πραγματοποιήθηκε τρεις φορές. Ο ακόλουθος τύπος χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του ποσοστού αναστολής της μετουσίωσης πρωτεΐνης:

όπου, Στην απορρόφηση του δείγματος δοκιμής =. Ac=απορρόφηση του ελέγχου.

2.9. Προσδιορισμός Κυτταροτοξικής και Αντικαρκινικής Δραστικότητας Νανοσωματιδίων Σιδήρου με τη χρήση της ανάλυσης MTT

Αξιολογήθηκε η επίδραση του V. leucoxylon και των συντιθέμενων FeNP του στη βιωσιμότητα των μη καρκινικών ινοβλαστικών κυττάρων L292 και η αντικαρκινική του δράση στον καρκίνο του δέρματος (A375), στον καρκίνο του πνεύμονα (A549) και στον καρκίνο του στόματος (KB-3-1). χρησιμοποιώντας την τυπική δοκιμασία ΜΤΤ, σύμφωνα με τους Carmichael et al., (1987) [37]. Όλες οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από το Εθνικό Κέντρο Κυτταρικής Επιστήμης (NCCS), Pune, Ινδία. Οι τιμές ποσοστιαίας αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης (IC50) προήλθαν χρησιμοποιώντας καμπύλες δόσης-απόκρισης για κάθε κυτταρική σειρά και ο ακόλουθος τύπος χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της ποσοστιαίας αναστολής ανάπτυξης. Η μετατροπή του ΜΤΤ σε ένα μωβ προϊόν φορμαζάνης από τη μιτοχονδριακή αφυδρογονάση υγιών κυττάρων είναι η βάση αυτού του πειράματος [38].

2.10. Μελέτη επούλωσης τραυμάτων in vitro με χρήση δοκιμής ανάλυσης γρατσουνιών

Οι ικανότητες εξάπλωσης και μετανάστευσης των κυττάρων κυτταρικής σειράς L292 που προκαλούνται από δείγματα με γνωστές συγκεντρώσεις φυτικού εκχυλίσματος και νανοσωματιδίων σιδήρου εξετάστηκαν στην τρέχουσα έρευνα [39]. Τρυβλία καλλιέργειας ζωικών κυττάρων με μέσα DMEM συμπληρωμένα με 10 τοις εκατό FBS και 2 τοις εκατό αντιβιοτικό Pen-Strep (Darmstadt, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκαν για την έναρξη της διαδικασίας κυτταροκαλλιέργειας. Ένα αποστειρωμένο πλαστικό άκρο πιπέτας χρησιμοποιήθηκε για να χαράξει το μονοστιβαδικό συρρέον των κυττάρων αφού αυτά είχαν αυξηθεί σε περίπου 50,000 κύτταρα ανά mL. Το διάλυμα PBS χρησιμοποιήθηκε για την απομάκρυνση τυχόν ανεπιθύμητων κυτταρικών υπολειμμάτων. Ως αρνητικός έλεγχος, χρησιμοποιήθηκαν μη επεξεργασμένα κύτταρα, ενώ το τυπικό ασκορβικό οξύ χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για δείγματα πολυμερούς γνωστής συγκέντρωσης. Για τις επόμενες 24 ώρες, τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ◦C με 5 τοις εκατό CO2. Για την εξέταση της σχετικής κυτταρικής μετανάστευσης και του κλεισίματος του τραύματος, οι γδαρμένες κυτταρικές στοιβάδες επωάστηκαν και απεικονίστηκαν σε διαστήματα που κυμαίνονται από 0 ώρες έως 6 ώρες έως 12 ώρες και 24 ώρες. Η βαθμονόμηση μέτρησης του MagVision Software (X64, 2016, Magnus, Νέο Δελχί, Ινδία) σε ανάλυση 4× χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της απόστασης του χάσματος. Για να προσδιοριστεί το κλείσιμο του τραύματος και ο ρυθμός μετανάστευσης, χρησιμοποιήθηκε ο τύπος που φαίνεται παρακάτω:

ως προς τα ακόλουθα: Α0h=περιοχή του τραύματος που μετρήθηκε αμέσως μετά το ξύσιμο. ATh=περιοχή τραύματος που μετρήθηκε μετά από ώρες. Rm=ρυθμός μετανάστευσης (μm/h); Wf=αρχικό πλάτος τραύματος (μm); και T=χρόνος μετεγκατάστασης (ώρα).

2.11. Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τυπική απόκλιση και το τυπικό σφάλμα και κάθε πείραμα διεξήχθη τρεις φορές. Το λογισμικό SPSS έκδοση 20 χρησιμοποιήθηκε για τη διεξαγωγή μονόδρομης ανάλυσης διακύμανσης (ANOVA) σχετικά με τις διαφορές στη μέση βαθμολογία που υπήρχαν μεταξύ των ομάδων.

Ζήτα περισσότερα:

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: συν 86 15292862950

ΚΑΤΑΣΤΗΜΑ:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop