Γκοσσυπιτρίνη, ένα φλαβονοειδές που εμφανίζεται στη φύση, εξασθενεί τη νευρωνική και μιτοχονδριακή βλάβη που προκαλείται από σίδηρο Μέρος 1

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Αφηρημένη:Η διαταραχή της ομοιόστασης του σιδήρου είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην απώλεια της μιτοχονδριακής λειτουργίας στα νευρικά κύτταρα, οδηγώντας σε νευροεκφυλισμό. Εδώ, αξιολογήσαμε την προστατευτική δράση της γκοσσυπιτρίνης (Gos), ενός φλαβονοειδούς που απαντάται στη φύση, σε βλάβη των νευρωνικών κυττάρων που προκαλείται από σίδηρο χρησιμοποιώντας κύτταρα ιππόκαμπου HT-22 ποντικού και μιτοχόνδρια που απομονώθηκαν από εγκεφάλους αρουραίων. Ο Gos μπόρεσε να διασώσει τα κύτταρα HT22 από τη βλάβη που προκλήθηκε από 100 uM Fe()-κιτρικό (EC50 8,6 uM). Αυτή η προστασία συνδέθηκε με την πρόληψη τόσο της επαγόμενης από σίδηρο διάχυσης του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης όσο και της εξάντλησης του ATP. Σε απομονωμένα μιτοχόνδρια, το Gos (50 μΜ) προκάλεσε σχεδόν πλήρη προστασία έναντι της επαγόμενης από σίδηρο μιτοχονδριακής διόγκωσης, της απώλειας του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού και της εξάντλησης του ATP. Το Gos απέτρεψε επίσης την επαγόμενη από το κιτρικό Fe(Ⅱ) υπεροξείδωση μιτοχονδριακών λιπιδίων με τιμή ICs0 (12,45 μM) που ήταν περίπου εννέα φορές χαμηλότερη από αυτή για το υδροϋπεροξείδιο τριτ-βουτυλίου που προκαλείταιοξείδωση. Επιπλέον, το φλαβονοειδές ήταν αποτελεσματικό στην αναστολή της αποικοδόμησης τόσο της 15 όσο και της 1,5 mM 2-δεοξυριβόζης. Επίσης μείωσε τη συγκέντρωση Fe(II) με την πάροδο του χρόνου, ενώ αύξανε τον ρυθμό κατανάλωσης O2 και μείωσε τη μείωση του Fe(II) από το ασκορβικό. Τα σύμπλοκα Gos-Fe(I) ανιχνεύθηκαν με φασματοσκοπίες UV-VIS και IR, με εμφανή στοιχειομετρία Gos-σιδήρου 2:1. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το Gos δεν δρα γενικά ως κλασικό αντιοξειδωτικό, αλλά επηρεάζει άμεσα τον σίδηρο, διατηρώντας τον στη μορφή του σιδήρου μετά την διέγερση της οξείδωσης του Fe(II). Ως εκ τούτου, τα μεταλλικά ιόντα δεν θα μπορούσαν να συμμετάσχουν σε μια αντίδραση τύπου Fenton και στη φάση διάδοσης της υπεροξείδωσης των λιπιδίων. Ως εκ τούτου, το Gos θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία νευρωνικών ασθενειών που σχετίζονται με οξειδωτικό στρες που προκαλείται από σίδηρο και μιτοχονδριακή βλάβη.

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

Λέξεις-κλειδιά: γκοσσυπιτρίνη; σίδερο; Κύτταρα HT-22. μιτοχόνδρια;νευροεκφυλισμός; νευροπροστασία

1. Εισαγωγή

Ο σίδηρος είναι ένας ουσιαστικός συμπαράγοντας σε πολλές κρίσιμες βιολογικές διεργασίες όπως η σύνθεση και αποκατάσταση του DNA, η μεταφορά οξυγόνου, η κυτταρική αναπνοή, ο ξενοβιοτικός μεταβολισμός και η σύνθεση ορμονών [1. Ωστόσο, σε υψηλά ενδοκυτταρικά επίπεδα, μπορεί να αυξήσει τα κυτταρικά αντιδραστικά είδη οξυγόνου με μια τροποποίηση των κυτταρικών οξειδοαναγωγικών δυνατοτήτων [2,3]. Η δυσομεόσταση του σιδήρου παρατηρείται σχεδόν σε κάθε νευρολογική πάθηση, όπως η νόσος του Πάρκινσον (PD), η νόσος του Alzheimer (AD), η νόσος του Huntington (HD), η σκλήρυνση κατά πλάκας, η αταξία του Friedreich, η επιληψία, το σύνδρομο ανήσυχων ποδιών και το εγκεφαλικό [4,5]. Ειδικότερα, στην ενδοεγκεφαλική αιμορραγία, όπου υπάρχει ρήξη των μικροαγγείων και το αίμα που απελευθερώνεται παράγει έκθεση σε σίδηρο που προέρχεται από το αίμα των νευρικών κυττάρων, οι κύριοι μηχανισμοί νευροεκφυλισμού είναι η επαγόμενη από τον σίδηρο και η αίμη παραγωγή ROS, η φλεγμονή και η διεγερτική τοξικότητα [6. ,7]. In vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα εγκεφαλικής αιμορραγίας έχουν δείξει την παρουσία φερρόπτωσης, μιας εξαρτώμενης από το σίδηρο μορφής ρυθμιζόμενης νέκρωσης [8]. Επιπλέον, αυξανόμενα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η διαταραχή της ομοιόστασης του σιδήρου είναι απαραίτητη για την απώλεια της μιτοχονδριακής λειτουργίας στα νευρικά κύτταρα [9,10], η οποία θα μπορούσε, με τη σειρά της, να οδηγήσει σε νευροεκφυλισμό [11-14. Πρόσφατα αναφέρθηκε μια σχέση μεταξύ της πρώιμης μορφής της νόσου του Πάρκινσον με δυσρύθμιση του μεταβολισμού του σιδήρου και της μιτοχονδριακής βλάβης [15]. Η συνύπαρξη σχετικά υψηλών ποσοτήτων σιδήρου και ROS στα μιτοχονδριακά διαμερίσματα καθιστά αυτό το οργανίδιο ευαίσθητο σε βλάβη που προκαλείται από ρίζες υδροξυλίου. Φαρμακολογικοί παράγοντες που στοχεύουν στη ρύθμιση του σιδήρου του εγκεφάλου και στη μιτοχονδριακή βλάβη που προκαλείται από σίδηρο μπορεί επομένως να είναι θεραπευτικά χρήσιμοι κατά του νευροεκφυλισμού. Αρκετοί χηλικοί παράγοντες σιδήρου έχουν βρεθεί ότι επιδεικνύουν νευροπροστατευτικές δράσεις σε διαφορετικά πειραματικά μοντέλα [16-19]. Από την άλλη πλευρά, έχουν υπάρξει πολλές αναφορές για το νευροπροστατευτικό δυναμικό των φυσικώς απαντώμενων πολυφαινολών λόγω των αντιοξειδωτικών τους δράσεων που βασίζονται σε έναν συνδυασμό χηλίωσης σιδήρου και ενεργειών δέσμευσης ελεύθερων ριζών [20,21]. Η ομάδα μας παρατήρησε ότι οι πολυφαινόλες που περιέχουν κατεχόλη όπως η μαγγιφερίνη, η γουτιφερόνη-Α και η ραπανόνη αλληλεπιδρούν με τον σίδηρο, τόσο in vitro όσο και in vivo, ακυρώνοντας έτσι τον καταλυτικό του ρόλο στην προώθηση του ROS [22-28]. Αναφέραμε επίσης πρόσφατα τις ισχυρές αντιοξειδωτικές επιδράσεις της γκοσσυπιτρίνης (Gos), ενός φλαβονοειδούς που απαντάται στη φύση (Εικόνα 1), υποδεικνύοντας την πιθανή χρήση του ως νευροπροστατευτικό παράγοντα [29]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τους μηχανισμούς που εμπλέκονται σε αυτές τις αντιοξειδωτικές επιδράσεις. Η παρουσία ενός επίπεδου εξαμελούς κυκλικού συστήματος με μετεγκατάσταση ηλεκτρονίων, ένα τμήμα κατεχόλης και τρεις ακόμη αρωματικές ομάδες υδροξυλίου (δύο από αυτές γειτονικές σε μια ομάδα καρβονυλίου), υποδηλώνουν έντονα ότι αυτό το μόριο θα μπορούσε να δράσει ως παράγοντας χηλικής σύστασης σιδήρου, καθώς αυτά είναι δομικά χαρακτηριστικά που ευνοούν τη χηλοποίηση του σιδήρου από τα φλαβονοειδή 30]. Ως εκ τούτου, ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να αξιολογήσει την ικανότητα των Gos να προστατεύουν την HT-22νευρωνικά κύτταρακαι απομόνωσαν μιτοχόνδρια εγκεφάλου αρουραίου από μεσολάβηση σιδήρουοξειδωτική βλάβη. Άλλες μελέτες σε συστήματα χωρίς κύτταρα/μιτοχόνδρια πραγματοποιήθηκαν για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η φύση της αλληλεπίδρασης Gos-σίδηρου.

2. Αποτελέσματα

2.1. Ο Gos διασώζει κύτταρα HT-22 από τον επαγόμενο από Fe(I) κυτταρικό θάνατο

Το Fe (II) (100 μM) μείωσε την επιβίωση των κυττάρων HT-22 στο 17,4 τοις εκατό μετά από 24 ώρες έκθεσης, όπως εκτιμήθηκε από τη δοκιμασία MTT. Το Gos απέτρεψε τον θάνατο των κυττάρων του ιππόκαμπου με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Το EC50 ήταν 8,64± 1,58 μM (Εικόνα 2Α, ένθετο). Η πλήρης προστασία των κυττάρων παρατηρήθηκε με 100 μM Gos ήταν πιο αποτελεσματική από το Trolox (500 uM), το γνωστό υδροδιαλυτό αντιοξειδωτικό, το οποίο απέτρεψε τον κυτταρικό θάνατο κατά 74 τοις εκατό .

Η έκθεση HT-22 σε σίδηρο για 2 ώρες (πριν από την εκτέλεση του κυτταρικού θανάτου) προκάλεσε τη διάχυση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, όπως εκτιμάται από τη διατήρηση της ροδαμίνης 123 μέσα στα οργανίδια (Εικόνα 2Β) και την εξάντληση του ATP (Εικόνα 2C ). Αυτό υποδηλώνει μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ των τοξικών επιδράσεων που προκαλούνται από τον σίδηρο στα μιτοχόνδρια και τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Το Gos απέτρεψε τη δοσοεξαρτώμενη βλάβη των μιτοχονδρίων που προκαλείται από τον σίδηρο, ακολουθώντας τα πρότυπα βιωσιμότητας των νευρώνων που έδειξαν ότι μπορεί να αποτρέψει τον επαγόμενο από τον σίδηρο θάνατο των κυττάρων HT-22 μέσω της μιτοχονδριακής προστασίας.

Εικόνα 2. Προστασία Gos έναντι βλάβης των νευρωνικών κυττάρων που προκαλείται από σίδηρο. Επιδράσεις του Gos στην επιβίωση του ιππόκαμπου νευρώνα ποντικού HT-22 (Α), στο δυναμικό της κυτταρικής μιτοχονδριακής μεμβράνης (Β) και στα κυτταρικά επίπεδα ATP (C). Gos (0-100 μM) ή Trolox (500 μM) επωάστηκαν ταυτόχρονα για 24 ώρες (βιωσιμότητα) ή 2 ώρες (δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης και επίπεδα ATP) με 100 μM FeCl2/ 1 mM κιτρικό. Οι συνθήκες της δοκιμασίας περιγράφονται στην Ενότητα 4. Τα κατεστραμμένα κύτταρα ελέγχου (χωρίς Gos) περιείχαν DMSO (0,001 τοις εκατό) συν το μίγμα σιδήρου-κιτρικού. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως το ποσοστό του κυτταρικού θανάτου σε σχέση με τον μη κατεστραμμένο έλεγχο (που περιέχει DMSO0,001 τοις εκατό ως όχημα). Οι τιμές είναι ο μέσος όρος ± SD τριών διαφορετικών πειραμάτων. Διαφορετικά σύμβολα υποδεικνύουν στατιστικές διαφορές στη σελ<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

Το Cistanche μπορεί να βελτιώσει την ανοσία

2.2. Gos Rescues Rat-Brain Mitochondria from Iron-Induced Mitochondrial Lipoperoxidation Brain mitochondria incubated with Fe（）-citrate （50 μM） underwent a marked lipoperoxidation expressed by an increase in the formation of the thiobarbituric acid reactive substance(Figure 3A). Gos inhibited the iron-mediated mitochondrial lipid peroxidation in a concentration-dependent manner （IC50 value of 12.45±1.24 μM） （Figure 3A, inset）. The effects of Gos on tert-butyl hydroperoxide（300 μM）-induced mitochondrial lipid peroxidation（IC50 value>100 μΜ) δείχνει ότι είναι πιο αποτελεσματικό στην πρόληψη της επαγόμενης από το σίδηρο υπεροξείδωσης λιπιδίων από την επαγόμενη από το υπεροξύλιο υπεροξείδωση λιπιδίων, υποδηλώνοντας την ικανότητά του να δρα απευθείας στον σίδηρο (Εικόνα 3Β).

Σχήμα 3. Το Gos αναστέλλει το σχηματισμό μηλονοδιαλδεΰδης στα μιτοχόνδρια, που προκαλείται από 50 uM Fe()-κιτρικό (A) ή 300μM υδροϋπεροξείδιο τριτ-βουτυλίου (Β). Μιτοχόνδρια εγκεφάλου αρουραίου (1 mg/mL) επωάστηκαν σε ένα μέσο αντίδρασης που περιείχε 125 mM σακχαρόζη, 65 mM KCl, 10 mM ρυθμιστικό διάλυμα HEPES (pH 7,4), 2 mM ηλεκτρικό και 2,5 uM ροτενόνη, με ή χωρίς Gos ({4} uM). Τα πειράματα ξεκίνησαν με την προσθήκη 50μM Fe(II) ή 300 μΜ υδροϋπεροξειδίου του τριτ-βουτυλίου, εκτός από το άθικτο στοιχείο ελέγχου (γκρι ράβδοι). Η περίοδος επώασης ήταν 20 λεπτά στους 28 βαθμούς C. Οι τιμές είναι οι μέσοι όροι ±SD (n=6). Διαφορετικά σύμβολα υποδεικνύουν στατιστικές διαφορές στη σελ<0.05 when="" comparing="" all="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" posthoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.3. Το Gos Αποτρέπει τη διάχυση του μιτοχονδριακού οιδήματος που προκαλείται από τον σίδηρο και την εξάντληση του ATP

Το Σχήμα 4Α δείχνει ότι το σύμπλοκο 50μM Fe(I)-κιτρικού προκάλεσε μιτοχονδριακή διόγκωση όπως εκφράζεται με μείωση της απορρόφησης στα 540nm (γραμμή f έναντι γραμμής a). Σχετίστηκε με μια αυθόρμητη και πλήρη αποπόλωση △Y (Εικόνα 4Β, linef έναντι γραμμής a) και εξάντληση ATP (Εικόνα 4C, στήλη Fe()/κιτρικό). Το Gos ανέστειλε τη διαδικασία διόγκωσης που προκαλείται από σίδηρο και τη διάχυση του AY με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση (Σχήμα 4Α, Β γραμμές). Οι τιμές απορρόφησης (μέση τιμή ± SD στα 7 λεπτά) από το Πλαίσιο Α ήταν: 0.482±0.013 (γραμμή α), 0}.459± { {23}}.011 (γραμμή β),0.445± 0.007 (γραμμή γ), 0,435± 0,015( γραμμή d), 0,360±0,011 (γραμμή e) και 0,338±0,012 (γραμμή f). Οι τιμές φθορισμού από το πλαίσιο Β (μέση τιμή ± SD στα 7 λεπτά) ήταν 15,03±1,71 (γραμμή α), 19,41±2,07 (γραμμή b), 22,29±2,58 (γραμμή c), 45,505±4,47 (γραμμή d), 118,468±5. (γραμμή e) και 146,201±5,83 (γραμμή f). Βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ της γραμμής f και των άλλων γραμμών, στο p<0.05. the="" naturally="" occurring="" flavonoids="" also="" prevented="" iron-mediated="" atp="" depletion="" in="" a="" concentration-dependent="" manner(figure="" 4c).="" a="" strong="" interaction="" of="" gos="" with="" iron="" is="" suggested="" as="" the="" key="" mechanism="" for="" neuroprotection="" against="" iron-induced="" damage,="" both="" in="" ht-22="" neuronal="" cells="" and="" in="" brain="" mitochondria.="" to="" further="" characterize="" this="" gos-iron="" interaction,="" different="" experiments="" on="" a="" cell/mitochondria-free="" system="" were="">

Εικόνα 4. (Α) Επαγωγή μετάβασης μιτοχονδριακής διαπερατότητας, (Β) δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (AH) απώλεια και (C) μείωση των επιπέδων ATP που προκαλείται από 50 μM Fe (II)-κιτρικό. Το A υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ανιχνευτή φθορισμού safranine (5 uM). Τα ανασταλτικά αποτελέσματα των Gos 50,25, 10 και 1μM φαίνονται στις γραμμές (b), (c), (d) και (e), αντίστοιχα. Οι γραμμές (α) και (στ) αντιπροσωπεύουν άθικτα χειριστήρια (χωρίς σίδερο) και κατεστραμμένα χειριστήρια (χωρίς Gos), αντίστοιχα. Μιτοχόνδρια εγκεφάλου αρουραίου (RBM-0.5 mg/mL), Fe(II) και 1 μΜ CCCP προστέθηκαν όπου υποδεικνύεται από τα βέλη. Διαφορετικά σύμβολα στο γράφημα (C) υποδεικνύουν στατιστικές διαφορές atp<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.(if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.4. Το Gos Επάγει την αυτοξείδωση του Fe(II)-κιτρικού άλατος και την κατανάλωση Ο, Κατανάλωση

Το Gos μείωσε τη συγκέντρωση Fe() (1-λεπτή προεπώαση) σε ένα μέσο αντίδρασης που περιέχει 2 mM κιτρικό (χωρίς μιτοχόνδρια) με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα 5Α, μαύροι κύκλοι). Μια 5-λεπτή περίοδος προεπώασης (Εικόνα 5Α, κόκκινα κουτιά) μείωσαν ακόμη περισσότερο τη συγκέντρωση Fe(II). Το Gos αύξησε επίσης το ρυθμό κατανάλωσης O2, πιθανώς λόγω της οξείδωσης του Fe(ll) σε Fe(ⅡII) (Εικόνα 5B,C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το Gos θα μπορούσε να αφαιρεί τον Fe(II) από το κιτρικό σύμπλεγμα και να το οξειδώνει σε μορφή σιδήρου σε μια διαδικασία που απαιτεί το Ο2 ως δέκτη ηλεκτρονίων. Αντίστοιχα, το Gos θα μπορούσε να παρεμποδίζει τον σχηματισμό «ριζών OH αδρανοποιώντας το Fe(Il) που είναι απαραίτητο για την αντίδραση τύπου Fenton-Haber-Weiss, η οποία μπορεί να ξεκινήσει την υπεροξείδωση των λιπιδίων της μιτοχονδριακής μεμβράνης.

Εικόνα 5. Το (A)Gos διεγείρει την αυτοξείδωση του Fe(Ⅲl) απουσία μιτοχονδρίων εγκεφάλου αρουραίου σε ένα τυπικό μέσο συμπληρωμένο με 1 mM κιτρικό και 5 mM1,10-φαινανθρολίνη.1,10-φαινανθρολίνη ήταν προστέθηκε 1 ή 5 λεπτά μετά την περίοδο επώασης Gos-Fe(II) και οι απορροφήσεις διαβάστηκαν στα 510 nm. Οι τιμές είναι ο μέσος όρος τριών προσδιορισμών. * στατιστική διαφορά στη σελ<0.05 when="" comparing="" 1="" vs.="" 5min="" incubation.="" (b)effects="" of="" gos="" on="" o,="" consumption="" mediated="" fe(il)="" autoxidation="" in="" a="" standard="" medium="" supplemented="" with="" 1="" mm="" citrate="" under="" the="" following="" conditions:(a)="" no="" gos,(b)10="" um="" gos,="" （c）="" 30μm="" gos,="" （d）50="" μm="" gos,and="" （e）100μm="" gos.="" fe（ii）="" （50μm）="" was="" added="" where="" indicated="" by="" the="" arrow.="" results="" are="" representative="" of="" three="" experiments.="" (c)="" oxygen="" consumption="" rate="" (nmol="" o2/min/ml)1="" min="" after="" fe()="" addition.legends="" are="" the="" same="" as="" in(b).="" different="" symbols="" indicate="" statistical="" differences="" at=""><0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" (in="" the="" same="" cell="" type)="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Molecules 2021, 26, 3364. https://doi.org/10.3390/molecules26113364 https://www.mdpi.com/journal/molecules