Γενετική της οστεοποντίνης σε ασθενείς με χρόνια νεφρική νόσο: Η γερμανική μελέτη για τη χρόνια νεφρική νόσο Ⅳ

Βασικές μεταβλητές και μετρήσεις

Ένα τυποποιημένο σύνολο βιοδεικτών μετρήθηκε σε ένα κεντρικό πιστοποιημένο εργαστήριο χρησιμοποιώντας τυποποιημένα πρωτόκολλα [81]. Μεταξύ άλλων, η κρεατινίνη και η λευκωματίνη από τον ορό και τα ούρα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια ανιχνεύσιμη μεθοδολογία IDMS (Creatinine plus, Roche, Γερμανία) και μια θολωσιμετρική μέθοδο (Tina-quant, Roche, Γερμανία) Roche/Hitachi MODULAR P, αντίστοιχα. Ο ρυθμός σπειραματικής διήθησης (GFR) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το CKD-EPI με βάση την κρεατινίνη για το mula (μονάδα: mL/min/1,73m2, [82]). Το UACR υπολογίστηκε ως μετρηθείσα λευκωματίνη ούρων/νάρια κρεατινίνη ούρων (mg/g, [83]). Η ηλικία και το φύλο αναφέρθηκαν από μόνοι τους στην αρχική επίσκεψη. Το 2015, η OPN μετρήθηκε από δείγματα ορού αναφοράς της πλήρους κοόρτης μελέτης GCKD χρησιμοποιώντας μια ποσοτική τεχνική ενζυμικής ανοσοδοκιμασίας σάντουιτς (ELISA στερεάς φάσης· Quantikine Human OPN Immunoassay DOST{12}} από την R&D Systems (R&D Systems, Ευρώπη, )). Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Κλινικής Χημείας και Εργαστηριακής Ρητορικής Ιατρικής, Greifswald, Γερμανία. Οι συντελεστές διακύμανσης (εντός της ανάλυσης) ήταν 4,5%, 5,3% και 3,5% για τα χαμηλά, τα διάμεση και τα υψηλά επίπεδα, αντίστοιχα. Ο συντελεστής διακύμανσης μεταξύ της ανάλυσης ήταν 6,4%. Τα αντιδραστήρια και τα δευτερεύοντα πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή.

ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΟ ΒΟΤΑΝΟ ΓΙΑ ΤΗΝ ΥΓΕΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ

Γονότυπος, ποιοτικός έλεγχος και καταλογισμός

Λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τον γονότυπο και τον καθαρισμό δεδομένων στη μελέτη GCKD έχουν περιγραφεί προηγουμένως [18]. Εν συντομία, απομονώθηκε DNA από πλήρες αίμα και γονότυπος σε 2.612.357 παραλλαγές μυρμηγκιών για 5.123 συμμετέχοντες GCKD χρησιμοποιώντας τη συστοιχία Illumina HumanOmni2.5 Exome BeadChip (Illumina, GenomeStudio, Genotyping Module Version 1.9.4) στο Municholtz Center. Ο καθαρισμός δεδομένων πραγματοποιήθηκε ξεχωριστά για το περιεχόμενο Omni2.5 και το περιεχόμενο τσιπ exome της συστοιχίας. Με βάση τυποποιημένα πρωτόκολλα [84], το λογισμικό προσαρμοσμένων γραπτών σεναρίων (R, Perl) και Plink1.9 [85] χρησιμοποιήθηκε για τον ποιοτικό έλεγχο (QC) του περιεχομένου Omni2.5. Τα βήματα QC με βάση το δείγμα περιελάμβαναν ελέγχους του ποσοστού κλήσης, του φύλου, της ετεροζυγωτίας, της γενετικής καταγωγής και της συγγένειας, με αποτέλεσμα τον αποκλεισμό 89 δειγμάτων. Σε επίπεδο παραλλαγής, οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNPs) αποκλείστηκαν εάν το ποσοστό κλήσης ήταν<0.96, and whenever the assumption of the Hardy-Weinberg equilibrium was violated (p-value <1.0E-05). After removing SNPs on duplicate positions, the cleaned dataset contained 5,034 individuals and 2,337,794 SNPs (S1 Fig). Genotypes were then imputed using minimac3 v2.0.1 at the Michigan Imputation Server [86]. The Haplotype Reference Consortium (HRC) haplotypes version r1.1 were used as the reference panel, and Eagle 2.3 was used for phasing. The final dataset contains data of 5,034 participants and 7,750,367 high-quality autosomal bi-allelic variants (imputation quality of R2 �0.3, MAF �1%). For the exome chip content, QC was similarly conducted [18]. In addition, checks specific for exome variants were added [87]. In brief, 96 individuals and 3,818 SNPs were removed, the latter of which had a call rate <0.95 and a Hardy-Weinberg equilibrium p-value <1.0E−05. The final exome chip dataset contains 5,027 participants with 226,233 variants (S1 Fig). For the exome chip association analysis, the genotypes were post-processed using zCall with a zscore threshold of six [88]. Genomic positions base on human genome build GRCh37.

Μελέτη συσχέτισης σε όλο το γονιδίωμα κοινών παραλλαγών

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [17,18], το GWAS διεξήχθη για συμμετέχοντες με GCKD με πλήρη γονοτυποποίηση (Omni2.5), eGFR, UACR και log2(OPN) δεδομένα μέτρησης (N=4,897) χρησιμοποιώντας παλινδρόμηση γραμμικού αυτιού του log2 (OPN) σε SNP (προσθετικό γενετικό μοντέλο) με MAF £1%, προσαρμοσμένο για ηλικία, φύλο, log(eGFR) και log (UACR) (Σχήμα S1). Η ανάλυση συσχέτισης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SNPTEST v2.5 [89]. Τα συνοπτικά στατιστικά στοιχεία ελέγχθηκαν για ποιότητα χρησιμοποιώντας το GWAtoolbox [90] και για πληθωρισμό χρησιμοποιώντας γονιδιωματικό έλεγχο [91]. Ωστόσο, δεν ζητήθηκε διόρθωση γονιδιωματικού ελέγχου (λ=1.01). Συσχετίσεις με τιμή p<5.0E-08 were considered significant. Per chromosome, an index SNP was defined as the SNP with the lowest genome-wide p-value with a 1-Mb interval centered around this SNP. This approach was repeated until no further SNP outside the interval(s) was available passing the genome-wide significance threshold. In order to discover further independent signals, we repeated GWAS analysis for chromosomes with significant results by conditioning on the genotype of the SNP with the lowest association pvalue of the respective chromosome. This procedure was repeated until no further genomewide signal was observed.

Ο λειτουργικός σχολιασμός των παραλλαγών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ANNOVAR[92], SNiPA [93], Open Targets Genetics [94], FAVOR [95] και RegulomeDB [96]. Τα γραφικά τοπικού συσχετισμού σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το LocusZoom v1.3 [97].

Λεπτή χαρτογράφηση

Statistical fine-mapping [21] was carried out as previously described [17] for the two replicated SNPs within a region ±500kb. Approximate Bayes factors (ABFs) were then derived from the original GWAS statistics estimates. The SD prior was chosen as 0.61 because 95% of the effect size estimates fell within the −1.2 to 1.2 interval [21]. The ABF of the SNPs were used to calculate the posterior probability for each variant driving the association signal (PPA, 'causal variant'). Credible sets were determined by summing up PPA-ranked variants until the cumulative PPA was >99%.

Αναλύσεις εντοπισμού

Προκειμένου να κατανοήσουμε περαιτέρω τους μοριακούς μηχανισμούς και τους σχετικούς φαινοτύπους στους οποίους βασίζονται οι συσχετίσεις, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις συνεντοπισμού των συνοπτικών στατιστικών OPN GWAS που σχετίζονται με τους δύο αναδιπλασιασμένους τόπους OPN με συνοπτικά στατιστικά GWAS από τρεις άλλες πηγές όπως περιγράφονται παρακάτω. Για όλες τις αναλύσεις συντοπισμού, χρησιμοποιήσαμε τη συνάρτηση «coloc.fast» από το πακέτο R gtx με προεπιλεγμένες παραμέτρους και προηγούμενους ορισμούς (https://github.com/ tobyjohnson/gtx), μια εφαρμογή μιας προσαρμοσμένης έκδοσης της μεθόδου συντοπισμού που εισήχθη από τους Giambartolomei et al. [98]. Θεωρούμε θετικό συνεντοπισμό όταν η θετική πιθανότητα μιας κοινής αιτιολογικής παραλλαγής στον τόπο συσχέτισης και για τα δύο χαρακτηριστικά (H4, p12) ήταν > 0.8.

Γονιδιακή έκφραση.

Αρχικά, χρησιμοποιήσαμε συνοπτικές στατιστικές GWAS δεδομένων γονιδιακής έκφρασης από το έργο GTEx [99] και τη μελέτη NEPTUNE [100]. Τα δεδομένα eQTL από το GTEx V8 (49 ιστοί) και τη μελέτη NEPTUNE (NephQTL από σπειράματα και σωληνοειδή διάμεσο νεφρό) λήφθηκαν από την πύλη GTEx (https://www.gtexportal.org/home/) και τον ιστότοπο NephQTL (http ://nephqtl.org/), αντίστοιχα. Τα βήματα ανάλυσης του εντοπισμού έχουν περιγραφεί λεπτομερώς αλλού [17]. Πρώτον, εξήχθησαν περιλήψεις GWAS των GTEx και NephQTL σε γονιδιωματικές περιοχές ±100kb των δύο OPN SNP. Τα γονίδια στο εξαγόμενο GWAS αναγνωρίζονται και για κάθε γονίδιο, ορίζεται ένα παράθυρο cis 500 kb που πλευρίζει την αρχή και το τέλος του γονιδίου. Στη συνέχεια, για κάθε τέτοιο παράθυρο γονιδίου cis, με τουλάχιστον ένα SNP να έχει τιμή συσχέτισης p < 0,001, οι περιλήψεις GWAS του ιστού GTEx και NephQTL καθώς και το OPN GWAS εξήχθησαν και χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος για ανάλυση εντοπισμού.