Λειτουργικά θραύσματα AIMP1-Προερχόμενου πεπτιδίου (AdP) και βελτιστοποιημένου υδρολύματος για την τοπική εναπόθεσή τους από το σχέδιο Box-Behnken

Αφηρημένη:

Το πολυλειτουργικό πεπτίδιο που προέρχεται από την πρωτεΐνη 1 (AIMP1) (AdP) που αλληλεπιδρά με σύμπλοκο αμινοακυλο-tRNA συνθετάσης έχει αναπτυχθεί ως κοσμητικό συστατικό για την αντιγήρανση του δέρματος λόγω των λειτουργιών του που ενεργοποιούν τους ινοβλάστες (FA) και αναστέλλουν τα μελανοκύτταρα (MI). Ωστόσο, απαιτούνταν μια κατάλληλη στρατηγική για την τοπική χορήγηση του AdP λόγω των ιδιοτήτων χαμηλής διαπερατότητας του. Σε αυτή τη μελέτη, οι περιοχές FA και MI του AdP (FA-AdP και MI-AdP, αντίστοιχα) προσδιορίστηκαν με χαρτογράφηση λειτουργικής περιοχής, όπου δοκιμάστηκαν οι δραστηριότητες πολλών θραυσμάτων AdP σε ινοβλάστες και μελανοκύτταρα, και τοπική χορήγηση με βάση το υδρόλυμα παρασκευάστηκε σύστημα για αυτά τα τμήματα AdP. Η σύνθεση εκδόχου του υδρολύματος βελτιστοποιήθηκε για να μεγιστοποιήσει το ιξώδες και τον ρυθμό ξήρανσης χρησιμοποιώντας το σχέδιο Box-Behnken. Η τεχνητή εναπόθεση στο δέρμα του φορτωμένου με FA-AdP υδρολύματος αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κύτταρα διάχυσης Keshary-Chien εξοπλισμένα με μεμβράνη Strat-M (STM).

Ο ποσοτικός προσδιορισμός του FA-AdP με επισήμανση φθορίζουσας βαφής σε STM πραγματοποιήθηκε με απεικόνιση φθορισμού κοντά στο υπέρυθρο. Το βελτιστοποιημένο υδρόλυμα έδειξε 127-πλάσια μεγαλύτερη εναπόθεση πεπτιδίου στο STM από το ελεύθερο FA-AdP (ρ < 0.05). Αυτή η εργασία προτείνει ότι το FA- και το MI-AdP είναι ενεργοί τομείς για αντιρυτιδικές και λευκαντικές δραστηριότητες, αντίστοιχα, και το υδρόλυμα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μια πολλά υποσχόμενη καλλυντική σύνθεση για την παροχή AdPs στο δέρμα.

Η έρευνα διαπίστωσε ότι όσο υψηλότερη είναι η δραστηριότητα της τυροσινάσης, τόσο περισσότερη μελανίνη παράγεται. Η υπερβολική παραγωγή μελανίνης μπορεί να προκαλέσει μελάγχρωση δερματικών παθήσεων όπως πανάδες, χλόασμα, κηλίδες ηλικίας και μελάνωμα. Πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι όταν η συγκέντρωση των συνολικών γλυκοσιδών του Cistanche deserticola είναι στο εύρος των {{0}}.5-3.0mg·mL-1, η επίδραση είναι {{0}}.5-3. στη δραστηριότητα της τυροσινάσης Έχει ανασταλτική δράση και έχει καλή σχέση δόσης-επίδρασης στην περιοχή από 0,5~2,0 mg·mL-1, επομένως μπορεί να είναι γνωστό ότι το Cistanche έχει λευκαντική δράση.

Κάντε κλικ στα οφέλη για την υγεία του κιστάνσε

Λέξεις-κλειδιά:

Πεπτίδιο προερχόμενο από AIMP1- (AdP); καλλυντικό πεπτίδιο; Σχέδιο Box-Behnken; υδρόλυμα; τοπική χορήγηση πεπτιδίων

1. Εισαγωγή

Η γήρανση του δέρματος, που χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό ρυτίδων και μελάγχρωσης και την τραχύτητα και ξηρότητα του δέρματος, είναι μια πολύπλοκη βιολογική διαδικασία, που προκαλείται από διάφορους εγγενείς και εξωγενείς παράγοντες [1,2]. Η εξωκυτταρική μήτρα (ECM), ένα μη κυτταρικό δομικό συστατικό που αποτελείται από διάφορα βιομακρομόρια, συνδέεται στενά με τη διαδικασία γήρανσης του δέρματος [3-5]. Το κολλαγόνο, το κύριο συστατικό της ECM του δέρματος, κατακερματίζεται σταθερά και μειώνεται στο δέρμα με τη γήρανση [6,7]. Το κατακερματισμένο κολλαγόνο θέτει σε κίνδυνο τη δομική ακεραιότητα και τη μεταβολική λειτουργία του δέρματος, προκαλώντας ρυτίδες [8,9]. Η υπερβολική εναπόθεση μελανίνης στην επιδερμίδα είναι ένα άλλο σημαντικό χαρακτηριστικό της γήρανσης του δέρματος, με αποτέλεσμα τη μελάγχρωση του δέρματος. Αυτή η διαδικασία προκαλείται από την ανεπιθύμητη ενεργοποίηση των μελανοκυττάρων υπό ακτινοβολία UV [10,11].

Έτσι, έχουν αναπτυχθεί καλλυντικά συστατικά για την αντιγήρανση του δέρματος με έμφαση στη μείωση των ρυτίδων και της μελάγχρωσης του δέρματος. Πρόσφατα, διάφορα πεπτίδια που προέρχονται από κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες έγιναν το επίκεντρο της προσοχής στον καλλυντικό τομέα λόγω των αντιγηραντικών τους δραστηριοτήτων [6,12].

Είναι γνωστό ότι οι πολυλειτουργικές πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με σύμπλοκο αμινοακυλο-tRNA συνθετάσης (AIMPs) σχηματίζουν το σύμπλοκο πολλαπλών συνθετάσης (MSC) με συνθετάσες αμινοακυλο-tRNA (ARS). Αυτό το MSC λειτουργεί ως κρίσιμο συστατικό του μηχανισμού μετάφρασης πρωτεϊνών [13]. Μεταξύ των μελών αυτής της οικογένειας πρωτεϊνών, το AIMP1 έχει συγκεντρώσει μεγάλη προσοχή στον τομέα της αισθητικής, δεδομένης της επουλωτικής του δράσης [14,15]. Το εκκρινόμενο AIMP1 επάγει τη σύνθεση κολλαγόνου των ινοβλαστών στην βλάβη του τραύματος μέσω της εξαρτώμενης από το ERK μονοπατιού, η οποία οδηγεί σε ταχεία μετατραυματική αποκατάσταση [16]. Επιπλέον, το AIMP1 διεγείρει τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα μέσω της μεσολαβούμενης από την πρωτεϊνική κινάση Β (PKB) ενεργοποίησης της κατενίνης και των κατάντη αλληλεπιδράσεων, αυξάνοντας το επίπεδο των MSCs στην κυκλοφορία του αίματος [17].

Είναι ενδιαφέρον ότι αυτές οι διαφορετικές εξωκυτταρικές λειτουργίες του AIMP1 αποδίδονται στις διαφορετικές περιοχές της δομής του. Για παράδειγμα, αυτή η πρωτεΐνη προάγει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών μέσω της περιοχής 6-46 αμινοξέων της [18]. Έτσι, το πεπτίδιο που προέρχεται από AIMP1- (AdP, όνομα INCI: sh-ολιγοπεπτίδιο 5/sh-ολιγοπεπτίδιο 5 SP) αυτής της περιοχής αναπτύχθηκε ως καλλυντικό για την αντιγήρανση του δέρματος. Σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη, το AdP έχει διπλές λειτουργίες, δηλαδή δραστηριότητες ενεργοποίησης ινοβλαστών και αναστολής μελανοκυττάρων [13]. Ωστόσο, δεν έχουν αναφερθεί πληροφορίες σχετικά με τους ενεργούς τομείς για αυτές τις λειτουργίες.

Η παροχή πεπτιδίων μέσω του δέρματος είναι δύσκολη λόγω της προστατευτικής φύσης του δέρματος. Ο φυσιολογικός ρόλος του δέρματος είναι ως φραγμός έναντι περιβαλλοντικών παραγόντων όπως το υπεριώδες φως, οι μικροοργανισμοί και τα ξενοβιοτικά [19]. Η κεράτινη στιβάδα (SC) είναι το πιο εξωτερικό στρώμα του δέρματος και αποτελείται από μια κρυσταλλική λιπιδική μήτρα ενσωματωμένη με κερατοκύτταρα [20]. Κάτω από το SC, η βιώσιμη επιδερμίδα που αποτελείται από κοκκιώδη στιβάδα, ακανθώδη στιβάδα και βασική στιβάδα προσδίδει δομική ακεραιότητα στο δέρμα. Μεταξύ αυτών των στρωμάτων, το SC είναι το κύριο εμπόδιο για την παροχή πεπτιδίου, καθώς αποτελείται από μια εξαιρετικά υδρόφοβη λιπιδική μήτρα και στενά συσκευασμένα κερατοκύτταρα.

Έχουν γίνει αρκετές προσπάθειες για να ξεπεραστεί αυτό το ζήτημα, οι οποίες περιλαμβάνουν λιποσώματα, μικρογαλάκτωμα, ιοντοφόρηση, ηλεκτροδιάτρηση και μικροβελόνα [21-25]. Ωστόσο, η πιο αξιόπιστη και αναπαραγώγιμη προσέγγιση για τη βελτίωση της παροχής στο δέρμα χρησιμοποιεί ενισχυτές διείσδυσης [26]. Η αιθανόλη, ένας αντιπροσωπευτικός ενισχυτής διείσδυσης για πεπτίδια, υιοθετήθηκε σε αυτή τη μελέτη [27]. Επιπροσθέτως, η καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη νατρίου (CMC), ένας μη τοξικός πηκτικός παράγοντας, επιλέχθηκε για την παρασκευή του συστήματος τοπικής παροχής με βάση το υδρόλυμα. Το CMC είναι το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο παράγωγο κυτταρίνης σήμερα, εφαρμογές του οποίου περιλαμβάνουν καλλυντικά, πρόσθετα τροφίμων, χαρτί, κλωστοϋφαντουργικά προϊόντα και φαρμακευτικά προϊόντα [28]. Το CMC παράγεται από την καρβοξυμεθυλίωση πολυσακχαριτών, όπως το άμυλο, τα λινάρια βαμβακιού και το κόμμι των ανακαρδιοειδών, που καθιστά υδατοδιαλυτές, χημικά σταθερές, μη τοξικές, βιοσυμβατές και βιοαποικοδομήσιμες ιδιότητες [29].

Η σύνθεση του υδρολύματος βελτιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης (RSM) για να εξασφαλιστεί το κατάλληλο ιξώδες και ρυθμός ξήρανσης για δερματική εφαρμογή. Αυτή η στατιστική τεχνική απαιτεί πολύ λιγότερο πειραματισμό και χρόνο για την επίτευξη κρίσιμων ποιοτικών χαρακτηριστικών του προϊόντος σε σύγκριση με τις μεθόδους one-factor-at-a-time (OFAT) [30,31]. Το RSM παρέχει επίσης τη σημασία των ανεξάρτητων μεταβλητών και τις αλληλεπιδράσεις τους [32]. Ο σχεδιασμός Box-Behnken (BBD) που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη ανήκει στο RSM και έχει πολλά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τα άλλα σχέδια RSM, απαιτώντας λιγότερες εκτελέσεις στην περίπτωση τριών ή τεσσάρων μεταβλητών [33]. Επιπλέον, το BBD μπορεί να αποφύγει τα συνδυασμένα ακραία στοιχεία, καθώς τα δεδομένα στο μέσο του άκρου χρησιμοποιούνται για την κατασκευή του μοντέλου [34].

Σε αυτή τη μελέτη, οι τομείς που ενεργοποιούν τους ινοβλάστες και αναστέλλουν τα μελανοκύτταρα του AdP (FA- και MI-AdP, αντίστοιχα) προσδιορίστηκαν για την αντιμετώπιση του λειτουργικού διαχωρισμού. Το θραύσμα FA-AdP φορτώθηκε στο βελτιστοποιημένο υδρόλυμα και η τεχνητή εναπόθεσή του στο δέρμα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια τεχνική απεικόνισης φθορισμού κοντά στο υπέρυθρο.

2. Αποτελέσματα

2.1. Λειτουργικά τμήματα πεπτιδίου που προέρχεται από AIMP1- (AdP)

Το AdP, {{0}} στο 46-θραύσμα υπολειμμάτων του AIMP1, έχει διπλές λειτουργίες (δηλαδή, δραστηριότητες ενεργοποίησης ινοβλαστών και αναστολής μελανοκυττάρων) στο κύτταρο που σχετίζεται με το δέρμα. Για λειτουργικό διαχωρισμό, θραύσματα του AdP (Fr1: 6-20, Fr2: 10-24, Fr3: 14-28, Fr4: 18-32, Fr5: 26-40 και Fr6: 32-46 υπολειμματικά θραύσματα του AIMP1) ήταν παράγονται με σύνθεση στερεάς φάσης και δοκιμάστηκαν σε ινοβλάστες και μελανοκύτταρα. Για τη διερεύνηση της περιοχής ενεργοποίησης ινοβλαστών του AdP (FA-AdP), προσδιορίστηκε η επαγωγή κολλαγόνου και ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός μετά την επεξεργασία κάθε θραύσματος. Το Fr3 έδειξε παρόμοιες επαγωγικές δραστηριότητες με το AdP στη σύνθεση κολλαγόνου και στον πολλαπλασιασμό ινοβλαστών (Εικόνα 1a,b). Σε σύγκριση με τον EGF (1 μg/mL), το Fr3 (0,1 μg/mL) εμφάνισε 15 τοις εκατό και 10 τοις εκατό πιο ισχυρές δραστηριότητες για επαγωγή κολλαγόνου και πολλαπλασιασμό ινοβλαστών, αντίστοιχα.

Για να αναγνωριστεί η περιοχή αναστολής μελανοκυττάρων του AdP (MI-AdP), τα θραύσματα του AdP (Fr1-6) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε μελανοκύτταρα που προκαλούνται από -MSH. Μεταξύ αυτών, το Fr4 έδειξε συγκρίσιμη αναστολή της σύνθεσης μελανίνης που προκαλείται από -MSH με εκείνη του AdP (Εικόνα 1c). Επιπλέον, σε σύγκριση με την αλβουμίνη (10 μΜ), το Fr4 (1 μg/mL) άσκησε 35 τοις εκατό υψηλότερη ανασταλτική επίδραση στη σύνθεση μελανίνης.

Σχήμα 1. Χαρτογράφηση πεδίου που ενεργοποιεί τους ινοβλάστες (FA) και αναστέλλει τη μελανίνη (MI) πεπτιδίου που προέρχεται από AIMP1- (AdP): (α) Οι ινοβλάστες της ακροποσθίας υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGF (1 μg/mL), AdP ({ {5}}.1 μg/mL) και θραύσματα AdP (Fr1–Fr6; 0.1 μg/mL). Μετά από 24 ώρες επώασης, το προκολλαγόνο τύπου Ι προσδιορίστηκε σε καλλιεργημένα μέσα με ELISA. (β) μετά από 48 ώρες επώασης, πραγματοποιήθηκε ανάλυση CCK8-για την παρακολούθηση του πολλαπλασιασμού των ινοβλαστών της ακροποσθίας. (γ) τα μελανοκύτταρα, προκατεργασμένα με -MSH (0.5 μΜ), υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με λευκωματίνη (At, 10 μΜ), AdP (1 μg/mL) και θραύσματα AdP ( Fr1–Fr6, 1 µg/mL). Μετά από 48 ώρες επώασης, μετρήθηκε η ενδοκυτταρική μελανίνη. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD) (n=3). * p < 0.05 και ** p < 0.01, σημαντικά διαφορετικά από τον έλεγχο.

2.2. Δοκιμές κυτταροτοξικότητας και ανοσογονικότητας FA- και MI-AdP

Δεδομένου ότι το ζήτημα της ασφάλειας είναι σημαντικό στον καλλυντικό τομέα, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές κυτταροτοξικότητας και ανοσογονικότητας σε FA-AdP και MI-AdP (δηλαδή, Fr3 και Fr4, αντίστοιχα). Για να εξασφαλιστεί η ασφάλεια αυτών των πεπτιδίων, μια υψηλή ποσότητα FA-AdP ή MI-AdP υποβλήθηκε σε επεξεργασία για να επιτευχθεί 100 × η αποτελεσματική συγκέντρωση. Στα κερατινοκύτταρα, τα FA-AdP και MI-AdP δεν έδειξαν κυτταροτοξικότητα έως και 100 μg/mL (Εικόνα 2α). Για δοκιμές ανοσογονικότητας, τα FA-AdP και MI-AdP υποβλήθηκαν σε αγωγή σε μονοκύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2b, το επίπεδο TNF των ομάδων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με πεπτίδιο δεν εμφάνισε σημαντική διαφορά σε σύγκριση με αυτό της ομάδας ελέγχου (Εικόνα 2b).

Εικόνα 2. Μη κυτταροτοξικότητα και μη ανοσογονικότητα των FA-AdP και MI-AdP: (α) Για να δοκιμαστεί η κυτταροτοξικότητα των FA-AdP και MI-AdP, τα κερατινοκύτταρα (κύτταρα HaCaT) επωάστηκαν με δοξορουβικίνη (Dox, 1{{ 29}} μΜ), AdP (100 μg/mL), FA-AdP (10 ή 100 μg/mL) και MI-AdP (10 ή 100 μg/mL). Μετά από 24 ώρες επώασης, η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε με ανάλυση CCK-8. (β) για τη δοκιμή ανοσογονικότητας, χρησιμοποιήθηκαν μονοκύτταρα (THP-1 κύτταρα). Μετά από 12 ώρες επώασης με LPS (50 ng/mL), AdP (100 μg/mL), FA-AdP (10 ή 100 μg/mL) και MI-AdP (10 ή 100 μg/mL), το επίπεδο TNF μετρήθηκε σε καλλιεργημένα μέσα με ELISA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SD (n=3). ** p < 0,01, σημαντικά διαφορετική από τις άλλες.

2.3. Ιξώδες AdP Hydrosol

Για να αποδειχθεί η βελτιωμένη τοπική παροχή AdP μέσω της κεράτινης στιβάδας (SC), παρασκευάστηκαν και αξιολογήθηκαν σκευάσματα υδρολύματος φορτωμένα με FA-AdP που αποτελούνταν από CMC, αιθανόλη και γλυκερίνη. Οι τιμές ιξώδους των υδρολυμάτων AdP κυμαίνονταν από 116,1–267,1 cps (Πίνακας 1).

Οι τιμές ιξώδους αυξήθηκαν καθώς οι συγκεντρώσεις CMC (x1), αιθανόλης (x2) και γλυκερίνης (x3) άλλαξαν από χαμηλές σε υψηλές τιμές. Οι συντελεστές των x1, x2, x3 και x2·x3 στην κωδικοποιημένη εξίσωση παλινδρόμησης ήταν 28,25, 32,91, 30.16 και 19,53, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι οι γραμμικοί όροι έχουν πιο σημαντικές επιπτώσεις στο ιξώδες από το όρος αλληλεπίδρασης. Οι πραγματικές, προσαρμοσμένες και προβλεπόμενες τιμές του συντελεστή προσδιορισμού (R 2 ) ήταν 0.9049, 0.8668 και 0.7364, αντίστοιχα. Η ομοιότητα μεταξύ αυτών των τιμών υποδηλώνει ότι το μοντέλο δεν ήταν υπερβολικά προσαρμοσμένο. Τα διαγράμματα της επιφάνειας απόκρισης που δείχνουν την επίδραση των ανεξάρτητων μεταβλητών στο ιξώδες του υδρολύματος παρουσιάζονται στο Σχήμα 3. Όπως αναμένεται από την εξίσωση που αναφέρθηκε παραπάνω, οι συγκεντρώσεις CMC, αιθανόλης και γλυκερίνης επέδειξαν θετικά αποτελέσματα στο ιξώδες.

2.4. Ρυθμός ξήρανσης AdP Hydrosol

Η απώλεια βάρους του υδρολύματος κατά την ξήρανση φαίνεται στο Σχήμα 4α και οι τιμές της σταθεράς ταχύτητας ξήρανσης (k) υπολογίστηκαν επιτυχώς προσαρμόζοντας το μοντέλο πρώτης τάξης σε αυτά τα δεδομένα (R 2 > 0).951, Πίνακας 1 ). Οι τιμές k κυμαίνονταν από 0.0083–0,0242 min−1, και η εξίσωση μειωμένου μοντέλου για k (y2) σε κωδικοποιημένες μονάδες είναι η παρακάτω:

που αποτελείται μόνο από τους όρους που έχουν σημαντική επίδραση στις τιμές k (p < 0.{{10}}5· Πίνακας 2). Οι θετικοί συντελεστές των όρων x2 και x2·x2 υποδηλώνουν ότι οι τιμές k αυξάνονταν καθώς αυξανόταν η συγκέντρωση της αιθανόλης, ενώ ο αρνητικός συντελεστής του όρου x3 έδειξε ξεκάθαρα την ανασταλτική επίδραση της γλυκερίνης στο στέγνωμα. Οι πραγματικές, προσαρμοσμένες και προβλεπόμενες τιμές R 2 αυτού του μοντέλου ήταν 0.9839, 0.9775 και 0.9659, αντίστοιχα, υποστηρίζοντας ότι το μοντέλο μπορεί να εξηγήσει τις τιμές k περισσότερο από 98 τοις εκατό χωρίς να είναι υπερβολική. Τα διαγράμματα επιφάνειας απόκρισης που παρουσιάζουν τη σχέση μεταξύ των ανεξάρτητων μεταβλητών και των τιμών k του υδρολύματος παρουσιάζονται στο Σχήμα 4 bd. Αξιοσημείωτο είναι ότι παρόλο που ο όρος αλληλεπίδρασης, x1·x2, έχει αρνητική τιμή συντελεστή, η συνολική επίδραση της συγκέντρωσης αιθανόλης στις τιμές k ήταν θετική υπό τις πειραματικές συνθήκες.

2.5. Βελτιστοποίηση του AdP Hydrosol με βάση την σύνθετη επιθυμία

Τα διαγράμματα βελτιστοποίησης που παρουσιάζουν τις συναρτήσεις επιθυμητότητας φαίνονται στο Σχήμα 5. Η μέγιστη σύνθετη επιθυμία (D) του 0.8912 λήφθηκε σε συγκεντρώσεις CMC, αιθανόλης και γλυκερίνης 0.229 τοις εκατό (w /v), 50 τοις εκατό (v/v) και 20 τοις εκατό (v/v), αντίστοιχα. Η τιμή D κοντά στο 1 υποδηλώνει ότι τόσο το ιξώδες όσο και το k πέτυχαν ευνοϊκά (δηλαδή, μεγιστοποιημένα) αποτελέσματα ως σύνολο. Οι μεμονωμένες τιμές επιθυμητότητας για το ιξώδες (d1) και k (d2) ήταν 1.0000 και 0,79429, αντίστοιχα, υποδηλώνοντας ότι η παραπάνω σύνθεση υδρολύματος είναι πιο αποτελεσματική στη μεγιστοποίηση του ιξώδους από το k. Αξίζει να σημειωθεί, αν και οι συγκεντρώσεις CMC και γλυκερίνης εμφάνισαν αντίθετα αποτελέσματα στο ιξώδες και το k, μόνο ο όρος συγκέντρωσης CMC εμφάνιζε το μέγιστο σημείο στη συνάρτηση D. Ο όρος συγκέντρωσης αιθανόλης έδειξε μόνο θετική επίδραση υπό τις πειραματικές μας συνθήκες.

2.6. Μελέτη εναπόθεσης τεχνητού δέρματος

Η εναπόθεση μεμβράνης Strat-M (STM, τεχνητό δέρμα) του υδρολύματος FA-AdP με επισήμανση φθορίζουσας βαφής παρακολουθήθηκε με απεικόνιση εγγύς υπέρυθρου φθορισμού (NIR) (Εικόνα 6). Με βάση τα αποτελέσματα των μελετών βελτιστοποίησης, το επισημασμένο με FA-AdP υδρόλυμα που περιέχει CMC, αιθανόλη και γλυκερίνη σε συγκεντρώσεις 0,229 τοις εκατό (w/v), 50 τοις εκατό (v/ ν), και 20 τοις εκατό (ο/ο) επιλέχθηκε ως το τελικό σκεύασμα. Σε επώαση 8 ωρών, η μέση ένταση φθορισμού του επεξεργασμένου με υδροζόλ STM ήταν 127- φορές υψηλότερη από εκείνη του ελεύθερου FA-AdP (δηλ. το διάλυμα σε διπλά απιονισμένο νερό) επεξεργασμένο STM (ρ < 0,05). Ωστόσο, οι τιμές του συντελεστή διακύμανσης (CV) ήταν συγκρίσιμες μεταξύ των δύο ομάδων (10,6 τοις εκατό και 14,8 τοις εκατό για υδρόλυμα φορτωμένο με FA-AdP και ελεύθερο FA-AdP, αντίστοιχα), υποστηρίζοντας την αναπαραγωγιμότητα της δραματικής ενισχυτικής επίδρασης του ανεπτυγμένου υδρολύματος .

3. Συζήτηση

Το AdP αναλύθηκε για να προσδιοριστεί ο λειτουργικός τομέας. Ο τομέας ενεργοποίησης ινοβλαστών του AdP (FA-AdP, sh-ολιγοπεπτίδιο 84) και ο τομέας αναστολής μελανοκυττάρων του AdP (MI-AdP, sh-ολιγοπεπτίδιο 91 SP) αποδείχθηκαν ως 14-28 και 18-32 υπολείμματα του AIMP1, αντίστοιχα . Παρά την ομολογία 66 τοις εκατό μεταξύ των αλληλουχιών τους, αυτά τα δύο πεπτίδια έδειξαν διαφορετικές λειτουργίες σε κύτταρα που σχετίζονται με το δέρμα, κάτι που θα μπορούσε να εξηγηθεί από τη διαφορά στις δευτερογενείς/τριτοταγείς δομές ή τους συνεργάτες αλληλεπίδρασης. Οι χαρακτηριστικές τρισδιάστατες δομές επιτρέπουν ακόμη και στα πεπτίδια υψηλής ομολογίας να έχουν διακριτές βιολογικές δραστηριότητες, παρέχοντας διαφορετικές διεπαφές αλληλεπίδρασης [35]. Εν τω μεταξύ, τα FA-AdP και MI-AdP είναι πεπτίδια μήκους 15-αμινοξέων (aa), τα οποία είναι πολύ μικρότερα από το AdP (41-αα πεπτίδιο μήκους). Γενικά, τα κολοβωμένα πεπτίδια έχουν πλεονεκτήματα όπως η δυνατότητα απλής και οικονομικά αποδοτικής σύνθεσης και ενίσχυσης της διείσδυσης στο δέρμα, υποδηλώνοντας ότι τα FA-AdP και MI-AdP είναι ελκυστικά καλλυντικά συστατικά.

Ωστόσο, σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη, αυτά τα πεπτίδια πρέπει να χορηγηθούν στο χόριο - όπου βρίσκονται οι ινοβλάστες - για να ασκήσουν αντιγηραντική δράση του δέρματος [13]. Έτσι, αναπτύχθηκαν σκευάσματα τύπου υδρολύματος για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος παροχής. Η αιθανόλη και η γλυκερόλη χρησιμοποιήθηκαν ως τα κύρια συστατικά του κολοβωμένου υδρολύματος με AdP. Η αιθανόλη είναι ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος ενισχυτής διείσδυσης στη βιομηχανία καλλυντικών, ο οποίος μπορεί να βελτιώσει την παροχή πεπτιδίων στο δέρμα με πολλαπλούς μηχανισμούς. Η αιθανόλη μπορεί να αλλάξει τη φυσική κατάσταση του ιστού του δέρματος ή ακόμη και να εξάγει μερικά από τα λιπίδια που συνθέτουν το στρώμα SC, με αποτέλεσμα τη βελτίωση της ροής πεπτιδίων μέσω του δέρματος [36]. Επιπλέον, η αιθανόλη μπορεί να αυξήσει τη συγκέντρωση του πεπτιδίου μετά τη χορήγηση λόγω της ταχείας απώλειας με εξάτμιση ή απορρόφηση από το δέρμα. Ο επακόλουθος υπερκορεσμός του πεπτιδίου μπορεί να παρέχει υψηλότερο δυναμικό παροχής στο δέρμα [26]. Η αιθανόλη μπορεί επίσης να σύρει απευθείας το πεπτίδιο στο δέρμα κατά τη διείσδυσή του [37].

Αν και οι συγκεντρώσεις αιθανόλης έως και 80 τοις εκατό μπορούν να χρησιμοποιηθούν χωρίς ανησυχίες για ερεθισμό του δέρματος [38], η καθίζηση του CMC σε υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης περιόρισε τη μέγιστη περιεκτικότητά του στο υδρόλυμα στο 50 τοις εκατό σε αυτή τη μελέτη. Η γλυκερίνη μπορεί επίσης να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα χορήγησης πεπτιδίων, της οποίας ο υποκείμενος μηχανισμός είναι η ενυδάτωση της στιβάδας SC [39]. Η ενυδάτωση του δέρματος μπορεί να αυξήσει τη διαδερμική απορρόφηση υδρόφιλων ενώσεων, συμπεριλαμβανομένων των πεπτιδίων [26].

Επιπλέον, το ιξώδες και οι τιμές k μπορεί επίσης να επηρεάσουν την αποτελεσματικότητα παροχής πεπτιδίου, καθώς και την ευκολία εφαρμογής [40,41]. Πιο συγκεκριμένα, το υψηλότερο ιξώδες σχετίζεται στενά με τη μεγαλύτερη κατακράτηση του υδρολύματος στο δέρμα και ο ταχύτερος ρυθμός στεγνώματος εγγυάται την ταχεία ανάπτυξη της βαθμίδας συγκέντρωσης πεπτιδίου μεταξύ του υδρολύματος και του δέρματος [40,41]. Σύμφωνα με τον πρώτο νόμο της διάχυσης του Fick, και οι δύο αυτές ιδιότητες πρέπει να μεγιστοποιηθούν για να ληφθεί η υψηλότερη ροή πεπτιδίου. Έτσι, το ιξώδες και οι τιμές k θεωρήθηκαν ως κρίσιμα χαρακτηριστικά ποιότητας (CQA) σε αυτή τη μελέτη. Για την επίτευξη επαρκούς ιξώδους, προστέθηκε CMC στο υδρόλυμα ως παχυντικός παράγοντας. Ωστόσο, καθώς το CMC καθιζάνει παρουσία υψηλής συγκέντρωσης αιθανόλης, το CMC δεν προστέθηκε σε περισσότερο από 0,3 τοις εκατό.

Είναι ενδιαφέρον ότι ακόμη και κάτω από αυτή τη χαμηλή συγκέντρωση, το CMC επέδειξε αρνητική επίδραση στον ρυθμό ξήρανσης στην προκαταρκτική μας μελέτη (τα δεδομένα δεν φαίνονται), υποδηλώνοντας την αναγκαιότητα μιας συστηματικής προσέγγισης για την επίτευξη του βελτιστοποιημένου περιεχομένου του. Ως εκ τούτου, το BBD υιοθετήθηκε για να αξιολογηθεί πιο διεξοδικά η σχέση μεταξύ των συνθέσεων και των CQA του υδρολύματος. Με βάση αυτή τη σχέση, ελήφθη η βελτιστοποιημένη σύνθεση που δείχνει τη μεγιστοποιημένη τιμή D.

Το βελτιστοποιημένο υδρόλυμα αξιολογήθηκε ως προς την αποτελεσματικότητα παροχής AdPs στο δέρμα. Ωστόσο, η χρήση συμβατικών μοντέλων μελέτης που χρησιμοποιούν δέρμα ζώων αποθαρρύνεται κατά τη δοκιμή καλλυντικών [42]. Ως εναλλακτική λύση στο δέρμα των ζώων, υιοθετήθηκε η STM, μια συνθετική μεμβράνη, η οποία μοιράζεται παρόμοια δομή με το ανθρώπινο δέρμα. Ένα σφιχτό ανώτερο στρώμα επικαλυμμένο με λιπίδια μοιάζει με το SC. Κάτω από το ανώτερο στρώμα, τα δύο στρώματα πολυαιθεροσουλφόνης (PES) υποστηρίζονται από τη μη υφασμένη μήτρα πολυολεφίνης. Αυτές οι δομές μιμούνται το χόριο και τον υποδόριο ιστό, αντίστοιχα [43]. Μετά τη μελέτη εναπόθεσης τεχνητού δέρματος, τα δείγματα STM αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το όργανο απεικόνισης NIR για να ποσοτικοποιηθεί η εναπόθεση FA-AdP. Η απεικόνιση NIR παρέχει πληροφορίες σχετικά με τη συνολική έκταση της εναπόθεσης πεπτιδίων στο STM σχεδόν ακαριαία. Επιπλέον, καθώς αυτή η τεχνική δεν απαιτεί καταστροφικές προεπεξεργασίες δειγμάτων, όπως ομογενοποίηση, εκχύλιση και συμπύκνωση, η ένταση φθορισμού των ανέπαφων δειγμάτων μπορεί να απεικονιστεί με χωρικές πληροφορίες. Η παρατηρούμενη δραματική ενίσχυση της εναπόθεσης FA-AdP στο τεχνητό δέρμα υποδηλώνει ότι το αναπτυγμένο υδρόλυμα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένα πολλά υποσχόμενο τοπικό σύστημα χορήγησης AdPs για την αντιγήρανση του δέρματος.

4. Υλικά και Μέθοδοι

4.1. Κυτταρική καλλιέργεια και αντιδραστήρια

Οι ινοβλάστες της ακροποσθίας (HFF-1), τα κερατινοκύτταρα (HaCaT) και τα μελανοκύτταρα (B16F10) καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και αντιβιοτικά (100 U/mL πενικιλλίνη και 100 μg/mL στρεπτοκίνης ). Κύτταρα ΤΗΡ-1 καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10 τοις εκατό FBS και αντιβιοτικά (100 U/mL πενικιλλίνη και 100 μg/mL στρεπτομυκίνη). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37◦C σε υγρή ατμόσφαιρα σε 5 τοις εκατό CO2. Όλα τα πεπτίδια συντέθηκαν με τη μέθοδο σύνθεσης στερεάς φάσης, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως από την ομάδα μας [13]. Το Blanose™ sodium carboxymethylcellulose 7LP EP (CMC, 90,5 kDa) αγοράστηκε από την Ashland (Schaffhausen, Ελβετία). Η γλυκερίνη και η αιθανόλη ελήφθησαν από την Samchun Chemical Co., Ltd. (Σεούλ, Κορέα). Ο εστέρας Alexa Fluor™ 647 NHS αγοράστηκε από την Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, ΗΠΑ). Η μεμβράνη Strat-M (STM) ελήφθη από την EMD Millipore Co. (Billerica, ΜΑ, ΗΠΑ). Αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) αγοράστηκε από την Lonza Group Ltd. (Βασιλεία, Ελβετία). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια ήταν αναλυτικής ποιότητας και αγοράστηκαν από εμπορικές πηγές.

4.2. ELISA κολλαγόνου

Κύτταρα ινοβλαστών ακροποσθίας (HFF-1· 5 × 104 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε ένα τρυβλίο καλλιέργειας 24-φρεατίου. Πριν από τη θεραπεία με πεπτίδιο, τα κύτταρα προεπωάστηκαν με μέσο DMEM χωρίς ορό για 6 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AdP, hEGF (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ) και θραύσματα AdP για 24 ώρες. Μετά από θεραπεία 24 ωρών, τα μέσα συλλέχθηκαν για τον προσδιορισμό ELISA κολλαγόνου. Το προκολλαγόνο τύπου Ι στο μέσο καλλιέργειας προσδιορίστηκε από το κιτ ELISA Procollagen τύπου I (Takara, Kusatsu, Ιαπωνία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποσότητα προκολλαγόνου τύπου Ι στα μέσα κανονικοποιήθηκε από την ποσότητα προκολλαγόνου τύπου Ι της ομάδας ελέγχου.

4.3. Δοκιμασία πολλαπλασιασμού

Κύτταρα ινοβλαστών ακροποσθίας (HFF-1· 3 × 103 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε ένα τρυβλίο 96-πηγαδιού και καλλιεργήθηκαν. Τα κύτταρα αντικαταστάθηκαν με μέσα χωρίς ορό και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AdP, hEGF και θραύσματα AdP για 48 ώρες. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε με ανάλυση CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Ιαπωνία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο πολλαπλασιασμός κανονικοποιήθηκε με τον πολλαπλασιασμό της ομάδας ελέγχου.

4.4. Μέτρηση μελανίνης

Τα μελανοκύτταρα (B16F10; 1 × 105 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε μια πλάκα 6-πηγαδιού και καλλιεργήθηκαν. Για να προκληθεί σύνθεση μελανίνης, χρησιμοποιήθηκε -MSH (0,5 μΜ), ένας επαγωγέας μελανίνης. Το AdP και τα θραύσματα του AdP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με -MSH (0,5 μΜ) για 48 ώρες. Η ενδοκυτταρική δραστηριότητα μελανίνης και τυροσινάσης παρακολουθήθηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [13]. Εν συντομία, μελανοκύτταρα (1 × 105 κύτταρα,) λύθηκαν με 1 Ν NaOH στους 70 °C για 1 ώρα. Η ενδοκυτταρική μελανίνη προσδιορίστηκε σε λυμένα δείγματα με απορρόφηση μήκους κύματος 490 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Synergy 2, BioTek, Winooski, VM, USA).

4.5. Δοκιμές κυτταροτοξικότητας και ανοσογονικότητας

Η ασφάλεια των FA-AdP και MI-AdP επαληθεύτηκε ως προς την κυτταροτοξικότητα και την ανοσογονικότητα. Για να δοκιμαστεί η κυτταροτοξικότητα των πεπτιδίων, τα κερατινοκύτταρα (HaCaT, 3 × 103 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε μια πλάκα 96-πηγαδιού και καλλιεργήθηκαν. Τα κύτταρα επωάστηκαν με δοξορουβικίνη (Dox, 10 μΜ), AdP (100 μg/mL), FA-AdP (10 ή 100 μg/mL), ή ΜΙ-ΑάΡ (10 ή 100 μg/mL). Μετά από επώαση 24 ωρών, η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία CCK-8 (Dojindo) σύμφωνα με το εγχειρίδιο του κατασκευαστή. Η ανοσογονικότητα των πεπτιδίων αξιολογήθηκε με διεξαγωγή TNF-ELISA. Κύτταρα THP-1 (5 × 104 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν σε μια πλάκα 24-πηγαδιού. Τα κύτταρα προεπωάστηκαν με μέσα που περιέχουν 1 τοις εκατό FBS για 6 ώρες. Μετά την προεπώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ng/mL LPS, AdP και θραύσματα AdP. Μετά από θεραπεία 12 ωρών, συλλέχθηκαν ρυθμισμένα μέσα για τον προσδιορισμό TNF-ELISA. Η ποσότητα του TNF σε ρυθμισμένα μέσα εκτιμήθηκε από ένα κιτ ανθρώπινου TNF- ELISA (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποσότητα TNF- σε ρυθμισμένα μέσα κανονικοποιήθηκε από την ποσότητα TNF- της ομάδας ελέγχου.

4.6. Παρασκευή υδρολύματος με FA-AdP

Οι συνθέσεις υδρολύματος FA-AdP παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας CMC, γλυκερίνη και αιθανόλη. Το CMC διαλύθηκε σε ζεστό διπλά απιονισμένο νερό (DDW, 80 ◦C) με συνεχή ανάδευση στις 700 rpm για 3 ώρες για να παρασκευαστεί ένα διάλυμα εργασίας 3 τοις εκατό (β/ο). Η γλυκερίνη και η αιθανόλη αναμίχθηκαν με το διάλυμα CMC χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή (Ultra-Turrax Τ-25, IKA Works GmbH & Co. KG, Staufen, Γερμανία) στις 14,000 rpm για 5 λεπτά. FA-AdP διαλυμένο σε DDW προστέθηκε στο μίγμα για να παραχθεί η τελική σύνθεση με συγκέντρωση FA-AdP 20 μΜ.

4.7. Πειραματικός Σχεδιασμός για Βελτιστοποίηση Hydrosol

Ο σχεδιασμός Box-Behnken (BBD) χρησιμοποιήθηκε για τη βελτιστοποίηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων του υδρολύματος FA-AdP. Οι συγκεντρώσεις CMC (x1), αιθανόλης (x2) και γλυκερίνης (x3) επιλέχθηκαν ως ανεξάρτητες μεταβλητές. Οι επιδράσεις αυτών των παραγόντων στο ιξώδες (y1) και τη σταθερά ταχύτητας ξήρανσης (y2) του υδρολύματος αξιολογήθηκαν σε τρία επίπεδα. Συμπεριλαμβανομένων τριών επαναλήψεων στο κέντρο, πραγματοποιήθηκαν 15 πειράματα. Οι πειραματικοί συνδυασμοί παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Τα καλύτερα προσαρμοσμένα τετραγωνικά μοντέλα δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας Minitab® 18.1 (Minitab Inc., State College, PA, USA) για τη διερεύνηση των επιδράσεων γραμμικής, τετραγωνικής και αλληλεπίδρασης των τριών παραγόντων. Μόνο οι μεταβλητές με τιμή p < 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές και συμπεριλήφθηκαν στο μοντέλο. Με βάση τα αποτελέσματα τυχαιοποιημένων πειραματικών δοκιμών, ελήφθησαν τα 3-διαστατικά επιφανειακά διαγράμματα. Δημιουργήθηκαν τα διαγράμματα βελτιστοποίησης που δείχνουν συναρτήσεις επιθυμητότητας και εκτιμήθηκε ο συνδυασμός ανεξάρτητων μεταβλητών που εμφανίζουν τη μέγιστη σύνθετη επιθυμία (D). Η τιμή D λήφθηκε ως ο γεωμετρικός μέσος όρος της ατομικής επιθυμίας (d) χρησιμοποιώντας τον παρακάτω τύπο:

όπου τα d1 και d2 αντιπροσωπεύουν την ατομική επιθυμία ιξώδους και σταθερά ταχύτητας ξήρανσης του υδρολύματος, αντίστοιχα, και δεν εφαρμόστηκε συντελεστής στάθμισης.

4.8. Μέτρηση του ιξώδους και του ρυθμού στεγνώματος

Το ιξώδες του υδρολύματος FA-AdP μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ιξωδόμετρο DV-II plus Pro εξοπλισμένο με άτρακτο LV-1 (Ametek Brookfield, Middleborough, MA, ΗΠΑ). Η μέτρηση έγινε μεταξύ 50–60 τοις εκατό της κλίμακας ροπής του οργάνου στους 25 ◦C. Για να αξιολογηθεί ο ρυθμός ξήρανσης, κλάσματα (200 μL) των αναπτυγμένων σκευασμάτων φορτώθηκαν σε δίσκους (εμβαδόν επιφάνειας: 63,6 mm2) γνωστού βάρους και επωάστηκαν σε ξηρό φούρνο (32 ◦C). Οι αλλαγές βάρους τους παρακολουθήθηκαν στα 0, 15, 30, 45 και 60 λεπτά. Η σταθερά ταχύτητας στεγνώματος (k; min−1 ) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη συσχέτιση πρώτης τάξης μεταξύ της αλλαγής βάρους κατά το στέγνωμα και του χρόνου που πέρασε. Οι γραμμές παλινδρόμησης σχεδιάστηκαν σύμφωνα με την ακόλουθη εξίσωση:

4.9. Αξιολόγηση της εναπόθεσης τεχνητού δέρματος με εγγύς υπέρυθρη απεικόνιση φθορισμού

Η μελέτη εναπόθεσης τεχνητού δέρματος διεξήχθη χρησιμοποιώντας απεικόνιση NIR. FA-AdP (4 mg) διαλύθηκε σε 0.1 Μ ρυθμιστικό διάλυμα διττανθρακικού νατρίου (1 mL, ρΗ 8,3) και αναμίχθηκε αργά με εστέρα Alexa Fluor™ 647 NHS (50 μg). Το μίγμα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Το επισημασμένο με φθορισμό FA-AdP καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας μια στήλη αφαλάτωσης PD-10 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) και η συγκέντρωσή του μετρήθηκε με κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης δικινχονικού οξέος (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MS, ΗΠΑ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Επισημασμένο με φθορισμό υδρόλυμα φορτωμένο με FA-AdP παρασκευάστηκε σύμφωνα με την ίδια μέθοδο στην Ενότητα 4.6. Η σύνθεση του υδρολύματος που εμφανίζει την υψηλότερη σύνθετη επιθυμία επιλέχθηκε ως η βελτιστοποιημένη σύνθεση για τη μελέτη χορήγησης δέρματος. Η συγκέντρωση του επισημασμένου με φθορισμό FA-AdP στο υδρόλυμα ήταν 20 μΜ. Ένα κλάσμα (1 mL) του επισημασμένου υδρολύματος FA-AdP ή του επισημασμένου FA-AdP διαλυμένου σε DDW (20 μΜ, ομάδα ελέγχου) εφαρμόστηκε στην άνω πλευρά του STM που σφίγγεται μεταξύ των κυττάρων δότη και υποδοχέα του κυττάρου διάχυσης Keshary-Chien ( FCDV-15 Κονσόλα Diffusion Cell Drive, Labfine, Anyang, Κορέα). Η περιοχή των κυττάρων διάχυσης ήταν 1,76 cm2 και το πείραμα διεξήχθη στους 32 ◦C υπό σκοτεινές συνθήκες. Μετά από 8 ώρες επώασης, το STM συλλέχθηκε και πλύθηκε με περίσσεια ποσότητα DDW 5 φορές. Η ένταση NIR των δειγμάτων τεχνητού δέρματος μετρήθηκε με VISQUE® InVivo Smart (Vieworks, Anyang, Κορέα).

4.10. Στατιστική

Η στατιστική ανάλυση (unpaired two-tailed Student's t-test) διεξήχθη χρησιμοποιώντας στατιστικό λογισμικό SPSS (Έκδοση 21.0· IBM Corp, NY, ΗΠΑ). Όλα τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) και η τιμή p μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Συνεισφορές συγγραφέα:

Όλοι οι συγγραφείς έχουν συμβάλει ουσιαστικά σε αυτήν την εργασία: conceptualization, J.-YL και MCP; μεθοδολογία, Y.-MH, T.-WK, and K.-RL; λογισμικό, DHK; έρευνα, J.-JL, Y.-MH, T.-WK, HSL, WJJ, JK και SK. συγγραφή — προετοιμασία πρωτότυπου σχεδίου, J.-JL; συγγραφή — αναθεωρημένη προετοιμασία προσχέδιο, Y.-MH και T.-WK; συγγραφή-αναθεώρηση και επεξεργασία, J.-YL και MCP. εποπτεία, D.-DK, SKK και C.-WC. διαχείριση έργου, J.-YL, και MCP; εξαγορά χρηματοδότησης, J.-YL

Χρηματοδότηση:

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το ερευνητικό ταμείο του Εθνικού Πανεπιστημίου Chungnam.

Σύγκρουση συμφερόντων:

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων. Οι χρηματοδότες δεν είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης. στη συλλογή, αναλύσεις ή ερμηνεία δεδομένων· στη συγγραφή του χειρογράφου ή στην απόφαση δημοσίευσης των αποτελεσμάτων.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Ganceviciene, R.; Λιάκου, Α.Ι. Θεοδωρίδης, Α.; Μακραντωνάκη, Ε.; Ζουμπούλης, CC Στρατηγικές αντιγήρανσης του δέρματος. Dermato-endocrinology 2012, 4, 308-319. [CrossRef]

2. Pena Ferreira, MR; Costa, PC; Bahia, FM Αποτελεσματικότητα των αντιρυτιδικών προϊόντων στην εμφάνιση της επιφάνειας του δέρματος: μια συγκριτική μελέτη με χρήση μη επεμβατικών μεθόδων. Δέρμα. Res. Τεχνολ. 2010, 16, 444–449. [CrossRef]

3. Hynes, RO Η εξωκυτταρική μήτρα: όχι μόνο όμορφα ινίδια. Science 2009, 326, 1216–1219. [CrossRef] [PubMed]

4. Frantz, C.; Stewart, KM; Weaver, VM Η εξωκυτταρική μήτρα με μια ματιά. J. Cell Sci. 2010, 123, 4195–4200. [CrossRef]

5. Ρήτρα, KC; Barker, TH Σηματοδότηση εξωκυτταρικής μήτρας στη μορφογένεση και την επιδιόρθωση. Curr. Γνώμη. Biotechnol. 2013, 24, 830–833. [CrossRef]

6. Malerich, S.; Berson, D. Καλλυντικά επόμενης γενιάς: τα πιο πρόσφατα πεπτίδια, αυξητικούς παράγοντες, κυτοκίνες και βλαστοκύτταρα. Dermatol. Clin. 2014, 32, 13–21. [CrossRef] [PubMed]

7. Uitto, J. Ο ρόλος της ελαστίνης και του κολλαγόνου στη δερματική γήρανση: ενδογενής γήρανση έναντι έκθεσης στη φωτογραφία. J. Drugs Dermatol. 2008, 7, s12–s16.

8. Fligiel, SE; Varani, J.; Datta, SC; Kang, S.; Fisher, GJ; Voorhees, αποικοδόμηση κολλαγόνου JJ σε ηλικιωμένο/φωτογραφημένο δέρμα in vivo και μετά από έκθεση σε μεταλλοπρωτεϊνάση μήτρας-1 in vitro. J. Investig. Dermatol. 2003, 120, 842–848. [CrossRef] [PubMed]

9. Varani, J.; Perone, Ρ.; Fligiel, SE; Fisher, GJ; Voorhees, JJ Αναστολή παραγωγής προκολλαγόνου τύπου Ι σε φωτοφθορές: συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας θραυσμάτων κολλαγόνου υψηλού μοριακού βάρους και μειωμένης σύνθεσης προκολλαγόνου. J. Invest. Dermatol. 2002, 119, 122-129. [CrossRef] [PubMed]

10. Carsberg, CJ; Warenius, HM; Friedmann, PS Μελανογένεση που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία σε ανθρώπινα μελανοκύτταρα. Επιδράσεις διαμόρφωσης πρωτεϊνικής κινάσης CJ Cell Sci. 1994, 107, 2591–2597.

11. Brenner, Μ.; Ακοή, VJ Ο προστατευτικός ρόλος της μελανίνης έναντι των βλαβών από την υπεριώδη ακτινοβολία στο ανθρώπινο δέρμα. Photochem. Photobiol. 2008, 84, 539–549. [CrossRef] [PubMed]

12. Lintner, Κ.; Mas-Chamberlin, C.; Mondon, Ρ.; Peschard, Ο.; Lamy, L. Καλλυντικά και ενεργά συστατικά. Clin. Dermatol. 2009, 27, 461-468. [CrossRef] [PubMed]

13. Kim, J.; Kang, S.; Kwon, Η.; Moon, Η.; Park, MC Διπλό λειτουργικό βιοδραστικό πεπτίδιο, πεπτίδιο προερχόμενο από AIMP1- (AdP), για αντιγήρανση. J. Cosmet. Dermatol. 2019, 18, 251–257. [CrossRef]

14. Kim, S.; Εσύ, Σ.; Hwang, D. Συνθετάσες αμινοακυλο-tRNA και ογκογένεση: περισσότερα από νοικοκυριό. Nat. Rev. Cancer 2011, 11, 708. [CrossRef] [PubMed]

15. Lee, SW; Kim, G.; Kim, S. Πολυλειτουργική πρωτεΐνη 1/p43 που αλληλεπιδρά με αμινοακυλο-tRNA συνθετάση: μια αναδυόμενη θεραπευτική πρωτεΐνη που λειτουργεί σε επίπεδο συστήματος. Γνώμη εμπειρογνωμόνων. Drug Discov. 2008, 3, 945–957. [CrossRef]

16. Helfrich, YR; Sachs, DL; Voorhees, JJ Επισκόπηση της γήρανσης του δέρματος και της φωτογήρανσης. Dermatol. Νοσηλευτές. 2008, 20, 177–183. [PubMed]

17. Park, SG; Shin, Η.; Shin, YK; Lee, Υ.; Choi, EC; Park, BJ; Kim, S. Η νέα κυτοκίνη ρ43 διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των δερματικών ινοβλαστών και την αποκατάσταση του τραύματος. Είμαι. J. Pathol. 2005, 166, 387–398. [CrossRef]

18. Han, JM; Park, SG; Lee, Υ.; Kim, S. Δομικός διαχωρισμός διαφορετικών εξωκυτταρικών δραστηριοτήτων σε πολυλειτουργική πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με συνθετάση αμινοακυλο-tRNA, p43/AIMP1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 342, 113–118. [CrossRef] [PubMed]

19. Witting, Μ.; Obst, Κ.; Friess, W.; Hedtrich, S. Πρόσφατες εξελίξεις στην τοπική παροχή πρωτεϊνών και πεπτιδίων με τη μεσολάβηση νανοφορέων μαλακής ύλης. Biotechnol. Adv. 2015, 33, 1355–1369. [CrossRef]

20. Kang, NW; Kim, MH; Sohn, SY; Kim, KT; Park, JH; Lee, SY; Lee, JY; Kim, DD Το φιλμ νανοϊνών κυτταρίνης υβριδοποιημένου με λιπίδια κυτταρίνης με κουρκουμίνη βελτιώνει τη δερματίτιδα που μοιάζει με ψωρίαση που προκαλείται από το imiquimod σε ποντίκια. Βιοϋλικά 2018, 182, 245–258. [CrossRef]

21. Aufenvenne, Κ.; Larcher, F.; Hausser, Ι.; Duarte, Β.; Oji, V.; Nikolenko, Η.; Del Rio, Μ.; Dathe, Μ.; Traupe, H. Η τοπική θεραπεία ενζυμικής υποκατάστασης αποκαθιστά τη δραστηριότητα της τρανσγλουταμινάσης 1 και διορθώνει την αρχιτεκτονική των δερματικών μοσχευμάτων με ανεπάρκεια τρανσγλουταμινάσης-1-. Είμαι. J. Hum. Genet. 2013, 93, 620–630. [CrossRef] [PubMed]

22. Goebel, AS; Schmaus, G.; Neubert, RH; Wohlrab, J. Δερματική διανομή πεπτιδίου με χρήση μορίων ενισχυτών και συστημάτων κολλοειδών φορέων – μέρος Ι: καρνοσίνη. Skin Pharmacol. Physiol. 2012, 25, 281–287. [CrossRef] [PubMed]

23. Prausnitz, MR; Mitragotri, S.; Langer, R. Τρέχουσα κατάσταση και μελλοντικές δυνατότητες διαδερμικής χορήγησης φαρμάκου. Nat. Rev. Drug Discov. 2004, 3, 115–124. [CrossRef]

24. Denet, AR; Vanbever, R.; Preat, V. Ηλεκτροπόρωση δέρματος για διαδερμική και τοπική παράδοση. Adv. Drug Deliv. Rev. 2004, 56, 659–674. [CrossRef]

25. Prausnitz, MR Microneedles για διαδερμική χορήγηση φαρμάκου. Adv. Drug Deliv. Rev. 2004, 56, 581–587. [CrossRef]

26. Williams, AC; Barry, BW ενισχυτικά διείσδυσης. Adv. Drug Deliv. Rev. 2004, 56, 603–618. [CrossRef]

27. Magnusson, BM; Runn, P. Επίδραση ενισχυτών διείσδυσης στη διείσδυση του αναλόγου της ορμόνης απελευθέρωσης θυρεοτροπίνης pGlu-3-methyl-His-Pro αμιδίου μέσω της ανθρώπινης επιδερμίδας. Int. J. Pharm. 1999, 178, 149–159. [CrossRef]

28. Butun, S.; Ince, FG; Erdugan, Η.; Sahiner, Ν. Κατασκευή ενός σταδίου βιοσυμβατών πολυμερικών σωματιδίων καρβοξυμεθυλοκυτταρίνης για συστήματα χορήγησης φαρμάκων. Υδατάνθρακες. Πολυμ. 2011, 86, 636–643. [CrossRef]

29. Pushpamalar, V.; Langford, SJ; Ahmad, Μ.; Lim, YY Βελτιστοποίηση των συνθηκών αντίδρασης για την παρασκευή καρβοξυμεθυλοκυτταρίνης από απόβλητα σάγου. Υδατάνθρακες. Πολυμ. 2006, 64, 312-318. [CrossRef]

30. Kim, J.-S.; Kim, Κ.-Τ.; Park, J.-H.; Lee, J.-Y.; Kim, Μ.; Min, HG; Σελήνη, Ι.-Η.; Choi, C.-Y.; Kim, BH; Kim, D.-D. Coacervate μικροκάψουλες βιταμίνης U βελτιστοποιημένες με κεντρικό σύνθετο σχεδιασμό (CCD). J. Pharm. Ερευνήστε. 2018. [CrossRef]

31. Ahmed, ZZ; Khan, FN; Shaikh, DA Αντίστροφη μηχανική και σύνθεση από QBD οφθαλμικού διαλύματος υδροχλωρικής ολοπαταδίνης. J. Pharm. Ερευνήστε. 2018, 48, 279–293. [CrossRef]

32. Navamanisubramanian, R.; Nerella, R.; Duraipandian, C.; Seetharaman, S. Προσέγγιση ποιότητας βάσει σχεδιασμού για βελτιστοποίηση παρειακών δισκίων ρεπαγλινίδης χρησιμοποιώντας Box-Behnken Design. Future J. Pharm. Sci. 2018, 4, 265–272. [CrossRef]

33. Prabhakaran, D.; Basha, CA; Kannadasan, Τ.; Aravinthan, P. Απομάκρυνση της υδροκινόνης από το νερό με ηλεκτροπηξία με χρήση κυψέλης ροής και βελτιστοποίηση με μεθοδολογία επιφάνειας απόκρισης. J. Environ. Sci. Health A 2010, 45, 400–412. [CrossRef] [PubMed]

34. Natrella, M. NIST/SEMATECH e-Handbook of Statistical Methods; NIST: Gaithersburg, MA, ΗΠΑ, 2010.

35. Amir, AI; van Rosmalen, Μ.; Mayer, G.; Lebendiker, Μ.; Danieli, Τ.; Friedler, Α. Οι εξαιρετικά ομόλογες πρωτεΐνες ασκούν αντίθετες βιολογικές δραστηριότητες χρησιμοποιώντας διαφορετικές διεπαφές αλληλεπίδρασης. Sci. Rep. 2015, 5, 11629. [CrossRef] [PubMed]

36. Megrab, NA; Williams, AC; Barry, BW Διαπέραση οιστραδιόλης σε μεμβράνες ανθρώπινου δέρματος, σιλαστικού και δέρματος φιδιού: οι επιδράσεις των συστημάτων συνδιαλύτη αιθανόλης/νερού. Int. J. Pharm. 1995, 116, 101–112. [CrossRef]

37. Morimoto, Η.; Wada, Υ.; Seki, Τ.; Sugibayashi, K. In vitro δερματική διείσδυση υδροχλωρικής μορφίνης κατά τη διάρκεια της πεπερασμένης εφαρμογής συστήματος ενίσχυσης της διείσδυσης που περιέχει νερό, αιθανόλη και l-μενθόλη. Biol. Pharm. Ταύρος. 2002, 25, 134–136. [CrossRef]

38. Löffler, Η.; Kampf, G.; Schmermund, D.; Maibach, H. Πόσο ερεθιστικό είναι το αλκοόλ; Br. J. Dermatol. 2007, 157, 74–81. [CrossRef]

39. Maibach, HI; Lodén, M. Dry Skin, and Moisturizers: Chemistry and Function; CRC Press: Boca Raton, Φλόριντα, ΗΠΑ, 2000.

40. Chang, R.-K.; Raw, Α.; Lionberger, R.; Yu, L. Γενική ανάπτυξη τοπικών δερματολογικών προϊόντων: ανάπτυξη σκευασμάτων, ανάπτυξη διεργασιών και δοκιμή τοπικών δερματολογικών προϊόντων. AAPS J. 2012, 15, 41–52. [CrossRef]

41. Lu, W.; Luo, Η.; Zhu, Ζ.; Wu, Υ.; Luo, J.; Wang, H. Παρασκευή και βιοφαρμακευτική αξιολόγηση για το διαδερμικό σπρέι μετρημένης δόσης δεξκετοπροφαίνης. J. Drug Deliv. 2014, 2014. [CrossRef]

42. Adler, S.; Basketter, D.; Creton, S.; Pelkonen, Ο.; van Benthem, J.; Zuang, V.; Andersen, KE; Angers-Loustau, Α.; Aptula, Α.; Bal-Price, Α.; et al. Εναλλακτικές (χωρίς ζώα) μέθοδοι για δοκιμές καλλυντικών: τρέχουσα κατάσταση και προοπτικές — 2010. Αψίδα. Toxicol. 2011, 85, 367–485. [CrossRef]

43. Haq, Α.; Goodyear, Β.; Ameen, D.; Joshi, V.; Michniak-Kohn, B. Strat-M®synthetic membrane: Σύγκριση διαπερατότητας με δέρμα ανθρώπινου πτώματος. Int. J. Pharm. 2018, 547, 432–437. [CrossRef]

Διαθεσιμότητα δείγματος:

Δείγματα των ενώσεων FA-AdP και MI-AdP είναι διαθέσιμα από τους συγγραφείς.

For more information:1950477648nn@gmail.com