Το FOXO ρυθμίζει την έκφραση των αντιμικροβιακών πεπτιδίων και προάγει τη φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων στις γαρίδες Αντιβακτηριακή ανοσία

Αφηρημένη

Τα ασπόνδυλα βασίζονται στην έμφυτη ανοσία, συμπεριλαμβανομένης της χυμικής και κυτταρικής ανοσίας, για να αντισταθούν σε παθογόνους λοιμώξεις. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι ο μεταγραφικός παράγοντας O (FOXO) συμμετέχει στις ανοσολογικές αποκρίσεις του βλεννογόνου των θηλαστικών και στη χυμική ανοσολογική ρύθμιση του εντέρου των ασπόνδυλων. Ωστόσο, αν το FOXO εμπλέκεται στη ρύθμιση της συστημικής και κυτταρικής ανοσίας στα ασπόνδυλα παραμένει άγνωστο. Στην παρούσα μελέτη, εντοπίσαμε ένα FOXO από γαρίδες (Marsupenaeus japonicus) και διαπιστώσαμε ότι εκφραζόταν σε σχετικά βασικά επίπεδα σε κανονικές γαρίδες, αλλά αυξήθηκε σημαντικά σε γαρίδες που προκλήθηκαν από Vibrio anguillarum. Το FOXO έπαιξε κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης της αιμολέμφης και της εντερικής μικροχλωρίδας προάγοντας την έκφραση του Relish, του μεταγραφικού παράγοντα της οδού ανοσολογικής ανεπάρκειας (IMD) για την έκφραση των αντιμικροβιακών πεπτιδίων (AMPs) στις γαρίδες. Βρήκαμε επίσης ότι η μόλυνση από παθογόνο ενεργοποίησε το FOXO και προκάλεσε την πυρηνική του μετατόπιση μειώνοντας τη δραστηριότητα της κινάσης σερίνης/θρεονίνης AKT. Στον πυρήνα, το ενεργοποιημένο FOXO ρύθμιζε άμεσα την έκφραση των γονιδίων-στόχων του Amp και Relish κατά της βακτηριακής μόλυνσης. Επιπλέον, το FOXO αναγνωρίστηκε ότι εμπλέκεται στην κυτταρική ανοσία προάγοντας τη φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων μέσω της προς τα πάνω ρύθμισης της έκφρασης του υποδοχέα δέσμευσης φαγοκυτταρωτικών υποδοχέων C (Src) και δύο μικρών GTPάσων, Rab5 και Rab7, που σχετίζονται με διακίνηση φαγοσώματος στο στο κυτταρόπλασμα. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το FOXO ασκεί τα αποτελέσματά του στην ομοιόσταση της αιμολέμφου και της εντερικής μικροχλωρίδας ενεργοποιώντας την οδό IMD σε φυσιολογικές γαρίδες και προάγοντας άμεσα ή έμμεσα την έκφραση AMP και ενισχύοντας τη φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων έναντι παθογόνων σε γαρίδες μολυσμένες με βακτήρια. Αυτή η μελέτη αποκάλυψε τις διαφορετικές λειτουργίες του FOXO στη βλεννογόνο (τοπική) και στη συστηματική αντιβακτηριακή ανοσία των ασπόνδυλων.

Οφέλη συμπληρώματος cistanche-πώς να ενισχύσετε το ανοσοποιητικό σύστημα

Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity

【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Εισαγωγή

Οι πρωτεΐνες της οικογένειας του μεταγραφικού παράγοντα Ο (FOXOs) εμπλέκονται σε διάφορες κρίσιμες βιολογικές διεργασίες των οργανισμών, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου, της επιδιόρθωσης του κατεστραμμένου DNA, της αντικαρκινικής ανοσίας και της ρύθμισης της διάρκειας ζωής [1,2]. Τα θηλαστικά έχουν τέσσερις διαφορετικές πρωτεΐνες FOXO (FOXO1, FOXO3, FOXO4 και FOXO6). Ωστόσο, τα ασπόνδυλα έχουν μόνο ένα FOXO, το οποίο είναι επίσης γνωστό ως Daf-16 στο Caenorhabditis elegans [3]. Η μεταγραφική δραστηριότητα του FOXO ρυθμίζεται από διάφορα είδη μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, όπως η φωσφορυλίωση, η ακετυλίωση, η μεθυλίωση και η ουβικιτινίωση [4]. Αυτές οι τροποποιήσεις επηρεάζουν την πυρηνική μετατόπιση ή την έξοδο του FOXO από τον πυρήνα και την αλληλεπίδρασή του με συν-κατασταλτές και συνενεργοποιητές, οι οποίοι μπορούν να προάγουν ή να μειώσουν τη δραστηριότητα του FOXO και να μεσολαβούν στις διαφορετικές βιολογικές του λειτουργίες [5,6]. Μετά την ενεργοποίηση, το FOXO συμμετέχει σε πολλές φυσιολογικές λειτουργίες ρυθμίζοντας τη μεταγραφή μιας ποικιλίας γονιδίων-στόχων [7]. Τα FOXO ενεργοποιούνται από διάφορα εξωκυτταρικά ερεθίσματα, συμπεριλαμβανομένων αυξητικών παραγόντων, κυτοκινών και ορμονών [8]. Τα σήματα ανάπτυξης, όπως η ινσουλίνη ή ο παρόμοιος με την ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας 1 (IGF-1), αλληλεπιδρούν με τους υποδοχείς της οδού ινσουλίνης και ενεργοποιούν τη σηματοδότηση της φωσφατιδυλινοσιτόλης 3-κινάσης (PI3K), οδηγώντας σε φωσφορυλίωση του FOXO από κινάση σερίνης/θρεονίνης, κινάση πρωτεΐνης Β (AKT) [9]. Το φωσφορυλιωμένο FOXO μετατοπίζεται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα ή εμποδίζει τη μετατόπισή του από το κυτοσόλιο στον πυρήνα, όπου ουβικιτινώνεται, οδηγώντας στην αποδόμησή του από το πρωτεάσωμα [10]. Αντίθετα, απουσία εξωτερικών σημάτων ανάπτυξης, η οδός σηματοδότησης PI3K-AKT είναι ανενεργή και το μη φωσφορυλιωμένο FOXO μετατοπίζεται στον πυρήνα για να προωθήσει τη μεταγραφή του γονιδίου στόχου [11]. Το FOXO συμμετέχει επίσης στις αντιβακτηριακές και αντι-ιικές έμφυτες ανοσολογικές αποκρίσεις των ασπόνδυλων [12,13]. Η χρόνια ενεργοποίηση του FOXO στα γηρασμένα έντερα της Drosophila καταστέλλει την έκφραση της πρωτεΐνης αναγνώρισης πεπτιδογλυκάνης SC2 (αρνητικός ρυθμιστής της οδού ανοσολογικής ανεπάρκειας (IMD)) και διασπά την εντερική ανοσολογική ομοιόσταση [14]. Το FOXO ρυθμίζει άμεσα τα γονίδια του αντιμικροβιακού πεπτιδίου (AMP) στους επιθηλιακούς ιστούς της μη μολυσμένης Drosophila ως απόκριση στο στρες της πείνας, το οποίο είναι ανεξάρτητο από τις έμφυτες οδούς ανοσίας που ανταποκρίνονται στα παθογόνα [15]. Ωστόσο, η μόλυνση από παθογόνο μπορεί επίσης να προκαλέσει το εντεροκύτταρο FOXO να εισέλθει στον πυρήνα από το κυτταρόπλασμα απευθείας στα έντερα της Drosophila [12]. Η εξαρτώμενη από το FOXO ρύθμιση των AMP εμφανίζεται επίσης σε επιθηλιακούς ιστούς θηλαστικών, υποδηλώνοντας ότι αυτό διατηρείται εξελικτικά στα ζώα [16]. Αρκετές μελέτες έδειξαν ότι τα FOXO ενεργοποιούνται από παθογόνα ή διέγερση κυτοκίνης στις ανοσοαποκρίσεις του βλεννογόνου [17]. Η μετατόπισή τους στον πυρήνα και η δέσμευσή τους στους προαγωγείς των γονιδίων-στόχων τους διεγείρεται από την οδό κινάσης της ενεργοποιούμενης από μιτογόνο πρωτεΐνης (MAP) και αναστέλλεται από την οδό PI3K/AKT. Τα γονίδια-στόχοι των FOXO περιλαμβάνουν προφλεγμονώδη μόρια σηματοδότησης, μόρια προσκόλλησης και υποδοχείς χημειοκίνης [17]. Το εάν τα FOXO εμπλέκονται στις συστηματικές ανοσολογικές αποκρίσεις έναντι των παθογόνων παραγόντων παραμένει ασαφές. Η προώθηση της έκφρασης των AMPs έναντι των παθογόνων είναι ένας σημαντικός μηχανισμός χυμικής έμφυτης ανοσίας στα ασπόνδυλα [18]. Στην έμφυτη ανοσία της Drosophila, τα μονοπάτια Toll και IMD εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης της AMP και τα AMP παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξάλειψη των εισβολέων παθογόνων [19-21]. Παρόμοια με την ανοσία των εντόμων, οι οδοί Toll, IMD και Janus kinase (JAK)/μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής (STAT) εμπλέκονται στη ρύθμιση έκφρασης AMP στα καρκινοειδή [22,23]. Απαιτείται διευκρίνιση εάν το FOXO μπορεί να ρυθμίσει την έκφραση των AMP ανεξάρτητα από τις οδούς Toll, IMD και JAK/STAT έναντι της μόλυνσης από παθογόνα στα καρκινοειδή. Εκτός από τη χυμική ανοσία, τα ασπόνδυλα βασίζονται επίσης στην κυτταρική ανοσία για την εκτέλεση εγγενών λειτουργιών ανοσίας έναντι της μόλυνσης από παθογόνους παράγοντες. Η φαγοκυττάρωση από αιμοκύτταρα είναι ένας από τους σημαντικούς μηχανισμούς για την κυτταρική ανοσία έναντι της μόλυνσης από παθογόνο [24]. Προηγούμενες μελέτες έχουν βρει ότι η αυτοφαγία με τη μεσολάβηση FOXO1-απαιτείται για την ανάπτυξη των φυσικών κυττάρων φονέων (NK) [25]. Επιπλέον, το FOXO εμπλέκεται στην προώθηση της βακτηριακής φαγοκυττάρωσης από τα ουδετερόφιλα [26]. Αν και δεν υπάρχουν εξειδικευμένα ανοσοκύτταρα στα μαλακόστρακα, όπως τα κύτταρα ΝΚ ή τα ουδετερόφιλα, τα αιμοκύτταρα της γαρίδας μπορούν να ασκήσουν συστηματική έμφυτη ανοσία έναντι της μόλυνσης από παθογόνα βακτήρια μέσω φαγοκυττάρωσης [27]. Ωστόσο, το εάν το FOXO συμμετέχει στη φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων στις γαρίδες είναι ασαφές. Η υδατοκαλλιέργεια γαρίδας είναι μία από τις ταχύτερα αναπτυσσόμενες βιομηχανίες στον κόσμο για την παραγωγή ζωικών πρωτεϊνών και έχει συμβάλει σημαντικά στην κάλυψη της παγκόσμιας αυξημένης ζήτησης για ζωικές πρωτεΐνες. Επί του παρόντος, η παγκόσμια παραγωγή γαρίδας είναι περίπου 4,88 εκατομμύρια τόνοι με αξία περίπου 39 δισεκατομμύρια δολάρια ΗΠΑ [28]. Ωστόσο, η εκτροφή μεγάλου αριθμού ζώων από κοινού οδηγεί σε σημαντικό άγχος στα ζώα, το οποίο διευκολύνει τα παθογόνα, συμπεριλαμβανομένων των βακτηρίων και των ιών, τον πολλαπλασιασμό και τις κλινικές ασθένειες, γεγονός που οδηγεί σε μεγάλες οικονομικές απώλειες για τη βιομηχανία [29]. Οι μελέτες για τους ανοσολογικούς μηχανισμούς των γαρίδων θα μπορούσαν να παρέχουν νέες στρατηγικές για την πρόληψη και τον έλεγχο των ασθενειών [30]. Στην παρούσα μελέτη, εντοπίσαμε ένα FOXO σε γαρίδες kuruma (Marsupenaeus japonicus). Μετά την κατακρήμνιση της έκφρασης Foxo, που ακολούθησε την πρόκληση Vibrio anguillarum, διαπιστώσαμε ότι η ικανότητα βακτηριακής κάθαρσης και το ποσοστό επιβίωσης της γαρίδας μειώθηκαν σημαντικά. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι το FOXO προώθησε την έκφραση των AMPs άμεσα ή έμμεσα και ενίσχυσε τη φαγοκυττάρωση των βακτηρίων στις γαρίδες. Αναλύθηκαν οι πιθανοί μηχανισμοί των επιδράσεων του FOXO έναντι της μόλυνσης από παθογόνο στις γαρίδες.

cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος

Αποτελέσματα

Το FOXO εκφράζεται σε βασικά επίπεδα σε μη αμφισβητούμενες γαρίδες και ρυθμίζεται προς τα πάνω σε γαρίδες που έχουν προσβληθεί με V. anguillarum

Από τον προσδιορισμό της αλληλουχίας μεταγραφώματος αιμοκυττάρων του M. japonicus, λάβαμε την πλήρους μήκους αλληλουχία cDNA του Foxo (αριθμός πρόσβασης GenBank: MW080526). Η σύγκριση τομέα έδειξε ότι η προβλεπόμενη πρωτεΐνη FOXO έχει μια περιοχή Forkhead (FH), η οποία είναι παρόμοια με τα Homosapiens FOXOs συμπεριλαμβανομένων των FOXO1, FOXO3, FOXO4 και FOXO6 και φέρει παρόμοια φωσφορυλίωση AKT (Σχήμα S1A). Τα αποτελέσματα της φυλογενετικής ανάλυσης έδειξαν ότι τα FOXO χωρίστηκαν σε δύο ομάδες συμπεριλαμβανομένων των FOXO σπονδυλωτών και ασπόνδυλων και η γαρίδα FOXO συγκεντρώθηκε στον κλάδο ασπόνδυλων στο φυλογενετικό δέντρο (Σχήμα S1B). Παρόμοια με τα ανθρώπινα FOXO [31], η γαρίδα FOXO έχει θέσεις τροποποίησης φωσφορυλίωσης εξωκυτταρικής ρυθμιζόμενης κινάσης (ERK) και θέσεις τροποποίησης ακετυλίωσης της πρωτεΐνης δέσμευσης CREB (CBP), αλλά δεν έχει θέσεις τροποποίησης αποακετυλίωσης sir tuin 1 (SIRT1) και C-JUN θέσεις τροποποίησης φωσφορυλίωσης κινάσης (JNK) (S2 Σχήμα). Παρασκευάστηκαν πολυκλωνικά αντισώματα που αναγνωρίζουν FOXO γαρίδας χρησιμοποιώντας την ανασυνδυασμένη περιοχή FH του FOXO που εκφράζεται σε Escherichia coli (Σχήμα 1Α). Η ανάλυση της ιστικής κατανομής του FOXO στα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης αποκάλυψε ότι εκφράστηκε σε όλους τους ιστούς που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 1Β). Η χρονική πορεία της έκφρασης FOXO στα αιμοκύτταρα και τα έντερα των γαρίδων που προκλήθηκαν από το V. anguillarum αναλύθηκε χρησιμοποιώντας qPCR και western blotting. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το FOXO ρυθμίστηκε προς τα πάνω στα αιμοκύτταρα και τα έντερα σε επίπεδο mRNA (Εικ. 1C και 1D) και σε επίπεδο πρωτεΐνης (Εικ. 1Ε και 1ΣΤ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το FOXO εμπλέκεται στην απόκριση στη μόλυνση από V. anguillarum και μας ώθησαν να διερευνήσουμε τη λειτουργία του FOXO στην ανοσία των γαρίδων.

Το FOXO συμμετέχει στη ρύθμιση της ομοιόστασης της αιμολέμφου και της εντερικής μικροχλωρίδας σε υγιείς γαρίδες

Για να διερευνηθεί η λειτουργία του FOXO στην ομοιόσταση της αιμολέμφου και της εντερικής μικροχλωρίδας στις γαρίδες, πραγματοποιήθηκε παρεμβολή RNA και αναλύθηκε το βακτηριακό φορτίο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του Foxo μειώθηκε σημαντικά στις γαρίδες Foxo-RNAi (Εικ. 2Α και 2Β). Τα αποτελέσματα εκτός στόχου του Foxo RNAi αναλύθηκαν επίσης ανιχνεύοντας την έκφραση άλλων γονιδίων της οικογένειας Fox (συμπεριλαμβανομένων των Foxk2 και Foxn3). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το knockdown του Foxo δεν μείωσε τα επίπεδα έκφρασης του Foxk2 ή του Foxn3 (Σχήμα S3A–S3C). Χρησιμοποιώντας δοκιμασίες western blotting και φθορίζουσας ανοσοκυτταροχημείας, παρατηρήσαμε περαιτέρω την υποκυτταρική κατανομή του FOXO στα έντερα και στα αιμοκύτταρα των γαρίδων που προκλήθηκαν από βακτήρια μετά τη σίγαση του Foxo. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε σύγκριση με την ομάδα dsGfp, το επίπεδο FOXO στον πυρήνα μειώθηκε σημαντικά στις γαρίδες Foxo-RNAi, ακόμη και αν οι γαρίδες είχαν μολυνθεί από V. anguillarum (S3D–S4E' Figs). Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η δοκιμασία Foxo RNAi θα μπορούσε να αποσιωπήσει ειδικά το Foxo σε αιμοκύτταρα και έντερα (συμπεριλαμβανομένου του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα). Στη συνέχεια, αναλύσαμε το βακτηριακό φορτίο στην αιμολέμφο και τα έντερα μετά την καταστροφή του Foxo σε γαρίδες υπό κανονικές συνθήκες (χωρίς βακτηριακή πρόκληση). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο αριθμός των βακτηρίων στην αιμολέμφο και τα έντερα αυξήθηκε σημαντικά μετά την επιτυχή καταστροφή της έκφρασης Foxo (Εικ. 2C και 2D). Περαιτέρω αναλύσαμε το ποσοστό επιβίωσης της γαρίδας Foxo-RNAi χωρίς βακτηριακή πρόκληση και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ποσοστό επιβίωσης της γαρίδας Foxo-knockdown μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με αυτό του ελέγχου (Εικόνα 2Ε). Για να επαληθεύσουμε περαιτέρω αυτά τα αποτελέσματα, αναλύσαμε το ποσοστό επιβίωσης των γαρίδων Foxo-RNAi που έλαβαν θεραπεία με αντιβιοτικά και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε σύγκριση με την ομάδα dsGfp, το ποσοστό επιβίωσης των γαρίδων χωρίς μικρόβια δεν μειώθηκε σημαντικά (Εικ. 2F). Όλα τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το FOXO παίζει ρόλο στην ομοιόσταση της in vivo μικροχλωρίδας (συμπεριλαμβανομένης της αιμολέμφας και της εντερικής μικροχλωρίδας) στις γαρίδες υπό κανονικές συνθήκες.

Οφέλη συμπληρώματος cistanche-αύξηση της ανοσίας

Το FOXO συμμετέχει στη ρύθμιση της ομοιόστασης της αιμολύμφου και της εντερικής μικροχλωρίδας προάγοντας την έκφραση Relish και Amp σε υγιείς γαρίδες

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι οι υγιείς γαρίδες περιέχουν χαμηλό αλλά σταθερό αριθμό βακτηρίων στην κυκλοφορούσα αιμολέμφο και υψηλές αν και σταθερές ποσότητες βακτηρίων στο γαστρεντερικό σωλήνα και ανοσοποιητικούς παράγοντες, όπως τα αντιμικροβιακά πεπτίδια (AMPs) που ρυθμίζονται από τον πυρηνικό παράγοντα κάπα Β (NF). -κΒ) οδός και δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) που ρυθμίζονται από το μονοπάτι της διπλής οξειδάσης (DUOX), παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην ομοιόσταση της αιμολέμφου και της εντερικής μικροχλωρίδας [32-34]. Για να διερευνήσουμε τον μηχανισμό της εμπλοκής του FOXO στη ρύθμιση της ομοιόστασης της αιμολέμφης και της εντερικής μικροχλωρίδας υπό κανονικές συνθήκες, εντοπίσαμε πρώτα την υποκυτταρική κατανομή του FOXO σε αιμοκύτταρα και έντερα υπό κανονικές συνθήκες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ένα ασθενές σήμα FOXO στους πυρήνες των αιμοκυττάρων γαρίδας και των εντερικών κυττάρων υπό κανονικές συνθήκες (Εικ. 3Α και 3Β), υποδηλώνοντας ότι λίγο FOXO ενεργοποιήθηκε από την in vivo μικροχλωρίδα στις γαρίδες υπό κανονικές συνθήκες. Η έκφραση AMP ρυθμίζεται από την οδό IMD στα έντερα της Drosophila [35]. Επομένως, υποθέσαμε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Relish μπορεί να είναι ένα γονίδιο στόχος του FOXO. Ανιχνεύσαμε την έκφραση mRNA του Relish, του μεταγραφικού παράγοντα της οδού IMD, σε αιμοκύτταρα και έντερα γαρίδας μετά την καταστροφή του Foxo. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση Relish μειώθηκε σημαντικά στις γαρίδες Foxo-knockdown (Εικ. 3C και 3D) και παρόμοια αποτελέσματα λήφθηκαν σε επίπεδο πρωτεΐνης (Εικ. 3Ε και 3Ε'). Τα αποτελέσματα πρότειναν ότι το FOXO θα μπορούσε να προάγει την έκφραση του Relish και να ενεργοποιήσει την οδό IMD. Για να επιβεβαιωθεί ότι το FOXO συμμετέχει στην ομοιόσταση της αιμολέμφου και της γαστρεντερικής οδού μέσω της σηματοδότησης IMD, ελήφθησαν γαρίδες χωρίς μικρόβια (Εικ. 3F) και ανιχνεύθηκε η ενεργοποίηση του RELISH και η έκφραση AMP. Σε σύγκριση με εκείνη στον έλεγχο, η ποσότητα FOXO και RELISH στους πυρήνες των εντερικών κυττάρων και των αιμοκυττάρων μειώθηκε σημαντικά (Εικ. 3G και 3Η). Εν τω μεταξύ, η έκφραση των AMPs, συμπεριλαμβανομένων των Crustins (CrusI{-2 έως 5) και αντι-λιποπολυσακχαριδικών παραγόντων (Alf A1, B1, C1, D1 και E1), που πιθανώς ρυθμίζονται από FOXO ή/και RELISH, εξετάστηκε στο μικρόβιο -ελεύθερες γαρίδες και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση των CrusI-3, Alf-B1 και Alf-C1 μειώθηκε σημαντικά στα αιμοκύτταρα και τα έντερα της γαρίδας (Εικ. 3I και 3J). Δεδομένου ότι η έκφραση των Alf-B1 και Alf C1 ρυθμιζόταν από την οδό IMD [36], αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το FOXO συμμετέχει στη ρύθμιση της ομοιόστασης της αιμολέμφης και του γαστρεντερικού σωλήνα υπό φυσιολογικές συνθήκες μέσω της οδού IMD για την προώθηση της έκφρασης AMPs.

Εικ. 1. Το FOXO ρυθμίστηκε προς τα πάνω σε γαρίδες που προκλήθηκαν από V. anguillarum. (Α) Ανασυνδυασμένη έκφραση της περιοχής FH του FOXO σε Ε. coli και στύπωμα western για την ανίχνευση FOXO χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά αντισώματα κατά του FOXO που παρασκευάζονται σε κουνέλια. Λωρίδα 1, οι συνολικές πρωτεΐνες του E. coli με Foxo-pGEX4T-1. Λωρίδα 2, οι συνολικές πρωτεΐνες των βακτηρίων μετά την επαγωγή IPTG. Λωρίδα 3, καθαρισμένο ανασυνδυασμένο FOXO. Η λωρίδα 4, FOXO στα έντερα των γαρίδων που δεν είχαν υποστεί αγωγή ανιχνεύθηκε με χρήση Western blotting. Μ, Δείκτες μοριακής μάζας πρωτεΐνης. (Β) Η κατανομή των ιστών του Foxo σε επίπεδα mRNA (άνω πάνελ) και πρωτεΐνης (κάτω πλαίσιο) ανιχνεύθηκε με RT-PCR και western blotting, αντίστοιχα. Το ACTB είναι η συντομογραφία του -actin. (C, D) Τα πρότυπα έκφρασης mRNA του Foxo σε αιμοκύτταρα (C) και έντερα (D) αναλύθηκαν με qPCR χρησιμοποιώντας γεωμετρική μέση έκφραση της -ακτίνης και του Ef{11}} ως ενδογενών γονιδίων ελέγχου. (E, F) Τα πρότυπα έκφρασης πρωτεΐνης του FOXO στα αιμοκύτταρα (Ε) και τα έντερα (F) ανιχνεύθηκαν με στύπωμα western. Τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης τριών επαναλήψεων εμφανίστηκαν στα κάτω πλαίσια. Οι ζώνες στο western blot ψηφιοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ σαρώνοντας τις ζώνες από τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης της FOXO/-ακτίνης εκφράστηκαν ως η μέση τιμή ± SD και η τιμή της γαρίδας ελέγχου ορίστηκε ως μία. Οι γραμμές σφαλμάτων στο σχήμα υποδεικνύουν SD (τρεις επαναλήψεις).

Το FOXO ενεργοποιείται στις γαρίδες από την πρόκληση V. anguillarum και συμμετέχει στην κάθαρση του παθογόνου της αιμολέμφης και των εντέρων

Αναφέρεται ότι το FOXO μπορεί να ενεργοποιηθεί με διέγερση από βακτήρια ή κυτοκίνη και μετατοπίζεται στον πυρήνα για να ρυθμίσει την έκφραση ορισμένων γονιδίων-στόχων στα θηλαστικά [17]. Για να ανιχνευθεί εάν το FOXO ενεργοποιήθηκε σε γαρίδες που προκλήθηκαν από βακτήρια, η υποκυτταρική κατανομή του FOXO στα έντερα της γαρίδας αναλύθηκε χρησιμοποιώντας western blotting. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ποσότητα FOXO στο κυτταρόπλασμα των εντερικών κυττάρων μειώθηκε σταδιακά από 2 σε 4 ώρες μετά την πρόκληση V. anguillarum (Εικόνα 4Α). Αντίθετα, η ποσότητα FOXO στον πυρήνα των κυττάρων του εντέρου αυξήθηκε σημαντικά μετά τη μόλυνση με V. anguillarum (Εικ. 4Β). Για να αναλυθεί ο ρόλος του FOXO στη συστημική ανοσία, χρησιμοποιήθηκε μια φθορίζουσα ανοσοκυτταροχημική δοκιμασία για την παρατήρηση της πυρηνικής μετατόπισης του FOXO σε αιμοκύτταρα γαρίδας 2 ώρες μετά την ετήσια διέγερση του λαρού V.. Βρήκαμε ότι η μετατόπιση FOXO που προκαλείται από βακτήρια στον πυρήνα αυξήθηκε σημαντικά, αλλά δεν υπήρξε εμφανής αλλαγή στις γαρίδες που προκλήθηκαν με PBS (Εικ. 4C και 4C'). Για να διερευνήσουμε εάν το πυρηνικό μετατοπισμένο FOXO εμπλέκεται στην κάθαρση του παθογόνου, αναλύσαμε το βακτηριακό φορτίο στην αιμολέμφο και τα έντερα σε γαρίδες Foxo-knockdown στις 6 ώρες μετά τη βακτηριακή πρόκληση. Βρήκαμε ότι μετά το νοκ ντάουν του Foxo, το φορτίο των βακτηρίων στην αιμολέμφο και τα έντερα αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με αυτό στις ομάδες ελέγχου (Εικ. 4D). Επιπλέον, το ποσοστό επιβίωσης των γαρίδων Foxo-knockdown που είχαν μολυνθεί με V. anguillarum μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με αυτό του ελέγχου (Εικόνα 4Ε). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το FOXO ενεργοποιήθηκε σε εντερικά κύτταρα και αιμοκύτταρα και πρότειναν ότι το FOXO συμμετέχει σε τοπικές και συστηματικές ανοσοαποκρίσεις έναντι βακτηριακής μόλυνσης.

Εικ. 2. Το FOXO συμμετέχει στις εντερικές (τοπικές) και συστηματικές αντιβακτηριακές ανοσοαποκρίσεις. (Α, Β) Η αποτελεσματικότητα του Foxo-RNAi σε αιμοκύτταρα (Α) και έντερα (Β) γαρίδας, όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας qPCR (Α) και western blotting (Β). Η ανάλυση ημερομηνίας qPCR χρησιμοποιώντας τη γεωμετρική μέση έκφραση της -ακτίνης και του Ef-1 ως ενδογενών γονιδίων ελέγχου. Οι γραμμές σφαλμάτων εμφανίζουν SD. (Γ) Ανίχνευση βακτηρίων αιμολέμφου γαρίδας Foxo-knockdown με στερεή καλλιέργεια LB (τρεις επαναλήψεις). Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε η ένεση dsGfp. Η αναλογία αραίωσης ήταν 1:10. (ΡΕ). Ο αριθμός των βακτηρίων στην αιμολέμφο και τα έντερα στις γαρίδες Foxo knockdown και στις γαρίδες έγχυσης dsGfp χωρίς βακτηριακή πρόκληση. (ΜΙ). Το ποσοστό επιβίωσης της γαρίδας Foxo-RNAi χωρίς βακτηριακή πρόκληση. Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε η ένεση dsGfp. (ΦΑ). Το ποσοστό επιβίωσης των γαρίδων Foxo-RNAi που έλαβαν θεραπεία με αντιβιοτικά. Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε η ένεση dsGfp. Φυσιολογικό: γαρίδες άγριου τύπου δεν έχουν υποβληθεί σε θεραπεία με αντιβιοτικά.

Εικ. 3. Μια βασική ποσότητα FOXO μετατοπίζεται στους πυρήνες των αιμοκυττάρων και των εντερικών κυττάρων προάγει την έκφραση Relish και στη συνέχεια ενεργοποιεί την οδό IMD για τη ρύθμιση της ομοιόστασης της αιμολέμφης και της εντερικής μικροχλωρίδας υπό κανονικές συνθήκες. (Α) Η ανοσοκυτταροχημεία χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της υποκυτταρικής κατανομής του FOXO στα αιμοκύτταρα της φυσιολογικής γαρίδας. Γραμμή κλίμακας=20 μm. Cy: Κυτόπλασμα; Αριθμός: Πυρήνας. (Β) Χρησιμοποιήθηκε στύπωμα Western για την ανίχνευση της υποκυτταρικής κατανομής του FOXO σε εντερικά κύτταρα από φυσιολογικές γαρίδες και μολυσμένες με V. anguillarum γαρίδες. (Γ) Η έκφραση του Relish σε επίπεδο mRNA ανιχνεύθηκε σε αιμοκύτταρα γαρίδας μετά την καταστροφή του Foxo με qPCR χρησιμοποιώντας γεωμετρική μέση έκφραση της -ακτίνης και του Ef-1 ως ενδογενών γονιδίων ελέγχου. (Δ) Η έκφραση του Relish σε επίπεδο mRNA στα έντερα των γαρίδων μετά την καταστροφή του Foxo ανιχνεύθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας γεωμετρική μέση έκφραση της -ακτίνης και του Ef-1 ως ενδογενών γονιδίων ελέγχου. (Ε) Το επίπεδο RELISH ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας western blotting σε γαρίδες μετά το νοκ ντάουν του Foxo. (Ε') Τρία αντίγραφα του πίνακα Ε ψηφιοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. (ΣΤ) Το βακτηριακό φορτίο της αιμολέμφου και των εντέρων στις γαρίδες 24 ώρες μετά τη θεραπεία με αντιβιοτικά. (Ζ) Το FOXO στον πυρήνα ανιχνεύθηκε με χρήση Western blotting σε αιμοκύτταρα και έντερα γαρίδας 24 ώρες μετά τη θεραπεία με αντιβιοτικά. (Η) RELISH στον πυρήνα ανιχνεύθηκε με χρήση Western blotting σε αιμοκύτταρα και έντερα γαρίδας 24 ώρες μετά τη θεραπεία με αντιβιοτικά. (I, J) Η έκφραση των Amps σε αιμοκύτταρα (Ι) και έντερα (J) γαρίδας χωρίς μικρόβια προσδιορίστηκε με qPCR χρησιμοποιώντας -ακτίνη και Ef-1 ως εσωτερικά γονίδια αναφοράς. Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε κανονική γαρίδα (ένεση H2O).

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η μεταγραφική δραστηριότητα FOXO ρυθμίζεται από τροποποίηση φωσφορυλίωσης και ότι η κινάση σερίνης/θρεονίνης AKT ρυθμίζει τη δραστηριότητα των παραγόντων μεταγραφής Forkhead φωσφορυλιώνοντάς τους και αναστέλλοντας τη ασαφή μετατόπισή τους [9,37]. Για να διερευνήσουμε εάν η αύξηση του FOXO στον πυρήνα μετά τη μόλυνση από παθογόνα βακτήρια επηρεάζεται από το AKT, ανιχνεύσαμε πρώτα το περιεχόμενο FOXO στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα με western blotting μετά την καταστροφή του Akt της γαρίδας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ποσότητα FOXO στον πυρήνα των αιμοκυττάρων και των εντερικών κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά μετά την καταστροφή της έκφρασης Akt (Εικ. 5Α και 5Β) στις γαρίδες 2 ώρες μετά τη μόλυνση με V. anguillarum (Εικ. 5C και 5C'). Για να επαληθεύσουμε τα πειραματικά αποτελέσματα, χρησιμοποιήσαμε επίσης μια δοκιμασία ανοσοκυτταροχημείας για να παρατηρήσουμε την υποκυτταρική κατανομή του FOXO στα αιμοκύτταρα της γαρίδας μετά την καταστροφή του Akt. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το FOXO αυξήθηκε σημαντικά στον πυρήνα των αιμοκυττάρων όταν το Akt κατέστρεψε 2 ώρες μετά τη μόλυνση με V. anguillarum (Εικ. 5D και 5D'). Για να διερευνήσουμε εάν η λοίμωξη από παθογόνο επηρεάζει τη δραστηριότητα AKT, εντοπίσαμε την αλλαγή φωσφορυλίωσης του AKT μετά από μόλυνση από παθογόνο χρησιμοποιώντας ένα ανθρώπινο αντίσωμα p-AKT (Ser473) (η θέση φωσφορυλίωσης της γαρίδας AKT είναι Ser486) και διαπιστώσαμε ότι το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης AKT μειώθηκε σημαντικά σε αιμοκύτταρα και έντερα γαρίδας μετά από 30 λεπτά μόλυνσης από V. anguillarum (Εικ. 5Ε και 5ΣΤ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μόλυνση από παθογόνο μπορεί να μειώσει το επίπεδο του φωσφορυλιωμένου AKT, το οποίο αναστέλλει τη δραστηριότητα του ενζύμου και μειώνει την ικανότητα του AKT να φωσφορυλιώνει το FOXO. Το μη φωσφορυλιωμένο FOXO εισέρχεται στον πυρήνα και προκαλεί την έκφραση των γονιδίων-στόχων του. το σχήμα δείχνει SD.

εκχύλισμα κιστάνι

Η μόλυνση από παθογόνο μειώνει τη δραστηριότητα του AKT και προκαλεί πυρηνική μετατόπιση FOXO

Το FOXO ασκεί ανοσολογική άμυνα ενάντια στα εισβάλλοντα βακτήρια ρυθμίζοντας την έκφραση των αντιμικροβιακών πεπτιδίων σε γαρίδες που έχουν μολυνθεί από βακτήρια

Για να διερευνήσουμε τον μηχανισμό με τον οποίο το FOXO επηρεάζει την απόκριση έναντι της βακτηριακής μόλυνσης στις γαρίδες, εντοπίσαμε πρώτα τα γονίδια ανοσοποιητικού τελεστή που ρυθμίζονται από το FOXO. Μετά την επιτυχή καταστροφή του Foxo σε αιμοκύτταρα και έντερα γαρίδων με ή χωρίς πρόκληση V. anguillarum, τα επίπεδα έκφρασης των CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 και Alf-E1 μειώθηκαν σημαντικά στις σιγασμένες γαρίδες σε σύγκριση με με αυτούς της ομάδας ελέγχου (Εικ. 6Α και 6Β). Για την περαιτέρω επαλήθευση των αποτελεσμάτων, εντοπίσαμε επίσης την έκφραση τεσσάρων AMP μετά την καταστροφή του Akt. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση των τεσσάρων AMPs αυξήθηκε σημαντικά 6 ώρες μετά τη μόλυνση από V. anguil larum σε σύγκριση με εκείνη στην ομάδα ελέγχου (Εικ. 6C και 6D). Σε σύγκριση με τα ρυθμισμένα προς τα πάνω AMPs (συμπεριλαμβανομένων των Alf-B1 και Alf-C1) υπό κανονικές συνθήκες (Εικ. 3I και 3J), το πρόσθετο γονίδιο των AMPs (CrusI-3, Alf-E1) αυξήθηκε επίσης στις γαρίδες που μολύνθηκαν από V anguillarum (Εικ. 6Α και 6Β). Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι το RELISH προώθησε την έκφραση των Alf-B1 και Alf-C1 στις γαρίδες [36]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το FOXO μπορεί να ρυθμίζει άμεσα την έκφραση AMP, όπως το CrusI{-3 και το Alf-E1, ανεξάρτητα από τον τρόπο διαδρομής σηματοδότησης IMD. Για να επιβεβαιωθεί η υπόθεση, πραγματοποιήθηκε μια δοκιμασία ChIP για να ανιχνευθεί εάν το FOXO μπορούσε να συνδεθεί με τον υποκινητή του Alf-E1. Ελήφθη η αλληλουχία προαγωγέα του Alf-E1 (Σχήμα S4) και προβλέφθηκαν θέσεις δέσμευσης FOXO (Σχήμα 6Ε). Το αποτέλεσμα ChIP έδειξε ότι το FOXO μπορούσε να συνδεθεί με τον προαγωγέα Alf-E1 (Εικ. 6F). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το FOXO συμμετέχει επίσης στην αντιβακτηριακή ανοσία ρυθμίζοντας άμεσα την έκφραση των AMPs στις γαρίδες.

Εικ. 4. Το FOXO μετατοπίστηκε στον πυρήνα σε γαρίδες που προκλήθηκαν από V. anguillarum. (Α, Β) Τα μοτίβα κατανομής FOXO στο κυτταρόπλασμα (Α) και στον πυρήνα (Β) των εντερικών κυττάρων γαρίδας που προκαλούνται από βακτήρια, όπως αναλύθηκαν με χρήση Western blotting (κάτω πάνελ των Α και Β). Οι ζώνες western blotting ψηφιοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ σαρώνοντας τις ζώνες από τρεις επαναλήψεις. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης της FOXO/-ακτίνης ή της FOXO/Histone 3 εκφράστηκαν ως η μέση τιμή ± SD και η τιμή της γαρίδας ελέγχου ορίστηκε ως μία. (Γ) Η πυρηνική μετατόπιση του FOXO σε αιμοκύτταρα γαρίδας 2 ώρες μετά το V. Η πρόκληση anguillarum ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας φθορίζουσες ανοσοκυτταροχημικές δοκιμασίες. Η ένεση PBS χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Γραμμή κλίμακας=20 μm. (Γ') Στατιστική ανάλυση του πλαισίου C Ο συνεντοπισμός των χρωσμένων με FOXO και DAPI πυρήνων σε αιμοκύτταρα αναλύθηκε με λογισμικό WCIF ImageJ. (Δ) Ο αριθμός των βακτηρίων στην αιμολέμφο και τα έντερα της γαρίδας Foxo-knockdown ακολούθησε την ένεση V. anguillarum. Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε η ένεση dsGfp σε γαρίδες μετά από βακτηριακή ένεση. (Ε) Το ποσοστό επιβίωσης της γαρίδας Foxo-RNAi που μολύνθηκε από V. anguillarum. Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε η ένεση dsGfp.

Το FOXO προάγει τη φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων έναντι των βακτηρίων προάγοντας την έκφραση SRC

Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι το FOXO αλληλεπιδρά άμεσα με τις περιοχές προαγωγέα των CXCR2 και CD11b για τη ρύθμιση της φαγοκυττάρωσης των ουδετερόφιλων στα θηλαστικά [26]. Για να ελέγξουμε εάν το FOXO σχετίζεται με φαγοκυττάρωση αιμοκυττάρων στην αντιβακτηριακή ανοσία γαρίδας, εξετάσαμε τον φαγοκυτταρικό ρυθμό μετά από παρεμβολή με το Foxo χρησιμοποιώντας διαφορετικές μεθόδους. Μετά το knockdown του Foxo, ο φαγοκυτταρικός ρυθμός και ο φαγοκυτταρικός δείκτης της ομάδας Foxo-knockdown ήταν σημαντικά χαμηλότεροι από εκείνους της ομάδας ελέγχου (dsGfp) (Εικ. 7Α και 7Α'). Χρησιμοποιήσαμε επίσης κυτταρομετρία ροής για να ποσοτικοποιήσουμε τον φαγοκυτταρικό ρυθμό των αιμοκυττάρων μετά τη σίγαση του Foxo. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ρυθμός κυττάρωσης φάγου της ομάδας Foxo-RNAi επίσης μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με εκείνον της ομάδας dsGfp (Εικ. 7Β και 7Β'). Για περαιτέρω επικύρωση αυτών των αποτελεσμάτων, εξετάσαμε επίσης τον φαγοκυτταρικό ρυθμό μετά την καταστροφή του Akt. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε σύγκριση με αυτά της ομάδας ελέγχου, ο φαγοκυτταρικός ρυθμός και ο φαγοκυτταρικός δείκτης αυξήθηκαν σημαντικά (Εικ. 7C και 7C'). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το FOXO προάγει τη φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων στις γαρίδες. Για να διερευνήσουμε πώς το FOXO ενισχύει τη φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων στις γαρίδες, εντοπίσαμε την έκφραση προηγουμένως αναφερθέντων γονιδίων που εμπλέκονται στη φαγοκυττάρωση των γαρίδων. Ο υποδοχέας σαρωτής κατηγορίας Β (SRB) και κατηγορίας C (SRC) αναφέρεται ότι εμπλέκονται στη φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων [38,39]. Βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης mRNA του Src, αντί του Srb, μειώθηκε σημαντικά μετά τη σίγαση του Foxo στα αιμοκύτταρα και τα έντερα (Εικ. 7D και 7E), ενώ η έκφραση του Src αυξήθηκε σημαντικά μετά την καταστροφή του Akt στις γαρίδες (Εικ. 7F). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε επίπεδο πρωτεΐνης (Σχήμα 7G και 7G'). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το FOXO προάγει την αιμοκυτταρική φαγοκυττάρωση των παθογόνων στις γαρίδες προάγοντας την έκφραση SRC.

Το FOXO προάγει την έκφραση των RAB5 και RAB7 κατά τη διάρκεια της φαγοκυττάρωσης στις γαρίδες

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι μικρές GTPases, RAB5 και RAB7, είναι οι βασικοί ρυθμιστές της μεταφοράς των νεοενδοκυττωμένων κυστιδίων σε πρώιμα και όψιμα ενδοσώματα [40]. Το RAB5 είναι ένας βασικός ρυθμιστής των αρχικών γεγονότων σύντηξης και είναι δείκτης πρώιμων ενδοσωμάτων [41,42]. Το RAB7 χρειάζεται για την όψιμη σύντηξη φαγοσώματος-λυσοσώματος και είναι δείκτης όψιμων ενδοσωμάτων [43]. Για να διερευνήσουμε εάν τα RAB5 και RAB7 εμπλέκονται στην κάθαρση του παθογόνου στις γαρίδες, αναλύσαμε πρώτα τα πρότυπα έκφρασης των Rab5 και Rab7 και βρήκαμε ότι οι δύο μικρές GTPases ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε γαρίδες που προκλήθηκαν με βακτήρια (Σχήμα S5A-S5D). Περαιτέρω αναλύσαμε το ποσοστό επιβίωσης των γαρίδων Rab{5-RNAi και Rab7-RNAi μετά από βακτηριακή πρόκληση και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ποσοστό επιβίωσης των γαρίδων Rab5 και Rab7 knockdown μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με αυτό του ελέγχου ( S5E και S5F Εικ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα RAB5 και RAB7 παίζουν σημαντικές λειτουργίες στην αντίσταση έναντι βακτηριακών παθογόνων. Για να διερευνήσουμε εάν τα RAB5 και RAB7 εμπλέκονται στη φαγοκυττάρωση που προκαλείται από FOXO, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης mRNA των Rab5 και Rab7 μετά από παρέμβαση με την έκφραση Foxo στις γαρίδες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης των Rab5 και Rab7 μειώθηκαν σημαντικά στα αιμοκύτταρα και τα έντερα (Εικ. 8Α και S6A). ενώ η έκφραση των Rab5 και Rab7 αυξήθηκε σημαντικά μετά το νοκ ντάουν του Akt στις γαρίδες (Εικ. 8Β). Για περαιτέρω επιβεβαίωση των παραπάνω αποτελεσμάτων, ανιχνεύθηκαν επίσης τα επίπεδα πρωτεΐνης των RAB5 και RAB7 σε γαρίδες Foxo ή Akt knockdown. Σε σύγκριση με την ομάδα ένεσης dsGfp, τα επίπεδα RAB5 και RAB7 μειώθηκαν επίσης σημαντικά στα αιμοκύτταρα και τα έντερα στις γαρίδες Foxo-knockdown αλλά αυξήθηκαν σημαντικά στις γαρίδες Akt-knockdown 2 ώρες μετά τη διέγερση από το V. anguillarum (Εικ. 8C–8D'; S6; και S6B'). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα RAB5 και RAB7 συμμετέχουν στη μεσολαβούμενη από FOXO κυττάρωση φάγων των αιμοκυττάρων στις γαρίδες. Περαιτέρω ανιχνεύσαμε ότι τα RAB5 και RAB7 συνεντοπίστηκαν με V. anguillarum σε αιμοκύτταρα γαρίδας (Εικ. 9). Συνολικά, τα αποτελέσματα πρότειναν ότι τα RAB5 και RAB7 εμπλέκονται στη φαγοκυττάρωση που προκαλείται από FOXO στις γαρίδες.

Εικ. 5. Η μόλυνση από παθογόνο μείωσε τη δραστηριότητα AKT, η οποία προήγαγε την πυρηνική μετατόπιση του FOXO σε αιμοκύτταρα και εντερικά κύτταρα γαρίδας. (Α, Β) Η αποτελεσματικότητα του Akt-RNAi στα αιμοκύτταρα και τα έντερα των γαρίδων, όπως προσδιορίζεται με qPCR χρησιμοποιώντας γεωμετρική μέση έκφραση της -ακτίνης και του Ef{3}} ως ενδογενών γονιδίων ελέγχου (Α) και κηλίδωσης western (Β). (Γ) Η ποσότητα FOXO στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των εντέρων από τις γαρίδες Akt-knockdown αναλύθηκε με στύπωμα western. Το dsGfp χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. (Γ') Η στατιστική ανάλυση του πίνακα (Γ). Το λογισμικό ImageJ χρησιμοποιήθηκε για την ψηφιοποίηση των ζωνών με σάρωση εικόνων τριών επαναλήψεων. (Δ) Η πυρηνική μετατόπιση του FOXO σε αιμοκύτταρα γαρίδας Akt-knockdown ανιχνεύθηκε 2 ώρες μετά την πρόκληση V. anguillarum χρησιμοποιώντας μια φθορίζουσα ανοσοκυτταροχημική δοκιμασία. Το dsGfp χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Γραμμή κλίμακας=20 μm. (Δ') Στατιστική ανάλυση του (Δ). Το λογισμικό WCIF ImageJ χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του συνεντοπισμού με την αναλογία έντασης φθορισμού του αντι-FOXO (πράσινο) και του χρωματισμένου με DAPI πυρήνα (μπλε) σε αιμοκύτταρα μετά τον καθορισμό της τιμής έκθεσης. (Ε, ΣΤ) Αλλαγή περιεχομένου φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ (ρ-ΑΚΤ) σε αιμοκύτταρα (Ε) και έντερα (F) γαρίδας που προκλήθηκαν από το V. anguillarum. Τα κάτω πάνελ είναι ψηφιοποιημένα σχήματα των (E) και (F) με βάση τις ζώνες Western blotting και στατιστικής ανάλυσης, αντίστοιχα.

Τσάι Cistanche

Συζήτηση

Το FOXO, ως πολύ σημαντικός μεταγραφικός παράγοντας, συμμετέχει σε πολλές φυσιολογικές και μεταβολικές λειτουργίες [44,45]. Στην παρούσα μελέτη, εντοπίσαμε ένα FOXO από γαρίδες (M. japonicus) και διαπιστώσαμε ότι συμμετέχει στη ρύθμιση της ομοιόστασης της αιμολέμφου και του εντερικού μικροχλωριδίου ρυθμίζοντας την έκφραση AMP υπό κανονικές συνθήκες. Το FOXO μπορεί να ενεργοποιηθεί με βακτηριακή μόλυνση στις γαρίδες και να μεταφερθεί στον πυρήνα, όπου ρυθμίζει άμεσα και έμμεσα (με την οδό IMD) την έκφραση των AMPs. Το FOXO ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη φαγοκυττάρωση, όπως SRC και μικρές GTPάσες, RAB5 και RAB7, για την προώθηση της φαγοκυττάρωσης των αιμοκυττάρων έναντι των παθογόνων. Ως εκ τούτου, η γαρίδα FOXO παίζει διαφορετικούς ρόλους σε συστημικές και τοπικές (εντερικές) ανοσολογικές αποκρίσεις κατά των παθογόνων (Εικόνα 10). Σε σύγκριση με τα ανθρώπινα FOXO, η γαρίδα FOXO έχει μια σχετικά διατηρημένη αλληλουχία αμινοξέων και θέσεις φωσφορυλίωσης AKT. Ωστόσο, η δεύτερη θέση φωσφορυλίωσης AKT της γαρίδας FOXO είναι η θρεονίνη αντί για τη σερίνη. Η φωσφορυλίωση AKT του FOXO ελέγχει την πυρηνική και κυτταροπλασματική μεταφορά του FOXO [9]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το AKT σχετίζεται με τον έλεγχο της πυρηνικής εισόδου του FOXO. Μετά τη μόλυνση από V. anguillarum, το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ μειώθηκε σημαντικά, γεγονός που έδειξε ότι η δραστηριότητα της ΑΚΤ μειώθηκε σε γαρίδες μολυσμένες από παθογόνο, αυξάνοντας έτσι την πυρηνική κατακράτηση ή πυρηνική μετατόπιση του FOXO και στη συνέχεια επάγοντας την έκφραση των γονιδίων-στόχων. όπως το Relish και το Amp, για να αντιστέκονται σε λοιμώξεις από παθογόνους παράγοντες. Προηγούμενες μελέτες έχουν βρει ότι το FOXO συμμετέχει στην ομοιόσταση της εντερικής μικροχλωρίδας της Drosophila καταστέλλοντας την έκφραση της πρωτεΐνης αναγνώρισης πεπτιδογλυκάνης SC2 (ο αρνητικός ρυθμιστής της οδού IMD) για να ενεργοποιήσει την οδό έκφρασης AMP [14]. Το RELISH αναφέρθηκε ως βασικό γονίδιο-στόχος του FOXO στον έλεγχο της ανοχής στην υποξία στη Drosophila [46]. Όπως και άλλα ζώα, ο γαστρεντερικός σωλήνας της γαρίδας περιέχει σχετικά υψηλή και σταθερή μικροχλωρίδα. Τα αυξανόμενα στοιχεία αποκαλύπτουν επίσης ότι η αιμολέμφος ορισμένων υδρόβιων υγιών ασπόνδυλων, συμπεριλαμβανομένων των γαρίδων, φιλοξενεί επίσης σταθερές ποσότητες βακτηρίων [47]. Η προηγούμενη μελέτη μας βρήκε ότι μια λεκτίνη τύπου C συμμετέχει στη ρύθμιση της ομοιόστασης της μικροχλωρίδας της αιμολέμφης διατηρώντας την έκφραση των AMPs [34], αλλά δεν γνωρίζουμε ποιες οδούς σήματος εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης AMP. Εδώ, τα αποτελέσματά μας πρότειναν ότι το FOXO εμπλέκεται στη ρύθμιση της ομοιόστασης της αιμολέμφου και της εντερικής μικροχλωρίδας μέσω της σηματοδότησης IMD υπό κανονικές συνθήκες. Σε μη μολυσμένες γαρίδες, το νοκ ντάουν του Foxo είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά μειωμένη έκφραση του Relish και το ποσοστό επιβίωσης των γαρίδων μειώθηκε σημαντικά, ακόμη και χωρίς βακτηριακή μόλυνση. Βρήκαμε επίσης μια μικρή ποσότητα FOXO στον πυρήνα των φυσιολογικών κυττάρων γαρίδας. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι το FOXO συμμετέχει στη ρύθμιση της ομοιόστασης της αιμολέμφου και της εντερικής χλωρίδας υπό φυσιολογικές συνθήκες προάγοντας την έκφραση Relish και στη συνέχεια ενισχύοντας την έκφραση AMP μέσω της οδού IMD. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το FOXO συμμετέχει στην τοπική και συστημική ανοσία για την προώθηση της ομοιόστασης της μικροχλωρίδας της αιμολέμφου και του γαστρεντερικού σωλήνα στις γαρίδες. Η χυμική ανοσία διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στην αντίσταση στη μόλυνση από παθογόνο με αντίστροφα ποσοστά μέσω της παραγωγής μιας μπαταρίας AMPs [21,48]. Η χυμική απόκριση περιλαμβάνει την επαγώγιμη σύνθεση και έκκριση AMPs, τα οποία απελευθερώνονται στην αιμολέμφο ως συστηματική απόκριση ή απελευθερώνονται στην επιδερμική επιφάνεια ή στην κοιλότητα του γαστρεντερικού σωλήνα ως τοπική απόκριση [19]. Η έκφραση AMP ρυθμίζεται κυρίως από τα μονοπάτια σηματοδότησης Toll/Dif και IMD/Relish στις φρουτόμυγες [49]. Επί του παρόντος, αρκετές οικογένειες AMPs έχουν εντοπιστεί στις γαρίδες, συμπεριλαμβανομένων των κρουστινών, των αντι-λιποπολυσακχαριδικών παραγόντων (Alfs) και των πεναειδινών [50]. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι το FOXO μπορεί άμεσα ή έμμεσα (μέσω της σηματοδότησης IMD/Relish) να ρυθμίσει την έκφραση των AMPs, συμπεριλαμβανομένων των CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 και Alf-E1. Θεωρήσαμε ότι η χαμηλή ενεργοποίηση του FOXO στα αιμοκύτταρα και τα έντερα της γαρίδας υπό κανονικές συνθήκες θα μπορούσε να ρυθμίσει το βασικό γονίδιο στόχο του Foxo, δηλαδή το Relish, για τη διατήρηση της ομοιόστασης της in vivo μικροχλωρίδας. Κατά τη διάρκεια της μόλυνσης, τα εισβάλλοντα παθογόνα ενεργοποιούν το FOXO, το μεγαλύτερο μέρος του οποίου μετατοπίζεται στον πυρήνα, όπου ρυθμίζει περισσότερα γονίδια-στόχους, συμπεριλαμβανομένων ορισμένων AMPs, όπως το Alf-E1 και το CrusI-3, εκτός από το Relish. Συνολικά, το FOXO συμμετέχει στη ρύθμιση της ομοιόστασης της αιμολέμφου και της εντερικής μικροχλωρίδας σε υγιείς γαρίδες μέσω της ενεργοποίησης σε επίπεδο βάσης της σηματοδότησης IMD στην αιμολέμφο και στο γαστρεντερικό σωλήνα. Η λοίμωξη από παθογόνο ενεργοποιεί το FOXO μειώνοντας τη δραστηριότητα του AKT και προάγει την έκφραση των AMPs άμεσα και έμμεσα στη συστημική ανοσία και στην τοπική (εντερική) ανοσία. Η φαγοκυττάρωση είναι ένα φαινόμενο εξαρτώμενο από τον υποδοχέα, ακτίνη και ATP, το οποίο πυροδοτείται από τη δέσμευση σωματιδίων ή παθογόνων σε συγκεκριμένους υποδοχείς κυτταρομεμβρανών και αντιπροσωπεύει μια σημαντική ανοσολογική διαδικασία μέσω της οποίας ο ξενιστής μπορεί να προστατευτεί από παθογόνα [24]. Μικρές GTPάσες, όπως οι RAB5 και RAB7, εμπλέκονται στη συνεχή αναδιαμόρφωση της μεμβράνης και στην κυκλοφορία κυστιδίων στη φαγοκυττάρωση. Η προηγούμενη μελέτη μας ανέφερε ότι οι υποδοχείς σαρωτής SRB και SRC εμπλέκονται στη φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων ως υποδοχείς στις γαρίδες [38,39]. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι μετά την καταστροφή του Foxo, η έκφραση Src μειώθηκε σημαντικά και ο ρυθμός φαγοκυττάρωσης αιμοκυττάρων μειώθηκε σημαντικά, υποδηλώνοντας ότι το Src είναι ένα γονίδιο στόχος του FOXO και ότι το FOXO εμπλέκεται στη φαγοκυττάρωση παθογόνων βακτηρίων που προκαλείται από SRC. Το FOXO θα μπορούσε επίσης να προωθήσει την έκφραση δύο μικρών GTPases, RAB5 και RAB7. Αυτές οι μικρές GTPάσες εμπλέκονται στη διαδοχική μεταφορά και είναι οι βασικοί καθοριστικοί παράγοντες των πρώιμων και όψιμων φαγοσωμάτων [51]. Τα φαγοσώματα μεταναστεύουν από την περιφέρεια του κυττάρου στην ενδοκυτταρική περιοχή, με το RAB5 να αντικαθίσταται από το RAB7 κατά τη μεταφορά και τα τελικά αγαθά μεταφέρονται στο λυσόσωμα για αποικοδόμηση [52,53]. Βρήκαμε επίσης ότι τα RAB5 και RAB7 θα μπορούσαν να συνεντοπιστούν με τα παθογόνα στα αιμοκύτταρα, γεγονός που έδειξε ότι τα παθογόνα φαγοκυτταροποιήθηκαν από αιμοκύτταρα στις γαρίδες περνώντας από πρώιμα και όψιμα φαγοσώματα πριν τελικά αποικοδομηθούν στα λυσοσώματα. Επομένως, το FOXO εμπλέκεται στην κυτταρική ανοσολογική απόκριση προάγοντας τη φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι το FOXO όχι μόνο συμμετέχει στη ρύθμιση της ομοιόστασης της μικροχλωρίδας υπό κανονικές συνθήκες αλλά και στην κάθαρση παθογόνων βακτηρίων σε μολυσμένες γαρίδες προάγοντας την έκφραση των AMPs και τη φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων.

Εικ. 6. Το FOXO εκτελεί τον αντιβακτηριακό του ρόλο στις γαρίδες ρυθμίζοντας την έκφραση των AMPs. (Α, Β) Η έκφραση των Amps σε αιμοκύτταρα (Α) και έντερα (Β) γαρίδας Foxo-knockdown, όπως προσδιορίζεται με qPCR χρησιμοποιώντας γεωμετρική μέση έκφραση της -ακτίνης και του Ef-1 ως ενδογενών γονιδίων ελέγχου. Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε η ένεση dsGfp σε γαρίδες. Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Mann-Whiteny U. (C, D) Η έκφραση των Amps σε αιμοκύτταρα (C) και έντερα (D) γαρίδας Akt knockdown αναλύθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας γεωμετρική μέση έκφραση της -ακτίνης και Ef-1 ως ενδογενών γονιδίων ελέγχου. Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε η ένεση dsGfp σε γαρίδες. Οι σημαντικές διαφορές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA. (Ε) Σχηματικό διάγραμμα των προβλεπόμενων θέσεων δέσμευσης του FOXO στον προαγωγέα Alf-E1. (F) Χρησιμοποιήθηκαν ChIP και RT-PCR για την ανίχνευση της δέσμευσης FOXO στην αλληλουχία προαγωγέα Alf-E1 χρησιμοποιώντας εκκινητές (Alf-E1-F και Alf-E1-R, Πίνακας 1). Η RT-PCR χρησιμοποιήθηκε επίσης για την ενίσχυση της περιοχής κωδικοποίησης του Alf-E1 με εκκινητές RT-PCR (Alf-E{1-RT-F και Alf-E1-RT-R. Πίνακας 1) χρησιμοποιώντας το ChIP έλαβε DNA ως πρότυπο. Το αντίσωμα IgG χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος και το φυσιολογικό γονιδιωματικό DNA ενισχυμένο θραύσμα χρησιμοποιήθηκε για την επιβεβαίωση της ζώνης στόχου.

Εικ. 7. Το FOXO ενισχύει την αιμοκυτταρική φαγοκυττάρωση των παθογόνων παραγόντων στις γαρίδες προάγοντας την έκφραση SRC. (Α) Αιμοκυτταρική φαγοκυττάρωση του V. anguillarum που παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας μια φθορίζουσα ανοσοκυτταροχημική δοκιμασία κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού. Το V. anguillarum επισημάνθηκε με FITC (πράσινο) και οι κυτταρικοί πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI (μπλε). Το κόκκινο βέλος δείχνει τα φαγοκυτταρικά αιμοκύτταρα. Γραμμή κλίμακας=20 μm. (Α') Στατιστική ανάλυση του φαγοκυτταρικού ρυθμού και του φαγοκυτταρικού δείκτη σε γαρίδες Foxo-knockdown. Η ομάδα έγχυσης dsGfp χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Πεντακόσια αιμοκύτταρα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού σε κάθε πείραμα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας το Student's t-test. (Β) Βακτηριακή φαγοκυττάρωση από αιμοκύτταρα που αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Τα φαγοκυτταρωμένα αιμοκύτταρα που περιέχουν βακτήρια (R2) διαχωρίστηκαν από τα μη φαγοκυτταρωμένα αιμοκύτταρα (R3) με βάση το σήμα φθορισμού των επισημασμένων βακτηρίων σε αιμοκύτταρα χρησιμοποιώντας το λογισμικό IDEAS Application v6.0. (Β') Ο φαγοκυτταρικός ρυθμός των αιμοκυττάρων με βάση τα δεδομένα κυτταρομετρίας ροής. Τρεις χιλιάδες αιμοκύτταρα μετρήθηκαν για κάθε ανάλυση και πραγματοποιήθηκαν τρεις επαναλήψεις. Η ομάδα dsGfp χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. (Γ) Αιμοκυτταρική φαγοκυττάρωση του V. anguillarum σε γαρίδες Akt knockdown παρατηρήστε κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού. Γραμμή κλίμακας=10 μm. (Γ') Στατιστική ανάλυση του φαγοκυτταρικού ρυθμού και του φαγοκυτταρικού δείκτη με βάση τα δεδομένα του πίνακα (Γ). (D) Το επίπεδο έκφρασης mRNA των Srb και Src σε αιμοκύτταρα από γαρίδες Foxo knockdown που αναλύθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας γεωμετρική μέση έκφραση της -ακτίνης και του Ef{11}} ως ενδογενών γονιδίων ελέγχου. Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε η ένεση dsGfp. (Ε) Η έκφραση mRNA των Srb και Src στα έντερα της γαρίδας Foxo-RNAi αναλύθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας γεωμετρική μέση έκφραση της -ακτίνης και του Ef-1 ως ενδογενών γονιδίων ελέγχου. (ΣΤ) Η έκφραση mRNA του Src σε αιμοκύτταρα γαρίδας Akt-RNAi που αναλύθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας τη μέση γεωμετρική έκφραση της -ακτίνης και του Ef-1 ως ενδογενών γονιδίων ελέγχου. (Ζ) Το επίπεδο πρωτεΐνης του SRC σε αιμοκύτταρα γαρίδας Foxo-RNAi ή Akt-RNAi, όπως αναλύθηκε με χρήση western blotting. Έγχυση dsGfp που χρησιμοποιείται ως έλεγχος. (Ζ') Η στατιστική ανάλυση βασισμένη σε δεδομένα τριών αντιγράφων του πίνακα (Ζ).

Υλικά και μέθοδοι

Δήλωση ηθικής

Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σε συμμόρφωση με τις εθνικές οδηγίες της Κίνας (GB 14922.2–2011 και GB 14925–2010). Τα πειράματα σε κουνέλια για την παρασκευή αντισωμάτων στη μελέτη διεξήχθησαν σύμφωνα με πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Επιτροπή Φροντίδας & Ευημερίας των Ζώων στο Πανεπιστήμιο Shandong School of Life Sciences (SYDWLL-2021-54). Η έγκριση σύμφωνα με τους κανονισμούς για τη χρήση γαρίδας στη μελέτη μας δεν ήταν απαραίτητη επειδή η έρευνά μας χρησιμοποίησε περιορισμένο αριθμό κοινών γαρίδων που καταναλώνονται συχνά από την ευρύτερη κοινότητα.

Των ζώων

Υγιείς γαρίδες (Marsupenaeus japonicus), βάρους περίπου 6-10 g η καθεμία, αποκτήθηκαν από την αγορά υδρόβιων προϊόντων στο Qingdao, στην επαρχία Shandong, στην Κίνα. Πριν από το πείραμα, οι γαρίδες καλλιεργήθηκαν για τουλάχιστον 1 ημέρα στο σύστημα καλλιέργειας γαρίδας με αεριζόμενο θαλασσινό νερό στους 23–25˚C για εγκλιματισμό στο νέο περιβάλλον.

Εικ. 8. Τα RAB5 και RAB7 εμπλέκονται στη μεσολαβούμενη από FOXO φαγοκυττάρωση αιμοκυττάρων στις γαρίδες. (Α, Β) qPCR χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των επιπέδων έκφρασης mRNA των Rab5 και Rab7 στα αιμοκύτταρα της γαρίδας Foxo-knockdown (Α) και της γαρίδας Akt-knockdown (Β) με και χωρίς βακτηριακή μόλυνση. Η qPCR χρησιμοποίησε τη γεωμετρική μέση έκφραση της -ακτίνης και του Ef-1 ως ενδογενή γονίδια ελέγχου. (Γ) Τα επίπεδα πρωτεΐνης των RAB5 και RAB7 σε αιμοκύτταρα γαρίδας Foxo-knockdown 2 ώρες μετά την πρόκληση V. anguillarum προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας στύπωμα western. (Γ') Η στατιστική ανάλυση βασισμένη σε δεδομένα τριών αντιγράφων του πίνακα (Γ). (D) Τα επίπεδα πρωτεΐνης των RAB5 και RAB7 σε αιμοκύτταρα γαρίδας Akt-knockdown 2 ώρες μετά την πρόκληση V. anguillarum προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας στύπωμα western. (Δ') Η στατιστική ανάλυση βάσει δεδομένων τριών αντιγράφων του πίνακα (Δ).

Βιοπληροφορική ανάλυση

Η πλήρους μήκους αλληλουχία cDNA του Foxo ελήφθη από αλληλουχία αιμοκυττάρων και εντερικής μεταγραφής του M. japonicus (BGI, Shenzhen, Κίνα). Το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) του Foxo ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ένα ζεύγος εκκινητών (Foxo-EX-F και Foxo-EX-R, Πίνακας 1) για επιβεβαίωση της αλληλουχίας. Το αντίστοιχο cDNA μεταφράστηκε εννοιολογικά για να ληφθεί η συναγόμενη πρωτεϊνική αλληλουχία χρησιμοποιώντας το εργαλείο ExPASy-Translation (http://cn.expasy.org/). Η ανάλυση ομοιότητας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/) και η πρόβλεψη αρχιτεκτονικής τομέα πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SMART (http://smart.emblheidelberg.de). Ένα φυλογενετικό δέντρο FOXO από διαφορετικά είδη κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα MEGA 6.{8}} [54].

Εικ. 9. Τα RAB5 και RAB7 συνεντοπίζονται με το V. anguillarum. Ο συνεντοπισμός των RAB5 και RAB7 με FITC με σήμανση-V. anguillarum σε αιμοκύτταρα γαρίδας, όπως αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μια φθορίζουσα ανοσοκυτταροχημική δοκιμασία. Τα βακτήρια επισημάνθηκαν με FITC (πράσινο) και εγχύθηκαν σε γαρίδες. Τα αιμοκύτταρα συλλέχθηκαν από πέντε γαρίδες σε 30 λεπτά και 1 ώρα μετά τη βακτηριακή ένεση και επωάστηκαν με αντισώματα αντι-RAB5 ή αντι RAB7. Το δευτερεύον αντίσωμα ήταν αντικουνελιού IgG Alexa-546 (κόκκινο). Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI (μπλε). Ο συνεντοπισμός στα αιμοκύτταρα υποδεικνύεται με λευκά βέλη. Γραμμή κλίμακας=10 μm.

Εικ. 10. Σχηματική αναπαράσταση της συμμετοχής FOXO στην τοπική και συστηματική έμφυτη ανοσία στις γαρίδες. (Α) Σε μη μολυσμένες συνθήκες, το FOXO διατηρεί την ομοιόσταση της αιμολέμφου και της εντερικής μικροχλωρίδας προάγοντας την έκφραση Relish και στη συνέχεια AMP. (Β) Σε μολυσμένες καταστάσεις, η φωσφορυλίωση ΑΚΤ μειώνεται από μόλυνση από παθογόνο, με αποτέλεσμα την αύξηση της περιεκτικότητας σε FOXO στον πυρήνα. Το FOXO προωθεί άμεσα την έκφραση του Relish και των AMPs για την εξάλειψη των διεισδυτικών παθογόνων. Από την άλλη πλευρά, το FOXO προάγει τη φαγοκυττάρωση των παθογόνων μικροοργανισμών μέσω της οδού φαγοκυττάρωσης που προκαλείται από SRC.

Βακτηριακή πρόκληση και συλλογή δειγμάτων

Το Vibrio anguillarum (ATCC 43305) ελήφθη από το Marine College του Πανεπιστημίου Shandong (Wei hai, Κίνα) και διατηρείται τώρα στο εργαστήριό μας. Το V. anguillarum καλλιεργήθηκε όλη τη νύχτα στους 37°C σε μέσο LB και επανακαλλιεργήθηκε για 4 ώρες στις 1:100 εμβολιασμός τη δεύτερη ημέρα. Τα βακτήρια στη φάση λογαριθμικής ανάπτυξης συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 5000 × g για 5 λεπτά στους 4˚C και πλύθηκαν δύο φορές με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl και 1,8 mM KCl και 1,8 mM pH 7,4). V. anguillarum επαναιωρήθηκε σε αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών για πρόκληση γαρίδας. Περίπου 2 × 107 μονάδες σχηματισμού αποικιών (CFU)/γαρίδα εγχύθηκαν στην κοιλιά κάθε γαρίδας χρησιμοποιώντας μια μικροσύριγγα. Στην ομάδα ελέγχου εγχύθηκε ο ίδιος όγκος PBS. Τα αιμοκύτταρα, η καρδιά, το ηπατοπάγκρεας, τα βράγχια, το στομάχι και τα έντερα συλλέχθηκαν από τουλάχιστον τρεις γαρίδες για εκχύλιση RNA και πρωτεΐνης. Για τη συλλογή αιμοκυττάρων, η αιμολέμφος εκχυλίστηκε από τον κοιλιακό κόλπο χρησιμοποιώντας μια σύριγγα προγεμισμένη με 0,8 ml αντιπηκτικού ρυθμιστικού διαλύματος (10% κιτρικό νάτριο) και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε γρήγορα στα 700 × g για 8 λεπτά στους 4 °C για απομόνωση αιμοκυττάρων.

Εκχύλιση RNA και πρωτεΐνης και σύνθεση cDNA

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα αιμοκύτταρα και τα διαφορετικά όργανα της γαρίδας χρησιμοποιώντας το TRIZol (ET101, Transgen, Beijing, China). Οι πρωτεΐνες από τα διάφορα όργανα εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα λύσης με δοκιμασία ραδιοανοσοκαθίζησης (RIPA) (Ρ0013Β, Beyotime, Jiangsu, Κίνα). Η σύνθεση πρώτου κλώνου cDNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ σύνθεσης cDNA (5x All-in-One RT MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Βανκούβερ, Καναδάς), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Πίνακας 1. Αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη.

MasterMix; Applied Biological Materials-abm, Vancouver, Canada), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ανασυνδυασμένη έκφραση και παρασκευή αντισωμάτων

Η αλληλουχία cDNA του Foxo ενισχύθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR) χρησιμοποιώντας εκκινητές Foxo-EX-F και Foxo-EX-R (Πίνακας 1). Τα καθαρισμένα προϊόντα PCR στη συνέχεια χωνεύτηκαν χρησιμοποιώντας περιοριστικά ένζυμα και απολινώθηκαν στο πλασμίδιο pGEX-4Τ-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). και τα κατασκευασμένα πλασμίδια μετασχηματίστηκαν σε κύτταρα Escher ichia coli Rosseta (DE3). Η έκφραση πρωτεΐνης προκλήθηκε χρησιμοποιώντας 1 mM ισοπροπυλ- - D-θειο γαλακτοπυρανοσίδη στους 37°C. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε χρωματογραφία συγγένειας χρησιμοποιώντας ρητίνη γλουταθειόνης (GST) (C600031, BBI, Shanghai, Κίνα), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αντιοροί κουνελιών κατά του FOXO παρασκευάστηκαν σύμφωνα με μια μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [55].

Western blotting

Οι πρωτεΐνες που εκχυλίστηκαν από διαφορετικά όργανα ή αιμοκύτταρα διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλοθειικού νατρίου 10% (SDS-PAGE). Οι πρωτεΐνες στα πηκτώματα SDS-PAGE μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτρικής κυτταρίνης χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό μεταφοράς (25 mM Tris–HCl, 2{14}} mM γλυκίνη, 0.037% mM SDS και 20% αιθανόλη) και επωάστηκε σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα ή 3% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με Tris (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, ρΗ 8,0) για 1 ώρα με ήπια ανακίνηση σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενή αντιορό: Anti-FOXO σε αραίωση 1:100, anti-RAB5 σε 1:25, anti Rab7 σε 1:25, αντι-βήτα ακτίνη (ACTB) σε 1:250 (παρασκευάστηκε στο εργαστήριό μας ) Πολυκλωνικά αντισώματα ιστόνης-3 (A2348, ABclonal, Wuhan, China, 1:2500); αντιφωσφορυλιωμένα (p)-AKT πολυκλωνικά αντισώματα (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, Κίνα, 1:500) και ανακινούνται απαλά όλη τη νύχτα στους 4˚C. Μετά από πλύσιμο τρεις φορές με TBST (0,1% Tween-20 προστέθηκε στο TBS), οι mem branes επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα (ZB2308 ZSGB-Bio, Beijing, China, 1:5,000) ή ( ZB2301 ZSGB-Bio, Πεκίνο, Κίνα, 1:5,000) για 3 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με απαλή ανακίνηση. Οι ανοσοαντιδραστικές πρωτεϊνικές ζώνες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα χλωριούχου μπλε νιτροτετραζολίου (Α610379, ΒΒΙ) και άλατος Ρ-τολουιδίνης (Α610072, ΒΒΙ) υπό σκοτεινές συνθήκες ή χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL). -ακτίνη ή ιστόνη-3 χρησιμοποιήθηκαν αναφοράs.

Μοτίβα κατανομής ιστού και έκφρασης σε γαρίδες που προκαλούνται από βακτήρια

Η ιστική κατανομή του Foxo/FOXO στα αιμοκύτταρα, την καρδιά, τα βράγχια, τα πτύελα, το στομάχι και τα έντερα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας RT-PCR με εκκινητές Foxo-F και Foxo-R (Πίνακας 1) και με στύπωμα western με αντισώματα αντι-FOXO, αντίστοιχα. Η διαδικασία PCR συνίστατο σε μια αρχική επώαση στους 94°C για 3 λεπτά. ακολουθούμενοι από 35 κύκλους 94˚C για 30 s, 50˚C για 30 s και 72˚C για 30 s. ακολουθούμενη από 72˚C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης (1,5% αγαρόζη). Το γονίδιο -ακτίνης (-ακτίνη-F και -ακτίνη-R, Πίνακας 1) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Τα μοτίβα έκφρασης χρονικής πορείας του Foxo/FOXO στα επίπεδα RNA και πρωτεΐνης σε γαρίδες που προκλήθηκαν με V. anguillarum αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qPCR) σε θερμικό κυκλοποιητή (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Γερμανία) και από west ern blotting, αντίστοιχα. Η διαδικασία qPCR περιελάμβανε: 95˚C για 10 λεπτά. 40 κύκλοι στους 95˚C για 10 δευτερόλεπτα και στους 60˚C για 50 δευτερόλεπτα. και στη συνέχεια περίοδος τήξης από 65˚C έως 95˚C. Τα αρχεία έκφρασης pro του Foxo παρήχθησαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2-ΔΔCT [56] χρησιμοποιώντας τον γεωμετρικό μέσο όρο των δύο γονιδίων εσωτερικού ελέγχου της -ακτίνης και του Ef-1 για κανονικοποίηση. Η αποτελεσματικότητα του ζεύγους εκκινητών στο qPCR αναλύθηκε ακολουθώντας τη μέθοδο MIQE [57] με 10-πλάσια λογαριθμική αραίωση ενός μίγματος cDNA για τη δημιουργία μιας γραμμικής τυπικής καμπύλης.

Απομόνωση πυρηνικών και κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών

Ο εντερικός ιστός αποκόπηκε από τις γαρίδες και πλύθηκε σε PBS τρεις φορές. Η εκχύλιση πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κιτ εξαγωγής πυρηνικής και κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης (R0050, Solarbio, Πεκίνο, Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τουλάχιστον τρεις γαρίδες χρησιμοποιήθηκαν για εκχύλιση πρωτεϊνών για την εξάλειψη των μεμονωμένων διαφορών.

Δοκιμασία παρεμβολής RNA

Για την ανάλυση της γονιδιακής λειτουργίας, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς παρεμβολής RNA (RNAi). Αρκετά ζεύγη εκκινητών που περιέχουν την αλληλουχία προαγωγέα Τ7 (Foxo-RI-F και Foxo-RI-R, Rab5-RI-F και Rab5 -RI-R, Rab7-RI- Τα F και Rab7 -RI-R· Akt-RI-F και Akt-RI-R. Πίνακας 1) σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν τα πρότυπα για τη σύνθεση dsRNA. Χρησιμοποιώντας την Τ7 RNA πολυμεράση (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) και το πρότυπο cDNA, συνθέσαμε τα θραύσματα dsRNA. Διπλής αλυσίδας Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη dsGfp RNA χρησίμευσε ως έλεγχος, ο οποίος ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας Gfp-RI-F και Gfp-RI-R (Πίνακας 1) ως εκκινητές για τη σύνθεση dsGfp. Στη συνέχεια, τα θραύσματα dsRNA (50 μg/κάθε) εγχύθηκαν στο κοιλιακό τμήμα του M. japonicus χρησιμοποιώντας μια μικροσύριγγα και μια δεύτερη ένεση πραγματοποιήθηκε 12 ώρες αργότερα χρησιμοποιώντας την ίδια δόση. Η αποτελεσματικότητα της παρεμβολής RNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR, που περιλαμβάνει αντίστροφη μεταγραφή του RNA για να σχηματίσει cDNA, το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο σε έναν προσδιορισμό qPCR) ή στύπωμα western 24 ώρες μετά τη δεύτερη ένεση. -η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερική αναφορά.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Calnan DR, Brunet A. Ο κώδικας FoxO. Ογκογόνο. 2008; 27(16):2276–2288. https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970.

2. Tran Η, Brunet Α, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS, et al. Το μονοπάτι επιδιόρθωσης του DNA που διεγείρεται από τον μεταγραφικό παράγοντα FOXO3a μέσω της πρωτεΐνης Gadd45. Επιστήμη. 2002; 296 (5567):530–534. https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479.

3. Martins R, Lithgow GJ, Link W. Ζήτω η FOXO: αποκαλύπτοντας το ρόλο των πρωτεϊνών FOXO στη γήρανση και τη μακροζωία. Κύτταρο γήρανσης. 2016; 15(2):196–207. https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314.

4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. Έλεγχος τριπλής στιβάδας-φωσφορυλίωση, ακετυλίωση και ουβικουϊτινοποίηση πρωτεϊνών FOXO. Κυτταρικός Κύκλος. 2005; 4(7):908–913. https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. Ρύθμιση παραγόντων μεταγραφής FoxO με ακετυλίωση και αλληλεπιδράσεις πρωτείνης-πρωτεΐνης. Bba-Mol Cell Res. 2011; 1813(11):1954–1960. https://doi.org/10.1016/j. bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404.

6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. Παράγοντες μεταγραφής FOXO: η κλινική σημασία και η ρύθμισή τους. Biomed Res Int. 2014; 2014:1–13. https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265.

7. Murphy CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser Α, Kamath RS, Ahringer J, et al. Γονίδια που δρουν στη ροή του DAF-16 για να επηρεάσουν τη διάρκεια ζωής του Caenorhabditis elegans. Φύση. 2003; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. Μονοπάτια ινσουλίνης/IGF-1R, SIRT1 και FOXOs - μια ενδιαφέρουσα μορφή πλάκας αλληλεπίδρασης για τα οστά και το οστεοσάρκωμα. Μπροστινή Ενδοκρινόλη (Λωζάνη). 2019; 10:93–103. https://doi.org/10. 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341.

9. Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, et al. Το Akt προάγει την κυτταρική επιβίωση μέσω της φωσφορυλίωσης και της αναστολής ενός μεταγραφικού παράγοντα κεφαλής. Κύτταρο. 1999; 96(6):857–868. https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.

10. Huang Η, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA, et αϊ. Το Skp2 αναστέλλει το FOX01 στην καταστολή του όγκου μέσω της αποικοδόμησης που προκαλείται από την ουβικιτίνη. P Natl Acad Sci ΗΠΑ. 2005; 102(5):1649– 1654. https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399.

11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum ΗΑ, et αϊ. Ο παράγοντας μεταγραφής Fork head DAF-16 μετατρέπει μεταβολικά σήματα και σήματα μακροζωίας που μοιάζουν με ινσουλίνη στο C. elegans. Φύση. 1997; 389 (6654):994–999. https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126.

12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Απαιτείται σηματοδότηση Intestinal FoxO για να επιβιώσει η στοματική μόλυνση στη Drosophila. Mucosal Immunol. 2016; 9(4):927–936. https://doi.org/10.1038/mi. 2015.112 PMID: 26627459.

13. Spellberg MJ, Marr MT. Το FOXO ρυθμίζει την παρεμβολή RNA στο Drosophila και προστατεύει από τη μόλυνση από τον ιό RNA. P Natl Acad Sci ΗΠΑ. 2015; 112(47):14587–14592. https://doi.org/10.1073/pnas. 1517124112 PMID: 26553999.

14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. Το PGRP-SC2 προάγει την ανοσοποιητική ομοιόσταση του εντέρου για να περιορίσει την κοινή δυσβίωση και να παρατείνει τη διάρκεια ζωής. Κύτταρο. 2014; 156(1–2):109–122. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12. 018 PMID: 24439372.

15. Becker Τ, Loch G, Beyer Μ, Zinke Ι, Aschenbrenner AC, Carrera Ρ, et αϊ. Ρύθμιση της έμφυτης ανοσολογικής ομοιόστασης που εξαρτάται από το FOXO. Φύση. 2010; 463(7279):369–373. https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753.

16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow Α, Herr C, Bischoff Μ, et αϊ. Οι μεταγραφικοί παράγοντες FOXO ρυθμίζουν τους έμφυτους ανοσολογικούς μηχανισμούς στα αναπνευστικά επιθηλιακά κύτταρα. J Immunol. 2013; 190(4):1603– 1613. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071.

17. Graves DT, Milovanova TN. Η ανοσία του βλεννογόνου και οι μεταγραφικοί παράγοντες FOXO1. Front Immunol. 2019; 10:2530–2541. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924.

18. Bulet P, Stocklin R, Menin L. Αντιμικροβιακά πεπτίδια: από ασπόνδυλα σε σπονδυλωτά. Immunol Rev. 2004; 198:169–184. https://doi.org/10.1111/j.0105-2896.2004.0124.x PMID: 15199962.

19. Buchon N, Silverman N, Cherry S. Immunity in Drosophila melanogaster—από τη μικροβιακή αναγνώριση στη φυσιολογία ολόκληρου του οργανισμού. Nat Rev Immunol. 2014; 14(12):796–810. https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701.

20. Hoffmann JA, Reichhart JM. Έμφυτη ανοσία Drosophila: μια εξελικτική προοπτική. Nat Immunol. 2002; 3(2):121–126. https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988.

21. Hultmark D. Drosophila immunity: μονοπάτια και μοτίβα. Curr Opin Immunol. 2003; 15(1):12–19. https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727.

22. Li FH, Xiang JH. Πρόσφατες εξελίξεις στις έρευνες για την έμφυτη ανοσία των γαρίδων στην Κίνα. Dev Comp Immunol. 2013; 39(1–2):11–26. https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214.

23. Sun JJ, Lan JF, Zhao XF, Vasta GR, Wang JX. Η δέσμευση της περιοχής περιελιγμένης περιέλιξης μιας λεκτίνης τύπου C στον υποδοχέα Domeless ενεργοποιεί άμεσα την οδό JAK/STAT στην ανοσοαπόκριση της γαρίδας στη βακτηριακή μόλυνση. PLoS Pathog. 2017; 13(9):e1006626. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061.

24. Gordon S. Φαγοκυττάρωση: μια ανοσοβιολογική διαδικασία. Ασυλία, ανοσία. 2016; 44(3):463–475. https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354.

25. Wang S, Xia PY, Huang GL, Zhu PP, Liu J, Ye BQ, et al. Η αυτοφαγία με τη μεσολάβηση FoxO1-απαιτείται για την ανάπτυξη των κυττάρων ΝΚ και την έμφυτη ανοσία. Nat Commun. 2016; 7:11023–11037. https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363.

26. Dong G, Song L, Tian C, Wang Y, Miao F, Zheng J, et al. Το FOXO1 ρυθμίζει τη δραστηριότητα των ουδετερόφιλων που προκαλείται από βακτήρια. Front Immunol. 2017; 8:1088–1102. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749.

27. Wang XW, Zhao XF, Wang JX. Η λεκτίνη τύπου C συνδέεται με τη βήτα-Integrin για να προάγει την αιμοκυτταρική φαγοκυττάρωση σε ένα ασπόνδυλο. J Biol Chem. 2014; 289(4):2405–2414. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258.

28. Norouzitallab P, Baruah K, Vanrompay D, Bossier P. Διδασκαλία της αυτοάμυνας στις γαρίδες για την καταπολέμηση των λοιμώξεων. Trends Biotechnol. 2019; 37(1):16–19. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649.

29. Flegel TW. Ιστορική εμφάνιση, επιπτώσεις και τρέχουσα κατάσταση των παθογόνων γαρίδων στην Ασία. J Invertebr Pathol. 2012; 110(2):166–173. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834.

30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. Αντιϊκή άμυνα στις γαρίδες: Από την έμφυτη ανοσία έως την ιογενή μόλυνση. Antivir Res. 2014; 108:129–141. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688.

31. Obsil T, Obsilova V. Σχέσεις δομής/λειτουργίας που διέπουν τη ρύθμιση των παραγόντων μεταγραφής FOXO. Ογκογόνο. 2008; 27(16):2263–2275. https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969.