Εκχυλίσματα λουλουδιών ως πολυλειτουργικές βαφές στη βιομηχανία καλλυντικών Μέρος 2

Παρακαλώ επικοινώνησεoscar.xiao@wecistanche.comΓια περισσότερες πληροφορίες

Πολλά φυσικά προϊόντα χρησιμοποιούνται σε παραδοσιακά ιατρικά συστήματα για τη θεραπεία της ανακούφισης των συμπτωμάτων από τον πόνο και τη φλεγμονή [61], επομένως, διερευνήθηκε η επίδραση των εκχυλισμάτων που αναλύθηκαν στην αναστολή της δραστηριότητας της λιποξυγενάσης και της πρωτεϊνάσης. Στο εύρος των συγκεντρώσεων που αναλύθηκαν (100-500 ug/mL), το υδατικό εκχύλισμα CTE έδειξε την ισχυρότερη ικανότητα να αναστέλλει την πρωτεϊνάση (Σχήμα 4) (σε 57 τοις εκατό για συγκέντρωση 500 ug/mL). Αυτή η δράση συγκρίθηκε με τον πολύ γνωστό αναστολέα πρωτεϊνάσης δικλοφενάκη, που χρησιμοποιείται ως έλεγχος (περίπου 89 τοις εκατό αναστολή στην υψηλότερη συγκέντρωση που δοκιμάστηκε). Ωστόσο, παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για το εκχύλισμα GGE και KTE (περίπου 56 τοις εκατό και 53 τοις εκατό, αντίστοιχα, για τις υψηλότερες συγκεντρώσεις). Χαμηλότερη αναστολή πρωτεϊνάσης παρατηρήθηκε για εκχυλίσματα PRE και PGE. Σε μια περαιτέρω δοκιμή που μετράει την ικανότητα αναστολής της λιποξυγενάσης, τα υδατικά εκχυλίσματα από KTE και CTE δείχνουν τις υψηλότερες τιμές (περίπου 67 τοις εκατό και 64 τοις εκατό αναστολή, αντίστοιχα, για συγκέντρωση 500 ug/mL). Η δικλοφενάκη χρησιμοποιήθηκε επίσης ως έλεγχος Τα εκχυλίσματα GGE, PGE και PRE παρουσιάζουν επίσης σημαντικά υψηλές τιμές (60 τοις εκατό , 57 τοις εκατό και 54 τοις εκατό, αντίστοιχα) Σημειώθηκε επίσης ότι η ικανότητα αναστολής των ενζύμων LOX και πρωτεϊνάσης εξαρτάται από τη συγκέντρωση του εκχυλίσματος (Εικόνα 5).

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι πολλές πολυφαινολικές ενώσεις συνέβαλαν σημαντικά στην αντιφλεγμονώδη δράση πολλών φυτικών εκχυλισμάτων[62]. Μελέτες έχουν δείξει τη συμμετοχή των ROS στη φλεγμονώδη διαδικασία και οι φαινολικές ενώσεις όπως το γαλλικό και το κινικό οξύ μπορεί να εμποδίσουν τον μεταβολισμό του αραχιδονικού οξέος αναστέλλοντας τη δραστηριότητα της δραστηριότητας της λιποξυγενάσης ή μπορεί να χρησιμεύσουν ως δέσμευση των δραστικών ελεύθερων ριζών, οι οποίες παράγονται κατά τη διάρκεια του αραχιδονικού οξέος. [63]. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από τους BenSaad et al. δείχνουν ότι το ελλαγικό οξύ, το γαλλικό οξύ και η πουνικαλαγίνη A&B που απομονώθηκαν από το P. granatum ανέστειλαν την παραγωγή του μονοξειδίου του αζώτου (NO), της προσταγλανδίνης E2 (PGE2) και της ιντερλευκίνης 6 (IL-6) σε λιποπολυσακχαρίτες (LPS) RAW 267.4 μακροφάγα. Το αν αυτές οι ενώσεις λειτουργούν ως μοναδικοί παράγοντες ή έχουν συνεργική δράση παραμένει ένα ερώτημα [64]. Δεδομένου ότι πολλά φλαβονοειδή παρουσιάζουν αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες, λόγω της εγγενούς αντιοξειδωτικής τους συμπεριφοράς, έχουν εμπλακεί σε διάφορες φλεγμονώδεις διαταραχές.Μέθοδος εκχύλισης φλαβονοειδών pdf,Συγκεκριμένα, η κερσετίνη είναι το πιο ενδιαφέρον μόριο επειδή παρεμβαίνει σε συγκεκριμένες βιολογικές οδούς. Επιπλέον, μελέτες δείχνουν ότι μπορεί να μειώσει τη φλεγμονώδη διαδικασία που εμπλέκεται σε πολλά μοντέλα μέσω διαφορετικών μηχανισμών[65]. Συγκεκριμένα, η ενεργοποιημένη από AMP πρωτεϊνική κινάση και η οδός ιστόνης/πρωτεϊνικής αποακετυλάσης (AMPK/SIRT1) οδηγεί σε πιο ενδιαφέρουσα διαχείριση της φλεγμονής. Έτσι, οι ενεργοποιητές AMPK μπορούν να μειώσουν τη φλεγμονή των μακροφάγων. Η κερκετίνη και άλλα φλαβονοειδή, ως ενεργοποιητές του AMPK και του SIRT1, μπορεί να μειώσουν τη φλεγμονή παρεμβαίνοντας σε αυτό το μονοπάτι [66]. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι η κερκετίνη και οι μονογλυκοσίδες της κερκετίνης ασκούν υψηλότερο δυναμικό αναστολής LOX [67]Nair et al. έχουν δείξει αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες του εκχυλίσματος ΚΤΕ αξιολογώντας την παρουσία φλαβονολών με το τμήμα κερκετίνης όπως η μαγγασλίνη Qu 3-[2G] ραμνοσυλρουτινοσίδη, η Qu 3-Ο-διρχαμνοσίδη και η ρουτίνη. Αυτά τα μόρια έχουν δείξει ισχυρή αναστολή της δραστηριότητας COX-2 και μερική καταστολή του ROS. Γενικά, οι πολυφαινόλες που υπάρχουν στο CTE έδειξαν αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες σε φλεγμονή που προκαλείται από LPS σε κύτταρα μακροφάγων RAW 264.7[68].

Κάντε κλικ εδώ για να μάθετε περισσότερα

2.5. Εκτίμηση Κυτταροτοξικότητας

Στη δημιουργία νέων καλλυντικών πρώτων υλών, μια από τις πιο σημαντικές ιδιότητες είναι η ασφάλεια χρήσης τους. Οι ουσίες που προορίζονται για χρήση σε καλλυντικά πρέπει να είναι μη τοξικές, ειδικά σε σχέση με τα κύτταρα του δέρματος, όπως τα κερατινοκύτταρα και οι ινοβλάστες. Δύο τύποι δοκιμών έχουν χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της τοξικότητας των εκχυλισμάτων που αναλύθηκαν σε κύτταρα HaCaT και BJ.φλαβονοειδήΗ πρώτη μελέτη, χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ουδέτερης πρόσληψης κόκκινου, μας δίνει τη δυνατότητα να αξιολογήσουμε τη βιωσιμότητα των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τα αναλυόμενα εκχυλίσματα. Αυτή η χρωστική εισέρχεται στα λυσοσώματα ενός ζωντανού κυττάρου και απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα των νεκρών κυττάρων. Παρατηρήθηκε (Εικόνα 6) ότι το εκχύλισμα CTE έχει την υψηλότερη ικανότητα να αυξάνει τον πολλαπλασιασμό τόσο των κυττάρων HaCaT όσο και των κυττάρων BJ. Σε σύγκριση με τον έλεγχο, αυτό το εκχύλισμα πέτυχε περίπου 20 τοις εκατό και 40 τοις εκατό υψηλότερες τιμές από την ελεγχόμενη παράμετρο σε συγκέντρωση 250 μL/mL (HaCaT και B】) και 500 μL/mL (κύτταρα BJ) αντίστοιχα. Το εκχύλισμα GGE σε συγκεντρώσεις 100 και 250 μL/mL και το εκχύλισμα ΚΤΕ σε συγκέντρωση 500 μL/mL χαρακτηρίστηκαν από μικρή τοξική επίδραση στα κύτταρα BJ. Άλλα εκχυλίσματα είχαν θετική επίδραση στη βιωσιμότητα αυτών των κυττάρων. Τα εκχυλίσματα PRE και PGE σε συγκέντρωση 100 μL/mL δεν διέφεραν σημαντικά από τον έλεγχο και αύξησαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων BJ κατά περίπου 10-15 τοις εκατό σε σύγκριση με τον έλεγχο σε συγκέντρωση 250 και 500 μL/ mL. Στην περίπτωση των κερατινοκυττάρων, δεν παρατηρήθηκε μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας. Για τα εκχυλίσματα PGE, PRE και CTE, σημειώθηκε αύξηση στον πολλαπλασιασμό με αυξανόμενη συγκέντρωση, ενώ μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων καταδείχθηκε με την αύξηση της συγκέντρωσης των εκχυλισμάτων KTE και GGE.

Η δεύτερη δοκιμή που πραγματοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της κυτταροτοξικότητας των εξεταζόμενων εκχυλισμάτων ήταν η δοκιμή ρεσαζουρίνης (Alamar Blue). Έχει δειχθεί (Εικόνα 7) ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων εξαρτάται από τη συγκέντρωση του εκχυλίσματος με το οποίο επωάστηκαν τα κύτταρα. Στην περίπτωση των ινοβλαστών, τα εκχυλίσματα PRE, PGE και CTE προκαλούν υψηλότερο κυτταρικό πολλαπλασιασμό με αύξηση της συγκέντρωσής τους. Στην υψηλότερη αναλυθείσα συγκέντρωση (500 μL/mL), παρατηρήθηκε περίπου 20 τοις εκατό υψηλότερος πολλαπλασιασμός σε σύγκριση με τον έλεγχο.χρήσεις της εσπεριδίνηςΣτην περίπτωση των εκχυλισμάτων KTE και GGE, παρατηρήθηκε μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων με αύξηση της συγκέντρωσης των εκχυλισμάτων. Αυτά τα εκχυλίσματα έδειξαν μικρή τοξική επίδραση στο BJ σε συγκεντρώσεις 250 και 500 μL/mL. Στην περίπτωση των κερατινοκυττάρων, παρατηρήθηκε παρόμοια επίδραση των αναλυόμενων εκχυλισμάτων στα κύτταρα του δέρματος, αλλά η ικανότητά τους να πολλαπλασιάζονται δεν ήταν τόσο ισχυρή όσο στην περίπτωση των ινοβλαστών. Η υψηλότερη ικανότητα αύξησης του πολλαπλασιασμού των κερατινοκυττάρων παρατηρήθηκε για το εκχύλισμα CTE σε όλο το εύρος των αναλυόμενων συγκεντρώσεων. Παρόμοιες τιμές λήφθηκαν για το εκχύλισμα PRE σε συγκέντρωση 250 μL/mL και για το εκχύλισμα PGE σε συγκέντρωση 500 μL/mL. Το εκχύλισμα ΚΤΕ έδειξε σημαντικά υψηλότερη τοξική επίδραση στα κύτταρα HaCa από το εκχύλισμα GGE.

Τα εκχυλίσματα που αναλύθηκαν δεν έχουν δοκιμαστεί εκτενώς για την τοξικότητά τους στα κύτταρα του δέρματος στο παρελθόν. Υπάρχουν μόνο λίγες μελέτες κυτταροτοξικότητας σε εκχυλίσματα ή τα κύρια δραστικά συστατικά τους, ειδικά σε καρκινικά κύτταρα. Οι συγγραφείς προηγούμενων μελετών ανέφεραν ότι αυτά τα εκχυλίσματα γενικά δεν έχουν τοξική επίδραση στα κύτταρα του δέρματος και η ικανότητά τους να αυξάνουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό αποδίδεται συχνότερα στην υψηλή περιεκτικότητα σε πολυφαινόλες, ανθοκυανίνες και φλαβονοειδή [45,69-73 ]. Ορισμένοι συγγραφείς ανέφεραν επίσης ότι τα μεμονωμένα συστατικά που περιέχονται στα εκχυλίσματα μπορεί να παρουσιάζουν τοξική επίδραση στα κύτταρα του δέρματος, ενώ το εκχύλισμα στο σύνολό του όχι. Οι Ali Hijazi et al. [69] έδειξε ότι τα αλκαλοειδή που εξάγονται από το Punica granatum είναι τοξικά για τις φυσιολογικές και καρκινικές κυτταρικές σειρές, ενώ ολόκληρο το εκχύλισμα είναι λιγότερο τοξικό. Η μελέτη των Nasiri et al. [70] δείχνει ότι το εκχύλισμα λουλουδιών Punica granatum μπορεί να είναι χρήσιμο στην επιτάχυνση της διαδικασίας επούλωσης των πληγών λόγω της ικανότητάς του να αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του δέρματος. Στην προηγούμενη έρευνά μας [45], αποδείχθηκε ότι τα υδατικά αιθανολικά εκχυλίσματα που ελήφθησαν από τα αναλυόμενα φυτά χαρακτηρίζονταν από υψηλότερη ικανότητα να αυξάνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων BJ και τα εκχυλίσματα KTE και GGE έδειξαν χαμηλότερη τοξική επίδραση σε αυτά τα κύτταρα .χαμένη αυτοκρατορία cistancheΗ επίδραση των εκχυλισμάτων νερού-αιθανόλης στα κύτταρα HaCaT ήταν παρόμοια με εκείνη των καθαρών υδατικών εκχυλισμάτων, αλλά στην περίπτωση των εκχυλισμάτων που ελήφθησαν με αιθανόλη, παρατηρήθηκαν ελαφρώς πιο ευνοϊκές ιδιότητες πολλαπλασιασμού από ό,τι στην περίπτωση των υδατικών εκχυλισμάτων. Οι διαφορές μεταξύ της σύνθεσης και των δύο τύπων αναλυόμενων εκχυλισμάτων μπορεί να προκαλέσουν διαφορές στην τοξικότητά τους. Όπως φαίνεται, τα εκχυλίσματα νερού δεν είναι τόσο πλούσια σε βιοενεργά συστατικά όσο τα εκχυλίσματα νερού-αιθανόλης. Οι μεγαλύτερες διαφορές παρατηρούνται στην περιεκτικότητα σε ρουτίνη και ισοκερκιτρίνη.

Το Cistanche μπορεί να αντιγηρανθεί

2.6.Προσδιορισμός Συντελεστή Ηλιοπροστασίας

Οι δυσμενείς επιπτώσεις της υπεριώδους ακτινοβολίας στο δέρμα μπορεί να αποκαλυφθούν τόσο λίγο μετά την έκθεση όσο και χρόνια αργότερα. Η ηλιακή ακτινοβολία έχει ανοσοκατασταλτική δράση η οποία επιταχύνει τη διαδικασία γήρανσης του δέρματος με όλες τις συνέπειες που συνδέονται με αυτήν, συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης καρκινογένεσης[74]. Οι τάσεις που παρατηρούνται αυτή τη στιγμή υποδεικνύουν μια αυξανόμενη ανάγκη για ανάπτυξη προϊόντων που χαρακτηρίζονται όχι μόνο από πολύ υψηλό επίπεδο ασφάλειας στη χρήση αλλά και από πολυλειτουργικότητα, με την έννοια ότι τα προϊόντα θα διαθέτουν αντιακτινοβολική προστασία του δέρματος με ευρύτερο εύρος δράσης από ό,τι χρησιμοποιήθηκε μέχρι τώρα. Ορισμένες φυτικές ουσίες διαδραματίζουν ανεκτίμητο ρόλο σε αυτήν την πτυχή, οι οποίες είναι σε θέση όχι μόνο να παρέχουν αντηλιακή προστασία αλλά και να εξουδετερώνουν τις ήδη υπάρχουσες αρνητικές επιπτώσεις της ηλιακής ακτινοβολίας στο δέρμα [75-77]. Η έρευνα που διεξήχθη έδειξε ότι τα αναλυόμενα φυτικά εκχυλίσματα PRE, PGE, KTE, CTE και GGE χαρακτηρίζονται από υψηλούς συντελεστές SPF.

Η ανάλυση των συντελεστών (SPF) πραγματοποιήθηκε για τα ληφθέντα υδατικά εκχυλίσματα από τα προαναφερθέντα φυτά σε συγκεντρώσεις 10 και 50 mg/mL. Για κάθε φυτό που ερευνήθηκε, υψηλότερη συγκέντρωση του εκχυλίσματος οδήγησε σε σημαντικά υψηλότερη τιμή SPF.μικρονισμένο καθαρισμένο κλάσμα φλαβονοειδών 1000 mg χρήσειςΗ σύγκριση μεταξύ των εκχυλισμάτων δείχνει ότι οι υψηλότερες τιμές του SPF παρατηρήθηκαν για το εκχύλισμα ΚΤΕ, το οποίο ισχύει και για τις δύο συγκεντρώσεις που ερευνήθηκαν. Μια άλλη ενδιαφέρουσα παρατήρηση είναι ότι ακόμη και στις χαμηλότερες από τις συγκεντρώσεις που ερευνήθηκαν το εκχύλισμα ΚΤΕ εξακολουθούσε να παρουσιάζει υψηλό δείκτη προστασίας, ενώ οι τιμές για άλλα εκχυλίσματα μειώθηκαν αισθητά. Αυτό είναι ξεκάθαρο όταν αναλύουμε πόσο το αποτέλεσμα για το ΚΤΕ ήταν υψηλότερο από άλλα αποσπάσματα. Για τη συγκέντρωση των 50 mg/mL, ο SPF ήταν υψηλότερος κατά τον παράγοντα 1,2 (σε σύγκριση με PGE, CTE) στον παράγοντα σχεδόν 1,9 (σε σύγκριση με PRE, GE). Ο ίδιος υπολογισμός για τη συγκέντρωση των 10 mg/mL θα δώσει παράγοντες από 1,4 (σε σύγκριση με PGE) σε παράγοντες του εύρους 2-3 (σε σύγκριση με CTE, GGE), ακόμη και μέχρι παράγοντες όπως 10 σε σύγκριση με ΠΡΟ. Όταν εστιάσουμε στο εκχύλισμα KTE, μπορεί κανείς να παρατηρήσει ότι μια φθίνουσα συγκέντρωση του εκχυλίσματος κατά παράγοντα 5 (από μια τιμή 50 mg/mL στην τιμή των 10 mL/mL) έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της τιμής του SPF κατά παράγοντα 3,4 , που σημαίνει ότι το SPF μειώνεται πιο αργά από τη συγκέντρωση. Τα παραπάνω δείχνουν ότι το εκχύλισμα ΚΤΕ μπορεί να είναι αποτελεσματικό ακόμη και όταν εφαρμόζεται σε χαμηλές συγκεντρώσεις (Εικόνα 8).

2.7. Μετρήσεις διαδερμικής απώλειας νερού (TEWL) και ενυδάτωσης δέρματος

Λόγω του ευρέος φάσματος βιολογικής και φαρμακολογικής δραστηριότητας των φυτικών πρώτων υλών, οι φυτικές ουσίες που περιέχονται στα εκχυλίσματα έχουν σημαντικό αντίκτυπο στην κατάσταση του δέρματος. Συγκεκριμένα, εδώ μιλάμε για την επίδραση των δευτερογενών μεταβολιτών στην κατάσταση του δέρματός μας [78,79].

Στο επόμενο στάδιο της έρευνας έγιναν οι αναλύσεις ενυδάτωσης και TEWL. Η επίδραση των δοκιμασμένων εκχυλισμάτων στο δέρμα αξιολογήθηκε. Οι μετρήσεις έγιναν σε δύο χρονικά διαστήματα των 60 και 360 λεπτών για τη συγκέντρωση εκχυλίσματος 10 mg/mL. Για τη μέτρηση TEWL, η μεγαλύτερη ποσοστιαία μείωση παρουσιάστηκε για το εκχύλισμα PGE, όπου η τιμή ελέγχου 13,9 έπεσε στο 8,71, με αποτέλεσμα μια ποσοστιαία μείωση 37 τοις εκατό . Αξίζει επίσης να αναλυθεί το απόσπασμα KTE από αυτή την οπτική γωνία, καθώς αυτό ήταν εκείνο που παρουσίαζε τις υψηλότερες τιμές SPF. Για το απόσπασμα KTE, η τιμή ελέγχου TEWL μειώθηκε στην τιμή 10,22, που σημαίνει μείωση 26 τοις εκατό (Εικόνα 9Α).

Ωστόσο, στην περίπτωση της δεύτερης μέτρησης του οργάνου, αποδείχθηκε ότι τα εκχυλίσματα που αναλύθηκαν προκαλούν αύξηση της ενυδάτωσης σε σχέση με το δείγμα ελέγχου, τόσο μετά από 60 όσο και μετά από 360 λεπτά.

Ως αποτέλεσμα των αναλύσεων, βρέθηκε ότι τα εκχυλίσματα PRE, PGE, KTE, CTE και GGE που αναλύθηκαν αυξάνουν την ενυδάτωση του δέρματος (Εικόνα 9Β). Παρατηρήθηκε αύξηση των ενυδατικών ιδιοτήτων μαζί με αύξηση της συγκέντρωσης του εκχυλίσματος στα σκευάσματα. Οι ισχυρότερες ενυδατικές ιδιότητες έχουν παρατηρηθεί για τα εκχυλίσματα PRE και PGE που ισοδυναμούν με 32 τοις εκατό και 29 τοις εκατό μετά από 60 λεπτά και ίσο με 21 τοις εκατό και 22 τοις εκατό μετά από 360 λεπτά. Το χαμηλότερο επίπεδο ενυδάτωσης του δέρματος, ωστόσο, βρέθηκε για το εκχύλισμα KTE που αντιστοιχεί στο 18 τοις εκατό μετά από 60 λεπτά και κοντά στο 3 τοις εκατό μετά από 360 λεπτά.

2.8. Ανάλυση Εφαρμογών

2.8.1. Προσδιορισμός των χρωματικών παραμέτρων των εκχυλισμάτων

Λόγω του φυσικού τους χρώματος, τα ενεργά συστατικά των φυτικών λουλουδιών μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φυσικές βαφές σε πολλά εμπορικά προϊόντα, όπως καλλυντικά και τρόφιμα. Έγινε ανάλυση χρώματος για τα ληφθέντα εκχυλίσματα (Πίνακας 5).

Τα εκχυλίσματα PRE, KTE και CTE βρέθηκαν να έχουν τις υψηλότερες δυνατότητες ως φυσικές καλλυντικές χρωστικές. Ωστόσο, οι υψηλότερες τιμές χρωματισμού (C*) παρατηρήθηκαν για το CTE. Με βάση την τιμή της παραμέτρου h βαθμού, βρέθηκε ότι είναι το κίτρινο χρώμα αυτού του εκχυλίσματος που παρατηρείται και είναι ορατό με γυμνό μάτι. Στην περίπτωση των εκχυλισμάτων KTE και PRE, παρά τη χαμηλή τιμή C* (2,8), το χρώμα αυτών των εκχυλισμάτων μπορεί να φανεί καθαρά με γυμνό μάτι και προσδιορίστηκε ως κόκκινο-μοβ για το PRE και μπλε-ιώδες για το εκχύλισμα KTE. Τα υδατικά εκχυλίσματα PGE και GGE ήταν κοκκινωπά και ελαφρώς πορτοκαλί χρώματος και οι λαμβανόμενες τιμές χρωματισμού ήταν στο επίπεδο του 1,3. Για αυτό το χρώμα, αυτές οι τιμές δεν ήταν σημαντικά διακριτές με γυμνό μάτι.

2.8.2. Προσδιορισμός των χρωματικών παραμέτρων των καλλυντικών με βάση τα εκχυλίσματα

Τα τελευταία χρόνια υπήρξε έντονη η ανάγκη ανάπτυξης νέων χρωστικών φυσικής προέλευσης, ιδιαίτερα στις βιομηχανίες τροφίμων και καλλυντικών. Σε σύγκριση με τις βαφές που λαμβάνονται συνθετικά, μπορεί να έχουν μικρότερο αρνητικό αντίκτυπο στην ανθρώπινη υγεία και στο περιβάλλον [80]. Τα ληφθέντα εκχυλίσματα χρησιμοποιήθηκαν στη σύνθεση ενός μοντέλου μικκυλιακού υγρού ντεμακιγιάζ. Σε κάθε σκεύασμα, χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 1 τοις εκατό. Τα αποτελέσματα των παραμέτρων χρώματος των μοντέλων καλλυντικών παρουσιάζονται στον Πίνακα 6.

Παρατηρήθηκε ότι η προσθήκη 1 τοις εκατό εκχυλισμάτων νερού από PRE, PGE, CTE και GGE επηρέασε σημαντικά το χρώμα του ντεμακιγιάζ. Κάθε δείγμα ήταν καθαρά ορατό με γυμνό μάτι σε χρώμα. Το εκχύλισμα PRE άλλαξε το χρώμα του καλλυντικού σε πορτοκαλί και το εκχύλισμα PGE, CTE και GGE το άλλαξε σε κίτρινο.

Η δυνατότητα χρήσης των αναλυθέντων εκχυλισμάτων ως πιθανών χρωστικών επιβεβαιώνεται από τις σχετικά υψηλές τιμές του △Demake-up remover with extract/base make-up dever, που υποδηλώνει σημαντική αλλαγή στο χρώμα των μοντέλων καλλυντικών με την προσθήκη του εκχυλίσματος σε σύγκριση στο βασικό δείγμα (χωρίς προσθήκη των εκχυλισμάτων). Τα βιβλιογραφικά δεδομένα [73] δείχνουν ότι εάν οι τιμές AE είναι υψηλότερες από 5, το χρώμα γίνεται αντιληπτό από τη γυμνή παραμονή και γίνεται αντιληπτό ως χρωματικό εφέ. Για ντεμακιγιάζ που περιέχουν εκχυλίσματα PRE, KTE και CTE, ελήφθησαν οι τιμές ΑΕ 8,83, 9,17 και 8,14, αντίστοιχα. Στην περίπτωση προϊόντων με εκχυλίσματα PGE και GGE, δεν παρατηρήθηκε σημαντική επίδραση στο εκχύλισμα στο χρώμα του παρασκευάσματος. Οι τιμές του AE είναι στην περιοχή 2.51-2.82. Αυτό σημαίνει ότι η διαφορά στο χρώμα είναι ορατή μόνο σε έναν έμπειρο παρατηρητή [80,81].

3. Υλικά και Μέθοδοι

3.1. Φυτικό Υλικό και Διαδικασία Εκχύλισης

Το φυτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε στην έρευνα ήταν ξερά άνθη των P. rhoeas L., P.granatum L., C.ternatea L., C.tinctorius L., και G.globosa L., τα οποία ελήφθησαν από το τοπικό κατάστημα βοτάνων . Η διαδικασία εξαγωγής πραγματοποιήθηκε σε λουτρό υπερήχων (Digital Mgtrasonic Cleaner, Βερολίνο, Γερμανία), η οποία πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Yang et al.[82]. 10 γραμμάρια ξηρών λουλουδιών και 100 γραμ. νερού χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή υδατικών εκχυλισμάτων των φυτών που δοκιμάστηκαν. Η διαδικασία διεξήχθη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα ληφθέντα εκχυλίσματα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και διηθήθηκαν τρεις φορές μέσω διηθητικού χαρτιού Whatman Νο. 1. Μετά τη διήθηση, τα εκχυλίσματα εξατμίστηκαν υπό ελαττωμένη πίεση στους 40 βαθμούς. Ένα μητρικό διάλυμα σε συγκέντρωση 100 mg/mL παρασκευάστηκε από τα ξηρά εκχυλίσματα και αποθηκεύτηκε στο σκοτάδι στους 4 βαθμούς μέχρι περαιτέρω ανάλυση. Χρησιμοποιούνται οι ακόλουθες συντμήσεις: PRE—Εκχύλισμα παπαβέρης, PGE—εκχύλισμα Punica granatum, GGE—εκχύλισμα Gomphrena globosa, CTE—εκχύλισμα Carthamus tinctorius, ΚΤΕ—Εκχύλισμα Clitoria ternatea.

3.2. Προσδιορισμός Βιοδραστικών Ενώσεων με HPLC-UV-ESI-MS

Τα ληφθέντα εκχυλίσματα αναλύθηκαν για τον προσδιορισμό των κύριων βιοδραστικών τους ενώσεων χρησιμοποιώντας ένα συζευγμένο HPLC(DionexUltiMate 300{{20}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA). με φασματόμετρο μάζας (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Καναδάς), εξοπλισμένο με πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) και μάζα παγίδας τριπλού τετραπολικού ιόντος αναλυτής. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός επιτεύχθηκε με σύστημα βαθμίδωσης αντίστροφης φάσης. Επιπλέον, 100×4,6 mm χρωματογραφική στήλη Kinetex 3,5 μm XB-C18 100 Α με πλευρικές αλυσίδες ισο-βουτυλίου και με σταθερή φάση TMS τελικού καλύμματος που χρησιμοποιείται με παρόμοια προστατευτική στήλη σύνθεσης αγοράστηκε από την Phenomenex και διατηρήθηκε στους 30 βαθμούς . Ένα δυαδικό σύστημα διαλυτών που περιλαμβάνει 0,1 τοις εκατό (ο/ο) υδατικό μυρμηκικό οξύ ως διαλύτη Α και μεθανόλη ως διαλύτη Β χρησιμοποιήθηκε υπό βαθμίδωση κατά τη διάρκεια 19,1 λεπτών του χρόνου εκτέλεσης. Οι συνθήκες έκλουσης που εφαρμόστηκαν ήταν ως εξής: 0.0-15.0 min 25-100 τοις εκατό B,15.0-17.0 min 100 τοις εκατό B,17.0-17.1 λεπτό. 100-25 τοις εκατό B,17.1-19.1 λεπτό 25 τοις εκατό B. Ο ρυθμός ροής της κινητής φάσης ήταν 0,6 mL/min και ο όγκος έγχυσης ήταν 10 μL. Το υγρό έκλουσης παρακολουθήθηκε με φασματόμετρο μάζας ιόντων ηλεκτροψεκασμού (ESI-MS) υπό τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος και σαρώθηκε από m/z 20 έως 1000 Da. Για την ποσοτική ανάλυση, ο τριπλός τετραπολικός ανιχνευτής MS λειτουργούσε σε λειτουργία σάρωσης παρακολούθησης πολλαπλών αντιδράσεων (MRM). Οι βέλτιστες συνθήκες αναλυτή μάζας και η επιλογή των ιόντων προϊόντων για μεμονωμένες ενώσεις προσδιορίστηκαν πειραματικά. Για το σκοπό αυτό, εισήχθησαν πρότυπα διαλύματα των ερευνημένων ενώσεων (1 ng/mL) σε σύνθεση κινητής φάσης χρησιμοποιώντας μια αντλία έγχυσης που λειτουργεί σε σταθερή παροχή δείγματος. Αφού βεβαιώθηκε ότι επιλέχθηκε το σωστό πρόδρομο ιόν, το δυναμικό αποσύνδεσης (DP), το δυναμικό εισόδου (EP), το δυναμικό εξόδου κυψέλης σύγκρουσης (CXP) και η ενέργεια σύγκρουσης (CE) βελτιστοποιήθηκαν για κάθε μετάβαση MRM (Πίνακας S1). Παρακολουθήθηκαν δύο μεταβάσεις MRM, μία για ποσοτικοποίηση και μία για επιβεβαίωση. Οι παράμετροι MS ρυθμίστηκαν ως εξής: τριχοειδική θερμοκρασία 600 C, αέριο παραπετάσματος στα 35 psi, αέριο εκνεφωτή στα 60 psi και αέριο ξήρανσης στα 50 psi. Εφαρμόστηκε τάση πηγής λειτουργίας αρνητικού ιονισμού -4500 V για τον προσδιορισμό των βιοδραστικών ενώσεων. Το άζωτο χρησιμοποιήθηκε ως αέριο κουρτίνας και σύγκρουσης. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με το λογισμικό Analyst 1.5.1. Η ταυτοποίηση των επιλεγμένων ενώσεων έγινε με μοριακή μάζα και θραύσμα εισόδων ανιόντων κάθε μεμονωμένης ένωσης και επιβεβαιώθηκε με κατακερματισμό MS2. Οι ταυτότητες εννέα ενώσεων προσδιορίστηκαν μαζί με τον χημικό τους τύπο, τα αποπρωτονωμένα μοριακά ιόντα και τα χαρακτηριστικά ιόντα θραύσματος για κάθε μεμονωμένη κορυφή. Έξι ενώσεις ποσοτικοποιήθηκαν με βάση την καμπύλη βαθμονόμησης που δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας περιοχές αιχμής των πιο έντονων μεταβάσεων MRM αναλυτικών προτύπων. Η γραμμικότητα της απόκρισης του ανιχνευτή για ποσοτικοποιημένες ενώσεις αποδείχθηκε με έγχυση προτύπων βαθμονόμησης σε οκτώ επίπεδα συγκέντρωσης που κυμαίνονται από 0,01 ug/mL έως 2 ug/mL. Οι καμπύλες βαθμονόμησης ήταν γραμμικές με τους συντελεστές συσχέτισης (R) μεγαλύτερους από 0,99. Σε περίπτωση που τα δείγματα δεν έπεφταν στη γραμμική περιοχή του ανιχνευτή CMS, τα δείγματα αραιώθηκαν.

Αναλυτικά πρότυπα κινικού οξέος, γαλλικού οξέος, καφεϊκού οξέος, καφεοϋλοκινικών οξέων (CQA, δύο ισομερή:3- και 5-CQA) και κερκετίνης αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ΗΠΑ ). Όλα τα πρότυπα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικού βαθμού (2 Μεγαλύτερη ή ίση με 99 τοις εκατό καθαρότητα).

Παρασκευάστηκαν τυπικά μητρικά διαλύματα ζυγίζοντας και διαλύοντας 20 mg κάθε προτύπου σε 10 mL μεθανόλης ποιότητας LC-MS για να δώσουν συγκέντρωση 2 mg/mL. Σειριακές αραιώσεις 2.{{10}} ug/mL, 1,5 ug/mL, 1.0 ug/mL, 0.5 ug/mL,0 Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν 0,1 ug/mL, 0,05 ug/mL, 0,02 ug/mL και 0,01 ug/mL χρησιμοποιώντας διάλυμα μεθανόλης ποιότητας LC-MS. Το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) ορίστηκε ως 0,01 ug/ml.

Η δοκιμασία LC-MS/MS πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Τα ληφθέντα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσοι όροι ± τυπικές αποκλίσεις.

3.3. Προσδιορισμός Αντιοξειδωτικών Ιδιοτήτων

3.3.1.ABTS· plus Scavenging Assay

Αρχικά, το διάλυμα ABTS παρασκευάστηκε με ανάμειξη 19,5 mg ABTS και 3,3 mg υπερθειικού καλίου με 7 ml ρυθμιστικού φωσφορικού (ρΗ=7.4) και διαλύθηκε για 16 ώρες στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, το διάλυμα αραιώθηκε μέχρι την απορρόφηση σε επίπεδο περίπου 1.0. Οι απορροφήσεις μετρήθηκαν σε μήκος κύματος 入=734 nm. Στη συνέχεια, 20 mL εκχυλισμάτων KTE, PGE, PRE, CTE και GGE (10,100,250,500 ug/mL) αναμίχθηκαν με 980 mL αραιωμένου διαλύματος ABTSe ​​συν και στη συνέχεια επωάστηκαν για 10 λεπτά στο σκοτάδι. Στο επόμενο βήμα, η απορρόφηση των παρασκευασμένων δειγμάτων μετρήθηκε στα 入=734 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο UV/VIS Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ). Ως τυφλό χρησιμοποιήθηκε απεσταγμένο νερό. Το ABTS plus scavenging υπολογίστηκε από την Εξίσωση (1):

όπου: Ως—απορρόφηση του δείγματος. Ac—απορρόφηση του δείγματος ελέγχου. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για κάθε εξαγόμενο δείγμα. Η διαδικασία περιγράφηκε από τους Gawel-Beben et al. [83].

3.3.2. Δοκιμασία Σάρωσης Ριζικής DPPH

Η ικανότητα των εκχυλισμάτων να δεσμεύουν τις ελεύθερες ρίζες πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Brand-Williams et al. [84]. Βασίζεται στη χρήση της ρίζας 1,1-διφαινυλ-2-πικρυλυδραζυλ (DPPH). Αρχικά, 33 μL υδατικών διαλυμάτων εκχυλισμάτων σε συγκεντρώσεις 100 ug/mL αναμίχθηκαν με 167 μL διαλύματος μεθανόλης DPPH (4 mM) και μεταφέρθηκαν σε μια πλάκα 96-πηγαδιού και στη συνέχεια αναμίχθηκαν με ανακίνηση. Στη συνέχεια, η απορρόφηση των δειγμάτων μετρήθηκε σε μήκος κύματος 517 nm. Οι μετρήσεις γίνονταν κάθε 5 λεπτά για 30 λεπτά σε φασματοφωτόμετρο φίλτρου UV-VIS Max入=5 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ). Τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις πραγματοποιήθηκαν για κάθε εκχύλισμα. Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε νερό με διάλυμα DPPH. Η αντιοξειδωτική ικανότητα εκφράστηκε ως ποσοστό της αναστολής της DPPH χρησιμοποιώντας την Εξίσωση (2):

όπου: Ως—απορρόφηση του δείγματος. Ac—απορρόφηση του δείγματος ελέγχου. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για κάθε εξαγόμενο δείγμα.

3.3.3. Ανίχνευση ενδοκυτταρικών επιπέδων αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS)

Για να προσδιοριστεί η ικανότητα των αναλυόμενων εκχυλισμάτων να δημιουργούν την ενδοκυτταρική παραγωγή ενεργών ειδών οξυγόνου σε κύτταρα HaCaT και BJ, χρησιμοποιήθηκε μια φθορογόνος χρωστική H, DCFDA. Αυτή η ένωση έχει την ικανότητα να εισέρχεται στα κύτταρα με παθητική διάχυση, όπου αποακετυλιώνεται από ενδοκυτταρικές εστεράσες σε μια μη φθορίζουσα ένωση. Εάν υπάρχουν αντιδραστικά είδη οξυγόνου στο κύτταρο, αυτή η ένωση μετασχηματίζεται σε DCF υψηλής φθορισμού. Για να προσδιοριστεί το ενδοκυτταρικό επίπεδο των ROS σε HaCaT και BJ, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96-πλάκες φρεατίων. Στη συνέχεια, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε επωαστήρα για 24 ώρες. Το μέσο DMEM αφαιρέθηκε και αντικαταστάθηκε με 10 μM H2DCFDA (Sigma Aldrich, St.Louis, MO, ΗΠΑ) διαλυμένο σε μέσο DMEM χωρίς ορό. Τα κύτταρα HaCaT και BJ επωάστηκαν σε Η, DCFDA για 45 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με τα εκχυλίσματα σε συγκεντρώσεις∶ 100, 250 και 500 ug/mL. Κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 mM υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες. Τα δείγματα ελέγχου ήταν κύτταρα χωρίς επεξεργασία με τα εξετασθέντα εκχυλίσματα. Ο φθορισμός DCF μετρήθηκε κάθε 90 λεπτά χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλάκας FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific) σε μέγιστη διέγερση 485 nm και φάσματα εκπομπής 530 nm [85].

3.4. Εκτίμηση της αναστολής των μεταλλοπεπτιδασών Matrix

3.4.1.Προσδιορισμός Αντι-Ελαστάσης Δραστικότητας

Για να προσδιοριστεί η πιθανότητα αναστολής της μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας, της ελαστάσης ουδετερόφιλων (NE), εφαρμόστηκε ένα κιτ φθορισμού (Abcam, ab118971). Η δοκιμή πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες που επισυνάπτονται στο κιτ και με τη διαδικασία που περιγράφεται από τους Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε τυπική πλάκα 96-πηγαδιού με καθαρό επίπεδο πυθμένα. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν φυτικά εκχυλίσματα σε συγκέντρωση 100 και 250 ug/mL. Αρχικά, διαλύματα ενζύμου ΝΕ, ένα υπόστρωμα ΝΕ και ένας έλεγχος αναστολέα (SPCK) παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες. Αραιωμένο διάλυμα ΝΕ προστέθηκε σε όλα τα φρεάτια και στη συνέχεια, τα δείγματα δοκιμής, ο έλεγχος αναστολέα και ο έλεγχος ενζύμου (Ρυθμιστικό Δοκιμασίας) προστέθηκαν στα επόμενα φρεάτια. Στη συνέχεια, τα δείγματα αναμίχθηκαν και επωάστηκαν στους 37 βαθμούς για 5 λεπτά. Εν τω μεταξύ, παρασκευάστηκε ένα μίγμα αντίδρασης με ανάμιξη του ρυθμιστικού διαλύματος προσδιορισμού και του υποστρώματος ΝΕ. Το μίγμα προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και αναμίχθηκε επιμελώς. Ο φθορισμός μετρήθηκε αμέσως σε μήκος κύματος διέγερσης 入=400 nm και εκπομπή 入=505 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ) Η ικανότητα αναστολής της δραστηριότητας ΒΑ του αναλυόμενου Τα δείγματα υπολογίστηκαν από την Εξίσωση (3):

Το τελικό αποτέλεσμα ήταν ο αριθμητικός μέσος όρος τριών ανεξάρτητων μετρήσεων.

3.4.2. Προσδιορισμός της δράσης κατά της κολλαγενάσης

Για να εκτιμηθεί η ικανότητα των ληφθέντων εκχυλισμάτων να αναστέλλουν τη δράση της κολλαγενάσης, εφαρμόστηκε ένα κιτ φθοριομετρίας (Abcam, Cambridge, UK, ab211108). Η δοκιμή πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες που επισυνάπτονται στο κιτ και με τη διαδικασία που περιγράφεται από τους Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε τυπική πλάκα 96-πηγαδιού με καθαρό επίπεδο πυθμένα. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν φυτικά εκχυλίσματα σε συγκέντρωση 100 και 250 ug/mL. Πρώτον, η κολλαγενάση (COL) διαλύθηκε σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα ανάλυσης κολλαγενάσης (CAB). Στη συνέχεια, τα αναλυμένα δείγματα προστέθηκαν σε COL και CAB. Παρασκευάστηκαν δείγματα ελέγχου αναστολέα με ανάμειξη του αναστολέα κολλαγενάσης (1,10-φαινανθρολίνη (80 mM) με κολλαγενάση και ρυθμιστικό διάλυμα CAB. Τα φρεάτια ελέγχου ενζύμου παρασκευάστηκαν με ανάμειξη αραιωμένου COL με CAB. Το ρυθμιστικό διάλυμα CAB χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος υποβάθρου Στη συνέχεια, τα δείγματα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Παρασκευάστηκε ένα μίγμα αντίδρασης με ανάμιξη του υποστρώματος κολλαγενάσης με CAB. Το μίγμα αντίδρασης που παρασκευάστηκε με αυτόν τον τρόπο προστέθηκε σε όλα τα αναλυόμενα δείγματα και αναμίχθηκε επιμελώς. Στη συνέχεια, ο φθορισμός μετρήθηκε σε μήκος κύματος διέγερσης 490 nm και εκπομπή 520 nm Η μέτρηση πραγματοποιήθηκε σε κινητική λειτουργία για 60 λεπτά στους 37 C. Η ικανότητα αναστολής της δραστηριότητας COL των ληφθέντων εκχυλισμάτων υπολογίστηκε με την Εξίσωση (4):

3.5. Προσδιορισμός Αντιφλεγμονωδών Ιδιοτήτων

3.5.1. Αναστολή Μετουσίωσης Πρωτεϊνών

Η ανασταλτική δραστηριότητα πρωτεϊνάσης των εκχυλισμάτων PRE, PGE, KTE, CTE και GGE πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Sakat et al.[87], η οποία τροποποιήθηκε από τους Gunathilake et al.[88]. Εν συντομία, το διάλυμα αντίδρασης (2 mL) αποτελούνταν από 1 mL θρυψίνης 1 τοις εκατό σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl 2{{10}} mM (pH7,4) και 1 mL δείγματος δοκιμής ({{17} }.02 mL εκχύλισμα 0.980 mL νερό). Το διάλυμα επωάστηκε (37 βαθμούς για 5 λεπτά), και στη συνέχεια προστέθηκε 1 mL καζεΐνης 0,8 τοις εκατό (β/ο) και το μίγμα επωάστηκε περαιτέρω για 20 λεπτά. Στο τέλος της επώασης, προστέθηκαν 2 mL υπερχλωρικού οξέος 70% για να ολοκληρωθεί η αντίδραση. Το μίγμα φυγοκεντρήθηκε και η απορρόφηση του υπερκειμένου μετρήθηκε στα 210 nm έναντι του ρυθμιστικού διαλύματος ως τυφλό. Το ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η ποσοστιαία αναστολή της μετουσίωσης της πρωτεΐνης υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:

όπου Α1= απορρόφηση του δείγματος ελέγχου και Α2= απορρόφηση του δείγματος δοκιμής.

3.5.2. Αναστολή της δραστηριότητας της λιποξυγενάσης

Η ικανότητα των ληφθέντων εκχυλισμάτων να αναστέλλουν τη δράση της λιποξυγενάσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Sarvesvaran et al. 【89】. Αρχικά, 10 μL φυτικών εκχυλισμάτων σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (100, 250 και 500 ug/mL) αναμίχθηκαν σε 96-πηγαδάκι με 160 μL 100 mM PBS και 20 μL διαλύματος λιποξυγενάσης σόγιας (167 U/ mL）. Τα δείγματα επωάστηκαν στους 25 βαθμούς για 10 λεπτά και μετά από αυτό το διάστημα προστέθηκαν 10 μL λινολεϊκού οξέος νατρίου για να ξεκινήσει η αντίδραση. Στη συνέχεια, η απορρόφηση των δειγμάτων μετρήθηκε στα 234 nm σε μια περίοδο 3 λεπτών ανά λεπτό χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Η δικλοφενάκη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. Το ποσοστό της αναστολής της δραστηριότητας της λιποξυγενάσης υπολογίστηκε από την Εξίσωση (6):

όπου: Όπως είναι η απορρόφηση του δείγματος που δοκιμάστηκε, Ac είναι η απορρόφηση του αρνητικού ελέγχου.

Το τελικό αποτέλεσμα ήταν ο αριθμητικός μέσος όρος τριών ανεξάρτητων μετρήσεων.

3.6. Ανάλυση Κυτταροτοξικότητας

3.6.1. Κυτταρικής καλλιέργειας

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν δύο κυτταρικές σειρές δέρματος: φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (HaCaT) και ινοβλάστες (BJ). Τα HaCaT ελήφθησαν από την CLSCell Lines Service (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Γερμανία) και BJ από την American Type Culture Collection ( Manassas, VA, ΗΠΑ). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, USA) με πυροσταφυλικό νάτριο, L-γλουταμίνη και υψηλή περιεκτικότητα σε γλυκόζη (4,5 g/L). Το μέσο εμπλουτίστηκε επίσης με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco, Waltham, MA, ΗΠΑ) και 1 τοις εκατό με αντιβιοτικά (100 U/mL πενικιλλίνη και 1000 ug/mL στρεπτομυκίνη, Gibco) για την πρόληψη της μικροβιακής μόλυνσης. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε επωαστήρα στους 37 βαθμούς σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95 τοις εκατό αέρα και 5 τοις εκατό διοξειδίου του άνθρακα.

3.6.2.Δοκιμασία Alamar Blue

Αφού τα καλλιεργημένα κύτταρα (HaCaT και BJ) είχαν φτάσει στην επιθυμητή συρροή, το μέσο DMEM αναρροφήθηκε στις φιάλες καλλιέργειας. Τα συνδεδεμένα στον πυθμένα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με στείρο αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά. Η κυτταρική στιβάδα αποσπάστηκε με θρυψίνη και στη συνέχεια τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα φρέσκο ​​μέσο DMEM. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 96-πλάκες με επίπεδο πυθμένα φρεατίων (VWR, Radnor, PE, USA) και μετά την προσάρτηση στον πυθμένα των πλακών, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με εκχυλίσματα (100, 250 και 500 ug/mL). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες.

Η δοκιμή κυτταροτοξικότητας πραγματοποιήθηκε με τη δοκιμασία Alamar Blue (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, Ολλανδία). Μετά την επώαση, ένα διάλυμα ρεζαζουρίνης σε συγκέντρωση 60 μΜ προστέθηκε στα φρεάτια, στη συνέχεια οι πλάκες τοποθετήθηκαν σε επωαστήρα στους 37 βαθμούς για 2 ώρες. Μετά από αυτό το χρονικό διάστημα, ο φθορισμός έχει μετρηθεί (入=570nm). Κάθε συγκέντρωση εκχυλίσματος πραγματοποιήθηκε σε τρεις επαναλήψεις.

3.6.3. Δοκιμασία ουδέτερης πρόσληψης κόκκινου

Η δοκιμασία ουδέτερης πρόσληψης κόκκινου είναι η δεύτερη δοκιμή που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της κυτταροτοξικότητας των PRE, PGE, KTE, CTE και GGE. Αρχικά,96-παρασκευάστηκαν πλάκες με επίπεδο πυθμένα όπως περιγράφεται στην προηγούμενη ενότητα. Μετά από 24 ώρες έκθεσης των κυττάρων στα εκχυλίσματα, αυτά αναρροφήθηκαν και αντικαταστάθηκαν με ουδέτερη κόκκινη βαφή (40 μg/mL) και επωάστηκαν για 2 ώρες. Μετά από αυτό το χρόνο, τα κύτταρα πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά. Στο επόμενο βήμα, ρυθμιστικό αποχρωματισμού (150 μL) προστέθηκε στα φρεάτια. Στη συνέχεια, η πρόσληψη του ουδέτερου κόκκινου dve προσδιορίστηκε με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (OD) στα 540 nm. Κάθε συγκέντρωση εκχυλίσματος πραγματοποιήθηκε σε τρεις επαναλήψεις.

3.7. Προσδιορισμός του παράγοντα αντηλιακής προστασίας (In vitro)

Ο παράγοντας αντηλιακής προστασίας (SPF) προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης ενός υδατικού διαλύματος εκχυλισμάτων σε συγκεντρώσεις 10 ug/mL και 50 ug/mL, εντός του εύρους μήκους κύματος από 290 έως 320 nm σε διαστήματα 5-nm. Από τα ληφθέντα αποτελέσματα, ο SPF υπολογίστηκε από την Εξίσωση Mansur [90]: όπου∶ EE（λ）-φάσμα ερυθηματικής επίδρασης, I（入）-φάσμα ηλιακής έντασης, ABS（入）-απορρόφηση του αντηλιακού προϊόντος, CF- συντελεστής διόρθωσης (=10), E(N)×I(λ)—χρησιμοποιήθηκαν τιμές που καθορίστηκαν από τον Sayre [91].

3.8. Μετρήσεις διαεπιδερμικής απώλειας νερού (TEWL) και ενυδάτωσης δέρματος

Οι μετρήσεις TEWL και ενυδάτωσης του δέρματος διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ανιχνευτή TEWAmeter TM 300 και ανιχνευτή Corneometer CM 825 συνδεδεμένο σε προσαρμογέα MPA (Courage plus Khazaka Electronic, Köln, Γερμανία). Πέντε εθελοντές συμμετείχαν στη μελέτη. Στο αντιβράχιο τους δέρμα, σημειώθηκαν έξι περιοχές (μέγεθος 2 × 2 εκ.) Εφαρμόστηκε ποσότητα 0,2 mL των εξετασθέντων φυτικών εκχυλισμάτων σε πέντε σημεία, η έκτη θέση ήταν ο έλεγχος (δεν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κανένα δείγμα). Μετά από 60 και 360 λεπτά Έγιναν μετρήσεις επιπέδου ενυδάτωσης και TEWL.Το τελικό αποτέλεσμα ήταν ο αριθμητικός μέσος όρος (από κάθε εθελοντή) πέντε ανεξάρτητων μετρήσεων (ενυδάτωση δέρματος) και 20 μετρήσεων (TEWL).

3.9.Παρασκευή Μοντέλων Καλλυντικών (ντεμακιγιάζ) που περιέχουν εκχυλίσματα

Ετοιμάστηκε ένα μοντέλο καλλυντικού (ντεμακιγιάζ). Όλα τα εξαρτήματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν σύμφωνα με τις απαιτήσεις EcoCert και COSMOS. Το σκεύασμα φαίνεται στον Πίνακα 7.

Το προϊόν παρήχθη με ανάμιξη των συστατικών (από το στοιχείο 1 έως το στοιχείο 6) σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι να ληφθεί ένα ομοιογενές υγρό. Στο τελευταίο στάδιο, το ρΗ του σκευάσματος ρυθμίστηκε. Το ντεμακιγιάζ χωρίστηκε σε μερίδες. Ποσότητα 1 τοις εκατό των μητρικών διαλυμάτων του εκχυλίσματος προστέθηκε σε κάθε δόση και αναμίχθηκε επιμελώς.

3.10. Προσδιορισμός των χρωματικών παραμέτρων εκχυλισμάτων και καλλυντικών (ντεμακιγιάζ) που περιέχουν εκχυλίσματα

Δείγματα εκχυλισμάτων και καλλυντικών με εκχυλίσματα δοκιμάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου, 48 ώρες μετά την παρασκευή τους. Ένας CHROMA METER CR-400(Konica Minolta, Sensing Inc., Τόκιο, Ιαπωνία) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των παραμέτρων χρώματος (συντεταγμένες CIELAB). Το σύστημα CIELAB ορίστηκε από τη Διεθνή Επιτροπή για τον φωτισμό το 1978. Βασίζεται σε τρία χαρακτηριστικά χρώματος: L*, a*,b, όπου το L* είναι μια μεταβλητή φωτεινότητας ανάλογη με την τιμή στο σύστημα Munsell και a* και b* είναι χρωματικές συντεταγμένες. Οι συντεταγμένες a* και b* υποδεικνύουν θέσεις στους άξονες κόκκινο/πράσινο και κίτρινο/μπλε, αντίστοιχα ( συν ένα=κόκκινο, -a=πράσινο, συν b=κίτρινο, - b =μπλε).

Με βάση τα δεδομένα που ελήφθησαν: L*, a* και b*, υπολογίστηκαν οι ακόλουθες χρωματικές παράμετροι: chroma (C*) και hue (h). Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες εξισώσεις:

4. Συμπεράσματα

Με βάση τα ληφθέντα αποτελέσματα, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι τα ελεγμένα φυτικά εκχυλίσματα παρουσιάζουν αρκετά θετικά χαρακτηριστικά, χάρη στα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην παραγωγή καλλυντικών ως ασφαλές και βιοενεργό συστατικό τους. Έχει αποδειχθεί ότι αυτά τα φυτά είναι πλούσια πηγή πολυφαινολών, που τους προσδίδει αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Το PRE έδειξε την καλύτερη ικανότητα να καθαρίζει τις ελεύθερες ρίζες, κάτι που πιθανώς οφείλεται στο ότι περιέχει τις περισσότερες πολυφαινόλες σε σύγκριση με άλλα φυτά. Οι PGE και PRE έδειξαν την καλύτερη ικανότητα να μειώνουν την παραγωγή ROS στα κύτταρα. Επιπλέον, τα φυτά δεν παρουσιάζουν καμία κυτταροτοξική δράση. Όλα τα εκχυλίσματα που δοκιμάστηκαν έδειξαν ανασταλτική δράση στα ένζυμα ελαστάση και κολλαγενάση, με το P. granatum και το GGE να έχουν τη μεγαλύτερη ανασταλτική δράση. Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι αυτά τα φυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν στα καλλυντικά ως ουσίες που επιβραδύνουν τις διαδικασίες γήρανσης. Επιπλέον, τα ληφθέντα αποτελέσματα δείχνουν ότι αυτά τα φυτά έχουν αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες. Σε αυτή την περίπτωση, το CTE και το KTE φάνηκαν να είναι τα καλύτερα. Οι KTE και PGE έδειξαν προστατευτική δράση έναντι της υπεριώδους ακτινοβολίας, ακόμη και σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, όλα τα φυτά είχαν προστατευτική δράση στην υπεριώδη ακτινοβολία. Επιπλέον, τα φυτά είχαν θετική επίδραση στην ενυδάτωση του δέρματος και μειώνουν την διαεπιδερμική απώλεια νερού. Τα εκχυλίσματα PRE, KTE και CTE μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αποτελεσματικές χρωστικές σε καλλυντικά προϊόντα. Το μοντέλο υγρό ντεμακιγιάζ που περιέχει τα προαναφερθέντα εκχυλίσματα χαρακτηρίστηκε από έντονο και σταθερό χρώμα στο χρόνο. Το χρώμα των καλλυντικών με εκχυλίσματα PGE και GGE γίνεται αντιληπτό μόνο από έμπειρους παρατηρητές και δεν διαφέρουν σημαντικά από το τυφλό δείγμα καλλυντικών, χωρίς την προσθήκη του εκχυλίσματος. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα ληφθέντα αποτελέσματα, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι το Papaver rhoeas, η Clitoria ternatea και το Carthamus tinctorius μπορούν να χρησιμοποιηθούν επιτυχώς ως πηγές κίτρινων, πορτοκαλί, μπλε και μοβ χρωστικών στην παραγωγή καλλυντικών που θα είναι ασφαλή στη χρήση, και Επιπλέον, θα έχει θετική επίδραση στο δέρμα.

Αυτό το άρθρο εξάγεται από το Molecules 2022, 27, 922. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules