Ο αναστολέας της φαρνεσυλτρανσφεράσης LNK-754 εξασθενεί τη αξονική δυστροφία και μειώνει την παθολογία του αμυλοειδούς σε ποντίκια Μέρος 4

Το LNK-754 και το lonafarnib ενισχύουν την αξονική ενδολυσοσωμική διακίνηση σε καλλιεργημένους νευρώνες

Για να διερευνήσουμε τον μηχανισμό του LNK-754 για τη μείωση της συσσώρευσης των LAMP1, BACE1 και LT σε δυστροφικούς νευρίτες σε ποντικούς 5XFAD, πραγματοποιήσαμε in vitro μελέτες χρησιμοποιώντας πρωτεύοντες καλλιεργημένους νευρώνες σε ποντίκια άγριου τύπου. Αρχικά αξιολογήσαμε το πρότυπο κατανομής των ενδολυσοσωμικών οργανιδίων σε νευρώνες που έλαβαν θεραπεία με όχημα, LNK-754 ή lonafarnib με ομοεστιακή μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Στους νευρώνες που έλαβαν θεραπεία με όχημα, τα φθορίζοντα κυστίδια LAMP1 συγκεντρώθηκαν ως επί το πλείστον σε κυτταρικά σώματα και εγγύς νευρίτες, ενώ στους νευρώνες που έλαβαν θεραπεία με LNK-754 και λοναφαρνίμπη, τα κυστίδια LAMP1 αυξήθηκαν στις εγγύς και άπω νευρίτες σε σύγκριση με τους νευρώνες που έλαβαν θεραπεία με όχημα. Εικ. 6Α-ΣΤ).

Παρόμοια με τα in vivo αποτελέσματά μας και σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [9], αυξημένη ολική LAMP1 ήταν επίσης παρούσα σε καλλιέργειες που έλαβαν LNK-754 και lonafarnib (Εικ. 6F-H). Η θεραπεία με Lonafarnib αύξησε σημαντικά τη συνολική εντόπιση των LAMP1 και LAMP1 στους νευρίτες, ενώ παρατηρήθηκε μια τάση για τη θεραπεία με LNK-754 (Εικ.6D, F). Το LAMP1 σηματοδοτεί μη ειδικά διάφορα ενδοσωμικά και αυτοφαγικά κυστίδια, επομένως στη συνέχεια αναλύσαμε τον εντοπισμό και την οξίνιση όψιμων ενδοσωμάτων και λυσοσωμάτων σε καλλιέργειες ζωντανών νευρώνων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LysoSensor Green, μια φθορίζουσα χρωστική που εμφανίζει μια εξαρτώμενη από το pH αύξηση στην ένταση του φθορισμού στην ένταση του φθορισμού.

Ο νευρίτης είναι μια από τις σημαντικές λειτουργικές δομές των νευρικών κυττάρων, που μπορεί να μεταδώσει νευρικά σήματα και να επικοινωνήσει με άλλα κύτταρα. Στους νευρίτες, η LAMP1 είναι μια σημαντική μεμβρανική πρωτεΐνη που συμμετέχει στη διαδικασία μεταφοράς του συστήματος ενδοκυτταρικής μεμβράνης και συμμετέχει στην αυτοφαγία και το σχηματισμό κυστιδίων. Επιπλέον, η έρευνα δείχνει ότι το LAMP1 σχετίζεται επίσης στενά με την ανοσία.

Ορισμένες μελέτες έχουν βρει ότι το LAMP1 παίζει σημαντικό ρόλο σε ασθένειες όπως όγκοι, λοιμώξεις και φλεγμονές. Η έκφραση του LAMP1 σχετίζεται στενά με την εισβολή του όγκου, τη μετάσταση και την πρόγνωση. Ταυτόχρονα, το LAMP1 μπορεί επίσης να συμμετέχει στην ανοσολογική απόκριση του οργανισμού. Οι ερευνητές διαπίστωσαν ότι το LAMP1 μπορεί να προάγει την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και των φυσικών φονικών κυττάρων και να ενισχύσει την ικανότητα θανάτωσης τους. Επιπλέον, το LAMP1 μπορεί επίσης να προάγει την κάθαρση του σώματος από παθογόνους μικροοργανισμούς και να βελτιώσει την ανοσολογική απόκριση.

Επιπλέον, το LAMP1 σχετίζεται επίσης με την εμφάνιση ορισμένων αυτοάνοσων νοσημάτων. Για παράδειγμα, το επίπεδο έκφρασης του LAMP1 είναι σημαντικά αυξημένο σε αυτοάνοσα νοσήματα όπως ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος. Επιπλέον, οι ερευνητές διαπίστωσαν επίσης ότι ορισμένοι ασθενείς με αυτοάνοσα νοσήματα έχουν επίσης υψηλότερα επίπεδα αντισωμάτων αντι-LAMP1, γεγονός που δείχνει ότι το LAMP1 μπορεί να σχετίζεται με την εμφάνιση αυτοάνοσων αντιδράσεων.

Συνοψίζοντας, ο ρόλος του LAMP1 στους νευρίτες δεν περιορίζεται στη λειτουργία του νευρικού συστήματος αλλά περιλαμβάνει και την ανοσολογική απόκριση του οργανισμού. Αν και η έρευνα που σχετίζεται με το LAMP1 βρίσκεται ακόμη σε αρχικό στάδιο, μπορεί να γίνει νέος στόχος για την πρόληψη και τη θεραπεία ορισμένων ασθενειών στο μέλλον. Περαιτέρω έρευνα σχετικά με τη σχέση μεταξύ του LAMP1 και της ανοσίας θα προσφέρει νέες ιδέες και ευκαιρίες για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη μας. Το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να ρυθμίσει την ισορροπία των νευροδιαβιβαστών, όπως η αύξηση των επιπέδων της ακετυλοχολίνης και των αυξητικών παραγόντων. Αυτές οι ουσίες είναι πολύ σημαντικές για τη μνήμη και τη μάθηση. Επιπλέον, το κρέας μπορεί επίσης να βελτιώσει τη ροή του αίματος και να προωθήσει την παροχή οξυγόνου, η οποία μπορεί να εξασφαλίσει ότι ο εγκέφαλος λαμβάνει επαρκή θρεπτικά συστατικά και ενέργεια, βελτιώνοντας έτσι τη ζωτικότητα και την αντοχή του εγκεφάλου.

Κάντε κλικ στο Γνωρίζω για να βελτιώσετε τη βραχυπρόθεσμη μνήμη

Η ολική ένταση φθορισμού LysoSensor Green παρέμεινε αμετάβλητη στους νευρώνες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όχημα, LNK-754 ή lonafarnib (Εικ. 6I, J). Σε συμφωνία με τα ευρήματά μας για το LAMP1, ο εντοπισμός των κυστιδίων LysoSensor αυξήθηκε σε άπω νευρίτες καλλιεργειών LNK-754 ή λοναφαρνίμπης (Εικ. 6I, βέλη).

Ένα σημαντικό ποσοστό θετικών κυστιδίων LAMP1-εντοπίστηκε σε εγγύς και άπω νευρίτες σε νευρώνες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με FTI, υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της FTase επηρεάζει την κινητικότητα των ενδολυσοσωμικών οργανιδίων. Αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα της θεραπείας FTI στη δυναμική των όψιμων ενδοσωμάτων και λυσοσωμάτων με απεικόνιση χρονικής καθυστέρησης ζωντανών πρωτογενών νευρωνικών καλλιεργειών άγριου τύπου που χρωματίστηκαν με LT (Εικ. 7Α).

Η ανάλυση κυμογράφου των αξονικών κυστιδίων LT αποκάλυψε ότι, κάτω από όλες τις συνθήκες θεραπείας, τα περισσότερα αξονικά κυστίδια LT ήταν ακίνητα ή ταξίδευαν σε χαμηλή ταχύτητα, ανάδρομη κατεύθυνση (Εικ. 7Β). Ωστόσο, υπήρξε μια ισχυρή μετατόπιση στο ποσοστό των στάσιμων, ανάδρομων και πρόσθιων αξονικών κυστιδίων LT στους νευρώνες που έλαβαν LNK-754 και λοναφαρνίμπη. Το ποσοστό των ανάδρομων κυστιδίων LT σε νευρώνες που έλαβαν LNK-754 (36%) ή lonafarnib (36%) ήταν σημαντικά υψηλότερο από ό,τι στους νευρώνες που έλαβαν θεραπεία με όχημα (19%) ενώ το ποσοστό των στατικών LT κυστιδίων σε LNK{{7 }} (62%) ή οι νευρώνες που έλαβαν θεραπεία με lonafarnib (60%) ήταν χαμηλότεροι σε σύγκριση με τους νευρώνες που έλαβαν θεραπεία με όχημα (74%) (Εικ. 7C).

Παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στον αριθμό των κυστιδίων LT ανά μήκος άξονα σε νευρώνες που έλαβαν lonafarnib και παρατηρήθηκε τάση για θεραπεία LNK-754 (Εικ. 7D), όπως στην κατανομή του LAMP1 (Εικ. 6A-D ) και LysoSensor (Εικ. 6I, J). Η απόσταση που διανύθηκε από τα κυστίδια LT αυξήθηκε σημαντικά στους νευρώνες που έλαβαν LNK-754 και lonafarnib (Εικ. 7E, G) και η μέση ταχύτητα των κυστιδίων LT ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε LNK{{{{0} (0.17μm/s) και η λοναφαρνίμπη (0.18μm/s) οι νευρώνες που έλαβαν θεραπεία σε σχέση με τους νευρώνες που έλαβαν θεραπεία με όχημα (0,11μm/s) (Εικ. 7F, H· ταινία S1, S2, S3 ). Μαζί με τα αποτελέσματά μας από ποντίκια 5XFAD που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με FTI, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν το ρόλο της FTase στη ρύθμιση τόσο της δημιουργίας όσο και της κινητικότητας των νευραξόνων των όψιμων ενδοσωμάτων και λυσοσωμάτων.

Συζήτηση

Πολλές νευροεκφυλιστικές ασθένειες χαρακτηρίζονται από εξασθενημένα λυσοσωμικά συστήματα και τη συσσώρευση ειδικών για την ασθένεια συσσωματωμάτων πρωτεΐνης. Ιδιαίτερα οι εγκέφαλοι AD εμφανίζουν εκτεταμένη δυσλειτουργία λυσοσώματος και μπορούν να διακριθούν από άλλες νευροεκφυλιστικές ασθένειες από τη συσσώρευση αυτοφαγικών και ενδολυσοσωμικών οργανιδίων σε διευρυμένους δυστροφικούς νευρίτες που περιβάλλουν τις αμυλοειδείς πλάκες [54].

Οι FTI είναι ένας πολλά υποσχόμενος θεραπευτικός υποψήφιος για επαναχρησιμοποίηση προς τη θεραπεία νευροεκφυλιστικών ασθενειών που μοιράζονται τις παθολογίες της δυσλειτουργίας του λυσοσώματος και της συσσώρευσης πρωτεϊνών. Αυξάνοντας τη λυσοσωμική λειτουργία, οι FTI θα μπορούσαν να έχουν σημαντικά θεραπευτικά αποτελέσματα στους δυστροφικούς νευρίτες στον εγκέφαλο AD. Ωστόσο, μέχρι τώρα, ο αντίκτυπος των FTI στην παθολογία Α και τη αξονική δυστροφία δεν έχει ακόμη δοκιμαστεί in vivo.

Προσδιορίσαμε την επίδραση των FTIs LNK754 και της λοναφαρνίμπης που διεισδύουν στον εγκέφαλο στην παθολογία που σχετίζεται με την AD στο μοντέλο ποντικού 5XFAD και παρουσιάσαμε νέα δεδομένα που δείχνουν ότι η χρόνια θεραπεία ποντικών 5XFAD με LNK-754 μείωσε το φορτίο της αμυλοειδούς πλάκας και μείωσε τον σχηματισμό δυστροφικών νευριτών. Αν και δεν αποτελεί άμεση εστίαση αυτής της μελέτης, η θεραπεία με LNK-754 και lonafarnib μείωσε επίσης την υπερφωσφορυλίωση tau στους εγκεφάλους ποντικών 5XFAD. Σε αντίθεση με τα ευρήματά μας για το LNK-754, τα ποντίκια 5XFAD που έλαβαν θεραπεία με lonafarnib εμφάνισαν μόνο ελαφρές βελτιώσεις στη σχετική παθολογία της AD και, με συνέπεια, οι δείκτες αναστολής της FTase ήταν ως επί το πλείστον αμετάβλητοι στους εγκεφάλους των ποντικών lonafarnib.

Το LNK-754 και το lonafarnib ήταν και τα δύο αποτελεσματικά in vitro. ο αριθμός και η ταχύτητα της διακίνησης αξονικών ενδολυσοσωμικών οργανιδίων σε ανάδρομη κατεύθυνση αυξήθηκαν δραματικά σε ζωντανούς καλλιεργημένους πρωτεύοντες νευρώνες. Το LNK-754 και το lonafarnib αύξησαν επίσης τα επίπεδα του ενδολυσοσωμικού δείκτη LAMP1 σε καλλιέργειες πρωτογενών νευρώνων και στους εγκεφάλους ποντικών 5XFAD. Έτσι, η θεραπεία FTI διέγειρε την ενδολυσοσωμική βιογένεση και την ανάδρομη αξονική διακίνηση όψιμων ενδοσωμάτων και λυσοσωμάτων in vitro, η οποία μπορεί να έχει επιβραδύνει τον εκφυλισμό των νευραξόνων και ανέστειλε τον σχηματισμό δυστροφικών νευριτών και την εναπόθεση πλάκας σε ποντίκια 5XFAD. Συγκεκριμένα, το LNK-754 μείωσε τη συσσώρευση BACE1 σε δυστροφικούς νευρίτες και απέκλεισε την οδό τροφοδοσίας της αξονικής δυστροφίας, της γενιάς A 42 και της εναπόθεσης πλάκας. Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν με προηγούμενες αναφορές που υποδεικνύουν την FTase ως θεραπευτικό στόχο για τη θεραπεία πρωτεϊνοπαθειών και προτείνουν ότι οι FTI στοχεύουν δυστροφικούς νευρίτες ενισχύοντας τη λειτουργία των λυσοσωμάτων και προάγοντας τη διακίνηση ενδολυσοσωμάτων.

Συγκρίναμε FTI διεισδυτικά στον εγκέφαλο LNK-754 και lonafarnib επειδή και οι δύο είναι γνωστό ότι ενεργοποιούν τα λυσοσώματα και την αυτοφαγία σε μοντέλα πρωτεϊνοπαθειών ποντικών και έχουν διερευνηθεί κλινικά για θεραπεία καρκίνου [8, 9, 41, 55-57]. Το Lonafarnib είχε ιδιαίτερο ενδιαφέρον επειδή μειώνει σημαντικά τα εγκλείσματα tau [9], είναι εγκεκριμένο από τον FDA για τη θεραπεία της προγηρίας και έχει γνωστό προφίλ ασφάλειας και ανεπιθύμητων ενεργειών στους ανθρώπους [57]. Ωστόσο, διαπιστώσαμε ότι το LNK-754 ήταν πολύ πιο αποτελεσματικό από το lonafarnib στη βελτίωση της παθολογίας του AD του ποντικιού 5XFAD.

Η απόδειξη ότι τόσο το LNK{{0}} και το lonafarnib διασχίζουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό προέρχονται από κλινικές δοκιμές για τον καρκίνο σε ανθρώπους [41, 57], αλλά μια σύγκριση του LNK-754 και της αιματοεγκεφαλικής διαπερατότητας του lonafarnib σε Τα ποντίκια 5XFAD δεν έχουν ακόμη εκτελεστεί, επομένως είναι κατανοητό ότι το lonafarnib δεν διέσχισε τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό τόσο αποτελεσματικά όσο το LNK-754. Η απόκλιση μεταξύ LNK-754 και lonafarnib θα μπορούσε επίσης να οφείλεται σε διαφορές στην ισχύ του LNK-754 και της lonafarnib, καθώς το IC50 για την αναστολή του H-Ras είναι 0,57nM για το LNK-754 [41] και 1,9nM για τη λοναφαρνίμπη [51]. Ανιχνεύσαμε εύκολα αλλαγές σε γνωστούς δείκτες αναστολής FTase στους εγκεφάλους ποντικών 5XFAD που έλαβαν θεραπεία με LNK{{20}, αλλά όχι σε ποντίκια lonafarnib, υποστηρίζοντας την ιδέα ότι μπορεί να απαιτείται υψηλότερη δόση lonafarnib για να επιτευχθεί ένα θεραπευτικό αποτέλεσμα.

Οι υψηλές δόσεις FTI είναι απαραίτητες για τη μέγιστη καταστολή της φαρνεσυλίωσης του Ras καθώς και άλλων κανονικών πρωτεϊνών υποστρώματος CAAX FTase. Σε αυτή τη μελέτη ακολουθήθηκε ένα θεραπευτικό σχήμα χαμηλής δόσης (1 mg/kg/ημέρα), επειδή τα στοιχεία δείχνουν ότι οι χαμηλές δόσεις FTIs μπορούν να ενεργοποιήσουν μη κανονικά υποστρώματα πρωτεΐνης που εμπλέκονται στις οδούς κάθαρσης πρωτεΐνης [8, 28]. Επιπλέον, η θεραπεία χαμηλής δόσης σε ασθενείς μπορεί να αποφύγει τις παρενέργειες που παρατηρούνται τυπικά με υψηλά επίπεδα αναστολής Ras. Η θεραπεία με LNK-754 (0,9 mg/kg/ημέρα) μείωσε τη συνένωση στον εγκέφαλο διαγονιδιακών ποντικών με PD και αυξημένη λυσοσωμική δραστηριότητα πάνω από τα βασικά επίπεδα σε ποντίκια άγριου τύπου [8]. Αντίθετα, η διαλείπουσα θεραπεία του lonafarnib με καθετήρα από το στόμα σε δόση που ήταν σημαντικά υψηλότερη (80 mg/kg/ημέρα) ήταν απαραίτητη για την αναστολή της συσσώρευσης tau [9].

Ενδέχεται να απαιτείται υψηλότερη δόση λοναφαρνίμπης για την ενίσχυση τόσο της ενδολυσοσωμικής λειτουργίας όσο και της διακίνησης νευραξόνων, καθώς βρήκαμε αυξημένα επίπεδα LAMP1 στους εγκεφάλους ποντικών που έλαβαν lonafarnib αλλά ελάχιστες επιδράσεις στις δυστροφίες και το φορτίο της πλάκας. Δοκιμάσαμε μόνο μία δόση FTI και θα χρειαστούν περαιτέρω μελέτες για τον προσδιορισμό της δόσης και της οδού χορήγησης που απαιτούνται για την επίτευξη βέλτιστης μείωσης των παθολογιών Α και δυστροφικών νευριτών. Οι in vitro επιδράσεις του LNK-754 και της λοναφαρνίμπης ήταν συνεπείς, υποδηλώνοντας ότι η λοναφαρνίμπη θα δημιουργούσε παρόμοιους φαινότυπους σε ποντικούς 5XFAD εάν επιτυγχανόταν συγκρίσιμη δραστηριότητα αναστολέα στη FTase.

Είναι πιθανό ότι η έκθεση του φαρμάκου σε κυτταροκαλλιέργειες ήταν πιο παρόμοια για τις δύο ενώσεις, σε σύγκριση με το μοντέλο in vivo.

Εάν συνέβη συγκρίσιμη αναστολή FTase in vivo, μια άλλη πιθανότητα είναι ότι η LNK-754 και η λοναφαρνίμπη αλλοίωσαν το φαρνεσυλιωμένο πρωτεόμιο στον εγκέφαλο 5XFAD με διαφορετικούς τρόπους. Αυτό έχει παρατηρηθεί σε κυτταρικές σειρές λευχαιμίας, όπου αναφέρθηκαν σαφείς διαφορές στις φαρνεσυλιωμένες πρωτεΐνες μετά από θεραπεία με τα FTIs BMS241,662 και L-778,123 [24]. Επιπλέον, αυτή η μελέτη έδειξε μοναδικά μοτίβα φαρνεσυλίωσης σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές, υποδεικνύοντας ότι ένα συγκεκριμένο φαρνεσυλιωμένο πρωτεόμιο θα μπορούσε να υπάρχει σε κάθε κυτταρικό τύπο, το οποίο θα μπορούσε να επιδεινώσει μικρές διαφορές στην αναστολή φαρνεσυλίωσης πρωτεΐνης μεταξύ LNK-754 και lonafarnib. Επομένως, είναι πιθανό οι φαρνεσυλιωμένες πρωτεΐνες που αναστέλλονται ειδικά από το LNK754, αλλά όχι η λοναφαρνίμπη, να είναι υπεύθυνες για τη μεσολάβηση της μείωσης της πλάκας και της δυστροφίας.

Μια εναλλακτική πιθανότητα, αν και απίθανη [58], είναι ότι η αναστολή του στόχου της γερανυλο-γερανυλ τρανσφεράσης (GGTase) από LNK-754 ή lonafarnib θα μπορούσε να έχει οδηγήσει σε διαφορική αναστολή υποστρωμάτων που ρυθμίζονται από GGTase. Τέλος, οι οδοί πρενυλίωσης για υποστρώματα που εμπλέκονται στη μείωση της πλάκας θα μπορούσαν να ενεργοποιηθούν σε ποντίκια που έλαβαν lonafarnib αλλά όχι σε ποντίκια LNK-754. Είναι πιθανό ότι η ταυτόχρονη αναστολή πολλαπλών υποστρωμάτων από το LNK-754 οδήγησε σε μείωση της πλάκας σε ποντικούς 5XFAD και ορισμένα ή όλα αυτά τα υποστρώματα δεν ανεστάλησαν σε ποντίκια lonafarnib. Για τον εντοπισμό μηχανισμών φαρνεσυλιωμένων υποστρωμάτων στη ρύθμιση της ανάπτυξης και της σποράς της πλάκας, θα πρέπει να πραγματοποιηθούν μελλοντικά πειράματα για να προσδιοριστεί ποια υποστρώματα μειώνονται περισσότερο στις περιοχές του ιππόκαμπου και του φλοιού του εγκεφάλου και συσχετίζονται με μειωμένο φορτίο πλάκας και δυστροφίες στον εγκέφαλο του LNK-754 και ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με lonafarnib 5XFAD.

Παρατηρήθηκε μια τάση σε όλη τη χρόνια μελέτη μας, όπου βρέθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ του φορέα και του LNK-754 στον φλοιό και μεταξύ της lonafarnib και του LNK-754 στον ιππόκαμπο. Παρατηρήσαμε σημαντικές μειώσεις στις πλάκες και στις περιοχές δυστροφίας του φλοιού του εγκεφάλου μεταξύ ποντικών που έλαβαν θεραπεία με όχημα και LNK{-754, ενώ σημαντικές διαφορές μεταξύ LNK-754 και lonafarnib βρέθηκαν στον ιππόκαμπο. Η παθολογία του αμυλοειδούς ξεκινά από τους νευρώνες του φλοιού στο στρώμα 5 και είναι πιο σοβαρή σε αυτήν την περιοχή του εγκεφάλου [36], επομένως υποψιαζόμαστε ότι αυτό οφείλεται στον χαμηλό αριθμό πλακών στον ιππόκαμπο και στη μεταβλητότητα του φορτίου της πλάκας σε ποντίκια 5XFAD. Αναμένουμε ότι τα αποτελέσματά μας θα φτάσουν σε στατιστική σημασία μεταξύ του LNK754 και του φορέα για όλα τα αποτελέσματα αυξάνοντας τη διάρκεια της θεραπείας ή αξιολογώντας τα ποντίκια σε προχωρημένη ηλικία όταν θα μπορούσαν να βρεθούν περισσότερες πλάκες στον ιππόκαμπο. Ωστόσο, μπορεί να εμφανιστούν διακριτοί μηχανισμοί μεταξύ του ιππόκαμπου και του φλοιού σε ποντίκια που έλαβαν LNK-754-. Για παράδειγμα, διαφορές στα φυσιολογικά επίπεδα της FTase σε κύτταρα συγκεντρωμένα στον ιππόκαμπο σε σύγκριση με τον φλοιό ή διαφορική έκφραση των υποστρωμάτων FTase μπορεί να υπάρχουν μεταξύ του ιππόκαμπου και του φλοιού.

Για να διερευνήσουμε τον μηχανισμό του LNK-754 για τη μείωση της παθολογίας του αμυλοειδούς σε ποντίκια 5XFAD, εστιάσαμε τη μελέτη μας ειδικά στους δυστροφικούς νευρίτες. Οι δυστροφικοί νευρίτες περιέχουν υψηλά επίπεδα LAMP1 και BACE1 και συμβάλλουν σημαντικά στην εναπόθεση εξωκυτταρικής πλάκας και στη δυστροφία των νευραξόνων, με αποτέλεσμα την απώλεια συναπτικών, νευροεκφυλισμό και γνωστικά ελλείμματα [14, 16, 18]. Με την αξιολόγηση πολλαπλών δεικτών δυστροφικών νευριτών, συμπεριλαμβανομένων των LAMP1, BACE1 και LT, βρήκαμε ότι οι πλάκες ίδιου μεγέθους έχουν λιγότερες δυστροφίες σε ποντίκια LNK-754 σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με όχημα ή λοναφαρνίμπη. Παρατηρήθηκε μια μέτρια μείωση στην αναλογία LAMP1:A 42 ανά πλάκα σε σύγκριση με τις μεγαλύτερες μειώσεις άλλων δεικτών δυστροφικών νευριτών σε ποντίκια που έλαβαν LNK-754, πιθανώς επειδή ένα μέρος του LAMP1 που σχετίζεται με την πλάκα υπάρχει στη μικρογλοία [59 ].

Το LT συσσωρεύτηκε σε δυστροφίες γύρω από πλάκες σε ζωντανούς ιστούς εγκεφάλου ποντικού (Εικ. 4Α), δείχνοντας ότι όψιμα ενδοσώματα και λυσοσώματα με υψηλή οξύτητα υπάρχουν σε δυστροφικούς νευρίτες. Επιπλέον, δείξαμε ότι η θεραπεία με LNK-754 είχε δραματική επίδραση στη μείωση της αναλογίας LT: TR, σε σύγκριση με την αναλογία LAMP1:A 42. Με βάση τα ευρήματά μας με τη χρώση LT, υποθέτουμε ότι το υποσύνολο του LAMP 1-θετικά κυστίδια που μειώθηκαν σε ποντίκια που υποβλήθηκαν σε χρόνια θεραπεία με LNK-754 οξινίστηκαν όψιμα ενδοσώματα και λυσοσώματα.

Το πιο σημαντικό, το LNK-754 απέτρεψε την ανώμαλη συσσώρευση του BACE1 σε δυστροφίες. Η αναστολή της δραστηριότητας του BACE1 σε δυστροφικούς νευρίτες στα πρώιμα στάδια της εναπόθεσης Α καταστέλλει τον σχηματισμό νέων πλακών, αντί της ανάπτυξης της αρχικής πλάκας [18], επομένως ένας παρόμοιος μηχανισμός θα μπορούσε να συμβεί σε ποντίκια που έλαβαν LNK-754. Στο μοντέλο ποντικιού APP/PS1, οι δυστροφικοί νευρίτες εμφανίζονται σε οροπέδιο μετά τις πλάκες που φτάνουν σε ακτίνα 10μm, κάτι που μπορεί να εξηγηθεί από την πλήρη απώλεια άξονα εξισορροπημένη με τη δημιουργία δυστροφικών νευριτών [18]. Οι θετικές συσχετίσεις μεταξύ LAMP1 και επιβάρυνσης πλάκας μετά από χρόνια θεραπεία με LNK-754 και LT και μέγεθος πλάκας μετά από οξεία θεραπεία LNK-754, θα μπορούσαν να προκληθούν από μια αλλαγή στην ισορροπία απώλειας και δημιουργίας δυστροφίας, μια αύξηση στον αριθμό ή το μέγεθος των βιώσιμων αξόνων και των νευρώνων που περιβάλλουν τις πλάκες, ή μείωση της αφθονίας των μεγάλων πλακών.

Ένα βασικό εύρημα της μελέτης μας ήταν ότι το LNK-754 και το lonafarnib ενίσχυσαν δραματικά την ανάδρομη αξονική διακίνηση των ενδολυσοσωμικών διαμερισμάτων. Έχει αναφερθεί ότι οι FTI, συμπεριλαμβανομένης της λοναφαρνίμπης, αυξάνουν την ακετυλίωση της ΜΤ και τη σταθερότητα στις καρκινικές κυτταρικές σειρές [31, 32, 60]. Ως εκ τούτου, η ενισχυμένη διακίνηση ενδολυσοσωμικών διαμερισμάτων στη μελέτη μας δυνητικά μεσολάβησε μέσω υποστρωμάτων που ευθύνονται για τη σταθεροποιητική επίδραση της ΜΤ των FTI. Είναι ενδιαφέρον ότι μια συνεργική επίδραση μεταξύ των παραδοσιακών σταθεροποιητικών παραγόντων MT και των FTIs έχει τεκμηριωθεί καλά σε περιπτώσεις καρκίνου [32, 33, 61], γεγονός που εγείρει την ενδιαφέρουσα πιθανότητα ότι μια παρόμοια θεραπεία θα μπορούσε να αποτρέψει τον σχηματισμό δυστροφικών νευριτών στους εγκεφάλους AD. Τα πρόσθετα αποτελέσματα της ενίσχυσης της αποικοδομητικής ικανότητας των λυσοσωμάτων και της διακίνησης αυτών των διαμερισμάτων πιθανότατα προώθησαν τη στόχευση του BACE1 σε ώριμα λυσοσώματα για αποικοδόμηση.

Αξίζει να σημειωθεί ότι η οξεία θεραπεία με LNK-754 μείωσε τους δυστροφικούς νευρίτες σε ηλικιωμένους ποντικούς 5XFAD και βελτίωσε τη χωρική μάθηση και τη μνήμη σε ποντίκια hAPP/PS1. Αυτό υποστηρίζει τον διπλό ρόλο των FTI στη θεραπεία της AD, αναστέλλοντας τη γενιά Α και προστατεύοντας από δυστροφικούς νευρίτες και γνωστική έκπτωση μετά από προχωρημένη εναπόθεση πλάκας. Σύμφωνα με αυτό, η απλοανεπάρκεια της FTase ειδικά σε ποντίκια APP/PS1 διέσωσε τη γνωστική εξασθένηση, ενώ η ανεπάρκεια της FTase ή της GGTase μείωσε και τα δύο την εναπόθεση Α [62]. Επιπλέον, το επίπεδο φαρνεσυλίωσης έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει τη συναπτική πλαστικότητα και την πυκνότητα της σπονδυλικής στήλης σε φέτες ιππόκαμπου σε ποντίκια άγριου τύπου [63], επομένως οι φαρνεσυλιωμένες πρωτεΐνες μπορούν να αλλάξουν τη συναπτική πλαστικότητα και τη σταθερότητα των μικροσωληνίσκων και αυτά τα υποστρώματα θα μπορούσαν να λειτουργήσουν ανεξάρτητα από άλλα προνυλιωμένα υποστρώματα που επηρεάζουν εναπόθεση πλάκας.

Ενώ υποθέτουμε ότι τα φαρνεσυλιωμένα υποστρώματα που ρυθμίζουν τη σταθερότητα των μικροσωληνίσκων και τη λειτουργία του ενδολυοσώματος βελτιώνουν τους δυστροφικούς νευρίτες και τη συμπεριφορά διάσωσης στο ποντίκι APP/PS1, άλλοι μηχανισμοί είναι δυνατοί. Για παράδειγμα, το Rhes είναι μια μικρή GTPάση που υφίσταται φαρνεσυλίωση και είναι γνωστό ότι προκαλεί αυτοφαγία [64]. Το Rhes μεσολάβησε στη βελτίωση της συμπεριφοράς σε διαγονιδιακά ποντίκια tau μειώνοντας τα επίπεδα φωσφο-tau [9], και ομοίως το Rhes θα μπορούσε να είναι υπεύθυνο για τη βελτίωση της μνήμης στο ποντίκι hAPP/PS1 που έλαβε θεραπεία με LNK754 μειώνοντας τη φωσφορυλίωση tau (π.χ. p-tau ser404), όπως παρατηρήθηκε σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με LNK-754 5XFAD, ανεξάρτητα από τη βελτίωση του δυστροφικού νευρίτη.

Η Farneslyation είναι κρίσιμη για την καλή λειτουργία πολλαπλών φυσιολογικά σχετικών πρωτεϊνών που θα μπορούσαν να είναι υπεύθυνες για τη μεσολάβηση των ευεργετικών επιδράσεων που παρατηρήθηκαν στη μελέτη μας. Πάνω από 32 φαρνεσυλιωμένα υποστρώματα εντοπίστηκαν πρόσφατα μέσω μεταβολικής επισήμανσης σε μια ανθρώπινη ενδοθηλιακή κυτταρική σειρά [65] και σε μια άλλη πρόσφατη μελέτη, 11 φαρνεσυλιωμένες πρωτεΐνες εμπλουτίστηκαν σε ποντίκια FTase knockout ειδικά για τον πρόσθιο νευρώνα [63]. Μια κύρια οικογένεια πρωτεϊνών που επηρεάζονται σε νευρώνες του πρόσθιου εγκεφάλου από φαρνεσυλίωση είναι οι Ras GTPases [63], οι οποίες μεσολαβούν σε πολλές κυτταρικές λειτουργίες συμπεριλαμβανομένης της ενδοσωματικής διακίνησης. Οι πρωτεΐνες Ras εμπλέκονται στην παθογένεση της AD. σε μεταθανάτιους εγκεφαλικούς ιστούς ασθενών με AD και ήπια γνωστική εξασθένηση, η αυξημένη ενεργοποίηση της σηματοδοσίας Ras συσχετίζεται με την παθολογία του αμυλοειδούς και τα αυξημένα επίπεδα του κατάντη σηματοδοτικού μορίου του ERK [30].

Επιπλέον, το μέλος της οικογένειας Ras Rhes αναγνωρίστηκε ως στόχος της λοναφαρνίμπης για να ενεργοποιήσει τα λυσοσώματα και να μειώσει τα μεταλλαγμένα συσσωματώματα tau [9]. Η μεταγραφική νευρωνική FTase knockout σε ποντίκια APP/PS1 αναγνώρισε τη σηματοδότηση mTORC1 και την προώθηση της μη αμυλοειδογόνου επεξεργασίας ως τον κορυφαίο παράγοντα που συμβάλλει στις ευεργετικές επιδράσεις στη γνωστική λειτουργία και την παθολογία του αμυλοειδούς, πιθανώς μεσολαβούμενη μέσω μείωσης της σηματοδότησης Ras ή Rheb [30]. Οι αλλαγές στη δραστηριότητα Rhes ή Rheb θα μπορούσαν να μειώσουν την επιβάρυνση A σε ποντίκια 5XFAD, αν και είναι απίθανο το Ras να απενεργοποιήθηκε πλήρως στις συγκεντρώσεις LNK-754 και lonafarnib που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτήν τη μελέτη. Αρκετά μη κανονικά υποστρώματα μη Ras FTase θα μπορούσαν να μεσολαβήσουν στις παρατηρούμενες επιδράσεις. Για παράδειγμα, η πρωτεΐνη SNARE ykt6 ενισχύει τη διακίνηση λυσοσωμικών υδρολασών και θα μπορούσε να προάγει τη λυσοσωμική λειτουργία [8]. Ένα άμεσο φαινόμενο FTase θα μπορούσε επίσης να είναι υπεύθυνο, καθώς η FTase μπορεί να δεσμεύσει απευθείας τους μικροσωληνίσκους και να επηρεάσει τη δραστηριότητα της αποακετυλάσης ιστόνης HDAC6, αποτρέποντας έτσι την αποακετυλίωση της τουμπουλίνης [33].

συμπεράσματα

Η ανοδική ρύθμιση της σηματοδότησης της FTase και η πρωτεϊνική φαρνεσυλίωση φαίνεται να είναι ένα πρώιμο συμβάν έναρξης στην παθογένεση της AD [30]. Σε αυτή τη μελέτη, ακολουθούμε μια φαρμακολογική προσέγγιση για την αναστολή της FTase in vivo στο μοντέλο ποντικού 5XFAD. Σε μοντέλα συνουκλεϊνοπαθειών και ταυοπαθειών ποντικών, τα τοξικά πρωτεϊνικά συσσωματώματα καθαρίστηκαν απευθείας με ενισχυμένη λυσοσωμική αποικοδόμηση που προκλήθηκε από τη θεραπεία FTI [8, 9]. Αντίθετα, υποθέτουμε ότι η γενιά A αναστέλλεται μέσω ενός έμμεσου μηχανισμού όπου η ενίσχυση της διακίνησης νευραξόνων ανέστειλε τον σχηματισμό δυστροφικών νευριτών και την αύξηση του BACE1. Μετά την έναρξη της παθολογίας της πλάκας, η βραχυπρόθεσμη θεραπεία με LNK-754 μείωσε τους δυστροφικούς νευρίτες σε ποντίκια 5XFAD και βελτίωσε τις συμπεριφορές μνήμης και χωρικής μάθησης σε ποντίκια hAPP/PS1.

Τα αποτελέσματά μας παρέχουν μια μελέτη απόδειξης της ιδέας για τη χρήση των FTI για την πρόληψη της συσσώρευσης A και προσθέτουν στο σημαντικό έργο που έχει αποδείξει ότι η γενετική καταστροφή της FTase βελτιώνει την παθολογία του αμυλοειδούς και διασώζει τη γνωστική λειτουργία σε μοντέλα ποντικών AD [30, 62, 66 ]. Τα συγκεκριμένα υποστρώματα FTase και τα κατάντη μονοπάτια που είναι υπεύθυνα για τους φαινοτύπους που παρατηρήθηκαν στη μελέτη μας θα πρέπει να διευκρινιστούν περαιτέρω σε μελλοντικές μελέτες. Η μείωση της συσσώρευσης BACE1 σε δυστροφικούς νευρίτες με θεραπεία FTI μπορεί να επιβραδύνει την εναπόθεση του A 42 ενώ προσφέρει μια θεραπευτική στρατηγική που αποφεύγει τις παρενέργειες εκτός στόχου που εμφανίζονται συνήθως όταν χρησιμοποιούνται αναστολείς BACE1 [67, 68]. Επιπλέον, η μείωση του φορτίου της αμυλοειδούς πλάκας στον εγκέφαλο πιθανότατα θα προβλέψει το κλινικό όφελος των ασθενών με AD [67] και ως εκ τούτου, οι FTI θα μπορούσαν να έχουν σημαντικές θεραπευτικές επιπτώσεις για την AD.

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τους D. Kirchenbuechler, P. Dluhy και C. Arvanitis του Κέντρου Προηγμένης Μικροσκοπίας στο Northwestern University για τις συμβουλές ειδικών σχετικά με τον ποσοτικό προσδιορισμό των εικόνων ανοσοφθορισμού και τις χρήσιμες συζητήσεις και τη χρηματοδότηση από το NIH R01 AG030142. Τέλος, ευχαριστούμε τον S. Kemal και τον J. Popovic του εργαστηρίου Vassar για την τεχνογνωσία και τη βοήθειά τους με πειράματα ζωντανής απεικόνισης και αιμάτωση ποντικών, αντίστοιχα.

Στοιχεία συγγραφέα

The Ken and Ruth Davee Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Chicago, IL 60611, USA. 2 BioEnergetics, Βοστώνη, MA 02115, Η.Π.Α. 3 Bial Biotech, Cambridge, MA 02139, Η.Π.Α. 4 Τμήμα Νευρολογίας, Ιατρική Σχολή Χάρβαρντ, Κέιμπριτζ, MA 02139, Η.Π.Α. 5 Mesulam Center for Cognitive Neurology and Alzheimer's Disease, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Σικάγο, IL 60611, ΗΠΑ.

βιβλιογραφικές αναφορές

1. Hardy J, Allsop D. Εναπόθεση αμυλοειδούς ως το κεντρικό γεγονός στην αιτιολογία της νόσου του Alzheimer. Trends Pharmacol Sci. 1991, 12(10):383–8.

2. Hardy J, Selkoe DJ. Η υπόθεση του αμυλοειδούς της νόσου του Αλτσχάιμερ: πρόοδος και προβλήματα στο δρόμο προς τη θεραπεία. Επιστήμη. 2002;297(5580):353–6.

3. Selkoe DJ. Η μοριακή παθολογία της νόσου του Alzheimer. Νευρώνας. 1991; 6(4):487-98.

4. Liu PP, Xie Y, Meng XY, Kang JS. Ιστορικό και πρόοδος υποθέσεων και κλινικών δοκιμών για τη νόσο του Αλτσχάιμερ. Στόχος μεταδόσεως σήματος Ther. 2019; 4:29.

5. Sevigny J, Chiao Ρ, Bussière Τ, Weinreb ΡΗ, Williams L, Maier Μ, et αϊ. Το αντίσωμα aducanumab μειώνει τις πλάκες Α στη νόσο του Αλτσχάιμερ. Φύση. 2016;537(7618):50–6.

6. Cuddy LK, Prokopenko D, Cunningham EP, Brimberry R, ​​Song P, Kirchner R, et al. Ένας -επιταχυνόμενος νευροεκφυλισμός που προκαλείται από σχετιζόμενο με το Αλτσχάιμερ. Sci Transl Med. 2020;12(563):eaaz2541.

7. Cummings J, Lee G, Ritter A, Sabbagh M, Zhong K. Σειρά ανάπτυξης φαρμάκων για τη νόσο Alzheimer: 2020. Dement Alzheimer (NY). 2020; 6(1): e12050.

8. Cuddy LK, Wani WY, Morella ML, Pitcairn C, Tsutsumi K, Fredriksen K, et al. Η επαγόμενη από το στρες κυτταρική κάθαρση μεσολαβείται από την πρωτεΐνη SNARE ykt6 και διαταράσσεται από -Συνουκλεΐνη. Νευρώνας. 2019;104(5):869–84.e11.

9. Hernandez I, Luna G, Rauch JN, Reis SA, Giroux M, Karch CM, et al. Ένας αναστολέας της φαρνεσυλτρανσφεράσης ενεργοποιεί τα λυσοσώματα και μειώνει την παθολογία tau σε ποντίκια με ταυοπάθεια. Sci Transl Med. 2019;11(485):eaat3005.

10. Mazzulli JR, Zunke F, Tsunemi T, Toker NJ, Jeon S, Burbulla LF, et al. Η ενεργοποίηση της -Γλυκοκερεβροσιδάσης μειώνει την παθολογική -Συνουκλεΐνη και αποκαθιστά τη λυσοσωμική λειτουργία στους νευρώνες του μεσεγκεφάλου ασθενών με Πάρκινσον. J Neurosci. 2016;36(29):7693–706.

11. Nixon RA. Ο ρόλος της αυτοφαγίας στη νευροεκφυλιστική νόσο. Nat Med. 2013; 19(8):983–97. 12. Bonam SR, Wang F, Muller S. Λυσοσώματα ως θεραπευτικός στόχος. Nat Rev Drug Discov. 2019; 18 (12): 923–48.

For more information:1950477648nn@gmail.com