Ο αναστολέας της φαρνεσυλτρανσφεράσης LNK-754 εξασθενεί τη αξονική δυστροφία και μειώνει την παθολογία του αμυλοειδούς σε ποντίκια Μέρος 2

Ζωντανή απεικόνιση νευρώνων

Για πειράματα ζωντανής απεικόνισης, οι νευρώνες παρασκευάστηκαν όπως παραπάνω και επιστρώθηκαν σε γυάλινα τρυβλία 35 mm (MatTek # P35G-1.5-14C) για 7 ημέρες σε καλλιέργεια. Στη συνέχεια προστέθηκε 10 ηΜ LNK-754 ή λοναφαρνίμπη σε ρυθμισμένα μέσα, οι καλλιέργειες ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ως φορέα. Μετά από 48 ώρες θεραπείας, τα μέσα αντικαταστάθηκαν με ρυθμισμένα μέσα από μη επεξεργασμένα παράλληλες πλάκες νευρώνων. 25nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) προστέθηκαν στα ρυθμισμένα μέσα και οι νευρώνες επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 βαθμούς.

Οι νευρώνες είναι ένα σημαντικό μέρος του νευρικού συστήματος, ικανοί να λαμβάνουν, να επεξεργάζονται και να μεταδίδουν πληροφορίες και αποτελούν την υλική βάση της ανθρώπινης νοημοσύνης και συμπεριφοράς. Η ανοσία είναι μια σημαντική εγγύηση για το ανθρώπινο σώμα να αντισταθεί στις ασθένειες. Μπορεί να εντοπίσει και να καταστρέψει παθογόνα και μη φυσιολογικά κύτταρα και να διατηρήσει την υγεία του σώματος.

Η έρευνα δείχνει ότι υπάρχει μια ισχυρή σύνδεση μεταξύ των νευρώνων και του ανοσοποιητικού συστήματος. Οι νευρώνες μπορούν να επηρεάσουν το ανοσοποιητικό σύστημα απελευθερώνοντας μια ποικιλία νευροδιαβιβαστών, όπως νορεπινεφρίνη, επινεφρίνη, κ.λπ. Αυτοί οι νευροδιαβιβαστές μπορούν να αλλάξουν τη δραστηριότητα των κυττάρων του ανοσοποιητικού, να ενισχύσουν τον πολλαπλασιασμό και τη λειτουργία των ανοσοκυττάρων και να βελτιώσουν την ανοσία του σώματος. Ταυτόχρονα, το ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί επίσης να επηρεάσει τη λειτουργία των νευρώνων μέσω διαφόρων οδών. Τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος μπορούν να εκκρίνουν μια ποικιλία κυτοκινών και ορμονών, επηρεάζοντας την ανάπτυξη, την ανάπτυξη και τη λειτουργία των νευρώνων μέσω των οδών του ανοσοποιητικού.

Επιπλέον, ψυχολογικοί και κοινωνικοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν την ανοσία και τη νευρωνική λειτουργία. Αρνητικά συναισθήματα όπως το στρες, το άγχος και η κατάθλιψη μπορούν να επηρεάσουν αρνητικά το ανοσοποιητικό σύστημα και τους νευρώνες, μειώνοντας την ανοσία του σώματος. Τα θετικά συναισθήματα, οι θετικές κοινωνικές σχέσεις και ο υγιεινός τρόπος ζωής μπορούν να προωθήσουν την υγιή ανάπτυξη της ανοσίας και των νευρώνων.

Συνοψίζοντας, υπάρχει μια διαδραστική και αμοιβαία υποστηρικτική σχέση μεταξύ των νευρώνων και της ανοσίας. Η διατήρηση της ψυχικής υγείας, η θετική αντιμετώπιση της ζωής και η υιοθέτηση καλών συνηθειών διαβίωσης μπορούν να προωθήσουν την ανοσία του σώματος και την υγιή ανάπτυξη των νευρώνων. Μπορεί να φανεί ότι πρέπει να βελτιώσουμε τη μνήμη μας. Το Cistanche deserticola μπορεί να βελτιώσει σημαντικά τη μνήμη, επειδή το Cistanche deserticola μπορεί επίσης να ρυθμίσει την ισορροπία των νευροδιαβιβαστών, όπως η αύξηση των επιπέδων της ακετυλοχολίνης και των αυξητικών παραγόντων. Αυτές οι ουσίες είναι πολύ σημαντικές για τη μνήμη και τη μάθηση. Επιπλέον, το κρέας μπορεί επίσης να βελτιώσει τη ροή του αίματος και να προωθήσει την παροχή οξυγόνου, η οποία μπορεί να εξασφαλίσει ότι ο εγκέφαλος λαμβάνει επαρκή θρεπτικά συστατικά και ενέργεια, βελτιώνοντας έτσι τη ζωτικότητα και την αντοχή του εγκεφάλου.

Κάντε κλικ στο Μάθετε τρόπους για να βελτιώσετε τη λειτουργία του εγκεφάλου

Η απεικόνιση με χρονική καθυστέρηση των νευρώνων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο ευρέως πεδίου Ti2. Η απεικόνιση ξεκίνησε αμέσως στα 30 λεπτά και συνεχίστηκε για όχι περισσότερο από 30 λεπτά. Οι εκθέσεις 1- λαμβάνονταν κάθε λεπτό και 20–30 ξεχωριστές περιοχές ανά πιάτο απεικονίστηκαν μέσα σε 30 λεπτά. Οι ποσοτικοποιήσεις απόστασης και ταχύτητας των σωματιδίων LysoTracker και οι αναλύσεις κυμογράφου πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό NIS Elements και περιγράφονται λεπτομερώς παρακάτω. Σε ξεχωριστά πειράματα, 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) προστέθηκε σε ρυθμισμένα μέσα και λήφθηκαν εικόνες ζωντανών νευρώνων για όχι περισσότερο από 15 λεπτά χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο Nikon A1 με αντικειμενικό φακό 60X (NA 1.4) και λογισμικό NIS Elements.

Ζωντανή απεικόνιση εγκεφαλικών ιστών

Σε {{0}}ποντίκια μηνών 5XFAD εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκά καθημερινά για 3 εβδομάδες και μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας, τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν και εγχύθηκαν με διάλυμα που περιείχε 1M KCl, 1M MgCl2, 0.1mM κυνουρενικό , 0,01 mM DL-2-Αμινο-5-φωσφονοπεντανοϊκό οξύ, 5 mM γλουταθειόνη, 25 mM γλυκόζη, 125 mM NaCl, 1,4 mM NaH2PO4 και 25 mM NaHCO3.

Στη συνέχεια, οι εγκέφαλοι ανατέμνονταν γρήγορα σε παγωμένο οξυγονωμένο ACSF που περιείχε 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, {{10}}.5 mM CaCl2, 4 mM 5 mM 2cro, 4 mM 2cro, 4 mM 50uM C6H7NaO6, 0.1 mM κυνουρενικό, 0.01 mM DL-2-Αμινο-5-φωσφονοπεντανοϊκό οξύ και 5 mM γλουταθειόνη. Ελήφθησαν φέτες στεφανιαίου μήκους 300 μm χρησιμοποιώντας δονούμενο μικροτόμο Compresstome VF{-200 (Εργαλεία Ακριβείας) και αφέθηκαν να ηρεμήσουν για 30 λεπτά για ανάκτηση στους 32 βαθμούς σε οξυγονωμένο διάλυμα ACSF που περιέχει τα ακόλουθα 2,5 mM KCl, 85 mM Na254, 1 Na25H1. 25 mM NaHC03, 0,5 mM CaCl2, 4 mM 4 MgCl2, 75 mM σακχαρόζη, 25 mM γλυκόζη, 50 uM C6H7NaO6, 0,1 mM κυνουρενικό, 0,01 mM DL{58}}5}αμινο-εντανοφωμο{58}}αμινο-5ο-μινοφωμο

Στη συνέχεια, οι φέτες μεταφέρθηκαν σε γυάλινα πιάτα 35 mm (MatTek # P35G-1.5-14C) που περιέχουν οξυγονωμένο ACSF με 25nM LysoTracker-Green και αραίωση 1:10,000 1 mg/ mL Tiazine Red (#S570435, Sigma Aldrich) που κατά τα άλλα ήταν πανομοιότυπο με το ACSF που χρησιμοποιήθηκε κατά την περίοδο ανάρρωσης. Η βιωσιμότητα της τομής επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας απεικόνιση ιστών με χρονική καθυστέρηση. Οι φέτες επωάστηκαν με LysoTracker-Green και Tiazine Red για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια οι περιοχές του φλοιού του εγκεφάλου απεικονίστηκαν αμέσως στο ίδιο διάλυμα στις 32 μοίρες σε ομοεστιακό μικροσκόπιο Nikon A1 με αντικειμενικό φακό 60X (NA 1.4) και λογισμικό NIS Elements για όχι περισσότερο από 30 λεπτά.

Εξαγωγή εγκεφάλου και ανοσοστύπωση

Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση ξυλαζίνης (15 mg/kg) και κεταμίνης (100mg/kg), διαχυθείσα με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (1XPBS) με φαινυλομεθυλσουλφονυλοφθορίδιο (20 μg/ml), λευπεπτίνη (0,5 μg/ml), ορθοβαναδικό νάτριο (20 μΜ) και διθειοθρεϊτόλη (0,1 mM), ακολουθούμενα από αφαίρεση εγκεφάλου. Όλα τα ρυθμιστικά διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση πρωτεΐνης περιείχαν κοκτέιλ III αναστολέα πρωτεάσης (#535140, Millipore) και αναστολέα φωσφατάσης Halt (#78420, Thermo Fisher Scientific). Οι ιστοί του ημιεγκεφάλου ζυγίστηκαν και ομογενοποιήθηκαν χειροκίνητα χρησιμοποιώντας ομογενοποιητή dounce 1:10 (β/ο) σε 1XPBS.

Μετά την ομογενοποίηση, τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στα 20,8{{1{0}}0 g για 30 λεπτά στους 4 βαθμούς. Το διαλυτό κλάσμα (υπερκείμενο) αφαιρέθηκε και το ίζημα επαναιωρήθηκε με σιφώνιο σε ρυθμιστικό προσδιορισμού ραδιοανοσοκαθίζησης (RIPA) [50 mM Tris, 0,15Μ NaCl, 1% οκτυλφαινοξυπολυαιθοξυαιθανόλη (IGEPAL), 1 mM 5.50,1% EDTA, 1 mM EDTA, 1% και EGTA. % δεοξυχολικό νάτριο σε pH8] για επώαση σε πάγο για 30 λεπτά.

Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπερήχους (Misonix XL{{0}}) για 20 δευτερόλεπτα σε πάγο και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 20.800 g για 30 λεπτά στους 4 βαθμούς. Το διαλυτό σε RIPA κλάσμα (υπερκείμενο) απομακρύνθηκε και το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 5Μ γουανιδίνη (ρΗ 8,0) για ανάλυση αδιάλυτων πρωτεϊνών. Κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε υπερήχους για 20 δευτερόλεπτα στον πάγο, περιστράφηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 20.800 g για 30 λεπτά στους 4 βαθμούς. Η δοκιμασία δικινχονικού οξέος (BCA) (#23225, Thermo Fisher Scientific) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης κάθε δείγματος.

Για στυπώματα western, 20 ug πρωτεΐνης κάθε δείγματος φορτώθηκαν σε πηκτώματα 4–12% NuPAGE (Invitrogen) και διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα MOPS υπό μειωμένες και μετουσιωμένες συνθήκες. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου και αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας Pierce ECL (ενισχυμένη χημειοφωταύγεια, Thermo Fisher Scientific). Τα σήματα που αναπτύχθηκαν οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ProteinSimple FCR (FluorChem R) και τα επόμενα σήματα χημειοφωταύγειας ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό AlphaView (ProteinSimple). Όλες οι κηλίδες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο τοπικής διόρθωσης φόντου εκτός από το στύπωμα HDJ-2, το οποίο αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το εργαλείο Σύνδεσης φόντου σε συνδυασμό με τη διόρθωση φόντου πολλαπλών περιοχών (λογισμικό AlphaView).

A 42 ELISA

Για τη μέτρηση του A 42 σε ομογενοποιήματα ημιεγκεφάλου από ποντίκια 5XFAD, χρησιμοποιήθηκε μια εμπορικά διαθέσιμη Enzyme- LinkedImmunosorbent-Assay (ELISA) (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή για την ανάλυση της γουανιδίνης και του PBS-διαλυτού A 42 σε ημιεγκέφαλο. Για τη μέτρηση του A 42 στους εγκεφάλους ποντικών hAPP/PS1, χρησιμοποιήθηκε μια εμπορικά διαθέσιμη ELISA (h amyloid 42 ELISA high sensitive, Te Genetics Company, Ζυρίχη, Ελβετία). Η ELISA πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Ανοσοφθορισμός εγκεφαλικού ιστού ποντικού

Μετά την έγχυση, οι εγκέφαλοι εκχυλίστηκαν και οι ημιεγκέφαλοι σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη 10, ακολουθούμενη από κρυοσυντήρηση σε διάλυμα σακχαρόζης 30% σε 1XPBS. Ένας παγωμένος ολισθαίνοντας μικροτόμος χρησιμοποιήθηκε για τη συλλογή 30-μm στεφανιαίων ή οβελιαίων τομών. Οι τομές τοποθετήθηκαν σειριακά σε μια πλάκα 12-πηγαδιού σε ένα κρυοπροστατευτικό διάλυμα (1xPBS, 30% σακχαρόζη και 30% αιθυλενογλυκόλη) και αποθηκεύτηκαν στους -20 βαθμούς μέχρι τη χρήση. Η χρώση με ανοσοφθορισμό διεξήχθη πρώτα με πλύσιμο τμημάτων τρεις φορές σε 1XTBS και στη συνέχεια επώαση τμημάτων σε γλυκίνη 16 mM σε 1XTBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από 3 επιπλέον πλύσεις σε 1XTBS, οι τομές μπλοκαρίστηκαν σε ορό κατσίκας 5% σε 0,25% Triton X-100 σε 1XTBS για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου.

Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύχτα σε πρωτογενή αντισώματα σε ένα διάλυμα από 0.25% Triton X-100, 1% αλβουμίνη ορού βοοειδών και 1XTBS στους 4 βαθμούς. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε δευτερογενής ανοσοχρώση με δευτερεύοντα αντισώματα επισημασμένα με AlexaFluor γαϊδουριού σε συγκέντρωση 1:1000 (Thermo Fisher Scientific). Το ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) χρησιμοποιήθηκε για τη συναρμολόγηση τμημάτων προτού απεικονιστούν σε μικροσκόπιο ευρέως πεδίου Ti2 ή σε ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ Nikon A1 για ποσοτικοποίηση εικόνας χρησιμοποιώντας το λογισμικό Nikon NIS Elements για λήψη.

Όλες οι ρυθμίσεις λήψης παρέμειναν οι ίδιες μεταξύ των γονοτύπων και όλες οι εικόνες λήφθηκαν εντός της ίδιας περιόδου απεικόνισης για μεμονωμένα πειράματα (Πανεπιστημιακό Κέντρο Προηγμένης Μικροσκοπίας Northwestern και Κέντρο Απεικόνισης Nikon).

Ποσοτικοποίηση εικόνας

Εγκέφαλοι ποντικιών

Η ποσοτικοποίηση ανοσοφθορισμού της ανοσοχρώσης ιστού εγκεφάλου ποντικού πραγματοποιήθηκε σε 3-5 τομές ανά ζώο, από συντεταγμένες Bregma περίπου -0.94 έως -2,55 mm, οι οποίες απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν αντικειμενικό φακό 10X σε μικροσκόπιο ευρέως πεδίου Ti2. Πραγματοποιήθηκαν ποσοτικές αναλύσεις, συμπεριλαμβανομένων των ορίων μεγέθους και έντασης, χρησιμοποιώντας το λογισμικό Nikon NIS-Elements (Northwestern University Nikon Imaging Center).

Ανάλογα με το σήμα, ορίστηκαν κατώφλια χρησιμοποιώντας το εργαλείο Γενικής Ανάλυσης με βάση το μέγεθος, το σχήμα και την αντίθεση του αντικειμένου και στη συνέχεια δημιουργήθηκαν δυαδικές μάσκες για κάθε κανάλι και περιοχή ενδιαφέροντος. Ο καθορισμός κατωφλίου πραγματοποιήθηκε χωριστά σε κάθε κανάλι για την απομόνωση σημάτων ενδιαφέροντος βελτιστοποιώντας την αναλογία σήματος προς θόρυβο και εξαλείφοντας τα μη ειδικά σήματα φόντου. Για τον υπολογισμό της καλυμμένης περιοχής LAMP1, BACE1 ή LysoTracker-Green, καθώς και των μετρήσεων έντασης φθορισμού LAMP1 και Lysosensor σε πρωτεύοντες νευρώνες, οι περιοχές ενδιαφέροντος ανιχνεύθηκαν χειροκίνητα χρησιμοποιώντας NIS-Elements και δημιουργήθηκε ένα δυαδικό στρώμα για κάθε περιοχή ενδιαφέροντος.

Για να υπολογιστεί η αναλογία LAMP1 προς A 42, η περιοχή της LAMP1 στους δυστροφικούς νευρίτες κανονικοποιήθηκε στην περιοχή της A 42 σε μεμονωμένη βάση πλάκας και οι μέσες αναλογίες ανά ποντίκι μεταξύ των ομάδων θεραπείας ποσοτικοποιήθηκαν. Η ανάλυση του συντελεστή συσχέτισης του Pearson για το BACE1 και το LAMP1 πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας στοιχεία NIS σε βάση ανά πλάκα σε προβολές μέγιστης έντασης εικόνων στοίβας Z 30μm που ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ Nikon A1 με μέγεθος βήματος 1μm.

Για να υπολογιστεί η αναλογία του LysoTrackerGreen προς το κόκκινο της τιαζίνης, η περιοχή του LysoTracker-Green στους δυστροφικούς νευρίτες κανονικοποιήθηκε στην περιοχή του Tiazine Red σε μεμονωμένη βάση πλάκας και η μέση αναλογία ανά ποντίκι προσδιορίστηκε ποσοτικά μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Τέσσερις στεφανιαίες τομές από συντεταγμένες Bregma περίπου -1,70 έως -2,55 mm χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της περιοχής ή της έντασης κάθε σήματος σε κάθε αντίστοιχη περιοχή του εγκεφάλου για κάθε ποντίκι. Η ανάλυση της περιοχής που καλύπτεται από πλάκα και του μεγέθους της πλάκας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον μέσο όρο πέντε τμημάτων ανά ποντίκι από συντεταγμένες Bregma περίπου -0,94 έως -2,55 mm. Η επιλογή τομής, η απόκτηση εικόνας, η ανίχνευση εικόνας και οι ποσοτικοποιήσεις πραγματοποιήθηκαν από ένα άτομο τυφλωμένο σε ομάδες θεραπείας και γονότυπους.

Πρωτογενείς νευρώνες

Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ανοσοχρώσης LAMP1 σε σταθερούς πρωτεύοντες νευρώνες ποντικού, τα σώματα ανιχνεύθηκαν χειροκίνητα με βάση τη μορφολογία χρησιμοποιώντας στοιχεία NIS και δημιουργήθηκε μια δυαδική μάσκα για κάθε περιοχή ενδιαφέροντος και κανάλι. Το κατώφλι χρησιμοποιήθηκε για τη βελτιστοποίηση των σημάτων LAMP1 και τη διάκριση του LAMP1 σε νευρίτες, συμπεριλαμβανομένων τόσο των δενδριτών όσο και των αξόνων, απομονώνοντας εικονοστοιχεία του θετικού LAMP1 για εικονοστοιχεία τουμπουλίνης.

Τα σήματα LAMP1 του κυτταρικού σώματος εξαιρέθηκαν από τη συνολική περιοχή LAMP1 για να αναλυθούν τα κυστίδια LAMP1 σε νευρίτες. Για την ανάλυση της κινητικότητας LysoTracker-Green σε νευρώνες, οι εικόνες ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας στοιχεία NISE. Η ταχύτητα και η απόσταση των συνολικών σωματιδίων LysoTrackerGreen σε κάθε πλαίσιο παρακολουθήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δυνατότητα αυτόματης παρακολούθησης κίνησης στα NIS-Elements. Ορίστηκε ένα όριο και εφαρμόστηκε σε όλες τις ταινίες με βάση το μέγεθος και την ένταση φθορισμού των σωματιδίων LysoTracker-Green για την εξάλειψη του θορύβου περιβάλλοντος.

Για τη δημιουργία κυμογράφων, πραγματοποιήθηκε απεικόνιση με χρονική καθυστέρηση μεμονωμένων νευρώνων σε ομοεστιακό μικροσκόπιο 60Χ και οι άξονες αναγνωρίστηκαν μορφολογικά. Το ποσοστό της συχνότητας των σωματιδίων που κινούνται σε μια πρόσθια ή ανάδρομη κατεύθυνση, ή στατικά, προσδιορίστηκε ποσοτικά διαιρώντας τον αριθμό των σωματιδίων για κάθε ομάδα με τον συνολικό αριθμό των σωματιδίων. Για τις αναλύσεις κυμογράφου, τα κινούμενα σωματίδια ορίστηκαν ως με ταχύτητα μεγαλύτερη από 0,1μM/sec.

Στατιστική ανάλυση

Το λογισμικό GraphPad Prism v8 χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση στατιστικών αναλύσεων, συμπεριλαμβανομένης της ανάλυσης διακύμανσης (ANOVA) με δοκιμές posthoc κατά τη σύγκριση περισσότερων από δύο δειγμάτων και μη ζευγαρωμένων t-test όταν συγκρίθηκαν μόνο δύο δείγματα. Συγκεκριμένες λεπτομέρειες δοκιμής, συμπεριλαμβανομένου του αριθμού των επαναλήψεων, του τύπου των posthoc δοκιμών και των τιμών P δηλώνονται στα υπόμνημα των σχημάτων. Όλες οι ποσοτικοποιήσεις απεικονίζονται στο μέσο όρο±SEM. Η σημασία συνήχθη όταν η τιμή P ήταν μικρότερη από 0.05, υποδεικνύεται από *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com