Εξερεύνηση του ρόλου μιας νέας ιντερλευκίνης-17 ομολογίας από το ασπόνδυλο θαλάσσιο μύδι Mytilus Coruscus στην έμφυτη ανοσοαπόκριση: Είναι η αρνητική ρύθμιση από τον Mc-Novel_miR_145 το κλειδί;
Dec 11, 2023
Αφηρημένη: Η ιντερλευκίνη-17 (IL-17) αντιπροσωπεύει μια κατηγορία προφλεγμονωδών κυτοκινών που εμπλέκονται σε χρόνιες φλεγμονώδεις και εκφυλιστικές διαταραχές. Πριν από αυτήν τη μελέτη, προβλέφθηκε ότι ένα ομόλογο IL-17 θα μπορούσε να στοχευτεί από το Mc-novel_miR_145 για να συμμετάσχει στην ανοσολογική απόκριση του Mytilus coruscus. Αυτή η μελέτη χρησιμοποίησε μια ποικιλία μεθόδων έρευνας μοριακής και κυτταρικής βιολογίας για να διερευνήσει τη συσχέτιση μεταξύ του ομολόγου Mc-novel{_miR_145 και της IL-17 και των ανοσοτροποποιητικών τους επιδράσεων. Η πρόβλεψη της βιοπληροφορικής επιβεβαίωσε τη συσχέτιση του ομολόγου IL-17 με την οικογένεια IL-17 μυδιού, ακολουθούμενη από ποσοτικές δοκιμές PCR σε πραγματικό χρόνο (qPCR) για να αποδειχθεί ότι η McIL-17-3 εκφραζόταν σε μεγάλο βαθμό σε ιστούς που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό και ανταποκρίθηκαν σε βακτηριακές προκλήσεις. Τα αποτελέσματα από τις αναλύσεις αναφοράς λουσιφεράσης επιβεβαίωσαν τη δυνατότητα του McIL-17-3 να ενεργοποιεί κατάντη NF-κb και τη στόχευσή του από Mc-novel_miR_145 σε κύτταρα HEK293. Η μελέτη παρήγαγε επίσης αντιορό McIL-17-3 και διαπίστωσε ότι το Mc-novel{_miR_145 ρυθμίζει αρνητικά το McIL-17-3 μέσω δοκιμασιών western blotting και qPCR. Επιπλέον, η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι το Mc-novel{_miR_145 ρύθμιζε αρνητικά το McIL-17-3 για να ανακουφίσει την απόπτωση που προκαλείται από LPS. Συλλογικά, τα τρέχοντα αποτελέσματα έδειξαν ότι το McIL-17-3 έπαιξε σημαντικό ρόλο στην ανοσολογική άμυνα των μαλακίων έναντι της βακτηριακής επίθεσης. Επιπλέον, το McIL- 17-3 ρυθμίστηκε αρνητικά από το Mc-novel_miR_145 για συμμετοχή στην απόπτωση που προκαλείται από LPS. Τα ευρήματά μας παρέχουν νέες ιδέες για τη ρύθμιση του μη κωδικοποιητικού RNA σε μοντέλα ασπόνδυλων.
Οφέλη του cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα
Λέξεις-κλειδιά: Κουσκούς Μυτίλους; ιντερλευκίνη-17; microRNA; απόπτωση; έμφυτη ανοσία
1. Εισαγωγή
Το ανοσοποιητικό σύστημα παίζει καθοριστικό ρόλο στην άμυνα του οργανισμού έναντι της εισβολής εξωγενών παθογόνων μικροοργανισμών. Συμβατικά, το αμυντικό σύστημα χωρίζεται σε έμφυτη και επίκτητη ανοσία. Η έμφυτη ανοσία αντιπροσωπεύει την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού ενάντια στα παθογόνα, τα οποία μπορούν να ανιχνεύσουν την εισβολή παθογόνων και να τα εξαλείψουν εν μέρει [1]. Η έμφυτη ανοσία διαμεσολαβείται από μια μεγάλη ποικιλία κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των φυσικών φονικών κυττάρων, των μονοκυττάρων, των ουδετερόφιλων, των ηωσινόφιλων, των βασεόφιλων και των κυκλοφορούντων δενδριτικών κυττάρων, τα οποία είναι συλλογικά γνωστά ως έμφυτα ανοσοκύτταρα. Αυτά τα κύτταρα απελευθερώνουν μεγάλο αριθμό κυτοκινών που εμπλέκονται στην κυτταρική επικοινωνία και έτσι βοηθούν στο συντονισμό των ανοσολογικών αποκρίσεων [2]. Στην περίπτωση μόλυνσης και φλεγμονής, οι κυτοκίνες λειτουργούν ως ρυθμιστές: ορισμένες κυτοκίνες επιδεινώνουν την ασθένεια (προφλεγμονώδη), ενώ άλλες προάγουν την υγεία (αντιφλεγμονώδη) [3]. Οι κυτοκίνες υπόκεινται σε υψηλά επίπεδα εξελικτικής πίεσης και έτσι παρουσιάζουν διαφοροποίηση αλληλουχίας [4], ενώ η οικογένεια κυτοκινών IL-17 παρουσιάζει υψηλή διατήρηση, η οποία εκδηλώνεται με μια πτυχή κόμβου κυστεΐνης στη λειτουργική αρχιτεκτονική που σχηματίζεται μέσω αλληλεπιδράσεων μεταξύ τεσσάρων διατηρημένα υπολείμματα κυστεΐνης [5]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η IL-17 είναι μια κατηγορία προφλεγμονωδών κυτοκινών που εμπλέκονται σε χρόνιες φλεγμονώδεις και εκφυλιστικές διαταραχές [6]. Το IL λειτουργεί δεσμεύοντας ειδικά με υποδοχείς για να προάγει την ανάπτυξη φλεγμονής, την απόρριψη του ανοσοποιητικού και την αιμοποίηση. Η οικογένεια κυτοκινών IL-17 στον άνθρωπο αποτελείται από έξι μέλη (IL-17A έως IL-17F), τα οποία παράγονται από ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα και άλλους έμφυτους κυτταρικούς πληθυσμούς ως απόκριση στην IL -1 και IL-23 [7,8]. Ωστόσο, ένας αυξανόμενος όγκος στοιχείων υποδηλώνει ότι η οικογένεια IL-17 παρουσίασε αξιοσημείωτη επέκταση στα θαλάσσια μαλάκια και τα είδη εχινόδερμων. Στο γονιδίωμα του μωβ αχινού Strongylocentrotus purpuratus, εντοπίστηκαν περίπου 30 γονίδια IL-17 [9]. Ομοίως, 31 γονίδια που μοιάζουν με IL-17- του χταποδιού βρέθηκαν σε κολεοειδή κεφαλόποδα, όπου 27 γονίδια έχουν μια ισχυρή έκφραση στα κορόιδα και το δέρμα [10]. Saco, et al. Ο [11] ανέκτησε 379 μοναδικές αλληλουχίες IL{-17 από 15 γονιδιώματα μυδιών με επαναλαμβανόμενη αλληλουχία και το γονιδίωμα αναφοράς του M. galloprovincialis [12] και τις διαίρεσε σε 23 ισόμορφες μέσω φυλογενετικής ανάλυσης. Περαιτέρω, διαπίστωσαν ότι οι ισομορφές IL-17 από τα είδη Mytilidae διατηρήθηκαν μεταξύ ατόμων και μοιράστηκαν μεταξύ των στενά συγγενών ειδών. Εκτός από τα είδη Mytilidae, οι μεγάλες οικογένειες IL-17 βρέθηκαν επίσης σε άλλα είδη μαλακίων, συμπεριλαμβανομένων των Crassostrea gigas, Mizuhopecten yessoensis και Pinctada fucata martensii [13]. Το θαλασσινό νερό βρίθει από παθογόνα και τα θαλάσσια μαλάκια βρίσκονται σε συνεχή επαφή μαζί τους, και ως εκ τούτου απαιτείται ένα ισχυρό οπλοστάσιο ανοσολογικών μορίων, οπότε η επέκταση της οικογένειας IL-17 προικίζει σε αυτά τα ζώα πιο αποτελεσματικές ανοσολογικές αποκρίσεις.
Έχουν γίνει αρκετές μελέτες που υποδεικνύουν τον σημαντικό ρόλο που διαδραματίζουν τα IL{0}} στην έμφυτη ανοσία των ζώων μαλακίων. Για παράδειγμα, η έρευνα έχει βρει ότι μετά τη μόλυνση από Vibrio harveyi, το επίπεδο mRNA της IL-17D ρυθμίστηκε πολύ προς τα πάνω στο Tegillarca granulosa [14], ενώ στο C. gigas, το CgIL17-5 έδειξε διακριτή αντίδραση στο Vibrio splendidus [15]. Επιπλέον, η IL{6}}s μαλακίων έχει αποδειχθεί ότι ανταποκρίνεται σε πολλά σχετιζόμενα με παθογόνα μοριακά πρότυπα (PAMPs), όπως ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS), το πολυϊνοσινικό: πολυκυτιδυλικό οξύ (polyI: C) και η πεπτιδογλυκάνη (PGN). Το LPS είναι ένα κύριο συστατικό του εξωτερικού τοιχώματος των αρνητικών κατά Gram βακτηριακών κυτταρικών τοιχωμάτων και αντιπροσωπεύει ένα από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα ανοσοδιεγερτικά. Από την άλλη πλευρά, το polyI: C είναι ένα δίκλωνο ανάλογο RNA που χρησιμοποιείται συχνά ως προσομοιωτής ιών στην επιστημονική έρευνα. Μετά τη διέγερση από το LPS, η μεταγραφική έκφραση των γονιδίων της οικογένειας IL-17 πυροδοτήθηκε γρήγορα στο στρείδι του Ειρηνικού C. gigas και στο στρείδι μαργαριταριού P. fucata [16,17]. Επίσης στα μαργαριταρένια στρείδια, το PfIL-17 βρέθηκε να εμπλέκεται στην ανοσολογική απόκριση στη διέγερση πολυΙ: C [17].
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
Επιπλέον, μια διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης έδειξε ότι το PfIL-17 ήταν σε θέση να ενεργοποιήσει γονίδια-στόχους σπονδυλωτών που περιέχουν θέσεις δέσμευσης NF-kB και να συμμετάσχει στο μονοπάτι σηματοδότησης NF-kB στα κύτταρα HEK293 [17]. Το PGN υπάρχει στο κυτταρικό τοίχωμα των Gram-θετικών βακτηρίων και χρησιμοποιείται συχνά ως μιμητικό για τα Gram-θετικά βακτήρια. Η ανασυνδυασμένη C. gigas IL17-5 αποδείχθηκε ότι έχει ισχυρή συγγένεια με την PGN, η οποία δεν είχε ποτέ αναφερθεί σε ιντερλευκίνες σπονδυλωτών [18]. Αυτές οι μελέτες παρείχαν ένα προοίμιο για την αποκάλυψη της ανοσοτροποποιητικής λειτουργίας της IL-17 στα μαλάκια. Ως κατηγορία προφλεγμονωδών κυτοκινών, η υπερβολική έκφραση της IL-17 μπορεί να προκαλέσει σοβαρή βλάβη στα κύτταρα. Οι οργανισμοί έχουν αναπτύξει διάφορους μηχανισμούς για τον έλεγχο της υπερβολικής αντίδρασης της IL-17, εκ των οποίων τα microRNA (miRNA) αντιπροσωπεύουν την πιο ισχυρή και καλά μελετημένη κατηγορία μη κωδικοποιημένων RNA. Τα MiRNA είναι μια οικογένεια βραχέων RNA μήκους περίπου 22 nt που μπορούν να ρυθμίσουν την έκφραση των γονιδίων-στόχων με μεταφραστική καταστολή ή αποικοδόμηση του mRNA [19]. Η τρέχουσα έρευνα για τη ρύθμιση των IL{17}}s από τα miRNAs επικεντρώνεται κυρίως στις συνεργικές τους επιδράσεις σε ανθρώπινες αυτοάνοσες ασθένειες όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η ψωρίαση και άλλες [20]. Η ανάπτυξη τεχνικής της αλληλουχίας υψηλής απόδοσης και του βιολογικού υπολογισμού καθιστά δυνατή τη σάρωση των miRNA των μαλακίων σε γονιδιωματικό επίπεδο και ένας μεγάλος αριθμός διατηρημένων και νέων miRNAs έχει εντοπιστεί από είδη μαλακίων όπως το επίπεδο στρείδι Ostrea edulis, το στρείδι του Ειρηνικού C. gigas , Lymnaea stagnalis, μύδι M. galloprovincialis κ.λπ. [21–29]. Αυτές οι μελέτες παρέχουν βασικά δεδομένα και μεγάλη υποστήριξη για τη λειτουργική ερμηνεία των miRNAs στα μαλάκια. Όσον αφορά τον ανοσορυθμιστικό ρόλο ορισμένων miRNAs στα μαλάκια, οι Tian, et al. [30] διαπίστωσε ότι το Pm-miR-29a θα μπορούσε να ρυθμίσει θετικά την IL-17 στο Pinctada martensii. μετά την υπερέκφραση του Pm-miR-29a, η έκφραση του IL{-17 στον μανδύα και τα βράγχια του είδους ρυθμίστηκε προς τα πάνω. Στο C. gigas, το cgi-miR-2d αύξησε την φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων του στρειδιού ρυθμίζοντας αρνητικά το CgIκB2 [31] και ρυθμίζοντας αρνητικά την έκφραση ενός γονιδίου που μοιάζει με μεταφορέα χολίνης στο πρώιμο στάδιο της μόλυνσης, το οποίο εμπλέκεται σε περίπλοκη ανοσοτροποποίηση [32].
φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα
Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity
【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Κατά τη διάρκεια της αποξήρανσης, το cgi-miR-365 βρέθηκε ότι προκαλείται από τη νορεπινεφρίνη και προάγει άμεσα την έκφραση του CgHSP90AA1 [33]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι το ικρίωμα miRNA659_26519 στοχεύει την καλμοδουλίνη για να ρυθμίσει την έκφραση της IL-17 στην πρώιμη φάση της ανοσολογικής απόκρισης του C. gigas [34]. Επιπλέον, συγκεκριμένες λειτουργίες ορισμένων miRNAs έχουν περιγραφεί σε άλλα ασπόνδυλα, όπως το αγγούρι της θάλασσας Apostichopus japonicus [35-39] και η γαρίδα Litopenaeus vannamei [40]. Αυτές οι μελέτες έχουν ανοίξει το πέπλο στους υποκείμενους μηχανισμούς των miRNA στα ασπόνδυλα και επίσης παρείχαν τεχνικές και μεθοδολογικές αναφορές για την τρέχουσα έρευνά μας. Στην προηγούμενη μελέτη μας, 26 miRNAs και 667 γονίδια του M. coruscus υπολογίστηκαν βιολογικά για διαφορική έκφραση μετά την πρόκληση Vibrio alginolyticus, εκ των οποίων το Mcnovel_miR_145 μπορεί να στοχεύσει ένα ομόλογο IL-17 και εμπλέκονται στην ανοσολογική απόκριση σε βακτηριακή λοίμωξη [41]. Ο στόχος της παρούσας μελέτης είναι να αναγνωρίσει το γονίδιο IL{-17 και να διερευνήσει τον πιθανό ρόλο του στην έμφυτη ανοσία και τη ρύθμισή του από το miRNA Mcnovel_miR_145 στο M. coruscus. Μέσω αυτής της μελέτης, στοχεύουμε να κατανοήσουμε καλύτερα τους μηχανισμούς ανοσοαπόκρισης των μαλακίων και να ρίξουμε φως στη μοριακή βάση της ανοσολογικής τους άμυνας έναντι των παθογόνων. Αυτή η έρευνα μπορεί επίσης να παρέχει πληροφορίες για τη ρύθμιση του μη κωδικοποιητικού RNA σε μοντέλα ασπόνδυλων.
2. Αποτελέσματα
2.1. Χαρακτηρισμός του McIL-17-3
Η αλληλουχία cDNA McIL-17-3 που περιέχει το πλήρες ORF, 30 -UTR και μερικό 50 - UTR κλωνοποιήθηκε σε πυρίτιο από το μεταγραφικό πλήρους μήκους M. coruscus (αριθμός πρόσβασης: PRJNA798880, F{ {5}}μεταγραφή_12404). Το McIL-17-3 περιέχει μια περιοχή ORF 585 bp που κωδικοποιεί 194 αμινοξέα. Το προβλεπόμενο μοριακό βάρος είναι 21,77 kDa και το ισοηλεκτρικό σημείο είναι 5,21. Η ανάλυση SMART αποκάλυψε μια τυπική περιοχή IL-17 σε αυτήν την πρωτεΐνη (Εικόνα 1Α). Κατασκευάστηκε ένα φυλογενετικό δέντρο με τη στρατολόγηση μελών IL-17 σπονδυλωτών και ειδών Mytilidae και χρησιμοποιήθηκαν IL2s ως εξωτερική ομάδα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, αυτά τα IL-17 συγκεντρώνονται σε έναν συγκεκριμένο κλάδο για να διακρίνονται από τα IL-2. Μέσα στο σύμπλεγμα IL-17, εμφανίστηκαν δύο φαινομενικά clades, το ένα αποτελούμενο από IL-17 σπονδυλωτών και το άλλο από IL-17 μυδιών. Στην ομάδα IL-17 του μυδιού, το McIL-17-3 συγκεντρώθηκε αρχικά με το αντίστοιχο μόριο από ένα άλλο είδος Mytilus, το M. galloprovincialis (Εικόνα 1Β).
2.2. Πρόβλεψη πολλαπλής ευθυγράμμισης και τριτογενούς δομής
Ο πυρήνας του McIL-17-3 αποτελείται από δύο ζεύγη αντιπαράλληλων κλώνων. το ένα ζεύγος περιλαμβάνει κλώνους 1 (υπολείμματα 52-58) και 2 (υπολείμματα 66-72 και 77-79), ενώ το άλλο περιλαμβάνει κλώνους 3 (υπολείμματα 89-103) και 4 (υπολείμματα 110-125) (Εικόνα 2Β, Γ) . Δύο δισουλφιδικές γέφυρες (Cys97/Cys134 και Cys125/Cys169) συνδέουν τους κλώνους 1 και 3, 2 και 4, αντίστοιχα (Εικόνα 2Α, Γ). Κατά συνέπεια, άλλα IL-17 μαλακίων διαθέτουν επίσης αυτές τις δύο δισουλφιδικές γέφυρες μεταξύ των κλώνων 1 και 3, 2 και 4 (Εικόνα 2Α, Γ). Σημειωτέον, αν και τα IL{32}}s σπονδυλωτών έχουν επίσης δύο δισουλφιδικές γέφυρες, υπάρχουν μεταξύ 2 και 4 (Εικόνα 2Α, Γ).
2.3. Μεταγραφική έκφραση του McIL-17-3
Το προφίλ κατανομής ιστού των μεταγραφών McIL{{{0}} αξιολογήθηκε με qPCR. Τα μεταγραφήματα του McIL-17-3 εκφράστηκαν σε όλους τους ιστούς που δοκιμάστηκαν και τα επίπεδα έκφρασης στα αιμοκύτταρα και τα βράγχια ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά στον προσαγωγό μυ (Εικόνα 3Α). Αξιολογήθηκε επίσης η χρονική έκφραση μεταγραφών αιμοκυττάρου McIL-17-3 σε απόκριση στην πρόκληση V. alginolyticus. Το επίπεδο mRNA του McIL-17-3 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω σε 3 και 12 HPC (3.13- ή 4.{11}}πλάσια αύξηση σε σύγκριση με 0 HPC, αντίστοιχα), αλλά δεν υπήρξε καμία αύξηση. εμφανής χρονική κανονικότητα γενικά (Εικόνα 3Β).
Σχήμα 1. Μοριακός χαρακτηρισμός του McIL-17-3. (Α) Αρχιτεκτονική ανάλυση διατηρημένων τομέων στο McIL-17-3 με χρήση SMART. Εμφανίστηκε ένας διατηρημένος τομέας IL-17. (Β) Φυλογενετική ανάλυση McIL-17-3. Το φυλογενετικό δέντρο κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό MEGAX με 2000 επαναλήψεις του bootstrapping χρησιμοποιώντας τη μέθοδο γειτονικής ένωσης. Το McIL-17-3 επισημάνθηκε με ένα πράσινο τρίγωνο. Τα είδη που περιλαμβάνονται στο φυλογενετικό δέντρο ανακτήθηκαν όλα από τη βάση δεδομένων Genebank και οι αριθμοί προσχώρησης καταγράφηκαν επίσης στο δέντρο. Πράσινο τρίγωνο για λογαριασμό της McIL-17-3. (Για την ερμηνεία των αναφορών στο χρώμα σε αυτό το υπόμνημα σχήματος, ο αναγνώστης παραπέμπεται στην έκδοση Web αυτού του άρθρου.)
2.4. The Activation of Downstream by McIL-17-3
Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, το ανασυνδυασμένο McIL-17-3 αύξησε τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης του pGLNF-κB-luc με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Στα 0,5 και 1.0 μg/φρεάτιο, η δραστηριότητα της λουσιφεράσης του pGLNF-κB-luc αυξήθηκε 2.07- και 11.{14}} φορές, αντίστοιχα.
2.5. Επιβεβαίωση του McIL-17-3 ως γονιδίου στόχου του Mc-novel_miR_145
Μέσω της πρόβλεψης βιοπληροφορικής, το γονίδιο McIL{{{0}} περιέχει μια τυπική αλληλουχία στόχο για το Mc-novel{_miR_145 στο 30 UTR του (Εικόνα 5Α). Μιμητικό και αναστολέας Mc-novel_miR_145 συν-μορφομετατράπηκαν με το πλασμίδιο αναφοράς UTR άγριου τύπου McIL{-17-3-30 σε κύτταρα HEK293 για να επιβεβαιωθεί η συσχέτισή τους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, η μίμηση Mc-novel_miR_145 μπορεί να αναστείλει τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης του McIL-17-3-30 UTR-WT (0).{{2{{58} }}}πλάσια μείωση σε σύγκριση με τον έλεγχο), ενώ ο αναστολέας Mc-novel_miR_145 μετριάζει αξιοσημείωτα τα αποτελέσματα (1.64-πλάσια αύξηση σε σύγκριση με το Mc-novel_ miR_145 ως απλώς μια ομάδα που προστέθηκε). Για να αξιολογήσουμε εάν το Mc-novel{{3{{0}}miR_145 στοχεύει απευθείας το γονίδιο McIL{-17-3 μέσω της θέσης στόχου στο 30 UTR, κατασκευάσαμε τη μεταλλαγμένη έκδοση των πλασμιδίων αναφοράς λουσιφεράσης που μετάλλαξε τις αλληλουχίες στόχευσης Mc-novel_miR_145 στο McIL-17-3 30 UTR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Γ, η μίμηση Mc-novel_miR_145 μείωσε σημαντικά τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης των κυττάρων που διαμολύνθηκαν με το McIL-17-3-30 UTR-WT (0.27-φορές). μείωση), ενώ δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στη δραστηριότητα της λουσιφεράσης σε κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με το McIL-17-3-30 UTR-MUT. Επιπλέον, οι δοσοεξαρτώμενες επιδράσεις του Mc-novel_miR_145 μιμούνται την αναστολή της δραστηριότητας της λουσιφεράσης McIL{-17-3-30 UTR-WT λουσιφεράσης μπορεί επίσης να παρατηρηθούν 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση (0 .71-, 0.43- και 0.20-πλάσια μείωση σε σύγκριση με τον έλεγχο, αντίστοιχα, Εικόνα 5D).
Εικόνα 2. Πολλαπλές ευθυγραμμίσεις του McIL-17-3 με άλλα μέλη της οικογένειας IL-17. (Α) Η αλληλουχία αμινοξέων του McIL-17-3 ευθυγραμμίστηκε με αυτή άλλων IL-17 που ανακτήθηκε από μύδια και σπονδυλωτά, συμπεριλαμβανομένων ποντικών και ζέβρα. Αυτές οι κυστεΐνες, που σχηματίζουν έναν κανονικό κόμπο, σημειώθηκαν με πράσινο χρώμα, με αντικατασταθέντα υπολείμματα αμινοξέων σημειωμένα με κόκκινο. Ο κόμπος κυστεΐνης υποδεικνύεται με χρωματικές γραμμές, μπλε που σημαίνει την παρουσία τους στα μαλάκια και κόκκινο που σημαίνει την παρουσία τους στα σπονδυλωτά. Σημείωση: Μόνο το δεύτερο μισό της στοίχισης ακολουθίας διατηρείται για οπτικοποίηση. (Β) Η τριτοταγής δομή της πρωτεΐνης McIL-17-3 προβλέφθηκε χρησιμοποιώντας το ελβετικό μοντέλο και το λογισμικό pyMol. Αυτές οι κυστεΐνες, που σχηματίζουν έναν κανονικό κόμπο, σημειώθηκαν. (Γ) Μια αναπαράσταση κινουμένων σχεδίων της κανονικής πτυχής κόμπων κυστεΐνης. Τα υπολείμματα κυστεΐνης υποδεικνύονταν με γεμισμένους κύκλους. αυτές που υπήρχαν στις πρωτεΐνες IL-17 ήταν κίτρινες, ενώ οι δύο που χάθηκαν ήταν γκρι. (Για την ερμηνεία των αναφορών στο χρώμα σε αυτό το υπόμνημα σχήματος, ο αναγνώστης παραπέμπεται στην έκδοση Web αυτού του άρθρου.)
Σχήμα 3. Ανάλυση προφίλ έκφρασης μεταγραφών McIL-17-3. (Α) Κατανομή μεταγραφών McIL-17-3 σε κοινούς ιστούς μυδιών. (Β) Χρονικές αλλαγές έκφρασης μεταγραφών McIL-17-3 σε απόκριση στην πρόκληση V. alginolyticus. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SD (n=3, * p < 0.05, ** p <0,01). (Για την ερμηνεία των αναφορών στο χρώμα σε αυτό το υπόμνημα σχήματος, ο αναγνώστης παραπέμπεται στην έκδοση Web αυτού του άρθρου.)
Εικόνα 4. Η ενεργοποίηση του ανταποκριτή NF-κB από τον McIL-17-3. Ο ανασυνδυασμένος φορέας pEGFP-McIL- 17-3 σε τρεις συγκεντρώσεις (0.1, 0.5 και 1.{{10}} μg/φρεάτιο) συνεπιμολύνθηκε. σε κύτταρα HEK293 χρησιμοποιώντας Lipo6000TM για 24 ώρες. Οι σχετικές δραστικότητες λουσιφεράσης υπολογίστηκαν με κανονικοποίηση στην τιμή pRLTK. Τα πειραματικά αποτελέσματα εκφράστηκαν ως πολλαπλές αλλαγές συγκρίνοντας τις δραστικότητες της λουσιφεράσης των επαγόμενων από ανασυνδυασμένο φορέα κυττάρων με εκείνες των κενών κυττάρων που προκαλούνται από φορέα στην ίδια συγκέντρωση. Κάθε τιμή εμφανίστηκε ως μέση τιμή ± SD (n=3) και οι ράβδοι με σύμβολο αστερίσκου ήταν σημαντικά διαφορετικές (* p < 0,05, ** p < 0,01).
Εικόνα 5. Mc-novel_miR_145 στοχευμένη McIL-17-3. (Α) Η αλληλουχία McIL-17-3 30 UTR εισήχθη στον φορέα pmiR-RB-Report™, αντίστοιχα κατασκευασμένα άγριου τύπου και μεταλλαγμένα πλασμίδια. Η αλληλουχία Mcnovel_miR{{10}} και η τοποθεσία στόχος McIL-17-3-30 UTR και η αλληλουχία τοποθεσίας μεταλλάγματος επισημάνθηκαν με κόκκινους δείκτες. (Β) Το πλασμίδιο McIL-17-3-30 UTR-WT συν-επιμολύνθηκε με Mc-novel_miR_145 mimic ή Mc-novel_miR{{2{{37} }}} αναστολέα σε κύτταρα HEK293. (Γ) Τα κύτταρα HEK293 επιμολύνθηκαν με McIL{-17-3-30 UTR-WT ή τον μεταλλαγμένο τύπο McIL-17-3-30 UTR-MUT, μαζί με Mc-novel{_miR_145 ή NC , για 24 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ανάλυσης αναφοράς διπλής λουσιφεράσης. (Δ) Τα πειράματα βαθμίδωσης συγκέντρωσης διεξήχθησαν για επιμόλυνση Mc-novel_miR_145. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν. **, p < 0,01, *, p < 0,05 έναντι των στοιχείων ελέγχου. (Για την ερμηνεία των αναφορών στο χρώμα σε αυτό το υπόμνημα σχήματος, ο αναγνώστης παραπέμπεται στην έκδοση Web αυτού του άρθρου.)
2.6. Το Mc-novel_miR_145 Ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση του McIL-17-3
Τα αιμοκύτταρα M. coruscus επιμολύνθηκαν με Mc-novel_miR_145 αναστολέα, Mcnovel_miR_145 και τους αντίστοιχους ελέγχους τους, και τις αλλαγές στο McIL{{ Η έκφραση 5}} αξιολογήθηκε στα επίπεδα μεταγραφής και πρωτεΐνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, η έκφραση του Mc-novel_miR_145 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω (8.83-πλάσια αύξηση) από τη μίμησή του και τη μειωμένη ρύθμιση ({{14) }}.41-πλάσια μείωση) από τον καταστολέα του στα αιμοκύτταρα, υποδηλώνοντας αποτελεσματικές επιδράσεις αυτών των συνθετικών ουσιών. Στο Σχήμα 6Β, η έκφραση του ενδογενούς McIL-17-3 παρεμποδίστηκε σημαντικά (0.51-πλάσια μείωση) από τη μίμηση Mc-novel_miR_145 στο μεταγραφικό επίπεδο και προκαλείται σημαντικά (2.42-πλάσια αύξηση) από τον αναστολέα Mcnovel_miR_145. Για τη διερεύνηση των επιδράσεων του Mc-novel_miR_145 στην έκφραση του McIL-17-3 σε επίπεδο πρωτεΐνης, παρήχθη ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κατά του McIL-17-3. Όπως φαίνεται στις διαδρομές 2 και 3 στο Σχήμα 6C, η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη McIL-17-3 εκφράστηκε επιτυχώς σε Ε. coli. Η ειδικότητα αντισώματος εξετάστηκε με την πρωτεΐνη μυδιού από αιμοκύτταρα με στύπωμα Western. Παρατηρήθηκε μία μονή ζώνη περίπου 22 kDa, που αντιστοιχεί στη μοριακή μάζα του McIL-17-3 (λωρίδα 4 στο Σχήμα 6C). Τα αποτελέσματα του στυπώματος Western στο Σχήμα 6Δ έδειξαν την αρνητική ρύθμιση του McIL-17-3 σε επίπεδο πρωτεΐνης από το Mc-novel_miR_145.
Fεικόνα 6. Το Mc-novel_miR_145 ανέστειλε την έκφραση του McIL-17-3 σε αιμοκύτταρα M. coruscus. (Α) Η έκφραση του Mc-novel_miR_145 αξιολογήθηκε με qPCR σε αιμοκύτταρα διαμολυνθέντα με 145 μιμητικούς, 145 αναστολείς και τον αντίστοιχο μάρτυρά τους. (Β) Μετά τη διαμόλυνση για 24 ώρες, τα μεταγραφικά επίπεδα του McIL-17-3 προσδιορίστηκαν με qPCR. (Γ) Ανασυνδυασμένη έκφραση, καθαρισμός και το παρασκεύασμα αντιορού για McIL-17-3. Lane M, τυπικός δείκτης μοριακού βάρους πρωτεΐνης. Λωρίδα 1, αρνητικός έλεγχος (χωρίς επαγωγή). Λωρίδα 2, επαγόμενη ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη McIL-17-3. Lane 3, καθαρισμένο McIL- 17-3. Lane 4, Western blot με αντίσωμα αντι-McIL{{2{0}} στα αιμοκύτταρα του M. coruscus. (D) Μετά από επιμόλυνση για 24 ώρες, τα επίπεδα πρωτεΐνης του McIL-17-3 προσδιορίστηκαν με στύπωμα Western. ** p < 0,01 έναντι των στοιχείων ελέγχου
2.7. Απόπτωση Αιμοκυττάρων
Ο ρυθμός απόπτωσης αιμοκυττάρων τεσσάρων ομάδων, π.χ. NC+LPS, McIL-17-3+LPS, Mcnovel_miR_145+McIL-17-3+LPS και Mc-novel{{6} Το }miR_145-i+McIL-17-3+LPS αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας διπλή χρώση. Μετά την υπερέκφραση του McIL{10}}, ο ρυθμός απόπτωσης των αιμοκυττάρων που προκλήθηκαν με LPS ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 7Α(α,β), Β). Όταν το McIL-17-3 συνεπιμολύνθηκε με Mc-novel_miR_145, ο ρυθμός απόπτωσης των αιμοκυττάρων που προκλήθηκε από το LPS μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με αυτόν του McIL-17-3 που διαμολύνθηκε μόνο του (Εικόνα 7Α( β, γ), Β). Αντίθετα, ο αποπτωτικός ρυθμός αιμοκυττάρων έδειξε μια αξιοσημείωτη αύξηση στην ομάδα Mc-novel_miR_145-i+ McIL-17-3+LPS σε σύγκριση με την ομάδα McIL-17-3+LPS (Εικόνα 7Α (β, δ), Β).
Σχήμα 7. Ο ρυθμός απόπτωσης αιμοκυττάρων εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο (PI) και χρώση FITC-Annexin-V
3. Συζήτηση
Η IL-17 αναγνωρίζεται ως μία από τις σημαντικές οικογένειες προφλεγμονωδών κυτοκινών, η οποία μπορεί να συμμετέχει αποτελεσματικά στην παθογένεση διαφορετικών ασθενειών [42]. Στην προηγούμενη μελέτη μας, ένα ομόλογο M. coruscus IL-17 έδειξε διαφορική έκφραση πριν και μετά τη μόλυνση με V. alginolyticus μέσω αλληλουχίας μεταγραφομένων [41], υποδηλώνοντας τον πιθανό ρόλο του στην έμφυτη ανοσοαπόκριση σε βακτηριακή πρόκληση. Εδώ, χαρακτηρίσαμε αυτό το ομόλογο IL{-17 και το ονομάσαμε McIL{-17-3. Η πρόβλεψη του λειτουργικού τομέα αποκάλυψε έναν τυπικό τομέα IL{-17, που προικίζει την επί του παρόντος ταυτοποιημένη συσχέτιση γονιδίου στην οικογένεια κυτοκινών IL{-17. Στο φυλογενετικό δέντρο, αυτό το νέο γονίδιο IL-17 έδειξε μια πολύ στενή συγγένεια με την IL-17- 3 από ένα άλλο είδος Mytilus, το M. galloprovincialis. Επιπλέον, μοιράζονταν μια πολύ υψηλή ταυτότητα αμινοξέων 95%, και επομένως ορίσαμε το τρέχον νέο γονίδιο IL-17 ως McIL-17-3 για να ακολουθήσει τη σύμβαση ονομασίας που χρησιμοποιείται στα είδη Mytilus. Η οικογένεια IL{14}} αποτελείται από έξι μέλη και πέντε υποδοχείς στον άνθρωπο [43], αλλά έχει βιώσει μια τεράστια γενετική επέκταση στα θαλάσσια ασπόνδυλα, ειδικά στα μύδια [11]. Με βάση αυτό, τα δεδομένα μας πρότειναν ότι το McIL-17-3 δεν σχετίζεται άμεσα με ορισμένα γονίδια στην οικογένεια της ανθρώπινης IL-17. Η πτυχή του κόμβου κυστεΐνης που βρίσκεται στα φύλλα είναι το τυπικό χαρακτηριστικό της οικογένειας IL-17 [5]. Αναμενόμενα, η πρόβλεψη της τριτογενούς δομής αποκάλυψε μια πτυχή κόμβου κυστεΐνης στην πρωτεΐνη McIL{-17-3, εμβαθύνοντας περαιτέρω την απόδοση του McIL-17-3 στην οικογένεια των κυτοκινών IL{-17. Για περαιτέρω διερεύνηση της διαφοροποίησης των αλληλουχιών αμινοξέων IL-17 μεταξύ διαφορετικών ειδών, μερικά τυπικά IL-17 και Mus musculus IL-17-A έως IL-17-F και Danio rerio Επιλέχθηκαν τα IL-17-1 έως IL-17-3 για την εκτέλεση της ανάλυσης πολλαπλής ευθυγράμμισης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ένα ενδιαφέρον εύρημα ότι η θέση του δισουλφιδικού δεσμού του IL-17s στα μύδια και στα σπονδυλωτά ήταν ασυνεπής: αυτοί οι δύο δεσμοί δισουλφιδίου υπήρχαν μεταξύ των -κλώνων 1 και 3, 2 και 4, αντίστοιχα, στα μύδια, αλλά μόνο μεταξύ -κλώνοι 2 και 4 σε σπονδυλωτά. Στην πρώτη και την τέταρτη θέση κυστεΐνης, η IL{42}}s σπονδυλωτών αντικαθιστά την κυστεΐνη με σερίνη. Αντίθετα, στη δεύτερη θέση κυστεΐνης, η IL{43}}s μυδιού αντικαθιστά την κυστεΐνη με θρεονενοποίηση σε δισουλφιδικό δεσμό σε μύδια και σπονδυλωτά και ο υποκείμενος μηχανισμός της είναι ασαφής και χρειάζεται περαιτέρω μελέτη. Δεδομένου του πολυμορφισμού του IL{44}}s στα μύδια, η δισουλφιδική σύνδεση μεταξύ των κλώνων 1 και 3 μπορεί να μην είναι τόσο ισχυρή όσο αυτή μεταξύ 2 και 4, προσδίδοντάς τους μεγαλύτερη πλαστικότητα στα μύδια. Εν πάση περιπτώσει, η ανάλυση λειτουργικών τομέων και τριτογενούς δομής υποδηλώνει ότι το McIL-17-3 που προσδιορίζεται επί του παρόντος είναι τυπικό της κυτοκίνης IL-17 μυδιού και μπορεί να παίζει παρόμοιο λειτουργικό ρόλο με τους ομολόγους του στα μαλάκια. Η έκφραση των γονιδίων IL-17 στους ανθρώπινους ιστούς ποικίλλει ευρέως, με μερικά να εκφράζονται μόνο σε λίγα κύτταρα και άλλα σε μεγάλο αριθμό ιστών [44,45]. Οι περισσότερες μελέτες σε μαλάκια έδειξαν ότι τα IL-17 είχαν ένα συστατικό προφίλ έκφρασης [13,15,17,46,47]. Ωστόσο, οι Li, Zhang, Zhang, Xiang, Tong, Qu και Yu [47] έδειξαν ένα ασυνεπές αποτέλεσμα στο C. gigas IL-17s: CgIL{-17-2, -3, {{ 65}} και -6 εκφράστηκαν σε μεγάλο βαθμό στα βράγχια του C. gigas, στους πεπτικούς αδένες και στον μανδύα, αλλά ελάχιστα εκφράστηκαν σε άλλους ιστούς. Εδώ, μεταγραφές McIL-17-3 βρέθηκαν σε όλους τους ιστούς που εξετάστηκαν, υποδηλώνοντας τους πολλαπλούς λειτουργικούς ρόλους του σε μια ποικιλία φυσιολογικών δραστηριοτήτων. Ωστόσο, τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του McIL-17-3 σε ορισμένους ιστούς που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό μαλάκιο, όπως τα αιμοκύτταρα, τα βράγχια και οι πεπτικοί αδένες, υποδηλώνουν τη στενότερη εμπλοκή του με την ανοσολογική απόκριση. Στη συνέχεια, η ταχεία ανταπόκρισή του στην επίθεση V. alginolyticus βαθαίνει αυτό το σημείο. Η ένεση του V. alginolyticus ρύθμισε σημαντικά προς τα πάνω την έκφραση του McIL{-17-3 και παρόμοια αποτελέσματα έχουν επίσης παρατηρηθεί σε άλλες IL-17 μαλακίων. Η έγχυση του V. anguillarum στο C. gigas προκάλεσε γρήγορη αύξηση της αφθονίας μεταγραφής CgIL{-17 στα αιμοκύτταρα, υποδηλώνοντας ότι ήταν ένα ανοσοποιητικό γονίδιο πρώιμης φάσης [46]. Όταν ο C. gigas υπέστη επίθεση από άλλο παθογόνο, τον V. splendidus, το επίπεδο mRNA του CgIL-17-5 στα αιμοκύτταρα ήταν επίσης σημαντικά αυξημένο [15]. Η διέγερση του LPS, του κύριου παθογόνου συστατικού των βακτηρίων, αύξησε δραματικά την έκφραση του PfIL-17 στους πεπτικούς αδένες του μαργαριταριού στρειδιού P. fucata [17]. Επιπλέον, το LPS θα μπορούσε να προκαλέσει την έκφραση του CgIL-17-3 στο C. gigas [47] και του PmIL-17-2 στο P. fucata martensii [13]. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν συλλογικά ότι η IL-17 έπαιξε σημαντικό ρόλο στην ανοσολογική άμυνα των μαλακίων έναντι της βακτηριακής επίθεσης. Σε αυτή τη μελέτη, το McIL-17-3 έδειξε την ικανότητα ενεργοποίησης της κατάντη οδού NF-κB. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε ορισμένα είδη μαλακίων. Στο μαργαριταρένιο στρείδι P. fucata, το PfIL-17 εμφάνισε επίσης ενεργοποίηση της οδού NF-κΒ στα κύτταρα HEK293 από τις αναλύσεις αναφοράς λουσιφεράσης [17]. Στο C. gigas, το CgIL-17-5 προώθησε την ενεργοποίηση των CgMAPKs και την πυρηνική μετατόπιση των CgRel και CgAP-1 για την προώθηση της έκφρασης mRNA των κυτοκινών και των αντιβακτηριακών πεπτιδίων [15]. Έχει αποδειχθεί ότι ο τρόπος δράσης του IL{-17 βασίζεται στην ένωσή του σε διμερή (ομοδιμερή ή ετεροδιμερή), των οποίων η δραστηριότητα εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την προσκόλλησή τους στους υποδοχείς (IL{-17Rs) που στόχος. Αυτοί οι υποδοχείς περιέχουν μια διατηρημένη κυτταροπλασματική περιοχή (SEFIR) που αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες προσαρμογής για την έναρξη οδών μεταγωγής σήματος προς τα κάτω για την ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων όπως το NF-κB και την προώθηση της έκφρασης των ανοσοποιητικών και προφλεγμονωδών γονιδίων-στόχων, όπως οι κυτοκίνες και τα αντιμικροβιακά πεπτίδια. 11,48,49].
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα IL{0}} μαλακίων μπορεί να έχουν τον ίδιο τρόπο δράσης με τα αντίστοιχα στα σπονδυλωτά. Αυτό πρέπει να επιβεβαιωθεί σε μελλοντικές μελέτες. Οι συσχετίσεις μεταξύ miRNA και IL-17 έχουν βρεθεί σε πολλά μοντέλα ανθρώπινων ασθενειών. Niimoto, et al. [50] επιβεβαίωσε τη θετική συσχέτιση μεταξύ miR-146a και IL-17μιας έκφρασης σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος και αρθρικό άρθρο από ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα και συνόψισε τη ζωτική λειτουργία του miR-146a στην διαφοροποίηση των κυττάρων που παράγουν IL-17-. Σε ασθενείς με ψωρίαση, το miR-146a δρα ως ισχυρός αναστολέας της φλεγμονής του δέρματος που προκαλείται από την IL-17-και τα χαμηλά επίπεδά του μπορεί να συμβάλλουν στην πρώιμη έναρξη της νόσου σε γενετικά ευαίσθητα άτομα [51]. Το MiR{10}}a μπορεί να βελτιώσει την περιοδοντίτιδα ρυθμίζοντας προς τα κάτω την έκφραση της IL-17 και αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό βλαστικών κυττάρων ανθρώπινου περιοδοντικού συνδέσμου [52]. Το MiR-155 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση της IL-17 για να συμμετέχει στην ανοσολογική απόκριση του ξενιστή στην μεταιική βακτηριακή πνευμονία σε πνεύμονες ποντικών. Τα ποντίκια με αναστολή του miR-155 εμφανίζουν ισχυρότερη έκφραση της IL-17 στον πνεύμονα, συνοδευόμενη από βελτιωμένη βακτηριακή κάθαρση [53]. Αυτές οι μελέτες υποδηλώνουν ότι η IL-17 ρυθμίζεται από πολλαπλά miRNAs και ποικίλλει ανάλογα με την ασθένεια και τον τύπο κυττάρων [20]. Σε μια προηγούμενη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη ανάλυση του miRNAome και του μεταγραφώματος για να διερευνήσουμε τη διαδραστική ρύθμιση του miRNA-mRNA από το M. coruscus ως απόκριση στη μόλυνση από V. alginolyticus. Τα αποτελέσματα προέβλεψαν ότι το Mc-novel_miR_145 θα μπορούσε να στοχεύσει το McIL{-17-3 για να συμμετάσχει στην έμφυτη ανοσοαπόκριση στη βακτηριακή μόλυνση [41]. Με στόχο τη διερεύνηση του υποκείμενου μηχανισμού της Mcnovel_miR_145 ρύθμισης του McIL-17-3 σε βάθος, διεξήχθη μια σειρά εργαστηριακών πειραμάτων στις παρούσες μελέτες. Ο υπολογισμός προέβλεψε ότι το Mc-novel_miR_145 θα μπορούσε να στοχεύσει το 30 UTR του McIL-17-3. Οι ακόλουθες αναλύσεις αναφοράς λουσιφεράσης πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα HEK293 συνεπιμολυνθέντα από Mc-novel_miR_145 μιμητικό, μιμητικό NC, αναστολέας, αναστολέας NC με McIL-17-3-30 UTR-WT, -MUT reporter πλασμίδια επιβεβαίωσαν περαιτέρω αυτό το σημείο. Περαιτέρω, Mc-novel_miR_145 μιμητικός, μιμητικός NC, αναστολέας και αναστολέας NC επιμολύνθηκαν σε αιμοκύτταρα M. coruscus για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματά τους στην έκφραση McIL-17-3 σε μεταγραφικά και πρωτεϊνικά επίπεδα . Η έκφραση του McIL-17-3 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα κάτω στην ομάδα επιμόλυνσης Mc-novel{{_miR_145, ενώ ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω στο Mc-novel_miR _145 ομάδα διαμόλυνσης αναστολέα, που υποδηλώνει αρνητική ρύθμιση του McIL-17-3 από την Mc-novel_miR{_145. Τα τρέχοντα αποτελέσματα ήταν αντίθετα με προηγούμενη μελέτη. Στο Pinctada martensii, οι Tian, Zheng, Huang, Jiao και Du [30] βρήκαν ότι παρόλο που το Pm-miR-29a θα μπορούσε να στοχεύσει την IL-17, η ρύθμιση ήταν θετική, καθώς η έκφραση της IL{{ 65}} στον μανδύα και στα βράγχια του Pinctada martensii ρυθμίστηκε προς τα πάνω μετά την υπερέκφραση του Pm-miR-29a. Δεδομένου ότι το P. martensii και το M. coruscus ανήκουν και τα δύο σε δίθυρα και είναι σχετικά στενά συνδεδεμένα, αυτά τα ασυνεπή αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ρύθμιση των IL-17s στα μαλάκια μπορεί να ποικίλλει με τα miRNAs. Εκτός από αυτό, καμία βιβλιογραφία δεν έχει αναφέρει τη συσχέτιση μεταξύ των miRNAs και των IL-17s στα μαλάκια και επομένως δεν υπάρχουν περισσότερες παράλληλες μελέτες για τη σύγκριση των τρεχόντων αποτελεσμάτων. Ωστόσο, μερικές μελέτες έχουν αναφέρει σχέσεις στόχευσης μεταξύ συγκεκριμένων miRNAs και συγκεκριμένων γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό στα μαλάκια.
Για παράδειγμα, το cgi-miR-2d αυξάνει τη φαγοκυττάρωση των αιμοκυττάρων του στρειδιού ρυθμίζοντας αρνητικά το CgICB2 στο Crassostrea gigas [31]. Επιπλέον, το cgi-miR-2d ρυθμίζει επίσης αρνητικά την έκφραση ενός γονιδίου που μοιάζει με μεταφορέα χολίνης για να συμμετέχει στην περίπλοκη ανοσορύθμιση των αιμοκυττάρων του στρειδιού κατά το πρώιμο στάδιο της μόλυνσης [32]. Αυτές οι μελέτες τουλάχιστον υποδηλώνουν ότι τα miRNA παίζουν πιθανό ρόλο στην έμφυτη ανοσολογική σηματοδότηση στοχεύοντας συγκεκριμένα γονίδια στα μαλάκια, όπως ακριβώς κάνουν στα σπονδυλωτά. Στη συνέχεια, επιδιώξαμε να διερευνήσουμε την πιθανή λειτουργία της αλληλεπίδρασης μεταξύ Mcnovel_miR_145 και McIL{{1{0}} στην έμφυτη ανοσία του M. coruscus και τον ρόλο τους στην Η απόπτωση που προκαλείται από LPS είναι το επίκεντρο της προσοχής μας. Το LPS είναι ένα εξαιρετικά προφλεγμονώδες μόριο που αποτελεί συστατικό του εξωτερικού περιβλήματος όλων των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Το LPS έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί απόπτωση σε διάφορα κύτταρα και ιστούς, όπως μακροφάγα [54], ενδοθηλιακά κύτταρα [55] και πνεύμονες ποντικού [56]. Ένα προκαταρκτικό πείραμα έδειξε ότι η έκθεση σε LPS σε ονομαστική συγκέντρωση 0,1 mg/mL για 24 ώρες προκάλεσε σημαντικά την απόπτωση των αιμοκυττάρων από το M. coruscus. Μετά την υπερέκφραση του McIL{19}}, το επίπεδο απόπτωσης των αιμοκυττάρων του M. coruscus αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, υποδηλώνοντας ότι το McIL-17-3 μπορεί να ενισχύσει την επαγόμενη από LPS απόπτωση των αιμοκυττάρων στο M. coruscus. Τα τρέχοντα αποτελέσματα ήταν συνεπή με ορισμένες προηγούμενες μελέτες. Στα ανθρώπινα ουδετερόφιλα, η IL-17A θα μπορούσε να μειώσει τις αντι-αποπτωτικές επιδράσεις που προκαλούνται από τον παράγοντα διέγερσης αποικιών μακροφάγων κοκκιοκυττάρων [57]. Η IL-17 επάγει την απόπτωση των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων, η οποία είναι ένας πιθανός μηχανισμός του οξέος στεφανιαίου συνδρόμου [58]. Η γενετική διαγραφή της IL{28}}Α μειώνει την απόπτωση των κυψελιδικών κυττάρων τύπου II και έτσι ανακουφίζει τη χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια [59]. Ωστόσο, εξακολουθούν να υπάρχουν ορισμένα αντίθετα επιχειρήματα. Όταν τα ποντίκια μολύνονται από τον ιό της εγκεφαλομυελίτιδας ποντικού Theiler, η IL-6 και η IL-17 συνεργικά προάγουν την επιμονή του ιού αναστέλλοντας την κυτταρική απόπτωση [60]. Αυτές οι συγκρούσεις υποδηλώνουν ότι ο υποκείμενος μηχανισμός της απόπτωσης που μεσολαβείται από την IL-17-είναι περίπλοκος και ότι η IL-17 μπορεί να παίζει αντίθετες λειτουργίες ανάλογα με τον τύπο της λοίμωξης.
Όταν το McIL-17-3 συνεπιμολύνθηκε με το Mc-novel_miR_145, το επίπεδο απόπτωσης που προκλήθηκε από το LPS ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε σύγκριση με το μοναδικό McIL{-17-3 που επιμολύνθηκε ομάδα, αντίστοιχα, το επίπεδο απόπτωσης ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω μετά τη συνεπιμόλυνση McIL-17-3 με αναστολέα Mc-novel_miR_145. Το Mc-novel_miR_145 έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει αρνητικά το McIL-17-3 και επομένως καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το McIL-17-3 επιδείνωσε την απόπτωση των αιμοκυττάρων που προκαλείται από το LPS, ενώ το Mc-novel Το _miR_145 μετρίασε τις επιπτώσεις. Αρκετά miRNAs που έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται στην απόπτωση κυττάρων ανθρώπου και ποντικού εντοπίστηκαν σε μαλάκια τα τελευταία χρόνια. Για παράδειγμα, τα miR-125b και miR- 335 βρέθηκαν στο επίπεδο στρείδι Ostrea edulis [21], το miR-184 βρέθηκε σε αιμοκύτταρα του στρειδιού Crassostrea gigas [23] και miR{{ 26}}, -29, -96, -182 και -193 βρέθηκαν στο αναγεννητικό κεντρικό νευρικό σύστημα του L. stagnalis [25]. Αυτά τα σχετιζόμενα με την απόπτωση miRNAs που ταυτοποιήθηκαν μέσω προσδιορισμού αλληλουχίας υψηλής απόδοσης και βιολογικών υπολογισμών επιβεβαιώνουν την ύπαρξη απόπτωσης που προκαλείται από miRNA στα μαλάκια. Οι Chen et al. ανέφερε μια ανοδική ρύθμιση του miR-2d μετά την πρόκληση Vibrio splendidus στα αιμοκύτταρα του Crassostrea gigas. Η υπερέκφραση του miR{37}}d συσχετίστηκε με μια κατακόρυφη έκφραση του IκB2 και μια σημαντική αύξηση του ρυθμού φαγοκυττάρωσης αιμοκυττάρων, που συνδέεται με καταστολή της απόπτωσης [31]. Τα αποτελέσματα ήταν συνεπή με την τρέχουσα μελέτη μας, συλλογικά, φαίνεται να υπονοούν ότι τα miRNAs ασκούν ανασταλτική λειτουργία στην απόπτωση των κυττάρων στα μαλάκια. Στην πραγματικότητα, τα περισσότερα από τα σχετιζόμενα με την απόπτωση miRNA στους ανθρώπους έχουν δείξει ανασταλτικά αποτελέσματα στην απόπτωση. Το MiR{42}} προστατεύει τα κύτταρα A549 και H1975 από την επαγόμενη από το LPS απόπτωση και τον φλεγμονώδη τραυματισμό μέσω της ανοδικής ρύθμισης του Sirt1, εμποδίζοντας έτσι τις οδούς NF-κB και Notch [61]. Επιπλέον, το miR-146 εξασθενεί την απόπτωση των ηπατοκυττάρων που προκαλείται από την ακτινοβολία και το LPS μέσω της αναστολής της οδού TLR4 [62]. Το MiR-93 αναστέλλει την απόπτωση των χονδροκυττάρων στην οστεοαρθρίτιδα στοχεύοντας το μονοπάτι σηματοδότησης TLR4/NF-κB [63]. Το MiR-129-5p ανακουφίζει τον τραυματισμό του νωτιαίου μυελού σε ποντίκια μέσω της καταστολής της απόπτωσης μέσω της οδού HMGB1/TLR4/NF-κB [64]. Ωστόσο, εξακολουθούν να υπάρχουν ορισμένα συγκεκριμένα miRNA που δείχνουν ενισχυτικές δράσεις στην απόπτωση. Για παράδειγμα, το miR-203 βρέθηκε ότι επιταχύνει την απόπτωση που προκαλείται από LPS στοχεύοντας το PIK3CA σε κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα [65]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν την πολυπλοκότητα του υποκείμενου μηχανισμού της απόπτωσης που προκαλείται από miRNA.
4. Υλικά και Μέθοδοι
4.1. Πειραματικό σχέδιο
Πρώτον, το McIL-17-3 αναγνωρίστηκε και χαρακτηρίστηκε από το M. coruscus μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης. Κατόπιν αυτού, η κατανομή ιστού των μεταγραφών McIL-17-3 καθώς και η απόκρισή του στη βακτηριακή πρόκληση αξιολογήθηκαν με ποσοτικές δοκιμές PCR σε πραγματικό χρόνο (qPCR). Στη συνέχεια, η συσχέτιση μεταξύ McIL-17-3 και Mc-novel{_miR_145 προσδιορίστηκε με ανάλυση αναφοράς λουσιφεράσης που πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα HEK293 και αιμοκύτταρα M. coruscus. Επιπλέον, ο λειτουργικός τους ρόλος στην απόπτωση που προκαλείται από LPS αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής.
4.2. Τεχνητό θαλασσινό νερό
Μετά από τρεις ημέρες αερισμού του δημοτικού νερού βρύσης, προστέθηκε στιγμιαίος θαλάσσιος κρύσταλλος (Haiding LTD, Ji'an, Κίνα), αναδεύτηκε καλά και έλιωσε για να φτάσει σε αλατότητα 30‰. Το διαμορφωμένο τεχνητό θαλασσινό νερό πρέπει να αερίζεται για 2 ώρες πριν χρησιμοποιηθεί.
4.3. Των ζώων
Το μύδι με χοντρό κέλυφος M. coruscus (μήκος κελύφους, 9,82 ± 0,53 cm, πλάτος κελύφους, 4,68 ± 0,45 cm· υγρό βάρος, 71,2 ± 2,7 g) αγοράστηκε από την αγορά Donghe στο Zhoushan, στην επαρχία Zhejiang, στην Κίνα. Όλα τα μύδια διατηρήθηκαν σε δεξαμενές γεμάτες με ASW περίπου 25 ◦C και αλατότητα 30‰ για περισσότερο από μία εβδομάδα πριν από τα επόμενα πειράματα.
4.4. Αναγνώριση cDNA McIL-17-3
Ένα ομόλογο IL-17 (McIL-17-3) κλωνοποιήθηκε σε πυρίτιο από το μεταγραφικό πλήρους μήκους του M. coruscus (αριθμός πρόσβασης: PRJNA798880, F01_μεταγραφή_12404). Η διαδικασία Blast πραγματοποιήθηκε για την πρόβλεψη της πιθανής αλληλουχίας αμινοξέων McIL-17-3, ακολουθούμενη από ανάλυση λειτουργικού τομέα με SMART και αξιολόγηση φυλογενετικής σχέσης με MEGA-X. Η πολλαπλή ευθυγράμμιση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη διαδικασία ClustalW. Το ελβετικό μοντέλο και η ομάδα χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη της τριτοταγούς δομής της πρωτεΐνης McIL-17-3. Η λεπτομερής διαδικασία ήταν σύμφωνα με την προηγούμενη μελέτη μας [66].
4.5. Ποσοτικές δοκιμές PCR σε πραγματικό χρόνο
Οι ποσοτικές δοκιμές PCR σε πραγματικό χρόνο (qPCR) είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την ανίχνευση και τη μέτρηση των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης. Εδώ, η κατανομή ιστού του McIL-17-3 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο qPCR. Επιπλέον, αλλαγές στην έκφραση του mRNA McIL-17-3 σε απόκριση σε βακτηριακή μόλυνση ανιχνεύθηκαν επίσης με qPCR. Το προφίλ κατανομής ιστού του McIL-17-3 προσδιορίστηκε στα βράγχια, τον μανδύα, τους πεπτικούς αδένες, τους γονάδες, τους προσαγωγούς μυς και τα αιμοκύτταρα χρησιμοποιώντας qPCR προγραμματισμένη στους 95 ◦C για 10 λεπτό, ακολουθούμενο από 40 κύκλους των 95 ◦C για 10 s, 60 ◦C για 45 s. Αυτοί οι ιστοί αποκόπηκαν από εννέα άτομα μυδιών και συγκεντρώθηκαν μαζί για να ανακουφίσουν την ατομική διαφοροποίηση. Στο πείραμα βακτηριακής πρόκλησης, χρησιμοποιήθηκε ζωντανός V. alginoliticus ως ερεθίσματα του ανοσοποιητικού. Ένας όγκος 100 μL βακτηρίων διαλυμένων σε θαλασσινό νερό (1 × 108 CFU mL−1) εγχύθηκε στον προσαγωγό των μυδιών. Δεν χρησιμοποιήθηκαν μύδια με ένεση ως έλεγχος. Λήφθηκαν τυχαία εννέα μύδια από κάθε ομάδα στις 0, 3, 6, 12, 24 και 36 ώρες μετά την πρόκληση (hpc). Τα αιμοκύτταρα από τρία μύδια συγκεντρώθηκαν μαζί για να θεωρηθούν ως ένα δείγμα και υπήρχαν τρία δείγματα για κάθε χρονικό σημείο. Τα MicroRNA εξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ εξαγωγής miRNA (HaiGENE, Αρ. Κατ.: B1802) και το cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ cDNA πρώτου κλώνου miRNA miRcute Plus (Tiangen, Αρ. Κατ.: 4992786) και το qPCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το miRcute Plus miRNA qPCR Kit (Tiangen, Αρ. Κατ.: 4992887). Τα γονίδια U6 και -ακτίνης χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικές αναφορές για qPCR και miRNAs qPCR, αντίστοιχα. Τα συγκεκριμένα ζεύγη εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το πείραμα παρατίθενται στον Πίνακα 1. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2−∆∆Ct [67].
Πίνακας 1. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ζεύγη εκκινητών PCR.
4.6. Κυτταρικής καλλιέργειας
Τα κύτταρα HEK293 θηλαστικών (RiboBio Ltd., Guangzhou, Κίνα) χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση των αναλύσεων αναφοράς λουσιφεράσης για τον προσδιορισμό της κατάντη ενεργοποίησης από McIL- 17-3 καθώς και της συσχέτισης μεταξύ του Mc-novel_miR{{ 4}} και McIL-17-3. Τα κύτταρα ΗΕΚ293 καλλιεργήθηκαν σε μέσο OPTI-MEM (GIBCO) στους 37 ◦C, 5% CO2. Για περαιτέρω διερεύνηση της ρύθμισης του McIL-17-3 από τον Mc-novel_miR_145 και του λειτουργικού τους ρόλου στην απόπτωση που προκαλείται από LPS, ανακτήθηκαν αιμοκύτταρα του M. coruscus από τον προσαγωγό του καθενός μύδι με βελόνα μιας χρήσης με διάμετρο 0.5 mm (25 G) που περιέχει 0.5 mL του αντιπηκτικού. Τα αιμοκύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις 3000 rpm, 4 ◦C και προστέθηκε 0,25% τρυψίνη (Solarbio). Τα αιμοκύτταρα εναιωρήθηκαν σε ένα μέσο L-15 που περιείχε 15% εμβρυϊκό βόειο ορό (Solarbio) και καλλιεργήθηκαν στους 26 ◦C με 5% CO2.
4.7. Σύνθεση Μιμητικού και Αναστολέα miRNA
Τα νουκλεοτίδια μιμητικού, αναστολέα και ελέγχου Mc-novel_miR_145 συντέθηκαν από την GenePharma (Σαγκάη). Η σειρά τους είναι η εξής: Mc-novel_miR_145 mimic, 52032- UCCAGAAAAGCGCUUCGGACG-30; Αναστολέας Mc-novel_miR_145, 50 -CGUCCGAAGCG CUUUUCUGGA-30 (χημικά τροποποιημένος κατά 20 Ome). μίμηση αρνητικού ελέγχου, 50 -UUGUA CUACACAAAAGUACUG-30; και αναστολέας αρνητικού ελέγχου, 50 -CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-30 (χημικά τροποποιημένο κατά 20 Ome).
4.8. Luciferase Reporter Analysis
Οι δοκιμασίες αναφοράς λουσιφεράσης χρησιμοποιούνται ευρέως για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης και της ρυθμιστικής δραστηριότητας. Η ποσότητα του φωτός που παράγεται είναι ανάλογη με την ποσότητα του παραγόμενου ενζύμου λουσιφεράσης, το οποίο με τη σειρά του αντανακλά τη δραστηριότητα του ρυθμιστικού στοιχείου. Η δραστικότητα της λουσιφεράσης στη συνέχεια μετράται χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο και τα αποτελέσματα αναλύονται και ερμηνεύονται για να προσδιοριστεί η ρυθμιστική δραστηριότητα του στοιχείου που μελετήθηκε. Χρησιμοποιήθηκαν αναλύσεις αναφοράς Luciferase για την ανάλυση της κατάντη ενεργοποίησης του McIL{{0}}. Σε αυτό το πείραμα, το πλασμίδιο pEGFP-McIL-17-3 (0.1, 0.5 και 1.0 μg/πηγάδι) μαζί με το pGLNF-κb- Το πλασμίδιο αναφοράς luc (0,25 μg/φρεάτιο) συνεπιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293 χρησιμοποιώντας Lipo6000TM για 24 ώρες. Ως έλεγχος χρησιμοποιήθηκε ένα τυφλό πλασμίδιο pEGFP-N1. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το Σύστημα Δοκιμασίας Αναφοράς Διπλής-Λουσιφεράσης® (Promega, Madison, WI, ΗΠΑ) σύμφωνα με την προδιαγραφή, με τη λουσιφεράση Renilla να χρησιμοποιείται ως ενδοέλεγχος. Το Mc-novel_miR_145 που στοχεύει το McIL-17-3 επιβεβαιώθηκε επίσης από αναλύσεις αναφοράς λουσιφεράσης. Ο βιοπληροφορικός υπολογισμός προέβλεψε ότι το Mc-novel_miR_145 μπορεί να στοχεύσει το 30 -UTR του McIL-17-3 και στη συνέχεια κλωνοποίησε το 30 -UTR του McIL{{ 29}} στον φορέα αναφοράς λουσιφεράσης pmiR-RB-ReportTM για την κατασκευή του άγριου πλασμιδίου αναφοράς McIL-17-3-30 UTR-WT. Ο φορέας αναφοράς τύπου μετάλλαξης McIL-17-3-30 UTR-MUT κατασκευάστηκε με μετάλλαξη του νουκλεοτιδίου σε 1023–1040 θέσεις: TCCGAAGCGCTTTTCTGG σε AGGCTTCGCGAAGACC. Ολίγο RNA (Mc-novel_miR_196 NC, μιμητικός, NCi, αναστολέας) διαμολύνθηκε μαζί με McIL-17-3- 3 0 UTR-WT ή McIL-17-3-30 UTR-MUT στο HEK293 κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipo6000TM.
4.9. Ανασυνδυασμένη Έκφραση, Καθαρισμός και Παρασκευή Αντιορού
Για την αξιολόγηση της επίδρασης του Mc-novel_miR_145 στην έκφραση της πρωτεΐνης McIL-17-3, παρασκευάστηκε ένας αντιορός McIL-17-3. Το θραύσμα cDNA που καλύπτει το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) του McIL-17-3 ενισχύθηκε με ένα συγκεκριμένο ζεύγος εκκινητών (Πίνακας 1) και εισήχθη στον φορέα pET-32a. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pET-32a-McIL{{10}} μετασχηματίστηκε σε Escherichia coli (DE3) (Takara) και επωάστηκε σε μέσο LB (που περιέχει 50 mg L−1 καναμυκίνη) στους 37 ◦C με ανακίνηση στις 130 rpm για 4 ώρες. Αφού η οπτική πυκνότητα έφθασε στην απορρόφηση 0.6 στα 600 nm, η ισοπροπυλ-βήτα-D-θειογαλακτοπία εντός (IPTG) με τελική συγκέντρωση 1 mM προστέθηκε στο βακτηριακό διάλυμα για να προκληθεί η έκφραση του ανασυνδυασμένου McIL{ {24}} πρωτεΐνη (rMcIL-17-3). Μετά από επώαση στους 37 ◦C για 6 ώρες, το μέσο φυγοκεντρήθηκε στις 8000 rpm για 30 λεπτά για να συλλεχθούν τα βακτήρια, ακολουθούμενο από εναιώρημα σε ρυθμιστικό TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, ρΗ 8,0). Το rMcIL-17-3 καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας Νι-νιτριλοτριοξικού οξέος (ΝΙ-ΝΤΑ) και η καθαρισμένη πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε διαπίδυση από ιμιδαζόλη για 24 ώρες. Η πρωτεΐνη που προέκυψε απομονώθηκε με μείωση 12% ηλεκτροφόρησης πηκτής SDS-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Η καθαρισμένη πρωτεΐνη αναδιπλώθηκε σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα γλυκερόλης ουρίας-TBS (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM ανηγμένης γλουταθειόνης, 10% γλυκερόλη, 0,2 mM οξειδίου γλουταθειόνης, μια βαθμιδωτή συγκέντρωση ουρίας 6,2, 4, , 1 και 0 Μ ουρία σε κάθε βαθμίδωση, pH 7,4, κάθε βαθμίδα στους 4 ◦C για 12 ώρες). Στη συνέχεια, η πρωτεΐνη που προέκυψε χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοποίηση 6-ποντικών εβδομάδων για να αποκτήσουν πολυκλωνικά αντισώματα.
4.10. Western Blotting
Δείγματα πρωτεΐνης εκχυλίστηκαν από αιμοκύτταρα με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA (Beyotime) και στη συνέχεια η συγκέντρωση ανιχνεύθηκε με κιτ BCA. Μετά την απομόνωση με SDS-PAGE, η πρωτεΐνη μεταφέρθηκε σε μεμβράνες PVDF με σφράγιση με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη σε TBST (20 Mm Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Tween-20, pH 8.0), ακολουθούμενο από το αντίσωμα κατά της επώασης McIL-17-3 όλη τη νύχτα. Στη συνέχεια, οι μεμβράνες επωάστηκαν με ένα αραιωμένο διάλυμα αντισώματος κατσίκας αντι-ποντικού IgG και συζυγούς αλκαλικής φωσφατάσης (Thermo Fisher Scientific, Αρ. Κατ.: 31324) στο δευτερεύον ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης αντισώματος (Beyotime, P0258) για 3 ώρες. Τέλος, οι ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν από το σύστημα ανίχνευσης ECL.
4.11. Απόπτωση
Η απόπτωση των αιμοκυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής σύμφωνα με το εγχειρίδιο του κιτ ανίχνευσης απόπτωσης FITC-Annexin-V (Beyotime). Εν συντομία, τα αιμοκύτταρα που συλλέχθηκαν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με LPS (0.1 mg/mL), 20 nM πλασμιδίου pEGFP-McIL-17-3, Mc novel_miR{{9} } mimic και Mc-novel_miR_145 αναστολέας. Μετά το πλύσιμο με PBS, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν στο μέσο L15 σε τελική συγκέντρωση 1 × 106 κύτταρα mL−1 και χρωματίστηκαν με FITC-Annexin-V και PI επωάζοντας σε θερμοκρασία δωματίου για 25 λεπτά στο σκοτάδι . Τέλος, το όργανο κυτταρομετρίας ροής (Beckman CytoFLEX FCM) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της απόπτωσης των κυττάρων και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό FlowJoTM 10. 4.12. Στατιστική Ανάλυση Τα πειραματικά αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Τα αποτελέσματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας μια αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης ANOVA με τη δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων του Tukey και χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Origin2021 για την ανάλυση των δεδομένων και την κατασκευή σχημάτων.
φυτικό κιστανάκι που ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα
5. Συμπεράσματα
Σε αυτή τη μελέτη, ένα νέο ομόλογο IL-17, το McIL-17-3, αναγνωρίστηκε από το M. coruscus και βρέθηκε ότι παίζει καθοριστικό ρόλο στην ανοσολογική άμυνα των μαλακίων έναντι της βακτηριακής επίθεσης. Επιπλέον, ανακαλύφθηκε ότι το McIL-17-3 ρυθμίζεται αρνητικά από το Mc-novel_miR_145, το οποίο συμβάλλει στη συμμετοχή του στην απόπτωση που προκαλείται από το LPS. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης παρέχουν πολύτιμες γνώσεις για τον ρυθμιστικό ρόλο της IL-17 στην ανοσοαπόκριση των μυδιών και υπογραμμίζουν τη δυνατότητα του μη κωδικοποιητικού RNA στη ρύθμιση των μηχανισμών ανοσολογικής άμυνας των ασπόνδυλων. Ωστόσο, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι υπάρχουν ορισμένοι περιορισμοί σε αυτή τη μελέτη. Συγκεκριμένα, ο μηχανισμός στον οποίο βασίζεται ο τρόπος δράσης του McIL-17-3 δεν μελετήθηκε και απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Επιπλέον, αυτή η μελέτη επικεντρώθηκε μόνο στην αλληλεπίδραση μεταξύ του Mc-novel_miR_145 και του McIL-17-3 και δεν διερεύνησε την πιθανή εμπλοκή άλλων miRNAs στην ανοσολογική απόκριση. Συνολικά, αυτή η μελέτη υπογραμμίζει τον σημαντικό ρόλο του μη κωδικοποιητικού RNA στους μηχανισμούς άμυνας του ανοσοποιητικού συστήματος και προτείνει ότι η διαμόρφωσή τους θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως πιθανή στρατηγική για στοχευμένες θεραπείες για διάφορες ασθένειες.
βιβλιογραφικές αναφορές
1. Medzhitov, R.; Janeway, C., Jr. Έμφυτη ανοσία. N. Engl. J. Med. 2000, 343, 338–344. [CrossRef] [PubMed]
2. Lacy, Ρ.; Stow, JL Απελευθέρωση κυτοκίνης από έμφυτα ανοσοκύτταρα: Συσχέτιση με ποικίλες οδούς διακίνησης μεμβρανών. Blood J. Am. Soc. Αιματόλη. 2011, 118, 9–18. [CrossRef] [PubMed]
3. Dinarello, CA Προφλεγμονώδεις κυτοκίνες. Chest 2000, 118, 503–508. [CrossRef] [PubMed]
4. Rauta, PR; Nayak, Β.; Das, S. Ανοσιακό σύστημα και ανοσολογικές αποκρίσεις στα ψάρια και ο ρόλος τους στη συγκριτική μελέτη ανοσίας: Ένα μοντέλο για ανώτερους οργανισμούς. Immunol. Κάτοικος της Λατβίας. 2012, 148, 23–33. [CrossRef]
5. Hymowitz, SG; Filvaroff, EH; Yin, J.; Lee, J.; Cai, L.; Risser, Ρ.; Maruoka, Μ.; Mao, W.; Foster, J.; Οι Kelley, RF IL-17 υιοθετούν μια πτυχή κόμβου κυστίνης: Δομή και δραστηριότητα μιας νέας κυτοκίνης, IL-17F, και συνέπειες για τη δέσμευση του υποδοχέα. EMBO J. 2001, 20, 5332–5341. [CrossRef]
6. Buckley, KM; Ho, ECH; Hibino, Τ.; Schrankel, CS; Schuh, NW; Wang, GZ; Οι παράγοντες Rast, JP IL17 είναι πρώιμοι ρυθμιστές στο επιθήλιο του εντέρου κατά τη διάρκεια της φλεγμονώδους απόκρισης στο Vibrio στην προνύμφη του αχινού. eLife 2017, 6, e23481. [CrossRef]
7. Cua, DJ; Tato, CM Innate IL-17-που παράγουν κύτταρα: Οι φρουροί του ανοσοποιητικού συστήματος. Nat. Rev. Immunol. 2010, 10, 479-489. [CrossRef]
8. Μύλοι, KH IL-17 και IL-17-που παράγουν κύτταρα σε προστασία έναντι παθολογίας. Nat. Rev. Immunol. 2022, 10, 479–489. [CrossRef]
9. Hibino, Τ.; Loza-Coll, Μ.; Messier, C.; Majeske, AJ; Cohen, AH; Terwilliger, DP; Buckley, KM; Brockton, V.; Nair, SV; Berney, K. Το ρεπερτόριο του ανοσοποιητικού γονιδίου κωδικοποιείται στο γονιδίωμα του πορφυρού αχινού. Dev. Biol. 2006, 300, 349–365. [CrossRef]
10. Albertin, CB; Simakov, Ο.; Μήτρος, Τ.; Wang, ZY; Pungor, JR; Edsinger-Gonzales, Ε.; Brenner, S.; Ragsdale, CW; Rokhsar, DS Το γονιδίωμα του χταποδιού και η εξέλιξη των νευρικών και μορφολογικών καινοτομιών των κεφαλόποδων. Nature 2015, 524, 220–224. [CrossRef]
11. Saco, Α.; Rey-Campos, Μ.; Rosani, U.; Novoa, Β.; Figueras, A. Η εξέλιξη και η ποικιλομορφία της ιντερλευκίνης-17 υπογραμμίζουν μια επέκταση στα θαλάσσια ασπόνδυλα και τον διατηρημένο ρόλο της στην ανοσία του βλεννογόνου. Εμπρός. Immunol. 2021, 12, 692997. [CrossRef] [PubMed]
12. Gerdol, Μ.; Moreira, R.; Cruz, F.; Gómez-Garrido, J.; Vlasova, Α.; Rosani, U.; Venier, Ρ.; Naranjo-Ortiz, MA; Murgarella, Μ.; Greco, S. Η μαζική παραλλαγή παρουσίας-απουσίας γονιδίου διαμορφώνει ένα ανοιχτό παν-γονιδίωμα στο μεσογειακό μύδι. Genome Biol. 2020, 21, 1–21. [CrossRef]
13. Cao, Υ.; Yang, S.; Feng, C.; Zhan, W.; Zheng, Ζ.; Wang, Q.; Deng, Υ.; Jiao, Υ.; Du, X. Εξέλιξη και ανάλυση λειτουργίας του γονιδίου ιντερλευκίνης-17 από Pinctada fucata martensii. Fish Shellfish Immunol. 2019, 88, 102–110. [CrossRef] [PubMed]
14. Wang, Q.; Xiao, G.; Αγκαλιάζω.; Chen, R.; Li, Μ.; Το Teng, S. Interleukin-17D μεσολαβεί στις αλλαγές που σχετίζονται με τη μόλυνση από το Vibrio harveyi στο Tegillarca granulosa μέσω της ενεργοποίησης της πρωτεΐνης ενεργοποιητή 1 in vivo. Aquaculture 2023, 566, 739178. [CrossRef]
15. Lv, X.; Sun, J.; Li, Υ.; Yang, W.; Wang, L.; Leng, J.; Yan, Χ.; Guo, Ζ.; Yang, Q.; Ο Wang, L. CgIL17-5 ρυθμίζει τις εκφράσεις mRNA των ανοσοενεργών μέσω της πρόκλησης της φωσφορυλίωσης των CgMAPK και της πυρηνικής μετατόπισης των CgRel και CgAP-1 στο στρείδι του Ειρηνικού Crassostrea gigas. Dev. Comp. Immunol. 2022, 127, 104263. [CrossRef] [PubMed]
16. Wang, L.; Sun, J.; Wu, Ζ.; Lian, Χ.; Han, S.; Huang, S.; Yang, C.; Wang, L.; Το τραγούδι, L. AP-1 ρυθμίζει την έκφραση της IL17-4 και της IL17-5 στο στρείδι του Ειρηνικού Crassostrea gigas. Fish Shellfish Immunol. 2020, 97, 554–563. [CrossRef]
17. Wu, S.-Z.; Huang, X.-D.; Li, Q.; Αυτός, Μ.-Χ. Ιντερλευκίνη-17 σε μαργαριταρένιο στρείδι (Pinctada fucata): Μοριακή κλωνοποίηση και λειτουργικός χαρακτηρισμός. Fish Shellfish Immunol. 2013, 34, 1050–1056. [CrossRef]
18. Xin, L.; Zhang, Η.; Zhang, R.; Li, Η.; Wang, W.; Wang, L.; Wang, Η.; Qiu, L.; Song, L. CgIL17-5, μια αρχαία φλεγμονώδης κυτοκίνη στο Crassostrea gigas που εμφανίζει τις λειτουργίες ετερογένειας σε σύγκριση με τα μόρια ιντερλευκίνης17 σπονδυλωτών. Dev. Comp. Immunol. 2015, 53, 339–348. [CrossRef]
19. Denli, AM; Μπλούζες, BB; Plasterk, RH; Ketting, RF; Hannon, GJ Επεξεργασία πρωτογενών microRNA από το σύμπλεγμα μικροεπεξεργαστή. Nature 2004, 432, 231–235. [CrossRef]
20. Khan, D.; Ansar Ahmed, S. Ρύθμιση της IL-17 σε αυτοάνοσα νοσήματα από μεταγραφικούς παράγοντες και microRNA. Εμπρός. Genet. 2015, 6, 236. [CrossRef]
21. Martín-Gómez, L.; Villalba, Α.; Kerkhoven, RH; Apollo, E. Ο ρόλος των microRNAs στη διαδικασία ανοσίας του επίπεδου στρειδιού Ostrea edulis κατά της μυϊκής μύσης. Μολύνω. Genet. Evol. 2014, 27, 40–50. [CrossRef] [PubMed]
22. Xu, F.; Wang, X.; Feng, Υ.; Huang, W.; Wang, W.; Li, L.; Fang, Χ.; Que, Η.; Zhang, G. Ταυτοποίηση διατηρημένων και νέων microRNAs στο στρείδι του Ειρηνικού Crassostrea gigas με βαθιά αλληλούχιση. PLoS ONE 2014, 9, e104371. [CrossRef]
23. Zhou, Ζ.; Wang, L.; Song, L.; Liu, R.; Zhang, Η.; Huang, Μ.; Chen, H. Η αναγνώριση και τα χαρακτηριστικά των σχετιζόμενων με το ανοσοποιητικό microRNAs σε αιμοκύτταρα του oyster Crassostrea gigas. PLoS ONE 2014, 9, e88397. [CrossRef] [PubMed]
24. Burgos-Aceves, MA; Cohen, Α.; Smith, Υ.; Faggio, C. Πιθανή ρύθμιση microRNA γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σε αιμοκύτταρα ασπόνδυλων. Sci. Σύνολο Περιβάλλοντος. 2018, 621, 302–307. [CrossRef]
25. Walker, SE; Spencer, GE; Necakov, Α.; Carlone, RL Αναγνώριση και χαρακτηρισμός microRNA κατά τη διάρκεια της επαγόμενης από ρετινοϊκό οξύ αναγέννησης ενός κεντρικού νευρικού συστήματος μαλακίων. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2018, 19, 2741. [CrossRef] [PubMed]
26. Abo-Al-Ela, HG; Faggio, C. Απόκριση στρες που προκαλείται από MicroRNA σε δίθυρα είδη. Ecotoxicol. Περιβάλλω. Saf. 2021, 208, 111442. [CrossRef] [PubMed]
27. Huang, S.; Yoshitake, Κ.; Asaduzzaman, Μ.; Kinoshita, S.; Watanabe, S.; Asakawa, S. Ανακάλυψη και λειτουργική κατανόηση των miRNAs στα μαλάκια: Μια προσέγγιση προφίλ σε όλο το γονιδίωμα. RNA ΒίοΙ. 2021, 18, 1702–1715. [CrossRef]
28. Rosani, U.; Bortoletto, Ε.; Bai, C.-M.; Novoa, Β.; Figueras, Α.; Venier, Ρ.; Fromm, B. Digging into bivalve miRNAomes: Between conservation and innovation. Philos. Μεταφρ. R. Soc. B 2021, 376, 20200165. [CrossRef]
29. Sun, X.; Zhang, Τ.; Li, L.; Tu, Κ.; Yu, Τ.; Wu, Β.; Zhou, L.; Tian, J.; Liu, Z. Υπογραφή έκφρασης MicroRNA στους γραμμωτούς και λείους μύες προσαγωγών του Yesso scallop Patinopecten yessoensis. Genomics 2022, 114, 110409. [CrossRef]
30. Tian, R.; Zheng, Ζ.; Huang, R.; Jiao, Υ.; Οι Du, X. miR-29a συμμετείχαν στον σχηματισμό ρινικού και στην ανοσολογική απόκριση στοχεύοντας το Y2R στο Pinctada martensii. Int. J. ΜοΙ. Sci. 2015, 16, 29436–29445. [CrossRef]
31. Chen, Η.; Zhou, Ζ.; Wang, Η.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, R.; Qiu, L.; Song, L. Ένα microRNA ειδικό για ασπόνδυλα και ανοσοαποκρινόμενο αυξάνει τη φαγοκυττάρωση αιμοκυττάρων στρειδιών στοχεύοντας το CgIκB2. Sci. Απ. 2016, 6, 1–10. [CrossRef] [PubMed]
32. Chen, Η.; Zhou, Ζ.; Wang, L.; Wang, Η.; Liu, R.; Zhang, Η.; Song, L. Ένα ειδικό για ασπόνδυλα miRNA στόχευε το αρχαίο χολινεργικό νευροενδοκρινικό σύστημα των στρειδιών. Open Biol. 2016, 6, 160059. [CrossRef]
33. Chen, Η.; Xin, L.; Τραγούδι, Χ.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, Ζ.; Zhang, Η.; Wang, L.; Zhou, Ζ.; Qiu, L. Ένα ανταποκρινόμενο στη νορεπινεφρίνη miRNA προάγει άμεσα την έκφραση του CgHSP90AA1 σε αιμοκύτταρα στρειδιών κατά την αποξήρανση. Fish Shellfish Immunol. 2017, 64, 297–307. [CrossRef] [PubMed]
34. Han, Ζ.; Li, J.; Wang, W.; Li, J.; Zhao, Q.; Li, Μ.; Wang, L.; Song, L. Μια καλμοδουλίνη που στοχεύει το ικρίωμα miRNA659_26519 ρυθμίζει την έκφραση της IL-17 στην πρώιμη ανοσοαπόκριση του στρειδιού Crassostrea gigas. Dev. Comp. Immunol. 2021, 124, 104180. [CrossRef] [PubMed]
35. Lv, Ζ.; Li, C.; Zhang, Ρ.; Wang, Ζ.; Zhang, W.; Jin, C.-H. Το miR-200 ρυθμίζει τις αντιβακτηριακές δραστηριότητες των κελομοκυττάρων και την εκκίνηση του LPS μέσω στόχευσης Tollip στο Apostichopus japonicus. Fish Shellfish Immunol. 2015, 45, 431–436. [CrossRef]
36. Li, C.; Zhao, Μ.; Zhang, C.; Zhang, W.; Zhao, Χ.; Duan, Χ.; Το Xu, W. miR210 ρυθμίζει την αναπνευστική έκρηξη σε Apostichopus japonicus coelomocytes μέσω στόχευσης υποδοχέα τύπου Toll. Dev. Comp. Immunol. 2016, 65, 377–381. [CrossRef]
37. Lv, Μ.; Chen, Η.; Shao, Υ.; Li, C.; Zhang, W.; Zhao, Χ.; Jin, C.; Ο Xiong, J. miR-92a ρυθμίζει την απόπτωση των κελομοκυττάρων στο αγγούρι Apostichopus japonicus μέσω στόχευσης Aj14-3-3ζ in vivo. Fish Shellfish Immunol. 2017, 69, 211–217. [CrossRef]
38. Shao, Υ.; Li, C.; Xu, W.; Zhang, Ρ.; Zhang, W.; Το Zhao, X. miR-31 συνδέει τον μεταβολισμό των λιπιδίων και την κυτταρική απόπτωση στον Apostichopus japonicus που προκαλείται από βακτήρια μέσω της στόχευσης του CTRP9. Εμπρός. Immunol. 2017, 8, 263. [CrossRef]
39. Guo, Μ.; Wang, Υ.; Fu, Χ.; Tao, W.; Ο Li, C. circRNA1149 από το Apostichopus japonicus καταστέλλει την απόπτωση των κελομοκυττάρων που δρα ως miR-92ένας σφουγγάρι για τη ρύθμιση της έκφρασης Bax ως απόκριση στη μόλυνση από Vibrio splendidus. Aquaculture 2023, 562, 738812. [CrossRef]
40. Zuo, Η.; Weng, Κ.; Luo, Μ.; Yang, L.; Weng, S.; He, J.; Xu, X. A MicroRNA-1–Μεσολαβημένη αναστολή του μονοπατιού NF-κB από το μονοπάτι JAK-STAT στο Ασπόνδυλο Litopenaeus vannamei. J. Immunol. 2020, 204, 2918–2930. [CrossRef]
41. Yang, Η.; Xu, Ζ.; Guo, Β.; Zhang, Χ.; Liao, Ζ.; Qi, Ρ.; Yan, X. Η ολοκληρωμένη ανάλυση του miRNAome και του transcriptome αποκαλύπτει τη ρύθμιση του δικτύου miRNA-mRNA σε μολυσμένο Vibrio alginolyticus μύδι με παχύ κέλυφος Mytilus coruscus. ΜοΙ. Immunol. 2021, 132, 217–226. [CrossRef] [PubMed]
42. de Morales, JMGR; Puig, L.; Daudén, Ε.; Cañete, JD; Pablos, JL; Martín, AO; Juanatey, CG; Adán, Α.; Montalbán, X.; Borruel, N. Κρίσιμος ρόλος της ιντερλευκίνης (IL)-17 σε φλεγμονώδεις και ανοσολογικές διαταραχές: Μια ενημερωμένη ανασκόπηση των αποδεικτικών στοιχείων που επικεντρώνονται σε διαμάχες. Αυτοάνοσο. Αναθ. 2020, 19, 102429. [CrossRef] [PubMed]
43. Kawaguchi, Μ.; Adachi, Μ.; Oda, Ν.; Kokubu, F.; Huang, S.-K. IL-17 οικογένεια κυτοκινών. J. Allergy Clin. Immunol. 2004, 114, 1265–1273. [CrossRef] [PubMed]
44. Starnes, Τ.; Broxmeyer, HE; Robertson, MJ; Hromas, R. Αιχμή: Η IL-17D, ένα νέο μέλος της οικογένειας IL-17, διεγείρει την παραγωγή κυτοκίνης και αναστέλλει την αιμοποίηση. J. Immunol. 2002, 169, 642–646. [CrossRef] [PubMed]
45. Gaffen, SL; Kramer, JM; Jeffrey, JY; Shen, F. Η οικογένεια κυτοκινών IL-17. Βιταμίνη. Horm. 2006, 74, 255–282. [PubMed]
46. Roberts, S.; Gueguen, Υ.; de Lorgeril, J.; Goetz, F. Ταχεία συσσώρευση μεταγραφής ομόλογου ιντερλευκίνης 17 σε αιμοκύτταρα Crassostrea gigas μετά από βακτηριακή έκθεση. Dev. Comp. Immunol. 2008, 32, 1099–1104. [CrossRef] [PubMed]
47. Li, J.; Zhang, Υ.; Zhang, Υ.; Xiang, Ζ.; Tong, Υ.; Qu, F.; Yu, Z. Γονιδιωματικός χαρακτηρισμός και ανάλυση έκφρασης πέντε νέων γονιδίων IL-17 στο στρείδι του Ειρηνικού, Crassostrea gigas. Fish Shellfish Immunol. 2014, 40, 455–465. [CrossRef]
48. Gaffen, SL Δομή και σηματοδότηση στην οικογένεια υποδοχέων IL-17. Nat. Rev. Immunol. 2009, 9, 556–567. [CrossRef]
49. Hata, Κ.; Andoh, Α.; Shimada, Μ.; Fujino, S.; Bamba, S.; Araki, Υ.; Okuno, Τ.; Fujiyama, Υ.; Το Bamba, T. IL-17 διεγείρει φλεγμονώδεις αποκρίσεις μέσω οδών κινάσης NF-κB και MAP σε ανθρώπινους μυοϊνοβλάστες του παχέος εντέρου. Είμαι. J. Physiol. -Γαστρεντερικό τεστ. ήπατος Physiol. 2002, 282, G1035–G1044. [CrossRef]
50. Niimoto, Τ.; Nakasa, Τ.; Ishikawa, Μ.; Okuhara, Α.; Izumi, Β.; Deie, Μ.; Suzuki, Ο.; Adachi, Ν.; Ochi, M. MicroRNA-146a εκφράζεται σε κύτταρα Τ που παράγουν ιντερλευκίνη-17 σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα. Μυοσκελετικό BMC. Διαταραχή. 2010, 11, 1–11. [CrossRef]
51. Srivastava, Α.; Nikamo, Ρ.; Lohcharoenkal, W.; Li, D.; Meisgen, F.; Landén, NX; Ståhle, Μ.; Pivarcsi, Α.; Sonkoly, E. MicroRNA- 146a καταστέλλει τη φλεγμονή του δέρματος που προκαλείται από την IL-17 και σχετίζεται γενετικά με την ψωρίαση. J. Allergy Clin. Immunol. 2017, 139, 550–561. [CrossRef] [PubMed]
52. Zhao, S.; Cheng, Υ.; Το Kim, JG microRNA-146a ρυθμίζει προς τα κάτω την IL-17 και την IL-35 και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των βλαστοκυττάρων ανθρώπινου περιοδοντικού συνδέσμου. J. Cell. Biochem. 2019, 120, 13861–13866. [CrossRef] [PubMed]
53. Podsiad, Α.; Standiford, TJ; Ballinger, MN; Eakin, R.; Park, Ρ.; Kunkel, SL; Moore, BB; Το Bhan, U. MicroRNA-155 ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση του ξενιστή στην μεταιική βακτηριακή πνευμονία μέσω της οδού IL{-23/IL-17. Είμαι. J. Physiol. -Κύτταρο πνεύμονα. ΜοΙ. Physiol. 2016, 310, L465–L475. [CrossRef]
54. Xaus, J.; Comalada, Μ.; Valledor, AF; Lloberas, J.; López-Soriano, F.; Argilés, JM; Bogdan, C.; Celada, A. LPS επάγει απόπτωση σε μακροφάγα κυρίως μέσω της αυτοκρινούς παραγωγής του TNF-. Blood J. Am. Soc. Αιματόλη. 2000, 95, 3823–3831.
55. Bannerman, DD; Goldblum, SE Μηχανισμοί ενδοθηλιακής απόπτωσης που προκαλείται από βακτηριακό λιποπολυσακχαρίτη. Είμαι. J. Physiol.-Lung Cell. ΜοΙ. Physiol. 2003, 284, L899–L914. [CrossRef]
56. Brass, DM; Hollingsworth, JW; Cinque, Μ.; Li, Ζ.; Potts, Ε.; Τολόζα, Ε.; Foster, WM; Schwartz, DA Η χρόνια εισπνοή LPS προκαλεί αλλαγές που μοιάζουν με εμφύσημα στον πνεύμονα του ποντικού που σχετίζονται με απόπτωση. Είμαι. J. Respir. Cell ΜοΙ. Biol. 2008, 39, 584–590. [CrossRef]
57. Dragon, S.; Saffar, AS; Shan, L.; Gounni, AS IL-17 εξασθενεί τις αντι-αποπτωτικές επιδράσεις του GM-CSF σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα. ΜοΙ. Immunol. 2008, 45, 160–168. [CrossRef] [PubMed]
58. Zhu, F.; Wang, Q.; Guo, C.; Wang, X.; Cao, Χ.; Shi, Υ.; Gao, F.; Μακ.; Zhang, L. IL-17 επάγει την απόπτωση των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων - Ένας πιθανός μηχανισμός για το οξύ στεφανιαίο σύνδρομο του ανθρώπου. Clin. Immunol. 2011, 141, 152–160. [CrossRef]
59. Chang, Υ.; Al-Alwan, L.; Audusseau, S.; Chouiali, F.; Carlevaro-Fita, J.; Iwakura, Υ.; Baglole, CJ; Eidelman, DH; Hamid, Q. Η γενετική διαγραφή της IL-17A μειώνει τη φλεγμονή που προκαλείται από τον καπνό του τσιγάρου και την απόπτωση των κυψελιδικών κυττάρων τύπου II. Είμαι. J. Physiol. -Κύτταρο πνεύμονα. ΜοΙ. Physiol. 2014, 306, L132–L143. [CrossRef]
60. Hou, W.; Jin, Υ.-Η.; Kang, HS; Η Kim, η BS Ιντερλευκίνη-6 (IL-6) και η IL-17 προάγουν συνεργικά την ιική επιμονή αναστέλλοντας την κυτταρική απόπτωση και τη λειτουργία των κυτταροτοξικών Τ κυττάρων. J. Virol. 2014, 88, 8479–8489. [CrossRef]
61. Wang, Q.; Li, D.; Han, Υ.; Ding, X.; Xu, Τ.; Tang, B. MicroRNA-146 προστατεύει τα κύτταρα A549 και H1975 από την απόπτωση που προκαλείται από το LPS και τον τραυματισμό φλεγμονής. J. Biosci. 2017, 42, 637–645. [CrossRef] [PubMed]
62. Chen, Υ.; Wu, Ζ.; Yuan, Β.; Dong, Υ.; Zhang, L.; Το Zeng, Z. MicroRNA-146a-5p εξασθενεί την επαγόμενη από ακτινοβολία και την επαγόμενη από LPS ενεργοποίηση ηπατικών αστερικών κυττάρων και την απόπτωση ηπατοκυττάρων μέσω της αναστολής της οδού TLR4. Cell Death Dis. 2018, 9, 1–16. [CrossRef] [PubMed]
63. Ding, Υ.; Wang, L.; Zhao, Q.; Wu, Ζ.; Το Kong, L. MicroRNA-93 αναστέλλει την απόπτωση και τη φλεγμονή των χονδροκυττάρων στην οστεοαρθρίτιδα στοχεύοντας το μονοπάτι σηματοδότησης TLR4/NF-κB. Int. J. ΜοΙ. Med. 2019, 43, 779–790. [CrossRef]
64. Wan, G.; Οποιος.; Tao, J.; Wang, Υ.; Zhou, Q.; Yang, R.; Το Liang, Q. MicroRNA-129-5p ανακουφίζει τον τραυματισμό του νωτιαίου μυελού σε ποντίκια μέσω της καταστολής της απόπτωσης και της φλεγμονώδους απόκρισης μέσω της οδού HMGB1/TLR4/NF-κB. Biosci. Απ. 2020, 40, BSR20193315. [CrossRef] [PubMed]
65. Ke, X.-F.; Fang, J.; Wu, Χ.-Ν.; Yu, C.-H. Το MicroRNA-203 επιταχύνει την απόπτωση σε κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα που διεγείρονται από LPS στοχεύοντας το PIK3CA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014, 450, 1297–1303. [CrossRef] [PubMed]
66. Qi, Ρ.; Tang, Z. Το μόριο Nrf2 ενεργοποιεί την αντιοξειδωτική άμυνα έναντι της οξείας έκθεσης στο βενζο(α)πυρένιο στο μύδι με παχύ κέλυφος Mytilus coruscus. Aquat Toxicol 2020, 226, 105554. [CrossRef]
67. Schmittgen, TD; Livak, KJ Ανάλυση δεδομένων PCR σε πραγματικό χρόνο με τη συγκριτική μέθοδο CT. Nat. Πρωτοκ. 2008, 3, 1101–1108. [CrossRef]