Διερεύνηση του θεραπευτικού δυναμικού και των μοριακών μηχανισμών του Cistanche στη θεραπεία του άσθματος

Περίληψη

Ασθμαείναι μια κοινή χρόνια αναπνευστική νόσος που χαρακτηρίζεται από φλεγμονή των αεραγωγών και υπερανταπόκριση, επηρεάζοντας σημαντικά την παγκόσμια υγεία. Οι τρέχουσες θεραπευτικές επιλογές, συμπεριλαμβανομένων των κορτικοστεροειδών, αντιμετωπίζουν περιορισμούς λόγω ποικίλων ανταποκρίσεων και παρενεργειών των ασθενών. Αυτή η μελέτη διερευνά τις θεραπευτικές δυνατότητες του παραδοσιακού κινέζικου βοτάνουCistanche deserticolaσε μοντέλο ποντικιού άσθματος που προκαλείται από ακάρεα οικιακής σκόνης (HDM). Χρησιμοποιήσαμε μια διεπιστημονική προσέγγιση, ενσωματώνοντας μεταγραφική, φασματομετρία μάζας, σταθμισμένη ανάλυση δικτύου συνέκφρασης γονιδίων (WGCNA) και πειραματική επικύρωση τόσο σε ζωικά όσο και σε κυτταρικά μοντέλα.

Τα ευρήματά μας το αποκαλύπτουνCistancheανακουφίζει σημαντικά την υπερανταπόκριση των αεραγωγών, την κυτταρική διήθηση και την υπερπαραγωγή βλέννας σε ασθματικά ποντίκια. Η μεταγραφική ανάλυση εντόπισε 643 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs) καιCistancheη θεραπεία διέκοψε τις οδούς που σχετίζονται με τα IL-4, IL-5 και τα ηωσινόφιλα. Η ανάλυση εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων (GSEA) πρότεινε ότιCistancheμπορεί να εμπλέκεται σε διαδικασίες που σχετίζονται με τα γλυκοκορτικοειδή, υποδεικνύοντας τις δυνατότητές του ως εναλλακτική ή συμπληρωματική θεραπεία σε σχέση με τα παραδοσιακά κορτικοστεροειδή.

Η υγρή χρωματογραφία – φασματομετρία μάζας υψηλής ευκρίνειας (LC-HRMS) προσδιόρισε την Pinoresinol 4-O- -D-γλυκοπυρανοσίδη (PG) ως βασικό ενεργό συστατικό τουCistanche, με στόχους που σχετίζονται κυρίως με το μονοπάτι σηματοδότησης PI3K-AKT. Η ανάλυση WGCNA των συνόλων δεδομένων για το άσθμα προσδιόρισε τη μονάδα "skyblue" ως υψηλά συσχετισμένη με το άσθμα, επισημαίνοντας την επαγώγιμη συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου (iNOS) ως γονίδιο κέντρου. Η μοριακή σύνδεση επιβεβαίωσε ισχυρή συγγένεια σύνδεσης μεταξύ PG και iNOS καιCistancheΗ θεραπεία μείωσε την έκφραση του iNOS, υποδηλώνοντας έναν πιθανό αντιφλεγμονώδη μηχανισμό.

Συμπερασματικά,Cistancheπαρουσιάζει θεραπευτικά αποτελέσματα στο άσθμα απόρυθμίζοντας τις ανοσολογικές αποκρίσειςκαιστόχευση βασικών γονιδίων και πρωτεϊνών που σχετίζονται με το άσθμα. Η μελέτη μας παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τη χρήση φυσικών προϊόντων για τη θεραπεία του άσθματος και υπογραμμίζει τις δυνατότητες τουCistanche ως εναλλακτική ήσυμπληρωματικός θεραπευτικός παράγοντας. Απαιτείται περαιτέρω έρευνα για την επικύρωση αυτών των ευρημάτων και τη διερεύνηση της ενσωμάτωσης τωνCistancheστην κλινική διαχείριση του άσθματος.

Εκχύλισμα Cistanche για τη θεραπεία τηςΆσθμα που προκαλείται από φλεγμονή

Τι πρέπει να λάβουμε εκχύλισμα cisntanche

 

 

1. Ερευνητικό Ιστορικό και Επιστημονικό Ζήτημα

Το άσθμα είναι το πιο διαδεδομένοχρόνια αναπνευστική νόσο, που χαρακτηρίζεται από στένωση των αεραγωγών καιφλεγμονή, που συχνά επιδεινώνεται από την υπερβολική έκκριση βλέννας. Οι παγκόσμιες εκτιμήσεις δείχνουν ότι πάνω από 300 εκατομμύρια άνθρωποι πάσχουν από άσθμα, με τον επιπολασμό του να αυξάνεται σταθερά παγκοσμίως (Joan et al., 2017). Αυτή η αυξανόμενη επιβάρυνση επηρεάζει σημαντικά τα παγκόσμια ποσοστά θνησιμότητας και αναπηρίας (Shin et al., 2023). Επί του παρόντος, οι κύριες θεραπείες βασίζονται σε μεγάλο βαθμό σε συμβατικά φάρμακα όπως τα κορτικοστεροειδή. Ωστόσο, λόγω διαφορών στην παρουσίαση της νόσου και στη φαρμακογονιδιωματική, ένα υποσύνολο ασθενών -όπως εκείνοι με μη ηωσινοφιλικό άσθμα- μπορεί να ανταποκρίνονται ελάχιστα στη θεραπεία με γλυκοκορτικοειδή (Barnes, 2013; Polyxeni et al., 2017). Επιπλέον, παρά την τήρηση των φαρμάκων ελέγχου, ορισμένα άτομα εμφανίζουν μη βέλτιστο έλεγχο της νόσου, με επίμονα και επιδεινούμενα συμπτώματα. Αν και τα υπάρχοντα φάρμακα μπορούν να ανακουφίσουν τα συμπτώματα, συχνά προκαλούν ανεπιθύμητες ενέργειες και έχουν περιορισμένη μακροπρόθεσμη αποτελεσματικότητα (Rachel et al., 2021; Kian Fan et al., 2013). Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για καινοτόμες θεραπευτικές στρατηγικές που διαχειρίζονται αποτελεσματικά τα συμπτώματα του άσθματος στοχεύοντας παράλληλα τους υποκείμενους μοριακούς μηχανισμούς.

Η Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική (TCM), με ιστορία άνω των 2.000 ετών, προσφέρει μια μοναδική προοπτική στη θεραπεία ασθενειών. Αυτό οδήγησε στην ανάπτυξη πολλών συνταγών, όπως π.χZanthoxylum bungeanum Maximσπόροι (ZBMS), οι οποίοι είναι γνωστοί για τις θεραπευτικές τους επιδράσεις στο άσθμα (Tang et al., 2014). Τα τελευταία χρόνια, η TCM έχει κερδίσει την προσοχή ως συμπληρωματική ή εναλλακτική προσέγγιση στη θεραπεία της νόσου. Μελέτες που διεξήχθησαν στις Ηνωμένες Πολιτείες έδειξαν ότι περίπου το 70% των ασθενών με άσθμα ενσωματώνουν φυτικά φάρμακα στα σχέδια θεραπείας τους (Land & Wang, 2018). Πολυάριθμες κλινικές μελέτες έχουν δείξει ευνοϊκά αποτελέσματα στη θεραπεία του άσθματος. Για παράδειγμα, μια πολυκεντρική τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη δοκιμή αποκάλυψε ότι ένας σύνθετος τύπος TCM, οι κόκκοι Pingchuan Yiqi, ανακούφισε αποτελεσματικά τα πνευμονικά συμπτώματα, μείωσε τους δείκτες φλεγμονής και μείωσε την εξάρτηση από 2-αγωνιστές. Σε σύγκριση με τους 2-αγωνιστές και τα κορτικοστεροειδή, αυτή η φόρμουλα TCM έδειξε λιγότερες τοξικές και παρενέργειες (Zhang et al., 2018).

Cistanche deserticola, γνωστό και ως "Jin Ya" ή "Mo Jing", είναι ένα πολυετές ποώδες φυτό με παρασιτική συνήθεια ανάπτυξης. Διανέμεται κυρίως σε άνυδρες περιοχές του βόρειου ημισφαιρίου και η χρήση του στην Κίνα χρονολογείται από αρχαία κείμενα όπως τοShennong Bencao Jing. Cistancheεκτιμάται ιδιαίτερα για την ικανότητά του να ενισχύει τη λειτουργία των νεφρών, να βελτιώνει τη ζωτικότητα και να θρέφει το αίμα και την ουσία (Zhou et al., 2023).

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια πολυεπιστημονική προσέγγιση - συνδυάζοντας μεταγραφική, ανάλυση φασματομετρίας μάζας, WGCNA και πειραματική επικύρωση σε ζωικά και κυτταρικά μοντέλα - για να διερευνήσουμε τις θεραπευτικές δυνατότητες τουCistancheστο άσθμα. Η έρευνά μας εντόπισε συγκεκριμένες δραστικές ενώσεις και διευκρίνισε πιθανούς μηχανισμούς δράσης (βλ. Εικόνα 1). Αυτά τα ευρήματα παρέχουν νέες ιδέες για τη θεραπεία του άσθματος εντός του πεδίου εφαρμογής της TCM και ανοίγουν το δρόμο για περαιτέρω έρευνα σε αυτόν τον τομέα.

 

 

Εικόνα 1. Διάγραμμα ροής εργασιών έρευνας

A.Χρησιμοποιώντας ιστούς πνεύμονα από το μοντέλο άσθματος, πραγματοποιήσαμε λεπτομερή ανάλυση αλληλουχίας μεταγραφών. Αυτό μας έδωσε τη δυνατότητα να εξερευνήσουμε τη μοριακή βάση του άσθματος και να εντοπίσουμε βασικούς στόχους που ρυθμίζονται απόCistanche deserticolaθεραπεία.

B.Με βάση τα μεταγραφικά δεδομένα, χρησιμοποιήσαμε υγρή χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας υψηλής ανάλυσης (LC-HRMS) για να διερευνήσουμε τα χημικά συστατικά τουCistanche. Αυτή η ανάλυση συμπληρώθηκε με έλεγχο ενεργών ενώσεων μέσω της βάσης δεδομένων Φαρμακολογίας Συστημάτων Παραδοσιακής Κινεζικής Ιατρικής (TCMSP). Αυτή η ολοκληρωμένη προσέγγιση οδήγησε τελικά στον προσδιορισμό της πινορεσινόλης 4-O- -D-γλυκοπυρανοσίδης (PG) ως το κύριο βιοδραστικό συστατικόCistanche.

C.Για περαιτέρω διερεύνηση συγκεκριμένων στόχων που σχετίζονται με το άσθμα, πραγματοποιήσαμε Ανάλυση Δικτύου Συνέκφρασης σταθμισμένων γονιδίων (WGCNA). Αυτή η ανάλυση χρησιμοποίησε δεδομένα γονιδιακής έκφρασης για τον εντοπισμό μονάδων που σχετίζονται σημαντικά με την παθολογία του άσθματος. Το γονίδιο hubiNOS(επαγώγιμη συνθάση μονοξειδίου του αζώτου) ταυτοποιήθηκε μέσω μιας ολοκληρωμένης μεθόδου με τέμνουσα υποψήφια γονίδια από κάθε ανάλυση.

D.Διεξήχθη μια μελέτη μοριακής σύνδεσης για την πρόβλεψη της συγγένειας δέσμευσης μεταξύ της ταυτοποιημένης δραστικής ένωσης PG και του iNOS. Ακολούθησε μια σειρά πειραματικών επικυρώσεων.

02. Βασικά ευρήματα και επισημάνσεις

Το Cistanche ανακουφίζει τις παθολογικές αλλαγές σε ασθματικά ποντίκια

Για την αξιολόγηση των επιπτώσεων τουCistanche deserticolaγια το άσθμα, καθιερώθηκαν ζωικά μοντέλα με ή χωρίςCistancheθεραπεία, χρησιμοποιώντας δεξαμεθαζόνη ως θετικό μάρτυρα (Εικόνα 2Α και Συμπληρωματικό Σχήμα 1). Η υπεραπόκριση των αεραγωγών (AHR) αξιολογήθηκε με μέτρηση των τιμών Penh (Εικόνα 2Β και Συμπληρωματικό Σχήμα 1Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική αύξηση στις τιμές Penh σε ποντικούς που εκτέθηκαν σε HDM με αυξημένες συγκεντρώσεις ακετυλοχολίνης σε σύγκριση με ποντίκια ελέγχου. Αντίθετα, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία μεCistancheκατά τη διάρκεια της επαγωγής του μοντέλου έδειξε σημαντική μείωση στις τιμές Penh. Είναι σημαντικό, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία μεCistancheμόνο δεν έδειξε σημαντική διαφορά στις τιμές Penh σε σύγκριση με τους ελέγχους.

Στη συνέχεια, αναλύσαμε τον διαφορικό αριθμό κυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό υγρό πλύσης (BALF), συμπεριλαμβανομένων των συνολικών κυττάρων, των ουδετερόφιλων και των ηωσινόφιλων (Εικόνα 2C και Συμπληρωματικό Σχήμα 1Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική αύξηση στον αριθμό των κυττάρων -ιδιαίτερα των ουδετερόφιλων και των ηωσινόφιλων- σε ποντίκια HDM, αντανακλώντας την αυξημένη πνευμονική φλεγμονή και τις αλλεργικές αποκρίσεις. Αντίθετα, HDM +Cistancheποντίκια εμφάνισαν σημαντική μείωση σε αυτούς τους κυτταρικούς πληθυσμούς στο BALF.

Επιπλέον, η ιστοπαθολογική χρώση των ιστών του πνεύμονα (Εικόνα 2D και Συμπληρωματικό Σχήμα 1C) αποκάλυψε σημαντικά αυξημένες βαθμολογίες φλεγμονής σε ποντίκια που είχαν εκτεθεί σε HDM, τα οποία επέστρεψαν στα αρχικά επίπεδα μετάCistancheπαρέμβαση. Η χρώση PAS επιβεβαίωσε αυτά τα ευρήματα δείχνοντας μια σημαντική αύξηση στην κατανομή των κύπελλων και στην έκκριση βλέννας σε ποντικούς HDM, η οποία μειώθηκε μετάCistancheθεραπεία. Συγκεκριμένα, χαμηλή δόσηCistanche, ιδιαίτερα στα 20 mg/kg, δεν εμφάνισε σημαντικές βελτιώσεις στα AHR ή στα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά, υποδεικνύοντας δοσοεξαρτώμενο αποτέλεσμα (Συμπληρωματικό Σχήμα 1).

Επιπλέον, μετρήθηκαν τα επίπεδα IgE, IL-5 και IL-13 (Εικόνα 2Ε), δείχνοντας αυξημένα επίπεδα σε ποντίκια HDM που αντιστράφηκαν μετάCistancheθεραπεία.

Εικόνα 2. Το Cistanche ανακουφίζει τις παθολογικές αλλαγές σε ασθματικά ποντίκια.
Α. Κατασκευή του μοντέλου άσθματος.
Β. Τιμές Penh για κάθε ομάδα ποντικού που εκτίθεται σε ποικίλες δόσεις ακετυλοχολίνης.
Γ. Αριθμός κυττάρων BALF, συμπεριλαμβανομένων των συνολικών κυττάρων, των ουδετερόφιλων και των ηωσινόφιλων.
Δ. Τομές πνεύμονα από κάθε ομάδα χρωματίστηκαν με H&E και PAS.
Ε. Αποτελέσματα ELISA που δείχνουν επίπεδα IgE ορού και IL-5/IL-13 στο BALF.
Μπάρα κλίμακας: 50 μm. Όλα τα δεδομένα που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα και εκφράζονται ως μέση ± τυπική απόκλιση (SD).

---

Η μεταγραφική ανάλυση αποκαλύπτει τις θεραπευτικές επιδράσεις του Cistanche σε ασθματικά ποντίκια

Για περαιτέρω διερεύνηση των θεραπευτικών αποτελεσμάτων τουCistancheγια το άσθμα, η αλληλουχία μεταγραφομένων πραγματοποιήθηκε σε ιστούς πνεύμονα από ποντίκια που εκτέθηκαν μόνο σε HDM και από αυτά που εκτέθηκαν τόσο σε HDM όσο καιCistanche. Συνολικά643 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs)ταυτοποιήθηκαν, συμπεριλαμβανομένων324 ρυθμίστηκε προς τα πάνωκαι319 μειωμένη ρύθμισηγονίδια (p < 0,05, |logFC| Μεγαλύτερο ή ίσο με 0,5, Εικόνα 3Α). Ένας χάρτης θερμότητας απεικονίζει τα επίπεδα έκφρασης των κορυφαίων 20 γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα πάνω και προς τα κάτω (Εικόνα 3Β).

Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις εμπλουτισμού Gene Ontology (GO) και Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) στα DEG. Τα γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω εμπλουτίστηκαν κυρίως σε μονοπάτια που σχετίζονται με ιικές αποκρίσεις, σηματοδότηση με μεσολάβηση ιντερφερόνης, σηματοδότηση υποδοχέα τύπου NOD και σηματοδότηση IL-17 (Εικόνες 3C και 3D). Αντίθετα, τα προς τα κάτω ρυθμισμένα γονίδια συσχετίστηκαν με την πυρηνική διαίρεση, την αλληλεπίδραση υποδοχέα κυτοκίνης-κυτοκίνης και τα μονοπάτια σηματοδότησης υποδοχέα Τ κυττάρων (Εικόνες 3Ε και 3ΣΤ).

Περαιτέρω ανάλυση με χρήση ανάλυσης παραλλαγής συνόλου γονιδίων (GSVA) ​​έδειξε ότι τοΟΔΟΣ ΗΩΣΙΝΟΦΙΛΩΝΗ βαθμολογία GSVA μειώθηκε σε ποντικούς που έλαβαν συν-θεραπεία με HDM καιCistanche, σε σύγκριση με ποντίκια μόνο με HDM, σύμφωνα με την παρατηρούμενη μείωση των ηωσινόφιλων στο BALF (Εικόνες 3G και 3H). Επιπλέον, οδοί στενά συνδεδεμένες με το αλλεργικό άσθμα-όπως το IL-5 και το IL-4 σηματοδότηση- βρέθηκε ότι ρυθμίζονται προς τα κάτω μετάCistancheθεραπεία (Εικόνα 3Η).

Τέλος, το Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) αποκάλυψε ότιCistancheη θεραπεία περιελάμβανε διαδικασίες που σχετίζονται μεσηματοδότηση γλυκοκορτικοειδώνκαιανοσοποιητικές κυτοκίνες τύπου 2, τα οποία συνδέονται στενά με την παθοφυσιολογία του άσθματος (Εικόνα 4).

 

 

 

 

Η ανάλυση HRMS ενός δεσμού LC αποκαλύπτει τα ενεργά συστατικά του Cianche. Α. Χρωματόγραμμα ολικού ιόντος του εκχυλίσματος Cistanche deserticola που παρακολουθήθηκε σε λειτουργία θετικού ιόντος. Β και Γ. Χρωματογραφήματα ιόντων PG σε κατάσταση θετικού ιόντος. Δ. Προφίλ MSMS του Π.Γ.

 

Σχήμα 6. Δραστικά συστατικά του Cianche που αποκαλύφθηκαν με ανάλυση LC-μονής HRMS. ΔΙΑΦΗΜΙΣΗ. Ανάλυση εμπλουτισμού στόχων PD, συμπεριλαμβανομένων των οδών GO, KEGG, Reactome και συνόλων γονιδίων WikiPathways.