Επιδράσεις των πιέσεων αιμάτωσης στην απώλεια ποδοκυττάρων στον απομονωμένο νεφρό ποντικιού με έγχυση

edmund.chen@wecistanche.com

Αφηρημένη

Ιστορικό/Στόχοι: Τα ποδοκύτταρα χάνονται στις περισσότερες σπειραματικές παθήσεις, οδηγώντας σε σπειραματοσκλήρωση και προοδευτικήΝεφρική Νόσος. Γενικά θεωρείται ότι τα ποδοκύτταρα εκτίθενται στη ροή διήθησης και επομένως σε σημαντικές δυνάμεις διάτμησης που οδηγούν την αποκόλλησή τους από τη σπειραματική βασική μεμβράνη (GBM). Σε αυτό το πλαίσιο, η εξάλειψη της διαδικασίας του ποδιού έχει προταθεί ως πιθανή προσαρμοστική απόκριση για την αύξηση της προσκόλλησης των ποδοκυττάρων στο GBM. Μέθοδοι: Δοκιμάσαμε αυτές τις υποθέσεις χρησιμοποιώντας οπτικό καθαρισμό και μορφομετρική ανάλυση διαστάσεων 3-υψηλής ανάλυσης στο απομονωμένο ποντικό με έγχυσηνεφρό.Διερευνήσαμε τη δυναμική της αποκόλλησης των ποδοκυττάρων σε διαφορετικές πιέσεις αιμάτωσης (50, 300 και περισσότερες από 450 mmHg) σε υγιή νεαρά ή ηλικιωμένα ποντίκια (ηλικίας 20 έναντι 71 εβδομάδων) ή ποντίκια στα οποία έγινε ένεση ορού αντι-GBM για να προκληθεί ολικό πόδι εξάλειψη της διαδικασίας. Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα υγιή ποδοκύτταρα σε νεαρά ποντίκια είναι στενά συνδεδεμένα με το GBM και ακόμη και οι υπερμέγιστες πιέσεις δεν προκάλεσαν σημαντική αποκόλληση. Σε σύγκριση με νεαρά ποντίκια, σε ηλικιωμένα ποντίκια και ποντίκια με νεφρίτιδα anti-GBM και εξάλειψη της διαδικασίας του ποδιού, σταδιακή προοδευτική απώλεια των ποδοκυττάρων είχε συμβεί ήδη πριν από την αιμάτωση. Οι υψηλές πιέσεις αιμάτωσης είχαν ως αποτέλεσμα μια σχετικά μικρή πρόσθετη απώλεια ποδοκυττάρων σε ηλικιωμένους ποντικούς. Σε ποντίκια με νεφρίτιδα anti-GBM, σημειώθηκε σημαντική πρόσθετη απώλεια ποδοκυττάρων σε αυτό το πρώιμο χρονικό σημείο κατά την αύξηση των πιέσεων αιμάτωσης στα 300 mmHg ή υψηλότερα. Συμπέρασμα: Αυτή η εργασία παρέχει την πρώτη πειραματική απόδειξη ότι τα ποδοκύτταρα είναι εξαιρετικά ανθεκτικά σε οξεία αυξημένες πιέσεις αιμάτωσης σε απομονωμένο ex vivoνεφρόμοντέλο αιμάτωσης. Μόνο στη σπειραματική νόσο, σημαντικός αριθμός τραυματισμένων ποδοκυττάρων αποκόπηκε μετά από οξείες αυξήσεις στην πίεση αιμάτωσης.

Λέξεις-κλειδιά:Σπειραματική υπέρταση; Σπειραματική υπερδιήθηση; Μηχανική καταπόνηση; Προχώρηση; Χρόνια νεφρική νόσος

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ

Εισαγωγή

Η σπειραματική υπέρταση και η υπερδιήθηση βλάπτουν το σπείραμα οδηγώντας σε προοδευτική σπειραματική νόσο. Πιστεύεται ευρέως ότι η αυξημένη πίεση αιμάτωσης εκθέτει την τούφα σε αυξημένη μηχανική καταπόνηση που προκαλεί την προσκόλληση των ποδοκυττάρων στη σπειραματική βασική μεμβράνη (GBM), συμβάλλοντας στην αποκόλλησή τους [1, 2]. Τα ποδοκύτταρα είναι εξαιρετικά διαφοροποιημένα, μεταμιτωτικά κύτταρα, απαραίτητα για έναν άθικτο σπειραματικό φραγμό διήθησης. Η απώλεια ποδοκυττάρων είναι πιθανότατα το αποτέλεσμα της αποκόλλησης βιώσιμων κυττάρων από το GBM και όχι της απόπτωσης ή της νέκρωσης [3-6] καθώς κατέστη δυνατή η καλλιέργεια ποδοκυττάρων που ανακτήθηκαν από τα ούρα ασθενών [4]. Η αποκόλληση βιώσιμων ποδοκυττάρων από το GBM μπορεί να προκύψει από εξασθενημένους μηχανισμούς προσκόλλησης ή αλτεμηχανικές δυνάμεις. Η εξασθενημένη προσκόλληση στο GBM μπορεί να οφείλεται σε κυτταρικό τραυματισμό ή μειωμένη έκφραση των μορίων προσκόλλησης και σχετίζεται κυρίως με φλεγμονώδεις σπειραματικές ασθένειες. Όσον αφορά τις μηχανικές δυνάμεις που σχετίζονται με το ποδοκύτταρο, υπάρχουν δύο βασικοί καθοριστικοί παράγοντες, δηλαδή η πίεση διήθησης και η ροή του διηθήματος [7-9]. Η πίεση φιλτραρίσματος δημιουργεί περιφερειακή τάση τοιχώματος και δρα ως δύναμη διαστολής στο GBM. Οι διακυμάνσεις στη διατοιχωματική υδροστατική πίεση αντισταθμίζονται αποτελεσματικά από την ικανότητα του GBM να δρα ως ελαστική μεμβράνη και να διαστέλλεται ή να συρρικνώνεται στην επιφάνεια [8, 10]. Από την άλλη πλευρά, η ροή του διηθήματος κατά μήκος του GBM ασκεί εφαπτομενικές δυνάμεις στην επιφάνεια των ποδοκυττάρων, δηλαδή διατμητική τάση. Γνωρίζουμε από in vitro μελέτες ότι τα ποδοκύτταρα είναι πολύ ευαίσθητα σε διατμητική τάση που αποσπάται από το υπόστρωμά τους όταν εκτίθενται σε τάσεις διάτμησης άνω των 0,025 Pa [11] και υιοθετώντας έναν ενδιάμεσο φαινότυπο που μπορεί να τα βοηθήσει να εξουδετερώσουν τις δυνάμεις που προέρχονται από τη ροή [12]. Το εάν η σπειραματική υπέρταση επηρεάζει τα ποδοκύτταρα μέσω αυξημένης πίεσης διήθησης και/ή αυξημένης διήθησης παραμένει ακόμη ασαφές. Σε αυτή τη μελέτη, παρέχουμε την πρώτη ανάλυση της ικανότητας των ποδοκυττάρων να αντιστέκονται στις αυξημένες μηχανικές δυνάμεις σε ένα ex vivo μοντέλο. Η απώλεια ποδοκυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με υψηλή ανάλυση χρησιμοποιώντας καθαρισμό ιστού και 3-διαστατική μορφομετρική ανάλυση σε νεαρά και υγιή ποντίκια

Υλικά και μέθοδοι

Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες της γερμανικής νομοθεσίας για την καλή διαβίωση των ζώων και εγκρίθηκαν από το Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02.04. 2015.A469). Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε μια συγκεκριμένη εγκατάσταση χωρίς παθογόνα με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό και 12-ωρο κύκλο ημέρας/νύχτας. Η αναπαραγωγή και ο προσδιορισμός του γονότυπου έγιναν σύμφωνα με τυπικές διαδικασίες. Ποντίκια Pod-rtTA/LC1/R26R/H2BeGFP σε γενετικό υπόβαθρο FVB/N έχουν περιγραφεί στο παρελθόν [13]. Για να ενεργοποιηθεί η διαγονιδιακή έκφραση του Pod-rtTA-eGFP, τα ποντίκια έλαβαν δοξυκυκλίνη μέσω του πόσιμου νερού κατά βούληση για 7 ημέρες (2 g/l, 5 τοις εκατό σακχαρόζη, προστατευμένη από το φως) ακολουθούμενη από περίοδο έκπλυσης 1 εβδομάδας σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές. Η νεφρίτιδα κατά της GBM προκλήθηκε με μία μόνο ενδοπεριτοναϊκή ένεση 5 mg/g νεφροτοξικού ορού σωματικού βάρους όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14].

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΩΝ ΝΕΦΡΩΝ/ΝΕΦΡΩΝ

Αιμάτωση νεφρού

Οι απομονωμένοινεφρόΤο μοντέλο αιμάτωσης χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται αλλού [15]. Εν συντομία, τα ποντίκια ναρκώθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση ξυλαζίνης/κεταμίνης (0, 1 ml/10 g σωματικού βάρους ip) και στη συνέχεια τα νεφρά εγχύθηκαν με ένα σύνθετο τροποποιημένο διάλυμα Krebs-Henseleit (Πίνακας 1) συμπληρωμένο με 5 % αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) στους 37 βαθμούς για να μιμηθεί το φυσιολογικό περιβάλλον κατά τη διάρκεια του πειράματος. Μέγιστη αγγειοδιαστολή τουνεφρόΗ αγγείωση προκλήθηκε με 1. υποδόρια ένεση βεραπαμίλης (50 μl) αμέσως μετά την επαγωγή της αναισθησίας και 2. προσθήκη παπαβερίνης στο διάλυμα έγχυσης. Μετά από αρχική έγχυση για 5 λεπτά στα 50 mmHg, εγχύθηκε μια λεκτίνη με φθορισμό (Communis I - RCA120, Vector Laboratories: RL-1082· 4 μΙ σε 986 μΙ αλατούχου ορού) για την επισήμανση των ενδοθηλιακών κυττάρων.Νεφράεγχύθηκαν για επιπλέον 5 λεπτά με το τροποποιημένο διάλυμα Krebs-Henseleit με 5 τοις εκατό BSA. Μετά από αυτό, η αριστεράνεφρόπου χρησίμευε ως ζευγαρωμένος έλεγχος σε κάθε πείραμα αφαιρέθηκε μετά από προσεκτική απολίνωση του αριστερούνεφρώνδοχεία, κόβονται σε φέτες και βυθίζονται απευθείας σε 3 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη (PFA) σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Το σωστόνεφρό was perfused either for additional 5 minutes at 300 mmHg or with supramaximal pressure (>>300 mmHg, οι πιέσεις διήθησης εκτιμήθηκαν ότι είναι πολύ πάνω από 400 mmHg), εφαρμόστηκαν χειροκίνητα, συνολικός όγκος 50 ml διαλύματος έγχυσης. ονεφράεγχύθηκαν με σταθερή πίεση 50 mmHg ή 300 mmHg με χρήση αντλίας ελεγχόμενης πίεσης (Universal Perfusion Systems UP-100, Hugo-Sachs Electronics, Γερμανία). Μετά το δεξίνεφρόαφαιρέθηκε, κόπηκε σε φέτες 2 mm και βυθίστηκε σε 3 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδη (PFA) σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS).

Τρισδιάστατη απεικόνιση και υπολογιστική ανάλυση βυθισμένη σε PFAνεφρόΟι φέτες επωάστηκαν σε μηχανικό αναδευτήρα για 5 ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα σταθεροποιημένα δείγματα πλύθηκαν σε 1 χ PBS και τοποθετήθηκαν σε μηχανικό αναδευτήρα όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου.ΝεφρόΣτη συνέχεια, οι φέτες τοποθετήθηκαν σε αιθανόλη 100 τοις εκατό υψηλής ποιότητας (Merck; 100983) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με απαλή ανακίνηση (τουλάχιστον 1 αλλαγή σε φρέσκια αιθανόλη), ακολουθούμενη από άμεση εμβάπτιση σε κινναμικό αιθύλιο (ECi) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 112372) και αφέθηκαν όλη τη νύχτα σε ένα ήπιο αναδευτήρα σε θερμοκρασία δωματίου υπό προστασία από το φως. Η ημιδιαφάνεια του ιστού επιτεύχθηκε σε λιγότερο από 1 ώρα. Για όρθια μικροσκόπια, χρησιμοποιήσαμε εσωτερικούς θαλάμους μιας χρήσης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Τα περισσότερα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 2-μικροσκόπιο φωτονίου (LaVision BioTec TriMScope, "Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Core Facilities). Το λογισμικό απεικόνισης των Φίτζι χρησιμοποιήθηκε για τη μετακίνηση μέσω του άξονα Z κάθε στοίβας σειριακών οπτικών τμημάτων και να απομονωθούν μεμονωμένα σπειράματα μέσω τρισδιάστατης καλλιέργειας [16]. 40 σπειράματα ανάνεφρό(20 υποφλοιώδεις και 20 παραμυελικοί) επιλέχθηκαν για ανάλυση. Έτσι, συνολικά 1200 σπειράματα αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη για να ληφθούν αποτελέσματα με επαρκή ακρίβεια. Τα ποδοκύτταρα ταυτοποιήθηκαν ως κύτταρα eGFP συν. Η ποσοτικοποίηση του όγκου των τριχοειδών, του σπειραματικού όγκου καθώς και του αριθμού των πυρήνων (κουκκίδες) και του όγκου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα λογισμικό τρισδιάστατης απόδοσης και ανάλυσης (Imaris v9.1; Bitplane AG, Ζυρίχη, Ελβετία) Η απόσταση των ποδοκυττάρων από τον αγγειακό πόλο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Bitplane XTension "Spot Closest. Distance". Ο αυτοματοποιημένος ποσοτικός προσδιορισμός των ποδοκυττάρων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Η ανάλυση εικόνας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Imaris (Biplane AG Zurich, Ελβετία). Κάθε σπείραμα ορίστηκε από το σημασμένο με λεκτίνη προσαγωγό αρτηρίδιο του. 20 υποφλοιώδεις και 20 παραμυελικοί (ορίζονται από την απόστασή τους από την επιφάνεια του φλοιού).

Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΟΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΟ ΠΟΝΟ

Μικροσκοπία φωτός & Ανοσοφθορισμός

Για μικροσκοπία φωτός, το 4 τοις εκατό ρυθμισμένο με φορμαλίνη σταθεροποιήθηκενεφρόθραύσματα αφυδατώθηκαν, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και χρωματίστηκαν με περιοδικό οξύ-Schiff (PAS). Το ποσοστό των μη φυσιολογικών/τραυματισμένων σπειραμάτων υπολογίστηκε με βάση την αναγνώριση 50 αντιπροσωπευτικών σπειραματικών διατομών ανά ποντίκι που επιλέχθηκαν κατά τη διάρκεια μιας συστηματικής βόλτας σενεφρώνφλοιός. Το τυπικό μας πρωτόκολλο ανοσοφθορισμού [18] πραγματοποιήθηκε σε τομές 2 μm ενσωματωμένες σε παραφίνη. Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα: πολυκλωνικό αντι-GFP κοτόπουλου (ab13970; Abcam), μονοκλωνικό αντι-συναπτοποδίνη ποντικού (sc-515842; Santa Cruz Biotechnology), πολυκλωνικό κουνέλι κατά ποντικού p57 (sc-8298· Santa -Cruz Biotechnology), rabbit polyclonal anti-WT1 (sc-192; Santa-Cruz Biotechnology), Cy2 donkey anti-chicken (703-225-155; Dianova, Αμβούργο, Γερμανία), Alexa Fluor546 κατσίκας κατά ποντικού IgG1 (A-21123· Thermo Fischer), πολυκλωνικό AF555 κατά γαϊδάρου (A31572; Life Technologies, Carlsbad, CA).

Ηλεκτρονική Μικροσκοπία

Μικρά κομμάτια του φλοιού στερεώθηκαν σε διάλυμα Karnovsky και ενσωματώθηκαν στο Epon (Serva, Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Οι εξαιρετικά λεπτές τομές εξετάστηκαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης ZEISS Leo 906 στα 60 kV με μεγέθυνση από 3597-6000x. Τα δείγματα πλύθηκαν σε 0,1 M φωσφορικό Soerensen (Merck, Darmstadt, Γερμανία), μονιμοποιήθηκαν εκ των υστέρων σε 1 τοις εκατό OsO 4 (Roth, Καρλσρούη, Γερμανία) σε ρυθμιστικό διάλυμα σακχαρόζης 17 τοις εκατό (Merck, Darmstadt, Γερμανία) και αφυδατώθηκαν με ανερχόμενη σειρά αιθανόλης ( 30, 50, 70, 90 και 100 τοις εκατό ) για 10 λεπτά το καθένα. Το τελευταίο βήμα επαναλήφθηκε 3 φορές. Τα αφυδατωμένα δείγματα επωάστηκαν σε οξείδιο προπυλενίου (Serva, Heidelberg, Γερμανία) για 30 λεπτά, σε ένα μείγμα ρητίνης Epon (Serva, Heidelberg, Γερμανία) και οξειδίου του προπυλενίου (1:1) για 1 ώρα και τελικά σε καθαρό Epon για 1 ώρα. Ο πολυμερισμός με επόνη πραγματοποιήθηκε στους 90 βαθμούς για 2 ώρες. Υπερλεπτές τομές (70-100 nm) κόπηκαν με υπερμικρότομο (Reichert Ultracut S, Leica με μαχαίρι διαμαντιού (Leica) και συγκεντρώθηκαν σε πλέγματα Cu/Rh (HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar Γερμανία). Η αντίθεση ενισχύθηκε με χρώση με 0,5 τοις εκατό οξικό ουρανύλιο και 1 τοις εκατό κιτρικό μόλυβδο (και τα δύο EMS, Μόναχο, Γερμανία) Τα δείγματα παρατηρήθηκαν σε μια τάση επιτάχυνσης 60 kV χρησιμοποιώντας ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss, Oberkochen, Γερμανία).

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με το λογισμικό GraphPad Prism v8. Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SD. Για σύγκριση 2 ομάδων, χρησιμοποιήθηκε ένα t-test. Πραγματοποιήθηκε σύγκριση πολλών ομάδων χρησιμοποιώντας ανάλυση διακύμανσης. Η post hoc διόρθωση Tukey χρησιμοποιήθηκε για πολλαπλές συγκρίσεις. Όλες οι δοκιμές ήταν 2-παραδιδόμενες και η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως P <>

Αποτελέσματα

Ημιαυτόματη μέθοδος προσδιορισμού του αριθμού των ποδοκυττάρων ανά σπειράμα Μελετήθηκαν τρεις ομάδες, δηλαδή υγιή νεαρά και μεγάλα ποντίκια και ποντίκια με σπειραματονεφρίτιδα anti-GBM (♂:♀ 1:1). Τα νεαρά, υγιή ποντίκια ήταν 15-21 εβδομάδων, ενώ τα ηλικιωμένα (ηλικιακά) ήταν 74 εβδομάδων. Η ολική εξάλειψη της διαδικασίας του ποδιού προκλήθηκε σε ποντίκια ηλικίας 14-20 εβδομάδων μέσω μίας μόνο ένεσης ορού anti-GBM 3 ημέρες πριν από την εγκατάσταση του απομονωμένου έγχυσηςνεφρόμοντέλο (Εικ. 1Α), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19].

Για τον προσδιορισμό της επίδρασης της ενδονεφρικής πίεσης αιμάτωσης στα ποδοκύτταρα,νεφράυποβλήθηκαν σε διαφορετικές πιέσεις αιμάτωσης στα απομονωμένανεφρόμοντέλο αιμάτωσης. Πρώτον, και τα δύονεφράδιαχέονταν πάντα στα 50 mmHg για 5 λεπτά. Για να ελέγξουμε εάν το διάλυμα αιμάτωσης διατήρησε την ακεραιότητα του σπειράματος στο βιώσιμο μη σταθεροποιημένονεφρά2 ποντίκια εγχύθηκαν σε σταθερή πίεση 100 mmHg για 90 λεπτά. Η αιμάτωση, η ροή των ούρων (25 μl/min/gr σωματικού βάρους) καθώς και η κάθαρση της ινουλίνης (22 μl/min) παρέμειναν σταθερές καθ' όλη τη διάρκεια του χρόνου (Συμπληρωματικό Σχήμα 1 – για όλο το συμπληρωματικό υλικό βλ.www.cellphysiolbiochem.com).Σε πειραματικούς ποντικούς, μετά την αρχική έγχυση στα 50 mmHg, το αριστερόνεφρό was removed and served as a control in all experiments. Next, constant pressure of 300 mmHg or a pressure significantly higher than 300 mmHg (>>300 mmHg; υπερμέγιστη πίεση διήθησης περίπου 450 – 500 mmHg) εφαρμόστηκαν στο υπόλοιπο δεξιάνεφρόγια 5 λεπτά. (Εικ. 1Β). Στο απομονωμένο διαχέεταινεφρά, τα ποδοκύτταρα ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας πυρηνική επισήμανση με eGFP-ιστόνη στα διαγονιδιακά μας ποντίκια που εκφράζουν eGFP κάτω από τον προαγωγέα ποδοκίνης (ποντίκια eGFP:Pod-rtTA). Οι αριθμοί των ποδοκυττάρων ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό αυτής της μεταβολικής επισήμανσης in vivo και της τρισδιάστατης μορφομετρίας (Εικ. 1C).

Απώλεια ποδοκυττάρων σε υγιή και ηλικιωμένα ποντίκια

Healthy mice contained 87.46 ± 5.66 (SD) podocytes per glomerulus at baseline (i.e.at physiological perfusion pressure of 50 mmHg) (Fig. 2A). Juxtamedullary glomeruli were larger than those in the outer cortex (Supplementary Fig. 2), but this was not associated with higher podocyte numbers (87.0± 23.65 vs. 90.1 ± 18.49, respectively, Fib 2B). No differences in the number of podocytes related to sex were observed (see below). In young mice, there was no significant loss of podocytes at high (300 mmHg) or maximal (>>300 mmHg) perfusion pressures (85.62 ± 10.83 and 81.98 ± 6.45 podocytes per glomerulus, respectively) (Fig. 1A). On PAS sections, mild histological changwere observed particularly in aged mice (Fig. 2A), which were independent of perfusion pressures. In addition, tubular dilatation and interstitial edema were apparent as a result of perfusion. In humans, older age (53 ± 10 years) has been associated with absolute and relative podocyte depletion [20]. Compared to young mice, our mice aged 72 weeks contained significantly lower numbers of podocytes per glomerulus at baseline (52.81 ± 13.8 SD), indicating that about 40% of the podocytes had been lost. Perfusion at high or maximal pressures resulted in only a very mild reduction of podocyte numbers (48.65 ± 16.8 SD and 41.06 ± 17.7 SD, respectively). Because of the precision of the counting method (absolute podocyte numbers in 40 glomeruli per mouse) [21], the loss of podocytes of 7.9% and 22% after perfusion with 300 or >>300 mmHg αντίστοιχα σε σύγκριση με την αρχική τιμή υποδηλώνει ότι αυτή η μικρή αύξηση στην απώλεια ποδοκυττάρων με υψηλότερη πίεση δεν είναι τυχαίο εύρημα. Στις τομές PAS, παρατηρήθηκαν ήπιες σπειραματικές αλλαγές σε ηλικιωμένους ποντικούς κατά την έναρξη (μεσαγγειακή επέκταση και περιστασιακή σκλήρυνση, Εικ. 2ΣΤ). ΕΝΑ

Απώλεια ποδοκυττάρων μετά από οξύ τραυματισμό

Ορός Anti-GBM εφαρμόστηκε σε νεαρά υγιή ποντίκια για να προκαλέσει σημαντικό και ειδικό τραυματισμό στα ποδοκύτταρα. Στο πολύ πρώιμο χρονικό σημείο (δηλ. 3 ημέρες) μετά την επαγωγή σπειραματονεφρίτιδας αντι-GBM, παρατηρήθηκε γενικευμένη εξάλειψη της διαδικασίας του ποδιού σε όλα τα σπειράματα με ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (Εικ. 3A-D). Σε απομονωμένη έγχυσηνεφράobtained from these mice, at baseline (i.e. perfusion with 50mmHg) podocyte numbers per glomerulus were reduced by 20% compared to controls (69.76 ± 7.07 vs 87.46 ± 5.66, respectively) (Fig. 3E). Perfusion with higher pressures (300 and >>300 mmHg) resulted in significant further reductions of podocyte numbers per glomerulus (50.84 ± 7.82 and 53.18 ± 4.26, respectively), i.e. 27% and 24% additional reduction (Fig. 3E). When analyzing individual glomeruli, the anti-GBM mice, perfusion with >>Τα 300 mmHg προκάλεσαν περισσότερο από 80 τοις εκατό απώλεια ποδοκυττάρων σε μια μειοψηφία των σπειραμάτων (Εικ. 3Ε). Αυτό είναι σύμφωνο με την εστιακή φύση του μοντέλου της νόσου κατά της GBM. Μέσα στα παραμυελώδη σπειράματα, η απώλεια ποδοκυττάρων ήταν πιο έντονη σε σύγκριση με τα υποφλοιώδη σπειράματα (56,66 ± 16,9 και 47,35 ± 17,07, αντίστοιχα) (Εικ. 3F)

By transmission electron microscopy (TEM), specific changes were observed after high perfusion pressures, in particular focal podocyte detachment from the GBM and denuded basement membrane (Fig. 3D). Cellular debris was present within the capillaries as well as within Bowman's space (>>300 mmHg); το ενδοθήλιο δεν παρουσίασε σημαντικές αλλαγές. Η χρώση PAS εντόπισε σωληναριακή διαστολή. Τρεις ημέρες μετά την ένεση του ορού αντι-GBM, δεν είχαν αναπτυχθεί ακόμη μισοφέγγαρες βλάβες (Εικ. 3G-I). Τα αρσενικά εμφάνισαν υψηλότερο βαθμό απώλειας ποδοκυττάρων σε σύγκριση με τα θηλυκά (63,71 ± 2,11 έναντι 75,81 ± 3,83 ποδοκύτταρα ανά σπειράμα), κάτι που είναι σύμφωνο με την παρατήρηση ότι τα αρσενικά ποντίκια είναι πιο ευαίσθητα στον αντιορό anti-GBM και σχηματίζουν περισσότερα κυτταρικά μισοφέγγαρα στην πορεία η ασθένεια (Εικ. 3J). Ωστόσο, η πρόσθετη απώλεια ποδοκυττάρων μετά από υψηλές πιέσεις αιμάτωσης ήταν παρόμοια σε άνδρες και γυναίκες (Εικ. 3J).

Εικ. 3. Απώλεια ποδοκυττάρων μετά από οξύ τραυματισμό. (AB) Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης από μάρτυρανεφρό per- fused at a low pressure and after supramaximal pressure (>>300 mmHg) shows normal foot process architecture. (C-D) Transmission electron microscopy reveals the typical finding of foot process effacement after injection of anti-GBM serum at baseline. After perfusion with higher pressure, areas of denuded basement membrane were observed. (E) Total number of podocytes per mouse in anti-GBM mice at baseline and under higher (300 mmHg) or supramaximal pressures (>> 300 mmHg); (each circle represents 1 kidney; n=7 control kidneys with 50mmHg, n=8 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=4 kidneys with 300 mmHg or >> 300mmHg). (F) Total number of podocytes per glomerulus in juxtamedullary and subcortical glomeruli; each circle represents 1 subcortical glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse) and each triangle represents 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse). (G-I) Histologic staining of anti-GBM mice at baseline identified protein casts, whereas three days after injection of anti-GBM serum no crescentic lesions could be found. After perfusion with higher pressure, tubule-interstitial dilatation and edema were observed. (J) Total podocyte number per mouse between males and females; each circle represents 1 kidney (n=4 control kidneys with 50mmHg, n=4 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=2 kidneys with 300 mmHg or >>300 mmHg). Για πολλαπλές συγκρίσεις ANOVA. ****Π<0.0001, ***p ="" <="" 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">

Ανίχνευση των χαμένων ποδοκυττάρων στα σωληνάρια

Τα eGFP συν ποδοκύτταρα παρατηρήθηκαν τακτικά εντός του αυλού των εγγύς σωληναρίων όπου φάνηκαν να προσκολλώνται στο όριο βούρτσας των εγγύς σωληναριακών κυττάρων (Εικ. 4Α). Αυτά τα ποδοκύτταρα δεν ξεπλύθηκαν σε υπερδιάχυσηνεφρόs, αντίθετα προσκολλήθηκαν μάλλον σφιχτά στο περίγραμμα της βούρτσας για να αντέχουν την εξαιρετική ροή των πρωτογενών ούρων σε πολύ υψηλές πιέσεις αιμάτωσης. Για να επιβεβαιωθεί η ταυτότητά τους, τα ποδοκύτταρα συγχρωματίστηκαν με δείκτες ειδικούς για τα ποδοκύτταρα (δηλαδή, p57, συναπτοποδίνη και WT-1) επιπλέον του πυρηνικού eGFP δείκτη ανίχνευσης γενετικής γενεαλογίας (Εικ. 4Β). Ο αριθμός των ποδοκυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερος σε εκείνα τα σπειράματα με προσκολλημένα ποδοκύτταρα στο σχετικό εγγύς σωληνάριο και η παρουσία ποδοκυττάρων στα σωληνάρια συσχετίστηκε αντιστρόφως με τον αριθμό των ποδοκυττάρων ανά σπειράμα (Εικ. 4C).

Προτιμητική απώλεια ποδοκυττάρων στην περιχιλιακή θέση

Finally, we investigated whether podocyte loss driven by an acute increase in perfusion pressures might occur in preferential locations of the glomerulus (i.e. at the vascular pole vs. the tubular pole of the glomerular tuft). To analyze the spatial distribution of podocyte detachment, the vascular pole was marked in each glomerulus (acquired in 3D) based on the lectin signal and the distance of each podocyte from the vascular pole was determined semi-automatically. The individual distances from the vascular pole were separated into quartiles (Fig. 4E). As depicted in Fig. 4E, the majority of podocytes clustered in the 2 middle quartiles (i.e. quartile 2 and 3). Less than 12 % of the podocytes localized to either in the first, i.e. vascular pole, or the fourth quartile, i.e. most distant from the vascular pole. Upon perfusion with pressures >>300 mmHg, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στη χωρική κατανομή των ποδοκυττάρων σε νεαρά και υγιή ποντίκια. Σε ηλικιωμένα ποντίκια, οι αποστάσεις των ποδοκυττάρων από τον αγγειακό πόλο ήταν γενικά αυξημένες, πιθανότατα αντανακλώντας σπειραματική υπερτροφία, ενώ η υπερδιάχυση είχε ως αποτέλεσμα μια προτιμώμενη αποκόλληση ποδοκυττάρων κοντά στον αγγειακό πόλο (το 1ο τεταρτημόριο μειώθηκε από 11,5 σε 4,9 τοις εκατό σε ηλικιωμένους ποντικούς, Εικ. 4Ε ). Παρομοίως, μια προτιμώμενη αποκόλληση ποδοκυττάρων κοντά στον αγγειακό πόλο παρατηρήθηκε σε εξαφανισμένα ποδοκύτταρα (anti-GBM, 1ο τεταρτημόριο μειωμένο από 25 σε 5 τοις εκατό).

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, εξετάσαμε τις οξείες επιδράσεις της αυξημένης πίεσης διήθησης και της ροής διήθησης στην απώλεια ποδοκυττάρων στον απομονωμένο νεφρό ποντικού με έγχυση, χρησιμοποιώντας την επί του παρόντος πιο ακριβή μέθοδο για τον προσδιορισμό του αριθμού των ποδοκυττάρων. Το πρώτο σημαντικό εύρημα της μελέτης μας ήταν ότι τα υγιή ποδοκύτταρα δεν είναι ευαίσθητα σε οξεία διατμητική τάση in vivo, όπως προτάθηκε προηγουμένως από μελέτες κυτταροκαλλιέργειας [11]. Προς έκπληξή μας, ούτε καν ακραίες υπερφυσιολογικές πιέσεις (πάνω από 450 mmHg) προκάλεσαν σημαντική αποκόλληση των ποδοκυττάρων. Αντίθετα, το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης αποκάλυψε ότι και τα τρία στρώματα του φραγμού διήθησης παρέμειναν σχετικά καλά διατηρημένα. Τα μεγαλύτερα ποντίκια εμφάνισαν μειωμένο αριθμό ποδοκυττάρων (όπως αναφέρθηκε προηγουμένως) και αυτό συσχετίστηκε με πολύ περιορισμένη μόνο αυξημένη ευαισθησία σε υψηλές πιέσεις αιμάτωσης. Το δεύτερο σημαντικό εύρημα ήταν ότι ο προηγούμενος τραυματισμός των ποδοκυττάρων έκανε τα ποδοκύτταρα ευαίσθητα στην αποκόλληση σε υψηλές πιέσεις αιμάτωσης. Τα ποντίκια Anti-GBM εμφάνισαν εξάλειψη των διεργασιών του ποδιού τρεις ημέρες μετά την ένεση του αντιορού αντι-GBM και σημαντικοί αριθμοί αποσπάστηκαν σε υψηλές πιέσεις αιμάτωσης. Σε ηλικιωμένα ποντίκια, υποθέτουμε ότι η φυσιολογία των ποδοκυττάρων διατηρείται σχετικά καλά, καθιστώντας τα λιγότερο επιρρεπή στην αποκόλληση. Με την εφαρμογή μιας ημι-αυτοματοποιημένης προσέγγισης μέτρησης, κάθε σπείραμα αναλύθηκε χωριστά (συνολικά αναλύθηκαν 1200 σπειράματα). Επιβεβαιώσαμε ότι τα παραμυελώδη σπειράματα έχουν μεγαλύτερο όγκο από τα υποφλοιώδη σπειράματα. Είναι ενδιαφέρον ότι οι αριθμοί των ποδοκυττάρων ήταν οι ίδιοι, δείχνοντας ότι η πυκνότητα των ποδοκυττάρων μειώνεται στα παραμυελώδη σπειράματα. Επιπλέον, τα παραμυελώδη σπειράματα ήταν επίσης πιο ευάλωτα σε αυξημένες πιέσεις διήθησης σε σύγκριση με τα υποφλοιώδη σπειράματα. Αυτά τα ευρήματα θα μπορούσαν να εξηγήσουν εν μέρει γιατί οι βλάβες του FSGS μπορούν να παρατηρηθούν σε μεγαλύτερη συχνότητα σε τόσο μεγαλύτερα σπειράματα [22, 23].

Εικ. 4. Ανίχνευση ποδοκυττάρων στο παρακείμενο prox. σωληνάριο. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα που δείχνει eGFP συν ποδοκύτταρα (πράσινα) στα σωληνάρια. (Β) Χρώση ανοσοφθορισμού των ποδοκυττάρων που είναι συνεπισημασμένα από το διαγονίδιο ιστόνης eGFP (πράσινο) και τους ενδογενείς δείκτες ποδοκυττάρων p57 (κόκκινο), wt-1 (κόκκινο) και συναπτοποδίνη (μωβ). (Γ) Συσχέτιση του αριθμού των ποδοκυττάρων ανά σπειράμα με τον αριθμό των ποδοκυττάρων που εντοπίστηκαν στο σωληνάριο (n=81 σπειράματα από ποντικούς ελέγχου, n= 41 σπειράματα από ηλικιωμένα ποντίκια και n= 81 σπειράματα από ποντίκια anti GBM). Για πολλαπλές συγκρίσεις, χρησιμοποιήθηκε ANOVA. ****Π<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">

Ένας περιορισμός αυτής της μελέτης είναι η σύντομη περίοδος παρατήρησης, καθώς δεν μπορούν να εξαχθούν συμπεράσματα σχετικά με τη μακροπρόθεσμη προσαρμογή των ποδοκυττάρων σε αυξημένες πιέσεις διήθησης. Έχει προταθεί ότι η πρώτη απόκριση των ποδοκυττάρων που εκτίθενται σε διατμητική τάση είναι να υποστούν προστατευτικές δομικές αλλαγές [8, 24]. Αυτές οι αλλαγές περιλαμβάνουν την απώλεια σχισμών φιλτραρίσματος (π.χ. FPE) και την αντικατάσταση των σχισμών-διαφραγμάτων με απόφραξη ή σφιχτές συνδέσεις. Οι αποφρακτικές συνδέσεις έχουν περιγραφεί προηγουμένως σε αρκετά μοντέλα σπειραματικής νόσου [25-28]. Ωστόσο, στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε ότι τα ποδοκύτταρα με FPE ήταν πιο ευαίσθητα σε υψηλότερες πιέσεις αιμάτωσης=. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι αυτές οι προσαρμοστικές αλλαγές δεν ήταν αρκετές για να προστατεύσουν από την αποκόλληση ή ενδεχομένως ακόμη και το αντίθετο, ότι καθιστούν τα ποδοκύτταρα πιο επιρρεπή στην αποκόλληση. Στη συνέχεια, μπορεί να υποστηριχθεί ότι το απομονωμένο διαχέεταινεφρόδεν είναι ένα φυσιολογικό σύστημα και ότι οι πιέσεις που ασκήθηκαν ήταν πολύ υψηλότερες από ό,τι σε συνθήκες in vivo. Από όσο γνωρίζουμε, κανένα άλλο μοντέλο δεν χρησιμοποιεί άθικτο βιώσιμονεφρόυπάρχει που θα επέτρεπε την άμεση διερεύνηση των επιπτώσεων των αυξημένων πιέσεων αιμάτωσης. Με την εφαρμογή αγγειοδιασταλτικών πριν και κατά τη διάρκεια της αιμάτωσης, η μέγιστη διάταση των προ-σπειραματικών αγγείων όπως προκαλείται για να επιτρέπεται η απεριόριστη ροή (υπερδιήθηση) και η μέγιστη μετάδοση αυξημένων πιέσεων αιμάτωσης στο σπείραμα. Στην παρούσα μελέτη, μελετήθηκαν οι οξείες επιδράσεις των υψηλότερων πιέσεων αιμάτωσης. Οι μακροπρόθεσμες επιδράσεις της παθολογικής υπερδιάχυσης θα μπορούσαν να είναι πιο επιβλαβείς, οδηγώντας σε ακόμη μεγαλύτερη απώλεια ποδοκυττάρων. Ωστόσο, η μελέτη μας προτείνει, ότι αυτή η χρόνια απώλεια ποδοκυττάρων δεν καθοδηγείται από την καθαρή δύναμη της ροής διήθησης αυτή καθεαυτή, αλλά μάλλον από τις (κακώς) προσαρμοστικές αλλαγές στα ποδοκύτταρα που μειώνουν την προσκόλλησή τους στο GBM. Οι ασθενείς με σπειραματικά νοσήματα επωφελούνται από την αντιυπερτασική θεραπεία αποτρέποντας τις (κακώς) προσαρμοστικές δομικές αλλαγές των ποδοκυττάρων.

συμπέρασμα

Αυτή η εργασία παρέχει την πρώτη in vivo απόδειξη ότι τα υγιή ποδοκύτταρα είναι εξαιρετικά σταθερά συνδεδεμένα με το GBM σε υγιείς νεφρούς ποντικού και μπορούν να αντισταθούν ακόμη και σε πολύ υψηλές πιέσεις αιμάτωσης. Η γήρανση ή ακόμη πιο έντονη οξεία βλάβη των ποδοκυττάρων με ολική εξάλειψη, καθιστά τα ποδοκύτταρα ευαίσθητα στην αποκόλληση σε αυξημένες πιέσεις αιμάτωσης.