ABSTＲACT

Στόχος: Να διευκρινιστεί αν γενικάκιστανοσίδες(GCs) βελτιώνειγνωστική δυσλειτουργίαποντίκια που γερνούν ταχέως (SAMP8) με τη μεσολάβηση ειδικών υποδοχέων ανδρογόνων (AＲ) στορύθμιση της έκφρασης της συναπτικής πρωτεΐνης． 

Μέθοδοι: Ένα σύνολο 76 7-μηνών αρσενικών ποντικών SAMP8 χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδα μοντέλου, ομάδα GCs, ομάδα GCs + φλουταμίδη (F), ομάδα GCs + fulvestrant (ICI), ομάδα F και ομάδα ICI. Οι λειτουργίες μάθησης και μνήμης των ποντικών σε κάθε ομάδα δοκιμάστηκαν με τον υδάτινο λαβύρινθο Morris. Χρησιμοποιήθηκαν στύπωμα Western και RT-PCR για τον έλεγχο τουεπίπεδο έκφρασης της συναπτοφυσίνης( SYN), μετασυναπτική πυκνότητα - 95 ( PSD - 95) και ο νευροτροφικός παράγοντας που προέρχεται από τον εγκέφαλο (BDNF) ποντικών σε κάθε ομάδα.

Αποτελέσματα: Τα GC βελτίωσαν σημαντικά τη μαθησιακή και γνωστική λειτουργία των ποντικών SAMP8.

Σε σύγκριση με την ομάδα GCs, η λειτουργία μάθησης και μνήμης των ποντικών στην ομάδα GCs + F και την ομάδα GCs + ICI ήταν σημαντικά μειωμένη. Τα αποτελέσματα Western blotting και RT-PCR έδειξαν ότι το επίπεδο έκφρασης των BDNF, SYN και PSD-95 ήταν σημαντικά αυξημένο σε επίπεδο πρωτεΐνης και επίπεδο γονιδίου στην ομάδα GCs σε σύγκριση με την ομάδα Model ( P ＜ 0). 11}}5) . Το επίπεδο έκφρασης SYN αυξήθηκε στην ομάδα GCs + F και GCs + ICI και τα επίπεδα έκφρασης των BDNF και PSD - 95 μειώθηκαν σημαντικά στην ομάδα GCs + F και GCs + ICI σε σύγκριση με την ομάδα GCs (P ＜ 0 - 05) .

Συμπέρασμα: Τα GCs μπορεί να μεσολαβούν ειδικά στο AＲ για να ενισχύσουν τη συναπτική πλαστικότητα σε ποντίκια SAMP8, το οποίο με τη σειρά του βελτιώνει τη μάθηση και τη γνωστική λειτουργία.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ:Γενικές κιστανοσίδες; Υποδοχέας ανδρογόνων; Συναπτική πλαστικότητα; Ποντίκια SAMP8

Συμπλήρωμα Cistanche Βελτίωση γνωστικής λειτουργίας Συμπλήρωμα διατροφής PhGs75% Ech 30% Act 12%

Η ασθένεια Αλτσχάϊμερ(μ.Χ.) είναι ένα κοινόνευρολογική εκφυλιστική ασθένεια, που κλινικά χαρακτηρίζεται από προοδευτική μείωση της γνωστικής λειτουργίας και αλλαγές στη νοητική και ψυχολογική κατάσταση [1]. Μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα τεστοστερόνης στους άνδρες ασθενείς με AD είναι σημαντικά χαμηλότερα από ό,τι στους κανονικούς άνδρες.

ογνωστική λειτουργία των ασθενώνέχει βελτιωθεί σε διάφορους βαθμούς μετάθεραπεία υποκατάστασης κετόνης[2], το οποίο υποδεικνύει ότι οι σχετιζόμενες με την ηλικία μειώσεις στα επίπεδα ανδρογόνων μπορεί να αποτελούν παράγοντα κινδύνου για AD σε ηλικιωμένους άνδρες.

Ολικές γλυκοσίδες Cistanche deserticola (γενικές κιστανοσίδες, GCs) είναι ένα από τα κύρια εκχυλίσματα Cistanche deserticola, το οποίο μπορεί να βελτιώσει τη μάθηση που σχετίζεται με την AD καιγνωστική δυσλειτουργία[3]. Επιπλέον, η χορήγηση GCs με καθετήρα αύξησε σημαντικά τα επίπεδα τεστοστερόνης στα ζώα [4]. Τα GC έχουν επίσης τη λειτουργία της προώθησης του yang και μπορούν να ασκήσουν

Φαρμακοδυναμικές επιδράσεις που μοιάζουν με ανδρογόνα. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η τεστοστερόνη μπορεί να βελτιώσει τις μαθησιακές και γνωστικές λειτουργίες των ζώων-μοντέλων AD και αυτή η διαδικασία βασίζεται σε συγκεκριμένους υποδοχείς ανδρογόνων (υποδοχέας ανδρογόνου, AR) με τη μεσολάβηση [5].

Είναι ευρέως γνωστό ότι η γνωστική δυσλειτουργία σε ασθενείς με AD σχετίζεται στενά με τη συναπτική πλαστικότητα. Ωστόσο, ο συγκεκριμένος μηχανισμός μέσω του οποίου τα GC ρυθμίζουν τη συναπτική πλαστικότητα και ως εκ τούτου βελτιώνουν τη μάθηση και τις γνωστικές λειτουργίες είναι ακόμα ασαφής. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει εάν τα GC μεσολαβούν σε συγκεκριμένο ARＲ για να επηρεάσουν τη συναπτική πλαστικότητα και επομένως να βελτιώσουν τις μαθησιακές και γνωστικές λειτουργίες στην AD.

1 Υλικά και μέθοδοι

1. 1 Πειραματόζωα και εξοπλισμός

Αρσενικά ποντίκια SAMP8 3-μηνών αγοράστηκαν από την Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου του Πεκίνου (SCXK [Beijing] 2016-0010) και ανατράφηκαν μέχρι την ηλικία των 7 μηνών. Τα ζώα διατηρήθηκαν σε καθαρό περιβάλλον στους (24 ± 1) βαθμούς και

Τα ζώα είχαν φυσικό φωτισμό και δωρεάν πρόσβαση σε τροφή και νερό, ενώ δόθηκε ανθρωπιστική φροντίδα σύμφωνα με τις αρχές 3R για τη χρήση πειραματόζωων. Αυτή η πειραματική μελέτη έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Δεοντολογίας Πειραματικών Ζώων του Ιατρικού Κολλεγίου Baotou (Baotou Medical College No. 20201102).

Τα κύρια αντιδραστήρια στο πείραμα είναι:Ολικές γλυκοσίδες Cistanche deserticola(GCs, Xi'an Ciyuan Biological Co., Ltd.); ανταγωνιστής υποδοχέα ανδρογόνου-φλουταμίδη (Sigma Company, Η.Π.Α.); ανταγωνιστής υποδοχέα οιστρογόνου-fulvestrant (ICI 182780, USA) Med Chem Express); Κουνέλι κατά BDNF αντίσωμα ποντικού,

PSD-95 αντίσωμα, αντίσωμα SYN, αντίσωμα -ακτίνης (Proteintech Company των Ηνωμένων Πολιτειών). Διάλυμα ηλεκτροφόρησης πρωτεΐνης, διάλυμα μεταφοράς πρωτεΐνης, TEMED, ρυθμιστικό διάλυμα ακρυλαμιδίου, υπερθειικό αμμώνιο, Tris (Beijing Solebao Technology Co., Ltd.); Κιτ σύνθεσης cDNA, ποσοτική ανίχνευση φθορισμού Talent

Κιτ αντιδραστηρίων (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.), κ.λπ. Ο κύριος πειραματικός εξοπλισμός περιλαμβάνει κάθετη δεξαμενή ηλεκτροφόρησης πλάκας, συσκευή ηλεκτροφόρησης, δεξαμενή μεταφοράς, αναδευτήρα αποχρωματισμού (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), σύστημα ανάλυσης απεικόνισης γέλης πρωτεΐνης (Shanghai Tanon Technology Co., Ltd.), όργανο ποσοτικής PCR φθορισμού σε πραγματικό χρόνο (ΗΠΑ Roche) κ.λπ.

1. 2 Ομαδοποίηση και διοίκηση

Δύο ποντίκια πέθαναν φυσικά κατά τη διαδικασία σίτισης και τα υπόλοιπα 78 ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδα μοντέλου, ομάδα GCs, ομάδα GCs + φλουταμίδη (F), ομάδα GCs + fulvestrant (ICI), ομάδα F, ICI

Ομάδες 13 ζώων η καθεμία. Εκτός από την ομάδα μοντέλου, την ομάδα F και την ομάδα ICI, στις άλλες ομάδες χορηγήθηκαν συνεχώς GCs σε δόση 50 mg/(kg·d) για 30 ημέρες.

Από την 24η ημέρα μετά τη χορήγηση GCs, η ομάδα GCs + flutamide (F) και η ομάδα GCs + fulvestrant (ICI) έλαβαν ενδοπεριτοναϊκή ένεση F (5 mg/kg/ημέρα) 30 λεπτά μετά τη χορήγηση των GC με καθετήρα. ), ICI (1 mg/kg/ημέρα), συνεχής ένεση για 7 ημέρες. Προσαρμόστε τη δοσολογική συγκέντρωση για να διασφαλίσετε ότι ο μέγιστος γαστρικός όγκος των ποντικών είναι 0,5 mL, 1 φορά/ημέρα.

1. 3 Δοκιμή λαβύρινθου νερού Morris

Τα ποντίκια προσαρμόστηκαν στο υδάτινο περιβάλλον μια μέρα νωρίτερα. Ο υδάτινος λαβύρινθος Morris διήρκεσε 6 ημέρες. Οι πρώτες 5 ημέρες ήταν η δοκιμή θέσης και πλοήγησης. Τα ποντίκια εκπαιδεύονταν μία φορά την ημέρα σε καθένα από τα τέσσερα τεταρτημόρια για 1 λεπτό κάθε φορά. Κάθε μεσοδιάστημα προπόνησης ήταν 15 λεπτά και τα αρχεία καταγράφονταν ταυτόχρονα. Καθυστέρηση διαφυγής της δοκιμής εντοπισμού θέσης και πλοήγησης των ζώων. την 6η ημέρα, αφαιρέστε την πλατφόρμα από το νερό και πραγματοποιήστε μια δοκιμή εξερεύνησης του διαστήματος. Καταγράψτε τον αριθμό των διασταυρώσεων της πλατφόρμας και το ποσοστό του χρόνου που αφιερώθηκε στο τεταρτημόριο στόχο του ποντικιού. το τεταρτημόριο στόχου) και η τροχιά κολύμβησης χωρικής εξερεύνησης (Κολυμβητική τροχιά δοκιμής χωρικού ανιχνευτή) και άλλοι δείκτες.

1. 4 Ανίχνευση Western blot

Έκφραση πρωτεϊνών που σχετίζονται με τις συνάψεις SYN, PSD-95 και BDNF. Μετά το τεστ υδάτινου λαβύρινθου Morris, όλα τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν τακτικά, τα κεφάλια τους αποκεφαλίστηκαν, οι εγκέφαλοί τους αφαιρέθηκαν και οι ιππόκαμποι τους αφαιρέθηκαν. Ο ιστός του ιππόκαμπου λύθηκε με πρωτεΐνη, διασπάστηκε με υπερήχους στους 4 βαθμούς, αφέθηκε σε πάγο για 30 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε στους 12,000 r/min για 15 λεπτά στους 4 βαθμούς. Το υπερκείμενο λήφθηκε και η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο BCA. Μετά τη φόρτωση της πρωτεΐνης, πραγματοποιήστε ηλεκτροφόρηση γέλης στοίβαξης σε σταθερή τάση 80 V, ηλεκτροφόρηση γέλης διαχωρισμού σε σταθερή τάση 120 V και μεταφορά υγρού σε σταθερή ροή 300 mA. Βγάλτε τη μεμβράνη PVDF, κλείστε την με 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 80 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και πλύνετε τη μεμβράνη τρεις φορές με TBST. 15 λεπτά/χρόνο, το πρωτογενές αντίσωμα επωάστηκε όλη τη νύχτα σε αναδευόμενο τραπέζι στους 4 βαθμούς. την επόμενη μέρα, η μεμβράνη πλύθηκε 3 φορές με TBST.

15 λεπτά/χρόνο, το δευτερεύον αντίσωμα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη χρώματος ECL και η απεικόνιση πραγματοποιήθηκε με σύστημα απεικόνισης χημειοφωταύγειας. Ως εσωτερική αναφορά χρησιμοποιήθηκε η -ακτίνη και η τιμή της οπτικής πυκνότητας της ζώνης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image J.

1. 5ＲRT－PCRＲΑνίχνευση

Η έκφραση mRNA των SYN, PSD-95 και BDNF εκχυλίστηκε από ολικό RNA ιστού ιππόκαμπου σύμφωνα με τη μέθοδο εκχύλισης Trizol και δημιουργήθηκε cDNA μετά από αντίστροφη μεταγραφή. Το κιτ ποσοτικής ανίχνευσης φθορισμού Talent χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτική ανίχνευση σχετικού φθορισμού. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές και τα αποτελέσματα μετατράπηκαν σε 2 - ΔΔCT αναλύθηκε. Οι εκκινητές ποντικιού-ακτίνης, SYN, PSD-95 και BDNF σχεδιάστηκαν από την Shanghai Sangon Company και οι αλληλουχίες εκκινητών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

1. 6 Στατιστική ανάλυση

Μέσω του SPSS 25. 0 στατιστικό λογισμικό για επεξεργασία, το λογισμικό Graphpad Prism 8 χρησιμοποιήθηκε για τη σχεδίαση στατιστικών γραφημάτων και η μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των μέσων ζευγαριών πολλαπλών δειγμάτων. P < 0. 05 σημαίνει ότι η διαφορά είναι στατιστικά σημαντική.