Επιδράσεις διαφορετικών εκχυλισμένων μερών του Cistanche Deserticola στις υπογλυκαιμικές επιδράσεις των μαύρων ποντικιών Db / Db Ⅱ

2 Πειραματικές μέθοδοι

2.1 Παρασκευή επεξεργασμένων προϊόντων Cistanche deserticola Cistanche deserticola:

Πάρτε τα φαρμακευτικά υλικά Cistanche deserticola, ξεπλύνετε τις ακαθαρσίες, βράστε στον ατμό σε μια κατσαρόλα υπό κανονική πίεση για 2 ώρες, κόψτε σε 6 mm και στεγνώστε στους 70 βαθμούς. Cistanche deserticola: Πάρτε κομμάτια αφεψήματος Cistanche deserticola, προσθέστε την κατάλληλη ποσότητα κρασιού από ρύζι, ανακατέψτε καλά, βρέξτε για 8 ώρες (κρασί από κίτρινο ρύζι: νερό=1:1), βράστε στον ατμό υπό υψηλή πίεση για 4 ώρες και στεγνώστε σε 70 μοίρες. (Χρησιμοποιήστε 30 mL κρασί από ρύζι για κάθε 100 g Cistanche deserticola).

ΦΥΣΙΚΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΚΙΣΤΑΝΧΗΣ

Υποστήριξη της Wecistanche-Ο μεγαλύτερος εξαγωγέας κιστάνι στην Κίνα:

Διεύθυνση ηλεκτρονικού ταχυδρομείου:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Αγορά για περισσότερες λεπτομέρειες Λεπτομέρειες:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-κατάστημα

2.2 Εμπλουτισμός διαφορετικών εκχυλισμένων μερών Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

Πάρτε 30 g σκόνης Cistanche deserticola/Tamarococcus deserticola, προσθέστε 10 φορές την ποσότητα νερού, θερμάνετε και αναρροή για εκχύλιση δύο φορές, 2 ώρες κάθε φορά, συνδυάστε τα εκχυλίσματα, συμπυκνώστε, προσθέστε αιθανόλη μέχρι η περιεκτικότητα σε αλκοόλη να φτάσει στο 60%, καθίζηση σε χαμηλή θερμοκρασία για 12 ώρες και φιλτράρετε με αναρρόφηση. , το ίζημα είναι το ακατέργαστο τμήμα πολυσακχαρίτη. Συμπυκνώστε το υπερκείμενο σε κατάλληλη συγκέντρωση, εφαρμόστε το σε μακροπορώδη ρητίνη προσρόφησης D101 και εκλούστε το με νερό και αιθανόλη διαφορετικών συγκεντρώσεων στη σειρά. Συλλέξτε το υδατικό έκλουσμα και συμπυκνώστε υπό ελαττωμένη πίεση σε παχύρρευστη πάστα, που είναι το συνολικό κλάσμα ολιγοσακχαρίτη. πλύσιμο με αιθανόλη 40%. Αφαιρέστε, συμπυκνώστε και στεγνώστε υπό μειωμένη πίεση, που είναι το ολικό κλάσμα γλυκοζίτη του Cistanche deserticola.

2.3 Προσδιορισμός περιεχομένου διαφορετικών εκχυλισμένων μερών του Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.1 Προσδιορισμός της συνολικής περιεκτικότητας σε πολυσακχαρίτες του Cistanche deserticola/Cistanche deserticola.

Ζυγίστε το δείγμα γλυκόζης 20. 00 mg σε ογκομετρική φιάλη των 50 mL για την παρασκευή 0. Για ένα πρότυπο διάλυμα γλυκόζης 4 mg·mL-1, μεταφέρετε με σιφώνιο 3, 4, 5, 6 και 7 mL αντίστοιχα σε μια ογκομετρική φιάλη 50 mL, αραιώστε τον όγκο με νερό και σιφωνήστε 2,0 mL κάθε διάλυμα γλυκόζης βαθμίδωσης συγκέντρωσης σε δοκιμαστικό σωλήνα. Πάρτε άλλη ίση ποσότητα απεσταγμένου νερού ως τυφλό μάρτυρα, προσθέστε 1 mL φαινόλης 5% σε κάθε σωληνάριο, ανακινήστε καλά, προσθέστε γρήγορα 5 mL πυκνού θειικού οξέος, αφήστε το για 10 λεπτά, βάλτε το σε λουτρό νερού 40 βαθμών για 15 λεπτά, αφαιρέστε το, ψύξτε γρήγορα σε θερμοκρασία δωματίου και μετρήστε την τιμή απορρόφησης στα 490 nm, πάρτε την απορρόφηση (A) ως τεταγμένη και τη συγκέντρωση γλυκόζης (C) ως τετμημένη, σχεδιάστε μια τυπική καμπύλη και λάβετε την εξίσωση παλινδρόμησης Y=8.37X-0.162 8 (R2=0.994 6). Ζυγίστε με ακρίβεια 1,0 g της συνολικής σκόνης πολυσακχαρίτη πρώτων υλών και προϊόντων, τοποθετήστε τα σε ογκομετρικές φιάλες των 50 mL αντίστοιχα, προσθέστε νερό για να διαλυθεί και ρυθμίστε τον όγκο στο σημάδι, τραβήξτε με ακρίβεια 2,0 ml σε δοκιμαστικό σωλήνα και μετρήστε το ίδιο τρόπο όπως η τυπική μέθοδος προετοιμασίας καμπύλης. , αυτό είναι.

2.3.2 Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε βεταΐνη σε Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.2.1 Παρασκευή διαλύματος αναφοράς:

Ζυγίστε με ακρίβεια 1,17 mg του διαλύματος αναφοράς βεταΐνης, τοποθετήστε το σε ογκομετρική φιάλη 5 mL, προσθέστε 50% μεθανόλη για να διαλυθεί και αραιωθεί σε όγκο και είναι έτοιμο.

2.3. 2. 2 Χρωματογραφικές συνθήκες

Η χρωματογραφική στήλη είναι Ecosil {{0}}Χρωματογραφική στήλη AMINO (4,6 mm×250 mm, 5 μm), κινητή φάση: ακετονιτρίλιο-νερό (99,5 ∶ 0,5) , θερμοκρασία στήλης: 30 βαθμοί, μήκος κύματος ανίχνευσης: 194 nm, ρυθμός ροής: 0,6 mL·min-1, όγκος έγχυσης 10 μL, χρωματογράφημα φαίνεται στο σχήμα 1. 2.3.2.3 Προετοιμασία του διαλύματος δοκιμής Ακριβώς ζυγίστε τη σκόνη του συνολικού κλάσματος ολιγοσακχαρίτη των ακατέργαστων και τελικών προϊόντων 1,0 g, αντίστοιχα τοποθετημένη σε ογκομετρική φιάλη 5 mL, προσθέστε απεσταγμένο νερό για να διαλυθεί και αραιωθεί σε όγκο, ανακινήστε καλά, περάστε από μικροπορώδη μεμβράνη φίλτρου 0,45 μL και είναι έτοιμο.

2.3.2.4 Προσδιορισμός Δείγματος Περιεχομένου

Απορροφήστε με ακρίβεια το διάλυμα δοκιμής ολικού ολιγοσακχαρίτη σε ακατέργαστο και παρασκευασμένο Cistanche deserticola, μετρήστε το σύμφωνα με τις συνθήκες στο «2.3.2.2» και υπολογίστε την περιεκτικότητα του δείγματος σε βεταΐνη.

2.3.3 Προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε εχινακοσίδη, βερμπασκοσίδη και ετεροκυσιφουγαρίνη στο Cistanche deserticola/Cistanche deserticola

2.3.3.1 Παρασκευή διαλύματος αναφοράς

Ζυγίστε επακριβώς 4,50 mg εχινακοσίδης, 4,80 mg βερμπασκοσίδης και 5,05 mg ετερόλογης κομιμικίνης σε ογκομετρικές φιάλες των 5 mL, προσθέστε 50% μεθανόλη για να διαλυθεί και να αραιωθεί μέχρι τη χαραγή και πάρτε κάθε μάρτυρα. Βάλτε 200 μL του διαλύματος δείγματος στο φιαλίδιο, προσθέστε 400 μL μεθανόλης 50% και ανακατέψτε καλά για να γίνει ένα μείγμα αναφοράς, ανακινήστε καλά και είναι έτοιμο.

2.3.3.2 Χρωματογραφικές συνθήκες

Η χρωματογραφική στήλη είναι Ecosil C18 (4,6 mm×250 mm, 5 μm), η μεθανόλη είναι η κινητή φάση Α, 0.1% μυρμηκικό οξύ είναι η κινητή φάση Β, βαθμιδωτή έκλουση, {{ 12}}~45 λεπτά, 30% A→ 70% A, ο ρυθμός ροής είναι 1,0 mL·min-1, η θερμοκρασία της στήλης είναι 30 μοίρες, το μήκος κύματος ανίχνευσης είναι 330 nm, ο όγκος έγχυσης είναι 10 μL και το χρωματογράφημα φαίνεται στο σχήμα 2.

2.3.3.3 Παρασκευή του διαλύματος δοκιμής

Ζυγίστε με ακρίβεια 1,0 g της συνολικής σκόνης γλυκοζίτη πρώτων υλών και προϊόντων, τοποθετήστε τα σε ογκομετρικές φιάλες 100 mL, προσθέστε 50% μεθανόλη για να διαλυθεί, προσαρμόστε τον όγκο στο σημάδι και ανακινήστε Καλά. Τραβήξτε με ακρίβεια 5 mL από κάθε δείγμα σε ογκομετρική φιάλη 10 mL, προσθέστε 50% μεθανόλη για να συμπληρώσετε τον όγκο, ανακινήστε καλά και περάστε από μια μικροπορώδη μεμβράνη φίλτρου 0,45 μm για να ληφθεί.

2.3.3.4 Προσδιορισμός Περιεχομένου Δείγματος

Σχεδιάστε με ακρίβεια το δείγμα ολικών γλυκοσιδίων Cistanche deserticola και μετρήστε το σύμφωνα με τις συνθήκες στο "2.3.3.2". Υπολογίστε τα περιεχόμενα εχινακοσίδης, βερμπασκοσίδης και ετερόλογης συνενοχής στο δείγμα.

2.4 Ομαδοποίηση ζώων, μοντελοποίηση και χορήγηση φαρμάκων

Το δωμάτιο των ζώων έχει 12 ώρες φωτός και 12 ώρες σκοτάδι, σχετική υγρασία 50% έως 70% και θερμοκρασία δωματίου από 18 έως 22 βαθμούς. Τα μαύρα ποντίκια db/db και τα μαύρα ποντίκια db/m (κανονική ομάδα ελέγχου) τράφηκαν κανονικά με συνηθισμένη τροφή και το πείραμα ξεκίνησε σε ηλικία 9 εβδομάδων. Εκτός από την κανονική ομάδα ελέγχου, τα υπόλοιπα μαύρα ποντίκια db/db επιλέχθηκαν τυχαία σύμφωνα με τα επίπεδα σακχάρου στο αίμα και το σωματικό βάρος. Χωρίστηκε σε 8 ομάδες, συγκεκριμένα ομάδα μοντέλου, ομάδα θετικού μάρτυρα, ομάδα ολικού πολυσακχαρίτη Cistanche deserticola, ομάδα ολικών ολιγοσακχαριτών Cistanche deserticola, ομάδα ολικών γλυκοζιδίων Cistanche deserticola, ομάδα ολικών πολυσακχαριτών Tartschistanche deserticola, ομάδα ολικού πολυσακχαρίτη Tarthouse deserticola, ομάδα ολικής ολιγοσακχαρίτης Tarthouse deserticola, ολική ομάδα ολιγοσακχαρίτης Cistanche deserticola. Εκτός από τον κανονικό έλεγχο

Εκτός από την ομάδα μοντέλου και την ομάδα μοντέλου, στους αρουραίους στις άλλες ομάδες χορηγήθηκε ενδογαστρική χορήγηση σε δόση 2 mL/100 g για 4 διαδοχικές εβδομάδες. Η συγκέντρωση του υγρού ήταν 4,1 g·kg-1. Η κανονική ομάδα ελέγχου και η ομάδα μοντέλου αντιμετωπίστηκαν με τον ίδιο τρόπο. Δώστε μια ορισμένη ποσότητα φυσιολογικού ορού στο στομάχι.

2.5 Επιδράσεις διαφορετικών εκχυλισμένων μερών του Cistanche deserticola στα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα μαύρων ποντικών db/db

2.5.1 Δοκιμή ανοχής γλυκόζης από το στόμα (OGTT).

Μετά από 26 ημέρες χορήγησης, νήστεψαν για 12 ώρες και 60 λεπτά μετά τη χορήγηση την επόμενη μέρα, στα μαύρα ποντίκια σε κάθε ομάδα χορηγήθηκαν 2.0 g·kg-1 γλυκόζης. σε 0, {{10}}.5, 1.0 και 2 αντίστοιχα. .0 h αίμα από την ουραία φλέβα ελήφθη για τη μέτρηση της τιμής της γλυκόζης στο αίμα. Με την τιμή της γλυκόζης αίματος ως τεταγμένη και τον χρόνο ως τετμημένη, δημιουργήθηκε ένα διάγραμμα μεταβολής της γλυκόζης αίματος και η περιοχή κάτω από τη γραμμή της καμπύλης γλυκόζης αίματος κάθε πειραματικής ομάδας υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο (AUC, hmmoL·L{ {13}}) [19]. AUC=A × {{20}}.25 + B × 0.50 + C × 0.75 + Δ. Στον τύπο: A, B, C και D είναι οι τιμές γλυκόζης αίματος σε 0, 0,5, 1,0 και 2,0 ώρες αντίστοιχα.

2.5.2 Υπολογισμός του δείκτη αντίστασης στην ινσουλίνη και του δείκτη αρτηριοσκλήρωσης

Ο δείκτης αντίστασης στην ινσουλίνη υπολογίστηκε σύμφωνα με τη βιβλιογραφική μέθοδο [20]: HOMA-IR=Γλυκόζη × Ινσουλίνη / 22. 5. HOMA - =20 × Ινσουλίνη / (Γλυκόζη - 3.5) × 100%. Το IR είναι αντίσταση στην ινσουλίνη και το (%) είναι η λειτουργία των κυττάρων. Η μοριακή μονάδα της γλυκόζης είναι mmoL·L{10}}

. Η ινσουλίνη χορηγείται σε mU·L-1. Οι αριθμοί γλυκόζης και ινσουλίνης μετρώνται κατά τη διάρκεια της νηστείας. Ο δείκτης αρτηριοσκλήρωσης (Αθηρογενής δείκτης) υπολογίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Zheng et al. [21]. Μέθοδος υπολογισμού: Αθηρογενής δείκτης=(TC-HDL-C) / HDL-C.

2.5.3 Επιδράσεις διαφορετικών εκχυλισμένων μερών Cistanche deserticola/Cistanche deserticola στον ορό INS και HbA1c μαύρων ποντικών db/db

Πάρτε τα κατεψυγμένα δείγματα ορού και φέρτε τα σε θερμοκρασία δωματίου πριν τα χρησιμοποιήσετε για δοκιμή με κιτ ανοσοπροσδιορισμού συνδεδεμένου με ένζυμα INS και HbA1c. Ακολουθήστε αυστηρά τις μεθόδους και τα βήματα στις οδηγίες του κιτ.

2.6 Επιδράσεις διαφορετικών εκχυλισμένων μερών Cistanche deserticola/Cistanche deserticola στο επίπεδο οξειδωτικού στρες του ήπατος μαύρων ποντικών db/db

Πάρτε τα κατεψυγμένα δείγματα ορού και φέρτε τα σε θερμοκρασία δωματίου πριν τα χρησιμοποιήσετε για δοκιμή με κιτ ανοσοπροσδιορισμού συνδεδεμένων με ένζυμα MDA και SOD. Ακολουθήστε αυστηρά τις μεθόδους και τα βήματα στις οδηγίες του κιτ.

2.7 Επιδράσεις διαφορετικών εκχυλισμένων μερών του Cistanche deserticola/Cistanche deserticola στον μεταβολισμό του ηπατικού λίπους μαύρων ποντικών db/db

Τα επίπεδα TG, TC, HDL-C και LDL-C ορού αρουραίου μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας σχετικά κιτ. Για συγκεκριμένα βήματα μέτρησης, ανατρέξτε στις οδηγίες του κιτ.

2.8 Επιδράσεις διαφορετικών εκχυλισμένων μερών Cistanche deserticola/Ratiana καμφοράς σε UA, Cr και mALB στο πλάσμα και στα ούρα μαύρων ποντικών db/db

Πάρτε κατεψυγμένα δείγματα πλάσματος και ούρων και φέρτε τα σε θερμοκρασία δωματίου πριν τα χρησιμοποιήσετε για τη δοκιμή κιτ ανοσοδοκιμών συνδεδεμένων με ένζυμα UA, Cr και mALB. Ακολουθήστε αυστηρά τις μεθόδους και τα βήματα στις οδηγίες του κιτ.

2.9 Παρατήρηση παθολογικών τομών παγκρέατος και νεφρού με χρώση ΗΕ

Οι ιστοί του παγκρέατος και των νεφρών εμποτισμένοι σε σταθεροποιητικό παραφορμαλδεΰδης 10% για 24 ώρες αφαιρέθηκαν, πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό και αποθηκεύτηκαν σε αιθανόλη 70%. Τα δείγματα ιστών αφαιρέθηκαν, αφυδατώθηκαν με διαβαθμισμένη αιθανόλη, καθαρίστηκαν, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (χρώση Η&Ε). Αφού στεγνώσει η κόλλα τομής, χρησιμοποιήστε ένα σύστημα ψηφιακής απεικόνισης υψηλής ανάλυσης για να παρατηρήσετε και να τραβήξετε φωτογραφίες των τμημάτων.

2.10 Προσδιορισμός κολλαγόνου τύπου IV ιστού νεφρού με ανοσοϊστοχημεία

Για έκφραση, τα τμήματα νεφρών αποκηρώθηκαν σε νερό και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάκτηση αντιγόνου. Αποκλείστηκαν με 10% ορό κατσίκας και επωάστηκαν με το πρωτεύον αντίσωμα στους 4 βαθμούς όλη τη νύχτα. Μετά την πλύση, το δευτερεύον αντίσωμα επωάστηκε. Η τρέχουσα λύση ήταν το DAB για την ανάπτυξη χρώματος. Η πλύση, η αφυδάτωση και η σφράγιση έγιναν κάτω από οπτικό μικροσκόπιο. Παρατηρήστε την έκφραση της πρωτεΐνης κολλαγόνου τύπου IV στον ιστό των νεφρών.

2.11 Στατιστικές μέθοδοι

Χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism Version 5.01 (2007, GraphPad Software re inc) για την ανάλυση των δεδομένων και των αποτελεσμάτων

Το αποτέλεσμα είναι μέσος όρος±SEM Υποδεικνύει ότι η διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων είναι Μονόδρομη

Μέθοδος 1 ζεύγη στήλης δοκιμής, Π.<0.05 is a significant difference and has statistical significance.