Περίληψη

Στόχος: Διερεύνηση των επιδράσεων μιας φόρμουλας που περιέχει Cistanche (που αντικαθιστά τα αρχικά βότανα που θρέφουν το αίμα και τονώνουν τους νεφρούς) στην έκφραση του μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα- 2 (TGF- 2), στην αναδιαμόρφωση του σκληρού χιτώνα και στη μεταφορά νερού σε αρουραίους με στέρηση μορφής μυωπίας (FDM) με ρύθμιση της caveol11/CA (CAV) της cav. (AQP1) μονοπάτι.

Μέθοδοι: Επιλέχθηκαν σαράντα αρσενικοί αρουραίοι SD βαθμού SPF, μεταξύ των οποίων 30 χρησιμοποιήθηκαν για την καθιέρωση του μοντέλου FDM. Μετά από επιτυχημένη μοντελοποίηση, οι αρουραίοι χωρίστηκαν στην ομάδα FDM, στην ομάδα πιρενζεπίνης (PIR) και στην ομάδα του τύπου Cistanche, με 10 αρουραίους σε κάθε ομάδα. Οι υπόλοιποι 10 μη-μοντελοποιημένοι αρουραίοι χρησίμευσαν ως η κανονική ομάδα. Η φυσιολογική ομάδα και η ομάδα FDM δεν έλαβαν καμία παρέμβαση. Η ομάδα PIR υποβλήθηκε σε θεραπεία με οφθαλμικές σταγόνες PIR δύο φορές την ημέρα (πρωί και βράδυ), ενώ στην ομάδα του τύπου Cistanche χορηγήθηκε ενδογαστρική χορήγηση της φόρμουλας που περιέχει Cistanche. Το διαθλαστικό σφάλμα και το αξονικό μήκος των αρουραίων ανιχνεύθηκαν με χρήση αμφιβληστροσκοπίου και διαγνωστικού οργάνου. Η χρώση HE χρησιμοποιήθηκε για την παρατήρηση των μορφολογικών αλλαγών του σκληρού ιστού. Χρησιμοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική χρώση για την ανίχνευση της έκφρασης του TGF- 2 στον σκληρό ιστό. Χρησιμοποιήθηκε στύπωμα Western για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών AQP1 και CAV1 στον σκληρό ιστό. Πραγματοποιήθηκε RT-PCR για τη μέτρηση των σχετικών επιπέδων έκφρασης του μεταφορέα γλουταμικού-ασπαρτικού (GLAST) και του mRNA του μεταφορέα γλουταμικού 1 (GLT-1) στον σκληρό ιστό. Αποτελέσματα: Σε σύγκριση με την κανονική ομάδα, το διαθλαστικό σφάλμα, το επίπεδο έκφρασης TGF- 2 και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών AQP1 και CAV1 στην ομάδα FDM, την ομάδα του τύπου Cistanche και την ομάδα PIR μειώθηκαν σημαντικά, ενώ το αξονικό μήκος και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του GLAST mRNA και GLT-1all PRNA <0 ήταν σημαντικά αυξημένα. Σε σύγκριση με την ομάδα FDM, το διαθλαστικό σφάλμα, το επίπεδο έκφρασης TGF- 2 και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών AQP1 και CAV1 στην ομάδα του τύπου Cistanche και την ομάδα PIR ήταν σημαντικά αυξημένα, ενώ το αξονικό μήκος και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των GLAST mRNA και GLT-1 mRNA μειώθηκαν σημαντικά (όλα P < 00). Σε σύγκριση με την ομάδα του τύπου Cistanche, το διαθλαστικό σφάλμα, το επίπεδο έκφρασης TGF- 2 και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών AQP1 και CAV1 στην ομάδα PIR μειώθηκαν σημαντικά, ενώ το αξονικό μήκος και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του GLAST mRNA και GLT-1 mRNA ήταν σημαντικά αυξημένα (όλα P < 0,05). Τα αποτελέσματα της χρώσης HE έδειξαν ότι δεν υπήρχαν παθολογικές αλλαγές στη δομή κάθε στιβάδας του αμφιβληστροειδούς στην κανονική ομάδα. ο αμφιβληστροειδής της ομάδας FDM αραιώθηκε και εμφανίστηκαν σοβαρές κενοτοπικές αλλαγές στο στρώμα των γαγγλιακών κυττάρων. το πάχος του αμφιβληστροειδούς της ομάδας τύπου Cistanche και της ομάδας PIR αυξήθηκε, η κυτταρική διάταξη ήταν βασικά κανονική, ο αριθμός των γαγγλιακών κυττάρων αυξήθηκε και τα κύτταρα σε κάθε στρώμα ήταν πυκνά διατεταγμένα, με την πιο σημαντική απόδοση στην ομάδα τύπου Cistanche. Συμπέρασμα: Η φόρμουλα που περιέχει Cistanche έχει μια ορισμένη θετική επίδραση στη θεραπεία της FDM και ο μηχανισμός της μπορεί να σχετίζεται με τη ρύθμιση της έκφρασης των CAV1, AQP1 και TGF- 2, καθώς και με την εξισορρόπηση και τη βελτίωση της αναδιαμόρφωσης του σκληρού χιτώνα και των λειτουργιών μεταφοράς νερού.

 

 

ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ CISTANCHE HERB ΓΙΑ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΗΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ

 

 

Λέξεις-κλειδιά

Μυωπία στέρησης μορφής; Φόρμουλα που περιέχει Cistanche; Μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας- 2; Ακουαπορίνη 1; Caveolin-1; Αναδιαμόρφωση σκληρού χιτώνα; Μεταφορά νερού

 

Τα τελευταία χρόνια, με τις αλλαγές στον τρόπο ζωής των ανθρώπων και τη συνεχή ανάπτυξη των ηλεκτρονικών συσκευών, η συχνότητα της μυωπίας έχει αυξηθεί. Ως κοινή ασθένεια, έχει γίνει παγκόσμιο πρόβλημα υγείας. Η μυωπία στέρησης μορφής (FDM) είναι ένας ειδικός τύπος μυωπίας, που συνήθως προκαλείται από τη στέρηση ή τη μείωση της οπτικής διέγερσης στα μάτια. Το FDM όχι μόνο παρεμβαίνει στη διαδικασία αναδιαμόρφωσης του σκληρού χιτώνα αλλά επίσης οδηγεί σε μη φυσιολογικές αλλαγές στο σχήμα του βολβού του ματιού και διαταραχές στη λειτουργία μεταφοράς νερού, που μπορεί να επιδεινώσουν περαιτέρω τη βλάβη και την παραμόρφωση του σκληρού ιστού. Η Aquaporin 1 (AQP1) είναι μια ευρέως υπάρχουσα πρωτεΐνη της οποίας η κύρια λειτουργία είναι να προάγει την ταχεία μεταφορά μορίων νερού μέσω των κυτταρικών μεμβρανών. Στο μάτι, η κατανομή και η λειτουργία του AQP1 σχετίζονται με τη δυναμική ισορροπία του ενδοφθάλμιου υγρού. Η Caveolin-1 (CAV1) είναι μια πρωτεΐνη που εμπλέκεται στο σχηματισμό μικροδομών της κυτταρικής μεμβράνης και στη μεταγωγή σήματος. Στο μάτι, το CAV1 είναι κυρίως παρόν στα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα φωτοϋποδοχέων του αμφιβληστροειδούς και σχετίζεται με τη μετάδοση οπτικών σημάτων και τη σταθερότητα του ενδοφθάλμιου περιβάλλοντος. Ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού- 2 (TGF- 2) είναι μια πλειοτροπική κυτοκίνη με πολλαπλές βιολογικές επιδράσεις, όπως η προώθηση του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και της μετανάστευσης των κυττάρων. Στο ενδοφθάλμιο περιβάλλον, ο TGF- 2 παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και συντήρηση του κερατοειδούς και του σκληρού χιτώνα. Επί του παρόντος, η κύρια θεραπεία για το FDM είναι η φαρμακευτική θεραπεία.

Στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική (TCM), ο σχηματισμός μυωπίας πιστεύεται ότι σχετίζεται με παράγοντες όπως το ανεπαρκές qi και αίμα και ανεπάρκεια νεφρικής ουσίας. Ο νεφρός θεωρείται ως το «συγγενές θεμέλιο» και σχετίζεται στενά με τη λειτουργία των ματιών. Η TCM υποστηρίζει ότι «το νεφρό διέπει την ουσία και η ουσία τρέφει τα μάτια· το συκώτι ανοίγει στα μάτια και το επαρκές αίμα στο συκώτι εξασφαλίζει καθαρή όραση». Ως εκ τούτου, η τόνωση των νεφρών και η θρέψη του αίματος ήταν πάντα μια σημαντική θεραπευτική αρχή για τις οφθαλμικές παθήσεις που προκαλούνται από σύνδρομα ανεπάρκειας στην TCM.

Το Cistanche, γνωστό ως το "τζίνσενγκ της ερήμου" και ένα από τα "εννέα αθάνατα φάρμακα" στο TCM, έχει ιστορία περισσότερα από 2.000 χρόνια ως φαρμακευτικό συστατικό. Καταγεγραμμένο ως θρεπτικό φαρμακευτικό υλικό κορυφαίας ποιότητας στα αρχαία κλασικά TCM, το Cistanche εκτιμάται ιδιαίτερα για τα αποτελέσματά του που τονώνουν τα νεφρά, αναπληρώνουν την ουσία, θρέφουν το αίμα και ενυδατώνουν την ξηρότητα. Σε αντίθεση με πολλά άλλα βότανα TCM, το Cistanche αναπτύσσεται αποκλειστικά σε ερήμους, κυρίως παρασιτικό στις ρίζες του Tamarix ramosissima σε περιοχές όπως το Xinjiang, η Εσωτερική Μογγολία και το Gansu στην Κίνα. Το μοναδικό περιβάλλον της ερήμου το προικίζει με πλούσια ενεργά συστατικά, όπως εχινακοσίδη, βερμπασκοσίδη και φλαβονοειδή, τα οποία έχουν αποδειχθεί επιστημονικά ότι έχουν ισχυρές αντιοξειδωτικές ιδιότητες, μειώνουν την απόπτωση των κυττάρων και προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

Η σύγχρονη έρευνα έχει δείξει ότι το Cistanche έχει σημαντικές θρεπτικές επιδράσεις στα νεφρά. Μπορεί να μειώσει την απόπτωση των νεφρικών κυττάρων, να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των νεφρικών κυττάρων, να επιδιορθώσει τα κατεστραμμένα νεφρικά κύτταρα και να διαστέλλει τα νεφρικά αιμοφόρα αγγεία, βελτιώνοντας έτσι τη λειτουργία των νεφρών. Επιπλέον, το Cistanche μπορεί να ενισχύσει την ανοσία προάγοντας τον πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων, να αντισταθεί στην κόπωση αυξάνοντας την παραγωγή γλυκογόνου στο ήπαρ και να ασκήσει αντιγηραντική δράση μέσω της δέσμευσης των ελεύθερων ριζών. Αυτές οι βιολογικές δραστηριότητες είναι σε μεγάλο βαθμό συνεπείς με τη θεωρία TCM της «τονωτικής ουσίας των νεφρών και της θρεπτικής ουσίας» και παρέχουν επίσης μια επιστημονική βάση για την εφαρμογή της στη θεραπεία οφθαλμικών παθήσεων. Βασισμένη στη θεραπευτική αρχή της TCM για τονωτικό του νεφρού και το θρεπτικό αίμα και συνδυάζοντας τα σύγχρονα φαρμακολογικά χαρακτηριστικά του Cistanche, αυτή η μελέτη αντικατέστησε τα αυθεντικά θρεπτικά και τονωτικά για το αίμα βότανα με Cistanche για να σχηματίσει μια νέα φόρμουλα που περιέχει Cistanche και διερεύνησε την αποτελεσματικότητά του και τον μηχανισμό του στην ανάπτυξη μιας φυσικής ιδέας για τη θεραπεία της FDM. για μυωπία.

1 Υλικά και Μέθοδοι

1.1 Πειραματόζωα

Σαράντα αρσενικοί αρουραίοι SD βαθμού SPF, βάρους 180-200 g και ηλικίας 6-8 εβδομάδων, αγοράστηκαν από το Beijing Keyu Animal Breeding Center [Αριθ. άδειας: SCXK (Jing) 2022-0004] και εκτράφηκαν τακτικά στο Animal Academy of Chinasye Science Laboratory of China. Αυτό το πείραμα συμμορφώθηκε με τις σχετικές διατάξεις των "Κανονισμών για τη χορήγηση πειραματόζωων" και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας του Οφθαλμικού Νοσοκομείου της Κίνας Ακαδημία Κινεζικών Ιατρικών Επιστημών (Αρ. παρτίδας: YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Κύρια αντιδραστήρια και όργανα

Το Cistanche tubulosa (αγοράστηκε από την Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd., με ενεργά συστατικά όπως εχινακοσίδη μεγαλύτερη από ή ίση με 30,0%, βερμπασκοσίδη μεγαλύτερη από ή ίση με 12,0% και ολικές γλυκοσίδες φαιναιθυλικής αλκοόλης μεγαλύτερη από ή ίση με 75,0%) χρησιμοποιήθηκε ως βασικό υλικό. Pirenzepine (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); Compound Tropicamide Eye Drops (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., προδιαγραφή 5 mL); 4 g·L-1 Oxybuprocaine Hydrochloride Eye Drops (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.); AQP1 αντίσωμα (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); CAV1 αντίσωμα (Wuhan Botu Biotechnology Co., Ltd.); -αντίσωμα ακτίνης (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); IgG αντι-κουνελιού κατσίκας (Wenzhou Kemiao Biotechnology Co., Ltd.); Κιτ χρώσης HE (Shanghai Zeye Biotechnology Co., Ltd.).

1.3 Μέθοδος μοντελοποίησης και ομαδοποίηση

Τριάντα αρουραίοι χρησιμοποιήθηκαν για την καθιέρωση του μοντέλου FDM. Οι αρουραίοι αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση πεντοβαρβιτάλης νατρίου (30 mg·kg-1). Μετά τον καθαρισμό και την απολύμανση του δεξιού ματιού με ιωδιούχο ποβιδόνη, κολλήθηκε μια αδιαφανής μάσκα ματιών στο δεξί μάτι. Η μάσκα ματιών ελέγχονταν καθημερινά για αποκόλληση ή ελαφριά διαρροή και κολλούσε ξανά εάν ήταν χαλαρή. Το αριστερό μάτι έμεινε χωρίς θεραπεία. Μετά από 4 εβδομάδες στέρησης μονοφθάλμιας μορφής, διόφθαλμη αμφιβληστροειδοσκόπηση και μέτρηση αξονικού μήκους πραγματοποιήθηκε στους αρουραίους. Τα κριτήρια επιτυχίας για τη μοντελοποίηση: μετά την κυκλοπληγία, το διαθλαστικό σφάλμα μετρήθηκε με ρετινοσκόπιο ή αυτόματο διαθλασίμετρο και το άδειο μάτι έδειξε σημαντική μυωπική μετατόπιση στη διαθλαστική κατάσταση [δηλαδή, η διαφορά στο διόφθαλμο διαθλαστικό σφάλμα μεγαλύτερη από ή ίση με 2 D θεωρήθηκε επιτυχημένη μοντελοποίηση και ο μέσος όρος της μετατόπισης του στερημένου ματιού συγκρίθηκε. 1.2) Δ]. Και οι 30 αρουραίοι μοντελοποιήθηκαν επιτυχώς και χωρίστηκαν στην ομάδα FDM, την ομάδα PIR και την ομάδα τύπου Cistanche, με 10 αρουραίους σε κάθε ομάδα. Οι υπόλοιποι 10 μη-μοντελοποιημένοι αρουραίοι χρησίμευσαν ως η κανονική ομάδα.

1.4 Μέθοδοι παρέμβασης

Η φυσιολογική ομάδα και η ομάδα FDM δεν έλαβαν καμία παρέμβαση. Στην ομάδα PIR χορηγήθηκαν 5 σταγόνες οφθαλμικές σταγόνες PIR στο δεξί μάτι δύο φορές την ημέρα (πρωί και βράδυ) με μεσοδιάστημα 2 λεπτών για 15 ημέρες. Η ομάδα του τύπου Cistanche παρενέβη με τον τύπο που περιέχει Cistanche. Το Cistanche tubulosa (50 g, το βασικό συστατικό) αφέψημα έγινε με νερό και συμπυκνώθηκε σε ένα ιατρικό διάλυμα με συγκέντρωση 1000 g·L-1. Στους αρουραίους δόθηκε ενδογαστρική χορήγηση σε δόση 12,70 g·kg-1 μία φορά την ημέρα για 15 ημέρες. Η δοσολογία του Cistanche καθορίστηκε με βάση την εμπειρία της κλινικής εφαρμογής και τη σύγχρονη φαρμακολογική έρευνα, διασφαλίζοντας αποτελεσματικές συγκεντρώσεις δραστικών συστατικών όπως η εχινακοσίδη και η βερμπασκοσίδη.

1.5 Μέθοδοι ανίχνευσης

1.5.1 Αξιολόγηση Διαθλαστικού Σφάλματος και Αλλαγών Αξονικού Μήκους

Ανίχνευση μορφολογικού και διαθλαστικού σφάλματος: Είκοσι τέσσερις ώρες μετά το τέλος της στέρησης μορφής, επιλέχθηκαν τυχαία 3 αρουραίοι από κάθε ομάδα για ανίχνευση. Πριν από το πείραμα, οι αρουραίοι τοποθετήθηκαν σε ένα προσαρμοσμένο στο σκοτάδι περιβάλλον για 30 λεπτά, στη συνέχεια αναισθητοποιήθηκαν με εισπνοή ισοφλουράνιου και στερεώθηκαν σε ειδικό ζωικό βραχίονα. Ένα σύστημα απεικόνισης OCT υψηλής ανάλυσης χρησιμοποιήθηκε για την πανοραμική σάρωση του βολβού του ματιού. Κατά τη διάρκεια της σάρωσης, ο καθετήρας ρυθμίστηκε ώστε να είναι κάθετος στον κερατοειδή για να ληφθούν καθαρές εικόνες διατομής του αμφιβληστροειδούς και του φακού. Κάθε μάτι σαρώθηκε 3 φορές διαδοχικά και η αξονική απόσταση από την πρόσθια επιφάνεια του κερατοειδούς έως το στρώμα του επιθηλίου της χρωστικής του αμφιβληστροειδούς (δηλαδή, το αξονικό μήκος) μετρήθηκε αυτόματα από το ενσωματωμένο λογισμικό του συστήματος για τον υπολογισμό του σφαιρικού ισοδύναμου διαθλαστικού σφάλματος. Για να διασφαλιστεί η ακρίβεια των δεδομένων, δύο επαγγελματικά εκπαιδευμένοι ερευνητές ανέλυσαν ανεξάρτητα τις εικόνες με τυφλό τρόπο. Εάν η διαφορά μεταξύ των δύο αποτελεσμάτων μέτρησης ήταν μεγαλύτερη από 0,50 D, τα δεδομένα απορρίφθηκαν και μετρήθηκαν εκ νέου. Επιβεβαιωτική ανίχνευση αξονικού μήκους: Για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων της μέτρησης OCT, χρησιμοποιήθηκε επίσης διαγνωστικό όργανο υπερήχων A-scan. Αρχικά, οφθαλμικές σταγόνες υδροχλωρικής οξυβουπροκαΐνης ενστάλαξαν και στα δύο μάτια των αρουραίων για τοπική αναισθησία και στη συνέχεια ο ανιχνευτής Α-σάρωση τέθηκε απαλά σε επαφή με τον κερατοειδή. Το όργανο ρυθμίστηκε στη χειροκίνητη λειτουργία και η ακριβής ταχύτητα διάδοσης με υπερήχους ρυθμίστηκε σύμφωνα με τα ενδοφθάλμια μέσα: 1540 m·s-1 για τον πρόσθιο θάλαμο και το υαλοειδές. Κατά τη λειτουργία, κάθε διεπαφή εντοπίστηκε με χειροκίνητη σήμανση και κάθε μάτι μετρήθηκε 3 φορές επανειλημμένα για να ληφθεί η μέση τιμή. Αυτό το πείραμα πραγματοποιήθηκε με τυφλό τρόπο και όλοι οι χειριστές έλαβαν ενιαία εκπαίδευση για να εξασφαλίσουν συνεπείς τεχνικές μέτρησης. Το όργανο βαθμονομήθηκε πριν από τη μέτρηση και ορισμένα δείγματα επιλέχθηκαν τυχαία για δοκιμή επαναληψιμότητας για να αξιολογηθούν οι συντελεστές συσχέτισης εντός και διατάξεων (ICC). Κατά τη διάρκεια του πειράματος ακολουθήθηκαν αυστηρές τυποποιημένες διαδικασίες λειτουργίας για να διασφαλιστεί η επιστημονικότητα και η αξιοπιστία των δεδομένων.

1.5.2 Χρώση HE

Μετά την ανίχνευση διαθλαστικού σφάλματος και αξονικού μήκους, οι αρουραίοι θυσιάστηκαν με υπερβολική αναισθησία. Τα βλέφαρα και οι περιβάλλοντες ιστοί και των δύο ματιών απολυμάνθηκαν και σημειώθηκαν το ρινικό και το κροταφικό σκέλος κάθετα στο μέσο του κερατοειδούς. Ο επιπεφυκότας κόπηκε σύμφωνα με τα σημάδια και ο βολβός του ματιού εκπυρήνωνε. Το limbus κόπηκε για να αφαιρεθεί ο ιστός του πρόσθιου τμήματος και το υαλοειδές, και ο σκληρός ιστός διατηρήθηκε. Ο σκληρός ιστός σταθεροποιήθηκε με 40 g·L-1 παραφορμαλδεΰδης για 24 ώρες, αφυδατώθηκε με αιθανόλη βαθμίδωσης, ενσωματώθηκε συνήθως σε παραφίνη, καθαρίστηκε με ξυλόλιο, τοποθετήθηκε με ουδέτερο βάλσαμο, τεμαχίστηκε στα 5 μm, χρωματίστηκε με HE και παρατηρήθηκε για μορφολογικές αλλαγές μορφολογικού ιστού με οπτικό μικροσκόπιο.

1.5.3 Ανοσοϊστοχημική χρώση για έκφραση TGF- 2 σε σκληρό ιστό

Επιλέχθηκαν δύο αρουραίοι από κάθε ομάδα. Τομές σκληρού ιστού υποβλήθηκαν σε ανάκτηση και αποκλεισμό αντιγόνου, επωάστηκαν με αντι-TGF ποντικού- 2 (1:3000) για 24 ώρες, πλύθηκαν, επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα (1:2000) για 1 ώρα, αναπτύχθηκαν τακτικά και βάφτηκαν αντίθετα, τοποθετήθηκαν με ουδέτερο ιστό και λήφθηκε με ουδέτερο ιστό 2 βάλσαμου. αλλαγές. Η γκρι τιμή του θετικού μέρους ανιχνεύθηκε από ένα σύστημα ανάλυσης εικόνας.

1.5.4 Ανίχνευση Western Blot των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης AQP1 και CAV1 σε σκληρό ιστό

Επιλέχθηκαν δύο αρουραίοι από κάθε ομάδα. Ο σκληρός ιστός αποκόπηκε, ομογενοποιήθηκε και η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε με προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος λύσης RIPA. Πραγματοποιήθηκαν μετουσίωση πρωτεΐνης, ποσοτικοποίηση, ηλεκτροφόρηση, μεταφορά μεμβράνης και αποκλεισμός. Πρωτογενή αντισώματα AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000) και αντίσωμα -ακτίνης (1:2000) προστέθηκαν και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς. Προστέθηκε δευτερογενές αντίσωμα (1:2000) και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Προστέθηκε αντιδραστήριο ECL και η τιμή του γκρι πρωτεΐνης αναλύθηκε με το λογισμικό Image Lab. Η αναλογία της γκρι τιμής της ζώνης στόχου προς αυτή της -ακτίνης ήταν το σχετικό επίπεδο έκφρασής της.

1.5.5 RT-PCR Ανίχνευση GLAST και GLT-1 mRNA έκφρασης σε σκληρό ιστό

Ο εναπομείνας σκληρός ιστός των αρουραίων ελήφθη και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Trizol. Το συνολικό RNA μετρήθηκε με ένα φασματοφωτόμετρο και το cDNA μεταγράφηκε αντίστροφα σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ. Το σύστημα αντίδρασης RT-PCR παρασκευάστηκε με τις ακόλουθες συνθήκες αντίδρασης: 75 βαθμούς για 30 δευτερόλεπτα, 85 βαθμούς για 60 δευτερόλεπτα, 80 βαθμούς για ανόπτηση για 30 δευτερόλεπτα, 65 βαθμούς για επέκταση για 30 δευτερόλεπτα, συνολικά 40 κύκλους. Με την -ακτίνη ως εσωτερική αναφορά, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του μεταφορέα γλουταμικού-ασπαρτικού (GLAST) και του μεταφορέα γλουταμικού 1 (GLT-1) υπολογίστηκαν με τη μέθοδο 2-ΔΔCt. Οι αλληλουχίες εκκινητών δείχνονται στον Πίνακα 1. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση μεταξύ των ομάδων και το τεστ LSD-t χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση κατά ζεύγη μεταξύ των ομάδων. Επίπεδο δοκιμής:=0.05.