Επίδραση της ραμιπρίλης στα νεφρά, τους πνεύμονες και την καρδιά ACE2 σε μοντέλο διαβητικών ποντικών
Mar 28, 2022
ΑΦΗΡΗΜΕΝΗΙστορικό: Το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κοροναϊός 2 (SARS-CoV-2) είναι υπεύθυνος για την τρέχουσα νόσο του κορωνοϊού 2019 (COVID-19). Το κύριο όργανο που επηρεάζεται σε αυτή τη μόλυνση είναι ο πνεύμονας και ο ιός χρησιμοποιεί το μετατρεπτικό ένζυμο 2 της αγγειοτενσίνης (ACE2) ως υποδοχέα για να εισέλθει στα κύτταρα στόχους. Σε αυτό το πλαίσιο, τέθηκε μια διαμάχη σχετικά με τη χρήση αναστολέων του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης (RAAS), καθώς αυτά τα φάρμακα ενδέχεται να αυξήσουν την έκφραση του ACE2 σε ορισμένους ιστούς και δυνητικά να αυξήσουν τον κίνδυνο μόλυνσης από SARS-CoV{11}}. Αυτό είναι ιδιαίτερα ανησυχητικό στους διαβητικούς ασθενείς, καθώς ο διαβήτης αποτελεί παράγοντα κινδύνου για τον COVID-19. Μέθοδοι: 12-διαβητικά ποντίκια εβδομάδων (db/db) έλαβαν θεραπεία με ραμιπρίλη ή μάρτυρα φορέα για 8 εβδομάδες. Μη διαβητικά ποντίκια db/m συμπεριλήφθηκαν ως μάρτυρες. Η έκφραση και η δραστηριότητα του ACE2 μελετήθηκαν στους πνεύμονες,νεφράκαι τις καρδιές αυτών των ζώων. Αποτελέσματα:ΝεφρόΗ δραστηριότητα ACE2 αυξήθηκε στα ποντίκια db/db σε σύγκριση με τα db/m (143,2 τοις εκατό ± 23 τοις εκατό έναντι 100 τοις εκατό ± 22,3 τοις εκατό, p=0,004), ενώ η ραμιπρίλη δεν είχε σημαντική επίδραση. Στον πνεύμονα, δεν βρέθηκαν διαφορές στο ACE2 όταν η σύγκριση ποντικών db/db με db/m και η ραμιπρίλη δεν είχε επίσης σημαντική επίδραση. Στην καρδιά, ο διαβήτης μείωσε τη δραστηριότητα του ACE2 (83 τοις εκατό ± 16,8 τοις εκατό , έναντι 100 τοις εκατό ± 23,1 τοις εκατό p=0,02) και η ραμιπρίλη αύξησε σημαντικά το ACE2 (83 τοις εκατό ± 16,8 τοις εκατό έναντι 98,2 τοις εκατό ± 15 τοις εκατό, σελ.=0.04). Συμπεράσματα: Σε ένα μοντέλο ποντικού με διαβήτη τύπου 2, η ραμιπρίλη δεν είχε σημαντική επίδραση στη δραστηριότητα του ACE2νεφρόή στους πνεύμονες. Επομένως, είναι απίθανο οι αναστολείς RAAS ή τουλάχιστον οι αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης να αυξάνουν τον κίνδυνο μόλυνσης από SARS-CoV-2 μέσω της αύξησης του ACE2.
Λέξεις-κλειδιά:COVID-19; Διαβήτης; Αποκλεισμός RAAS; Πνεύμονας; νεφρικές παθήσεις? νεφρό
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟ
ΕισαγωγήΗ πανδημία που προκαλείται από το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κοροναϊός 2 (SARS-CoV-2) που ξεκίνησε τον Δεκέμβριο του 2019 στη Γουχάν της Κίνας, έχει οδηγήσει σε παγκόσμια υγειονομική κρίση. Ο πνεύμονας είναι το κύριο προσβεβλημένο όργανο στη νόσο του κοροναϊού-19 (COVID-19). Το SARS-CoV-2 χρησιμοποιεί το ένζυμο μετατροπής της αγγειοτενσίνης 2 της διαμεμβρανικής πρωτεΐνης (ACE2) ως έναν από τους υποδοχείς για την είσοδο στα κύτταρα-στόχους (Hoffmann et al., 2020), ένα χαρακτηριστικό κοινό με το SARS-CoV (ο ιός που προκάλεσε την επιδημία SARS το 2002) (Li et al., 2003). Το ACE2 είναι μια καρβοξυπεπτιδάση που μετατρέπει την αγγειοτενσίνη-Ι (Ang-I) και την αγγειοτενσίνη-ΙΙ (Ang-II) σε αγγειοτενσίνη-1-9 (Ang{-1-9) και αγγειοτενσίνη-1-7 (Ang{{23 }}), αντίστοιχα. Αυτό το ένζυμο αποτελεί μέρος της εναλλακτικής οδού του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης-αλδοστερόνης (RAAS). Η ενεργοποίησή του έχει αγγειοδιασταλτικά αποτελέσματα καθεαυτή και ρυθμίζει με αρνητικό τρόπο τον κλασικό βραχίονα του RAAS (αγγειοσυσταλτικό) (Obukhov et al., 2020; Romero et al., 2015). Το ACE2 εκφράζεται ευρέως στα εγγύς σωληναριακά κύτταρα τουνεφρό(Lely et al., 2004). Σε μικρότερο βαθμό εκφράζεται επίσης στον πνεύμονα (σε πνευμονοκύτταρα τύπου 2) (Hamming et al., 2004· Serfozo et al., 2020) και στην καρδιά (στα καρδιομυοκύτταρα) (Oudit et al., 2009). Οι πληροφορίες που παρέχονται από την πρώτη πανδημία SARS-CoV το 2002, αποκάλυψαν ότι η μόλυνση SARS-CoV προκάλεσε μείωση της έκφρασης ACE2 στον πνεύμονα. Σε οξεία πνευμονική βλάβη, η ανεπάρκεια ACE2 έχει συσχετιστεί με ενισχυμένη ιστική βλάβη, η οποία μπορεί να αποδοθεί σε υπερβολική ενεργοποίηση του αγγειοσυσταλτικού σκέλους του RAAS (άξονας υποδοχέα τύπου 1 ACE/Ang-II/Angiotensin-II) (Kuba et al. , 2006). Ως εκ τούτου, το RAAS φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στη σοβαρότητα της πνευμονικής βλάβης που σχετίζεται με τη μόλυνση από SARS-CoV-2. Επιπλέον, η απορρύθμιση του RAAS παρατηρείται κλασικά στον διαβήτη και οι αλλαγές στην έκφραση του ACE2 έχουν εντοπιστεί στονεφρόκαι την καρδιά των διαβητικών ασθενών (Reich et al., 2008). Τα δεδομένα μετα-ανάλυσης έχουν αποκαλύψει ότι οι ασθενείς που έχουν μολυνθεί από SARS-CoV-2 δεν έχουν υψηλότερο επιπολασμό διαβήτη, αν και οι διαβητικοί ασθενείς παρουσιάζουν αυξημένο κίνδυνο να υποστούν σοβαρές μορφές μόλυνσης από SARS-CoV{-2 και χειρότερα αποτελέσματα (Fadini et al., 2020). Περίπου το 40 τοις εκατό των ασθενών με διαβήτη τύπου 2 είναι υπερτασικοί ("Μελέτη για την υπέρταση στη διαβήτη (HDS): I. Επιπολασμός της υπέρτασης σε πρόσφατα εμφανιζόμενους διαβητικούς ασθενείς τύπου 2 και η συσχέτιση με παράγοντες κινδύνου για καρδιαγγειακές και διαβητικές επιπλοκές", 1993) και είναι επομένως αντιμετωπίζονται με αναστολείς RAAS: αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης (ACEis) ή αναστολείς των υποδοχέων της αγγειοτενσίνης-ΙΙ τύπου 1 (ARBs). Επιπλέον, αυτά τα φάρμακα χρησιμοποιούνται επίσης ευρέως για τη θεραπεία της μη διαβητικής υπέρτασης και της πρωτεϊνουρίας σε πολλούςνεφρικές παθήσεις(García-Carro et al., 2019).
Κατά τη διάρκεια του πρώτου κύματος της πανδημίας COVID-19, προέκυψε μια διαμάχη σχετικά με τη χρήση αναστολέων RAAS καθώς ορισμένες μελέτες σε πειραματικά μοντέλα έδειξαν ότι η θεραπεία με αυτά τα φάρμακα αύξησε την έκφραση του ACE2 στον καρδιακό ιστό (Ferrario et al., 2005 Ishiyama et al., 2004; Ocaranza et al., 2006) και στονεφρώναγγείωση (Soler et al., 2009). Λόγω αυτών των προκλινικών ενδείξεων, έχει προταθεί ότι η θεραπεία με αναστολείς RAAS θα μπορούσε να αυξήσει την ευαισθησία στη λοίμωξη από SARS-CoV-2 δημιουργώντας ένα παράδοξο καθώς τα αυξημένα επίπεδα ACE2 θεωρούνται συνήθως προστατευτικά για τους ιστούς (Aleksova et al., 2020 Sparks et al., 2020; Wang et al., 2020). Παρά τα αποτελέσματα των προαναφερθέντων μελετών (Ferrario et al., 2005; Ishiyama et al., 2004; Ocaranza et al., 2006; Soler et al., 2009) δεν υπάρχουν αρκετά στοιχεία που να επιβεβαιώνουν ότι αυτά τα φάρμακα προάγουν την έκφραση του ACE2 ως άλλοι συγγραφείς που χρησιμοποιούν παρόμοια πειραματικά μοντέλα δεν έχουν παρατηρήσει τη διαμόρφωση ACE2 που προκαλείται από αναστολείς RAAS (Burchill et al., 2012; Burrell et al., 2005). Επιπλέον, οι επιδράσεις των αναστολέων RAAS στη διαμόρφωση του ACE2 του πνεύμονα έχουν αξιολογηθεί ελάχιστα. Σε μια πρόσφατη αναφορά, ο Wysocki και οι συνεργάτες του περιέγραψαν τη διαμόρφωση ACE2 στονεφρόκαι πνεύμονας ποντικών (C57BLKS/J) που έλαβαν θεραπεία με αναστολείς RAAS (telmisatan ή captopril) (Wysocki et al., 2020). Εδώ μελετάμε τις επιδράσεις ενός ΜΕΑ (ραμιπρίλη) σενεφρό, ACE2 πνεύμονα και καρδιάς σε μοντέλο ποντικού με διαβήτη τύπου 2.
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΗΝ ΝΕΦΡΙΚΗ/ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΟΙΜΩΞΗ
2. Υλικά και μέθοδοι
2.1.Διαδικασίες με ζώαΑρσενικά διαβητικά ποντίκια με ανεπάρκεια υποδοχέα λεπτίνης οκτώ εβδομάδων (db/db) και τα μη διαβητικά ετερόζυγα νεογνά (db/ plus ) αγοράστηκαν από τον Charles River (BKS.Cg-Dock7m plus / plus Lepr"J.Strain Code: 607 ).Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε ομάδες των 4 ανά κλουβί το μέγιστο με ad libitum πρόσβαση σε κανονικά ποντίκια Chow και νερό σε κύκλο 12 ωρών φωτός: 12 ωρών σκότους. Μετά από 4 εβδομάδες (12-ποντίκια εβδομάδων) ένα ομάδα db/db (n =7) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ραμιπρίλη (8 mg/kg/ημέρα) αραιωμένη σε πόσιμο νερό (20 mg/L) για 8 εβδομάδες. Όχημα db/db (n=7 )και db/m (n=7) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Το βάρος και η γλυκόζη αίματος παρακολουθούνταν κάθε δύο εβδομάδες και η αρτηριακή πίεση πριν και μετά τη θεραπεία (βλ. συμπληρωματικές μεθόδους). Μετά την περίοδο θεραπείας, τα ζώα θυσιάστηκαν κάτω από νάτριο Αναισθησία πεντοβαρβιτάλης.Τα ποντίκια στη συνέχεια εγχύθηκαν με κρύο PBS 1x και λήφθηκε πλήρες αίμα με καρδιακή παρακέντηση Τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν σε σωλήνες με πηκτή ενεργοποίησης πήξης (41.1378.005, Sarstedt, Γερμανία) για να ληφθεί το s ερουμ. Στη συνέχεια, τονεφρό,η καρδιά και ο πνεύμονας αφαιρέθηκαν, καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο και διατηρήθηκαν στους -80 βαθμούς C μέχρι τη χρήση. Επιπλέον, ένα μέρος τουνεφρόκαι η καρδιά σταθεροποιήθηκε σε φορμαλίνη 10 τοις εκατό και ενσωματωμένη παραφίνη για ιστολογικές αναλύσεις. Το πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από τις Επιτροπές Δεοντολογίας Πειραμάτων σε Ζώα του Ερευνητικού Ινστιτούτου Vall d'Hebron (47.18 CEEA). Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Generalitat de Catalunya στο πλαίσιο των Οδηγιών του Ευρωπαϊκού Συμβουλίου για την προστασία και φροντίδα των ζώων που χρησιμοποιούνται για έρευνα και άλλους επιστημονικούς σκοπούς (2010/63/ΕΕ).
2.2. Ανάλυση ACE2Η έκφραση του γονιδίου ACE2 και της πρωτεΐνης, καθώς και η δραστηριότητα του ACE2, αναλύθηκαν στονεφρό, εκχυλίσματα πνευμόνων και καρδιάς. Στον ορό, αξιολογήθηκε μόνο η δραστηριότητα του ACE2. Η έκφραση του γονιδίου ACE2 μετρήθηκε με RT-qPCR και η μέθοδος A△Cr εφαρμόστηκε για σχετική ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας την Hypo-xanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT) ως γονίδιο οικιακής φροντίδας. Τα επίπεδα πρωτεΐνης ACE2 εκτιμήθηκαν με στύπωμα Western και η δραστηριότητα ACE2 προσδιορίστηκε μέσω φθορίζουσας ενζυματικής ανάλυσης χρησιμοποιώντας ένα φθορογόνο υπόστρωμα με ACE (Mca-Ala-Pro-Lys (Dnp)-OH: Enzo Life-Sciences) όπως περιγράφεται προηγουμένως (Riera et al.2016). Επιπλέον, στονεφρόκαι στην καρδιά ανιχνεύσαμε το ACE2 με ανοσοϊστοχημεία. Η μεθοδολογία περιγράφεται λεπτομερώς στις συμπληρωματικές μεθόδους.
2.3. Στατιστικές αναλύσειςΗ κανονική κατανομή ελέγχθηκε συγκρίνοντας τα δεδομένα μας με την προβλεπόμενη κανονική κατανομή με διάγραμμα quantil-quantil (QQ) και επιβεβαιώθηκε με τεστ κανονικότητας (Shapiro-Wilk και/ή Kolmogorov-Smirnov). Οι ομάδες συγκρίθηκαν (db/m vs db/db και db/db vs db/db συν Ramipri) με Welch t-test όταν ικανοποιήθηκε η κανονικότητα ή με τη δοκιμή Mann-Whitney όταν τα δεδομένα ακολούθησαν μια μη κανονική κατανομή. Τα δεδομένα εκφράζονται alwavs ως μέση ± τυπική απόκλιση (SD). Οι τιμές p είναι λεπτομερείς για την εκτίμηση της εμπιστοσύνης των συγκρίσεων και η στατιστική σημασία λήφθηκε υπόψη όταν p Μικρότερο ή ίσο με 0.05. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις και τα γραφήματα πραγματοποιήθηκαν με το GraphPad Prism Version 8.2.1.
3. Αποτελέσματα
3.1. Η ραμιπρίλη μειώνει την αρτηριακή πίεση σε ποντικούς db/dbΟι τελικοί στόχοι της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί (1) πώς διαμορφώνεται το διαβητικό πλαίσιονεφρών, πνευμονικός και καρδιακός υποδοχέας ACE2 (SARS-CoV-2 για τη μόλυνση των κυττάρων-στόχων) και (2) εάν η θεραπεία με ACEi θα μπορούσε να τροποποιήσει τη συμπεριφορά ACE2 στον διαβήτη. Για το σκοπό αυτό,12-διαβητικά ποντίκια εβδομάδων (db/db) έλαβαν θεραπεία με ραμιπρίλη (8 mg/kg/ημέρα), ένα ΜΕΑ, για 8 εβδομάδες. Ως μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν ποντίκια οχήματος db/db και μη διαβητικά ποντίκια (db/m). Όπως αναμενόταν, όλα τα διαβητικά ποντίκια, και τα δύο που έλαβαν θεραπεία με ραμιπρίλη και το όχημα, εμφάνισαν υπεργλυκαιμία και αυξημένο βάρος στο τέλος του πειράματος σε σύγκριση με ποντίκια todb/m (Πίνακας 1). Στο πειραματικό μας περιβάλλον, τα ποντίκια db/db απεικόνισαν μειωμένη συστολική και διαστολική αρτηριακή πίεση σε σύγκριση με ποντίκια ελέγχου db/m (βλ. Πίνακα 1). Όπως αναμενόταν, η χορήγηση ραμιπρίλης για 8 εβδομάδες μείωσε σημαντικά τη συστολική αρτηριακή πίεση σε σύγκριση με την ομάδα του φορέα db/db και/ή την ομάδα db/m (Πίνακας 1) που αποδεικνύει ότι η θεραπεία με ραμιπρίλη ήταν αποτελεσματική.
3.2. Το ACE2 είναι αυξημένο στους νεφρούς των ποντικών db/db που δεν τροποποιήθηκε από τη ραμιπρίληΜελετήσαμε τη διαμόρφωση του ACE2 στονεφρόαπό τα db/m, τα ποντίκια φορέα db/db και τα db/db ποντίκια που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ραμιπρίλη χρησιμοποιώντας δύο προσεγγίσεις: (1) έκφραση του γονιδίου ACE2 με qPCR και (2) προσδιορισμό δραστηριότητας ACE2 χρησιμοποιώντας φθορίζον υπόστρωμα. Τα ποντίκια οχήματος db/db εμφάνισαν αυξημένη έκφραση νεφρικού γονιδίου ACE2 σε σύγκριση με το db/m(1.011 ± 0.16 έναντι 1582 ± 0.18, p<0.0001), this="" effect="">
αντιστράφηκε με τη χορήγηση ραμιπρίλης (1,280 ± 0,18, p=0,01) (Εικ. 1, Α). Η νεφρική δραστηριότητα ACE2 (100 τοις εκατό ± 14,2 τοις εκατό έναντι 114 τοις εκατό ± 31,9 τοις εκατό , p=0.2) επίσης έτεινε να αυξάνεται στο όχημα db/db, ωστόσο η ραμιπρίλη δεν τροποποίησε τη δραστηριότητά της (114 τοις εκατό ± 31,9 τοις εκατό έναντι 109,3 τοις εκατό ± 18,6 τοις εκατό ) (Εικ. 1D)). Σε εκχυλίσματα πρωτεΐνης εμπλουτισμένα με μεμβράνη, έγινε προφανές ότι τα ζώα db/db είχαν αυξημένη δραστηριότητα ACE2 σε σύγκριση με τα db/m (100 τοις εκατό ± 22,3 τοις εκατό έναντι 143,2 τοις εκατό ± 23,1 τοις εκατό , p=0,004) και , και πάλι, η ραμιπρίλη δεν τροποποίησε τη δραστηριότητα του ACE2 σενεφρόεκχυλίσματα εμπλουτισμένα με μεμβράνη (Εικ. 2Α). Στονεφρότομές ιστού, η έκφραση ACE2 εντοπίστηκε στο όριο της βούρτσας των σωληναριακών κυττάρων και η χρώση ήταν πιο εμφανής στα db/db σε σύγκριση με τα db/m (Εικ. 3). Δεν παρατηρήσαμε σημαντικές αλλαγές στην κατανομή του ACE2 στονεφρότων ζώων που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ραμιπρίλη σε σύγκριση με τα μη υποβληθέντα σε θεραπεία db/db (Εικ. 3).
3.3. Η ραμιπρίλη δεν τροποποίησε το πνευμονικό ACE2 στα ποντίκια db/db Στον πνεύμονα, πραγματοποιήσαμε την ίδια προσέγγιση όπως στηννεφρόνα μελετήσει το ACE2. Δεν βρήκαμε διαφορές μεταξύ του db/m και του φορέα db/db όσον αφορά την έκφραση του γονιδίου ACE2 (Εικ. 1, Β) που σχετίζεται κυρίως με την υψηλή μεταβλητότητα στην έκφραση του mRNA του ACE2 (0.97 ± {{6} }.8 έναντι 1.{10}}7 ± 0.71, p=0.63). Δεν μπορέσαμε να βρούμε διαφορές μεταξύ της δραστηριότητας του πνεύμονα και του ACE2 (ούτε στα εκχυλίσματα ολικών πρωτεϊνών ή σε εκχυλίσματα εμπλουτισμένα με μεμβράνη) (Εικ. 1Ε και 2Β, και Συμπληρωματικό Σχήμα 1 και 2, αντίστοιχα). Επιπλέον, στον πνεύμονα του db/db, η θεραπεία με ραμιπρίλη δεν προκάλεσε αλλαγές στην έκφραση και τη δραστηριότητα του γονιδίου ACE2 (Εικ. 1Β και Ε, Εικ. 2Β και Συμπληρωματικό Σχήμα 1 και 2).
3.4 Το ACE2 μειώνεται στην καρδιά του d/d και η ραμιπρίλη ομαλοποιεί τα επίπεδα του ACE2Αναλύσαμε επίσης το ACE2 στην καρδιά Στον καρδιακό ιστό, το ACE2 μειώθηκε σημαντικά στα db/db έναντι των db/m, λαμβάνοντας υπόψη και τα δύο επίπεδα mRNA (1.01±0.12 ws {{8 }}.84±0.16,p=0.05)(Εικ.1C)και δραστηριότητα ACE2 (100 τοις εκατό ±23,1 τοις εκατό ws 83 τοις εκατό ±16,8 τοις εκατό , p{20}}.02）（臣g.1F） Σε εκχυλίσματα εμπλουτισμένα με μεμβράνη, η δραστηριότητα ACE2 μειώθηκε επίσης σημαντικά σε db/db σε σύγκριση με db/m (Σχήμα 2Ο. Η θεραπεία με ραμιπρίλη αποκατέστησε σημαντικά τη δραστηριότητα ACE2 στα παρατηρούμενα ποντίκια ελέγχου db/m (83 τοις εκατό ± 16,8 τοις εκατό έναντι 98,2 τοις εκατό ±15 τοις εκατό ,p=0.04) (Εικ. 1Ε). Ωστόσο, η ραμιπρίλη δεν ήταν σε θέση να τροποποιήσει την έκφραση του γονιδίου ACE2 στην καρδιά (Εικ, IC), Επιπλέον, αξιολογήσαμε την κατανομή του ACE2 στον καρδιακό ιστό όπου το ACE2 Η χρώση έδειξε διάχυτη κατανομή με αυξημένη χρώση ACE2 σε ορισμένες περιοχές. Σημειώσαμε ότι η ένταση της χρώσης ήταν πιο ήπια σε db/db σε σύγκριση με db/m. Η ραμιπρίλη φάνηκε να αποκαθιστά την ένταση της χρώσης (Hig 3).
3.5 Η δραστηριότητα του ACE2 ορού είναι αυξημένη στα db/db και δεν τροποποιήθηκε από τη ραμιπρίληΤέλος, μετρήσαμε τη δραστηριότητα του ACE2 σε δείγματα ορού των db/m, db/db και db/db που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ραμιπρίλη. Η δραστηριότητα του ACE2 στον ορό αυξήθηκε σημαντικά στα db/db σε σύγκριση με τα db/m (99,9 τοις εκατό ± 29,3 τοις εκατό ws 146 τοις εκατό ± 57,2 τοις εκατό , p= 0,03) και η ραμιπρίλη δεν μετρίασε αυτήν την επίδραση (146 τοις εκατό ±57,2 τοις εκατό έναντι 128 τοις εκατό ±55,7 τοις εκατό ,p= 0.5)(Εικ.4).
4. Συζήτηση
Η τρέχουσα πανδημία που προκαλείται από τον SARS-CoV-2 έχει προκαλέσει μια διαμάχη που σχετίζεται με τη χρήση αναστολέων RAAS σε ασθενείς με COVID-19. Παρά τα αποδεδειγμένα οφέλη από τη χρήση ACEi ή ARB σε καρδιαγγειακούς ασθενείς (Fegan et al, 2000; Romero et al., 2015) έχει προταθεί ότι αυτά τα φάρμακα μπορεί να αυξήσουν την έκφραση του ACE2, του υποδοχέα του SARS-CoV{{ 7}}, και ως εκ τούτου αυξάνουν τον κίνδυνο και τη σοβαρότητα του COVID-19 (Aleksova et al, 2020; Sparls et al, 2020; Wang et al, 2020).
Με την παρούσα μελέτη στοχεύσαμε να ρίξουμε φως σε αυτή τη διαμάχη και για το σκοπό αυτό αναλύσαμε το ACE2 σε δείγματα νεφρού, πνεύμονα, καρδιάς και ορού ενός μοντέλου διαβητικών ποντικών (db/db) που έλαβαν θεραπεία με ραμιπρίλη για 8 εβδομάδες. Χρησιμοποιήσαμε ένα διαβητικό μοντέλο για να προσδιορίσουμε την επίδραση του αποκλεισμού RAAS καθώς το διαβητικό περιβάλλον είναι παράγοντας κινδύνου ανά θάλασσα για κακή πρόγνωση σε ασθενείς με COVID-19 (Fadini et al, 2020; Williamson et al, 2020). Βρήκαμε αυξημένη έκφραση και δραστηριότητα του γονιδίου ACE2 του νεφρού σε εκχυλίσματα μεμβράνης σε ποντικούς db/db (Εικ. 1Α και 2Α, αντίστοιχα). Προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης δείξει αύξηση του νεφρικού ACE2 σωληναρίσματος στα db/db διαβητικά ποντίκια (Wysocki et al, 2006; Yeet al, 2004, 2006) καθώς και σε άλλα μοντέλα διαβητικών ποντικών (Riera et al, 2016; Wysocki et al, 2006 ). Η ραμιπρίλη μπόρεσε να αναστρέψει την αύξηση του ACE2 σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης, υποδηλώνοντας ότι η χορήγησή της ήταν προστατευτική έναντι της επιβλαβούς επίδρασης του διαβήτη στους νεφρούς. Τα ευρήματά μας στο νεφρό έρχονται σε αντίθεση με τα αποτελέσματα που δημοσιεύθηκαν στην πρόσφατη έκθεση του Wysocki και των συνεργατών (Wysocldi et al.2020) καθώς περιέγραψαν τον αποκλεισμό RAAS σε ποντικούς C57BLKS/J προάγει μια μείωση της έκφρασης ACE2 μαζί με την εσωτερίκευση της πρωτεΐνης. Στη μελέτη μας χρησιμοποιώντας το μοντέλο ποντικών db/db, δεν βρήκαμε ότι η ραμιπρίλη μείωσε τη δραστηριότητα ACE2 στο νεφρό (Εικ. 1Dand2A) και δεν παρατηρήσαμε ούτε εσωτερίκευση πρωτεΐνης (Εικ. 3). Ακόμα κι έτσι, βρήκαμε ότι η θεραπεία με ραμιπρίλη προκάλεσε μείωση της έκφρασης του γονιδίου ACE2 σε db/db (Εικ, 1Α). Η έκφραση γονιδίου και πρωτεΐνης μπορεί να μην συσχετίζεται λόγω διαφορετικών χρονικών περιόδων μεταξύ της πρωτεϊνικής σύνθεσης και της αποικοδόμησης, αλλά τα αποτελέσματα που λαμβάνονται στην έκφραση του γονιδίου ACE2 (Fg.1A) υποδηλώνουν ότι ο αποκλεισμός του RAAS θα προωθούσε μια μείωση του ACE2 στους νεφρούς, όπως προτείνεται από τον Wysocki και τους συνεργάτες. Wysocldi et al.2020). Η προσέγγισή μας, σε αντίθεση με τη μελέτη των Wysocki και cols. (Wysocldi et al.2020), μιμήθηκε τους ασθενείς με διαβήτη που συνήθως λαμβάνουν αναστολείς RAAS για να καθυστερήσει την εξέλιξη της διαβητικής νεφροπάθειας (Garcia-Carro et al..2019). Inline, ένα πρόσφατο wark των Batchu et al. έχει δείξει ξεκάθαρα στους νεφρούς και τους πνεύμονες ποντικών με συννοσηρότητα διαβήτη (γήρανση, δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά και διαβήτης που προκαλείται από στρεπτοζοτοκίνη) ότι το ACE2 ρυθμίζεται προς τα πάνω. Ωστόσο, ο αποκλεισμός RAAS δεν μπόρεσε να τον τροποποιήσει (Batchu et al.2020). Ετσι. τουλάχιστον για το νεφρό. Τα αποτελέσματά μας δεν υποστηρίζουν την ιδέα ότι ο αποκλεισμός του RAAS θα ευνοούσε την υπερέκφραση του ACE2. Σε ανθρώπους, δύο ανεξάρτητες μελέτες περιέγραψαν ότι η έκφραση του σωληναριακού γονιδίου ACE2 και της πρωτεΐνης ήταν μειωμένη στους διαβητικούς
νεφροπάθεια σε σύγκριση με υγιή άτομα (Mizuiri et al, 2008; Reich et al, 2008), αν και ένας άλλος συγγραφέας δεν μπόρεσε να βρει διαφορές (Lelyet al.2004). Όσον αφορά την επίδραση του αποκλεισμού του RAAS στους ανθρώπους, υπάρχουν ορισμένες ενδείξεις ότι επηρεάζει την έκφραση του ACE2 στους νεφρούς (Lely et al, 2004; Reich et al, 2008).
Αναλύσαμε επίσης το ACE2 σε ιστούς του πνεύμονα και της καρδιάς όπου η παρουσία του ACE2 είναι πολύ χαμηλότερη από ότι στους νεφρούς (Συμπληρωματικό Σχήμα S1 και S2). Όσον αφορά τον πνεύμονα, λάβαμε υψηλή μεταβλητότητα μεταξύ των ατόμων στην έκφραση του γονιδίου ACE2 (Εικ. 1), η οποία μπορεί εν μέρει να εξηγηθεί από το γεγονός ότι η έκφραση του ACE2 στον πνεύμονα είναι πολύ χαμηλή και περιορίζεται στα πνευμονοκύτταρα τύπου 2 (Ziegler et al, 2020). Λάβαμε υγιή αποτελέσματα όταν το ACE2 υπολογίστηκε με μέτρηση της ενζυμικής δραστηριότητας. Η δραστηριότητα ACE2 του πνεύμονα ήταν παρόμοια μεταξύ του ελέγχου db/m και του διαβητικού db/db και δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα db/db που έλαβαν θεραπεία με ραμιπρίλη σε σύγκριση με το όχημα db/db (Fgs.IE και 2B). Αν και το ACE2 στον πνεύμονα δεν έχει μελετηθεί ευρέως σε ζωικά μοντέλα, έχει αναφερθεί ότι τα ποντίκια NOD και τα μη διαβητικά συγγενή τους έχουν παρόμοια δραστηριότητα ACE2 στον πνεύμονα (Roca-Ho et al.2017). Αντίθετα, η στρεπτοζοτοκίνη και τα διαβητικά ποντίκια που προκλήθηκαν από δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά έδειξαν αυξημένη δραστηριότητα ACE2 του πνεύμονα σε σύγκριση με μη διαβητικά ποντίκια (Batchu et al., 2020). Όσον αφορά την επίδραση του αποκλεισμού RAAS στο πνευμονικό ACE2, τα αποτελέσματά μας είναι συνεπή με τις αναφορές των Wysockiet al και Batchu et al. καθώς δεν βρήκαν διαφορές συμπεριλαμβανομένης της δραστηριότητας ACE2 όταν τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ARBs ή ACEi (Batchu et al.2020; Wysocldi et al.2020). Σε ανθρώπους, μια μελέτη σε 1051 ασθενείς αποκάλυψε ότι η έκφραση του γονιδίου ACE2 του πνεύμονα ρυθμίστηκε προς τα κάτω από μακροχρόνια θεραπεία με ACEi, ενώ δεν τροποποιήθηκε από τα ARBs (Milne et al, 2020), αν και δεν υπήρχαν διαθέσιμα δεδομένα σχετικά με τα επίπεδα ή τη δραστηριότητα της πρωτεΐνης ACE2.
Η έκφραση και η δραστηριότητα του καρδιακού γονιδίου ACE2 μειώθηκαν σημαντικά στο μικρόφωνο db/db σε σύγκριση με το db/m (Εικ. 1 και F, αντίστοιχα). Σε αυτή την περίπτωση, η θεραπεία με ραμιπρίλη αύξησε τη δραστηριότητα ACE2 (Εικ. 1 ΣΤ. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι στο μοντέλο db/db το διαβητικό προφίλ προάγει μια μείωση του καρδιακού ACE2 που αποκαθίσταται υπό τον αποκλεισμό RAAS. Σε διαβητικά ποντίκια db/db, η μείωση του καρδιακού ACE2 φαίνεται να συμβαίνει με την πάροδο του χρόνου, όπως κάνουν τα νεότερα ζώα (8 εβδομάδων) δεν παρουσιάζουν μειωμένη δραστηριότητα ACE2 στην καρδιά (Ye et al, 2004). Το καρδιακό ACE2 έχει επίσης μειωθεί σε διαβητικούς αρουραίους που προκαλούνται από στρεπτοζοτοκίνη (Qiao et al, 2015; Shin e al. 2017) αν και άλλα μοντέλα διαβητικού ποντικού δείχνουν αύξηση του καρδιακού ACE2 σε σύγκριση με τους μη διαβητικούς συντρόφους τους (Patel et al, 2012; Roca-Ho et al., 2017). Ακόμα κι έτσι, πειράματα in vitro υποδηλώνουν ότι η γλυκόζη μπορεί να μειώσει άμεσα το ACE2 στα λεία μυϊκά κύτταρα των καρδιακών αγγείων (Lavrentyev και Malik , 2009). Διαμόρφωση ACE2 στην καρδιά καθώς και η επίδραση του μπλοκ RAAS Το kade έχει μελετηθεί κυρίως στο έμφραγμα του μυοκαρδίου (ΕΜ) τόσο σε μοντέλα αρουραίων όσο και σε ανθρώπους. Σε ένα μοντέλο αρουραίου MI, ο Ocaranza και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι η δραστηριότητα ACE2 της καρδιάς ήταν μειωμένη στον MI και τον αποκλεισμό του RAAS
με την εναλαπρίλη το ανέστρεψε (Ocaranz et al, 2006), παρόμοια με αυτό που συμβαίνει στη μελέτη μας. Ωστόσο, άλλες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε παρόμοια μοντέλα αρουραίων MI δεν έχουν καταλήξει στα ίδια συμπεράσματα (Burrell et al.2005; Ishiyama et al, 2004). Στους ανθρώπους, το ACE2 φαίνεται να αυξάνεται στην καρδιά μετά από MI (Burrell et al, 2005) και στην ιδιοπαθή και ισχαιμική μυοκαρδιοπάθεια (Goulter et al, 2004). Από όσο γνωρίζουμε, η επίδραση του αποκλεισμού του RAAS στην καρδιακή έκφραση του ACE2 δεν έχει μελετηθεί σε ανθρώπους. Τέλος, αναλύσαμε τη δραστηριότητα του ACE2 στον ορό. Το ACE2 μπορεί να βρεθεί τόσο στις κυτταρικές μεμβράνες των κυττάρων των ιστών όσο και διαλυτό (sACE2). που προέρχεται από την αποβολή του δεσμευμένου στη μεμβράνη ACE2 από την περιοχή μεταλλοπεπτιδάσης ADAM 17(ADAM17) (Lambert et al, 2005). Το ACE2 λειτουργεί μόνο ως υποδοχέας για τον SARS-CoV-2 σε επίπεδο οργάνου, αλλά έχει προταθεί ότι το sACE2 θα μπορούσε να μειώσει την ικανότητα μόλυνσης του ιού ενεργώντας ως δόλωμα (Balle et al, 2020, Monteil et al, 2020; Wysocl et al, 2021), αν και τα χαμηλά επίπεδα sACE2 στο αίμα δύσκολα θα παρήγαγαν αυτό το ευεργετικό αποτέλεσμα. Παρόλα αυτά, είναι ενδιαφέρον να γνωρίζουμε εάν τα επίπεδα ACE2 στον ορό ρυθμίζονται (ή όχι) στον διαβήτη ή από αναστολείς RAAS καθώς θα μπορούσε να είναι ένα σήμα παραλλαγών στον ιστό ACE2 Υπό αυτή την έννοια, έχει υποτεθεί ότι το ADAM17 θα μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό αντισταθμιστικό ρόλο ανταγωνίζονται για τη διάσπαση του ACE2 με τη διαμεμβρανική πρωτεάση της σερίνης 2 (TMPRSS2), μια θεμελιώδη πρωτεάση για την εσωτερίκευση του SARS-CoV-2 (Palau et al.2020). Βρήκαμε ότι το ACE2 ορού ήταν αυξημένο στα db/db σε σύγκριση με τα db/m και η ραμιπρίλη δεν επανέστρεψαν αυτό το αποτέλεσμα (Fg,.3). Άλλες μελέτες έχουν επίσης περιγράψει την αύξηση του ACE2 στο αίμα σε μοντέλα διαβητικών ποντικιών (Riera et al.2016; Roca-Hoet al, 2017;
Wysocki et al., 2013) και σε διαβητικούς ασθενείς τύπου 1 (Soro-Paavonen et al.2012) αν και η επίδραση του αποκλεισμού RAAS δεν έχει μελετηθεί ευρέως. Από αυτή την άποψη στους ανθρώπους, τα στοιχεία δεν είναι ομοιογενή. Στη μελέτη του Soro-Paavonen και των στόλ. (Soro-Paavonen et al, 2012), η θεραπεία με ACEi αύξησε τα επίπεδα ACE2 στο αίμα τόσο σε άνδρες όσο και σε γυναίκες και τη θεραπεία ARB μόνο σε γυναίκες. Αντίθετα, σε μια πρόσφατη προεκτύπωση, σημειώθηκε ελαφρά μείωση του ACE2 στο αίμα με τη θεραπεία με ARB, αλλά ο ACEi δεν προκάλεσε καμία αλλαγή (Emilsson et al, 2020).
Το CISTANCHE ΘΑ ΒΕΛΤΙΩΣΕΙ ΤΟΝ ΝΕΦΡΟ/ΝΕΦΡΟ ΠΟΝΟ
Λόγω των προαναφερθεισών αποκλίσεων σχετικά με τη διαμόρφωση του ACE2 μεταξύ διαφορετικών μοντέλων διαβητικών ζώων και σε ανθρώπους, είναι δύσκολο να ληφθεί μια οριστική απάντηση στο ερώτημα: "Ο αποκλεισμός RAAS επάγει την υπερέκφραση του ACE2;". Σε μια γενική επισκόπηση, λαμβάνοντας υπόψη τα δεδομένα μας και τα στοιχεία από άλλους συγγραφείς, η εντύπωση είναι ότι το διαβητικό πλαίσιο στις περισσότερες περιπτώσεις τροποποιεί την έκφραση του ACE2 τόσο στο νεφρό όσο και στην καρδιά (μειώνει ή ρυθμίζει προς τα πάνω, ανάλογα με το μοντέλο ή το είδος ) και ότι ο αποκλεισμός του RAAS: (1) μειώνει ή δεν τροποποιεί το ACE2 του νεφρού (τόσο σε πειραματικά μοντέλα όσο και σε απάνθρωπο), (2) δεν τροποποιεί το ACE2 του πνεύμονα (αν και χρειάζονται περισσότερα στοιχεία εδώ), (3) προάγει την έκφραση του ACE2 στο η καρδιά (στα περισσότερα πειραματικά μοντέλα) και (4) έχει ποικίλες επιδράσεις στα επίπεδα ACE2 στο αίμα (ανάλογα με την ομάδα και τον τύπο του αναστολέα RAAS). Ως εκ τούτου, η βασική προϋπόθεση "Ο αποκλεισμός RAAS προκαλεί υπερέκφραση του ACE2 και κατά συνέπεια. αυξάνει τον κίνδυνο μόλυνσης από SARS-CoV-2" δεν ισχύει για την καρδιά, το νεφρό και, το πιο σημαντικό, όχι για τον πνεύμονα . Αν και, αυτή η υπόθεση είναι αμφιλεγόμενη, καθώς παρέχει μόνο μια απλοϊκή θεώρηση της ρύθμισης της έκφρασης ACE2 και δεν λαμβάνει υπόψη ότι το ACE2 είναι προστατευτικό στα περισσότερα πλαίσια (Batlle et al, 2012; Oudit et al, 2010; Zhong et al. , 2010). Έχει αποδειχθεί ότι το ACE2 είναι ευεργετικό σε πειραματικά μοντέλα πνευμονικής βλάβης που προκαλείται από τον ιό της γρίπης H7N9 (Yang et al, 2015) ή LPS (Ye and Liu, 2020). Σε ένα μοντέλο ποντικών με πνευμονική βλάβη, SARS -Η μόλυνση από τον CoV μείωσε την έκφραση του ACE2 του πνεύμονα, αλλά η θεραπεία με λοσαρτάνη βελτίωσε τον τραυματισμό των πνευμόνων και η έκφραση του ACE2 αυξήθηκε ταυτόχρονα (Kuba et al, 2005) υποδηλώνοντας ότι το ACE2 ήταν ευεργετικό για την επίλυση της ιογενούς λοίμωξης. Επιπλέον, το φλεγμονώδες πλαίσιο, όπως η καταιγίδα κυτοκινών που συμβαίνει σε ένα υποσύνολο ασθενών με κορονοϊό (Mehta et al, 2020) μπορεί επίσης να ρυθμίσει την έκφραση του ACE2, αν και δεν είναι σαφές προς ποια κατεύθυνση (de Lang et al., 2006 ; Wet al.2020). Σε κάθε περίπτωση, τόσο η ανοδική ρύθμιση όσο και η μείωση του ACE2 θα μπορούσαν ενδεχομένως να είναι επιζήμιες κατά τη διάρκεια της λοίμωξης από SARS-CoV-2, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα επίπεδα ACE2 πρέπει να βρίσκονται σε εύρος ισορροπίας (South et al.2020).
Συμπερασματικά, εδώ αποδεικνύουμε σε ένα μοντέλο διαβητικών ποντικών ότι η αναστολή του ΜΕΑ προκαλεί μόνο ανοδική ρύθμιση του ACE2 στη διαβητική καρδιά, όπου το ACE2 μειώνεται δευτερογενώς στον διαβήτη. Αυτό δεν συμβαίνει στο νεφρό ή στον πνεύμονα ενισχύοντας την ιδέα ότι στους περισσότερους ιστούς ο αποκλεισμός του RAAS δεν αυξάνει τα επίπεδα έκφρασης του ACE2. Ακόμη και τα αποτελέσματα που λάβαμε στην καρδιά, είναι συζητήσιμο εάν η θεραπεία με ARB ή ACEi ενέχει πραγματικό κίνδυνο για αυξημένη λοίμωξη από COVID-19 και επιδεινώνει την πρόγνωσή της. Ο αποκλεισμός του RAAS έχει σαφή καρδιαγγειακά οφέλη (Fegan et al, 2000; Romero et al, 2015), ενώ είναι απίθανο τα χαμηλά επίπεδα ACE2 να είναι ωφέλιμα για την επίλυση του COVID-19.
