Επίδραση των εκχυλισμάτων Cistanche Tubulosa στην αναπαραγωγική λειτουργία των αρσενικών σε διαβητικούς αρουραίους που προκαλούνται από στρεπτοζοτοκίνη-νικοτιναμίδιο

Λέξεις-κλειδιά:Διαβήτης; αγονία;Cistanche tubulosaεκχύλισμα(CTE);εχινακοσίδη(ECH);αντιφλεγμονώδηδραστηριότητα;αντιοξειδωτικόδραστηριότητα;στεροειδογένεσηυπάρχοντα

Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα οφέλη της σκόνης εκχυλίσματος κιστάνς

1. Εισαγωγή

Ο σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ) είναι μια κατάσταση κατά την οποία υπάρχουν αυξημένα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα λόγωστην αναποτελεσματικότητα του παγκρέατος να παράγει αρκετή ινσουλίνη ή στην αδυναμία του οργανισμού να τη χρησιμοποιήσειαποτελεσματικά. Σύμφωνα με τον ΠΟΥ, ο αριθμός των ατόμων με διαβήτη αυξήθηκε από 108 εκατομμύρια το 1980σε 422 εκατομμύρια το 2014 [1]. Υπάρχουν τέσσερις κύριες κατηγορίες: ο προδιαβήτης (ένα στάδιο πριν από τον διαβήτη), ο τύπος 1(όπου το πάγκρεας αποτυγχάνει να παράγει ινσουλίνη), τύπου 2 (το σώμα αποτυγχάνει να χρησιμοποιήσει ινσουλίνη) και κύησηςδιαβήτη (που εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης). Το οξειδωτικό στρες εμφανίζεται λόγω της ανισορροπίας μεταξύ τωνπαραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) και αντιοξειδωτικών [2] οδηγεί τελικά στη διαβητική κατάσταση.Οι επιπλοκές του διαβήτη περιλαμβάνουν νεφρική ανεπάρκεια, νευρική βλάβη, τύφλωση, εγκεφαλικό επεισόδιο, καρδιάεπίθεση, εμβρυϊκός θάνατος και υπογονιμότητα. [1]. Μελέτες δείχνουν ότι οι πυρήνες του σπέρματος, το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA),και τα μιτοχόνδρια υπέστησαν σημαντική βλάβη σε άνδρες διαβητικούς ασθενείς [3]. Οξειδωτικό στρες κατά τη διάρκειαη μεταφορά του σπέρματος θα αλλάξει τη διαδικασία του ανδρικού αναπαραγωγικού συστήματος [4,5]. 

Η διαδικασία της σπερματογένεσης ελέγχεται από τον υποθάλαμο-υπόφυση-γοναδικό (HPG)άξονας. Η ορμόνη απελευθέρωσης γοναδοτροπίνης (GnRH) που παράγεται από τον υποθάλαμο διεγείρει τηνπαραγωγή ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) και ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH). Βρίσκονται κύτταρα Leydigδίπλα στο σπερματοφόρο σωληνάριο και παράγουν τεστοστερόνη υπό τον έλεγχο της LH. Πυροδοτήσεις FSHη παραγωγή αντιγονοδεσμευτικής πρωτεΐνης (ABP) που βοηθά στη διέλευση της ανδρικής ορμόνης. Έτσι, η υπογονιμότητακαι άλλα προβλήματα προκύπτουν κυρίως λόγω των ταραχών που παρουσιάζονται στον άξονα του HPG. Διοίκηση τουο συνδυασμός στρεπτοζοτοκίνης-νικοταμίδης προκαλεί διαβήτη σε πειραματικούς αρουραίους. Στρεπτοζοτοκίνηείναι μια χημική ένωση τοξική για την παραγωγή ινσουλίνης κύτταρα στο πάγκρεας και η νικοτιναμίδη είναι αυδατοδιαλυτή βιταμίνη που προστατεύει την κύτταρα από πλήρη βλάβη [6]. Cistanche tubulosaείναι ένα είδος φυτού της ερήμου γνωστό και ως "Rou Cong-Rong" [7]. Είναι έναμη χλωροφυλλικό παρασιτικό φυτό που φύεται κυρίως στη ρίζα τουCalotropis proceraδέντρο και είναιδιανέμεται ευρέως στην άνυδρη γη του Gansu, Qinghai, Xinjiang, Μογγολία, Ιράν και Ινδία. Το κοινόόνομα τουCistanche tubulosaείναι ο «Υάκινθος της ερήμου». Είναι ευρέως αποδεκτό στην κινεζική παραδοσιακή ιατρικήκαι του έχει δοθεί το όνομα «Ginseng of the Desert». Χρησιμοποιείται ευρέως στον ιατρικό τομέα για ναθεραπεία νοσηρής λευκόρροιας, άφθονης μετρορραγίας, χρόνιων νεφρικών παθήσεων, δυσκοιλιότητας, ανικανότητας καιαγονία. Χημικά συστατικά τουCistanche tubulosaαποτελούνται από μη πτητικές φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίδες(PHGs), ιριδοειδή, λιγνάνες, πτητικά έλαια, αλδιτόλες, ολιγοσακχαρίτες και πολυσακχαρίτες [8]. Σπουδέςδείχνουν ότι η εχινακοσίδη από αυτό το βότανο προστατεύει τους κατεστραμμένους ινοβλάστες ρυθμίζοντας τα επίπεδα ROS [9]. Αυτή η ένωση παράγει αντιοξειδωτικές, αγγειοχαλαρωτικές και αντιφλεγμονώδεις δράσεις μαζί μενευροπροστασία και πρόληψη της οστεοπόρωσης [10,11]. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να διερευνήσει την επίδραση τουCistanche tubulosaεκχύλισμαπου περιέχει ECH στοαναπαραγωγική δυσλειτουργία του διαβητικού αρουραίου που προκαλείται από στρεπτοζοτοκίνη-νικοτιναμίδιο.

2. Υλικά και μέθοδοι

2.1. Υλικά

Το ECH και το CTE αγοράστηκαν από τη Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Ταϊβάν). Προχωρημένοςτα τελικά προϊόντα γλυκοζυλίωσης (AGEs) αγοράστηκαν από την Biovision (San Francisco, CA, USA). LC-540και κυτταρικές σειρές ΤΜ3 αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Έρευνας και Ανάπτυξης Βιομηχανίας Τροφίμων(Hsinchu, Ταϊβάν). Αρσενικοί αρουραίοι Sprague-Dawley (SD) πέντε εβδομάδων αγοράστηκαν από τοΕθνικό Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Feed Lab Diet® αγοράστηκε από την PMINutrition International, Inc. (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Ελήφθη 2,2-διφαινυλ-1-πικρυυλυδραζύλιο (DPPH)από τη Sigma (St. Louis, MO, ΗΠΑ). Μεθανόλη και 4-(2-υδροξυαιθυλ)-1-πιπεραζινοαιθανοσουλφονικόοξύ (HEPES) αγοράστηκαν επίσης από τη Sigma. Το τροποποιημένο Eagle medium/F12 της Dulbecco καιθρυψίνη-ΕϋΤΑ ελήφθησαν από την GIBCO (Νέα Υόρκη, ΝΥ, ΗΠΑ). 3-(4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,5-βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο (MTT), διχλωρο-διυδρο-φθοροσκεΐνη διοξική (DCFH-DA), διμεθυλσουλφοξείδιο (DMSO) και νιτρομπλε τετραζόλιο (ΝΒΤ) αγοράστηκαν από τη Sigma. Ενζυματική γλυκόζηΤα κιτ ελήφθησαν από το Kyokutoseiyaku, Τόκιο, Ιαπωνία. Αγοράστηκαν κιτ ELISA ινσουλίνηςαπό την Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Σουηδία). T-PER Tissue Protein ExtractionΤο αντιδραστήριο αποκτήθηκε από την Thermo Scientifific (Σικάγο, IL, ΗΠΑ). Πυρηνικά κατά του ανθρώπου/ποντικού/ποντικούπαράγοντας-κάπα Β NF-κΒ πολυκλωνικά αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, SantaΚρουζ, Καλιφόρνια, Η.Π.Α. Πολυκλωνικός υποδοχέας Anti-Mouse/Rat for advanced glycation endproducts (RAGE).αντισώματα, πολυκλωνικά αντισώματα αντι-ανθρώπου/ποντικού/ποντικού StarAR και αντι-ανθρώπου/ποντικού/ποντικούΤα μονοκλωνικά αντισώματα κυτοχρώματος Ρ{{0}Α1 αγοράστηκαν από την Gene Tex (Irvine, CA, ΗΠΑ).Πολυκλωνικά αντισώματα CYP11A1 κατά του ανθρώπου/ποντικού/ποντικού ελήφθησαν από το Cell SignalingTechnology (Beverly, PA, ΗΠΑ). Το αντιδραστήριο easy-Blue αγοράστηκε από την Invitrogen, Thermo FisherScientific (Carlsbad, CA, USA). Η αγαρόζη και ο δείκτης DNA 100 bp ελήφθησαν από την Promega,Corporation (Madison, WI, ΗΠΑ). Το RNeasy Lipid Tissue Mini Kit αγοράστηκε από την QIAGEN,Hilden, Γερμανία.

CO 5 τοις εκατό2 θερμοκοιτίδα (CO2 θερμοκοιτίδα, Napco 5410, Ταϊβάν). Η κυτταρική σειρά ΤΜ3 καλλιεργήθηκε σε Dulbecco'sτροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) συμπληρωμένο με γλυκόζη (4,5 g/L), πυροσταφυλικό νάτριο (0,5 mM),L-γλουταμίνη (2,5 mM), διττανθρακικό νάτριο (1,2 g/L), 4-(2-υδροξυαιθυλ)-1-πιπεραζινοαιθανοσουλφονικόοξύ (HEPES, 15 mM) και ορός εμβρύου μόσχου (FCS, 10 τοις εκατό ) ή ορός αλόγου (5 τοις εκατό ) στους 37◦C σε 5 τοις εκατόCO2 εκκολαπτήριο.

Προσδιορισμός της κυτταρικής βιωσιμότητας της εχινακοσίδης (ECH): 3-(4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2,5-Το αντιδραστήριο βρωμιούχου διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό βιωσιμότητας των κυττάρων. Η συγκέντρωση των κυττάρωνπροσαρμόστηκε στο 2× 105κύτταρα / mL σε 96-πλάκα φρεατίου. Μετά, 20µL ECH (αραιωμένο σε 2 τοις εκατό του μέσου)προστέθηκε και επωάστηκε για 24 ώρες στους 37°C◦C σε 5 τοις εκατό CO2 εκκολαπτήριο. Αργότερα, 100µL του αντιδραστηρίου ΜΤΤ ήτανπροστέθηκε και επωάστηκε για 4 ώρες στους 37°C◦C σε σκοτεινές συνθήκες. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm(Αναγνώστης ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Ελβετία).Σχετική κυτταρική βιωσιμότητα ( ποσοστό )=[(Αδείγμα στα 570 nm− Aκενό στα 570 nm)]/[(Aέλεγχος στο 570− Aκενό στο 570)] × 100.

Ανάλυση περιεχομένου αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS):

Ο αριθμός κελιού προσαρμόστηκε σε2 × 105κύτταρα/mLσε μια πλάκα 12-πηγαδιού που περιέχει 2 τοις εκατό FBS. Μετά, 50µL/mL ECH, RES και AGEsπροστέθηκαν στην πλάκα και επωάστηκαν στους 37°C◦C για 24 ώρες. Μετά από 24 ώρες, 20 ,70 -διχλωροφλουορεσκεΐνη-διοξεική(DCFH-DA) προστέθηκε και επωάστηκε στους 37°C◦C για 30 λεπτά. Μετά τη φυγοκέντρηση (400× g, 5 λεπτά),

και AGEs προστέθηκαν και επωάστηκαν στους 37°C◦C σε 5 τοις εκατό CO2 θερμοκοιτίδα για 24 ώρες. Μετά, 400µL του T-PERπροστέθηκαν, αποξέστηκαν τα κύτταρα και φυγοκεντρήθηκαν στο 125,000× g για 20 λεπτά (4◦ΝΤΟ). Το υπερκείμενοσυλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε στο−80 ◦C (−80 ◦C καταψύκτη, Nuaire, Plymouth, MN, USA) για περαιτέρω ανάλυση.

Για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε κιτ δικινχονικού οξέος (BCA). Μετά, 10µL τυπικού διαλύματος κυττάρωνκαι 200µL αντιδραστηρίου BCA προστέθηκαν σε τρυβλία 8-πηγαδιών και επωάστηκαν στους 37°C◦C σε 5 τοις εκατό CO2 εκκολαπτήριογια 30 λεπτά. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 562 nm. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση ταυτοποίησης πρωτεΐνηςμε ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS)-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Δείγματα ήτανπαρασκευάστηκε με προσθήκη προϊόντος λύσης πρωτεΐνης σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης πρωτεΐνης και διεξήχθη ανάλυση στυπώματος westernγια την ανίχνευση των συγκεκριμένων πρωτεϊνών.

2.2.2. Ανάλυση In Vivo

Σχεδιασμός μοντέλου ζώου: Εξήντα 4-αρσενικοί αρουραίοι Sprague–Dawley (SD) εβδομάδων ηλικίας αγοράστηκαν από τοΕθνικό Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων (Ταϊπέι, Ταϊβάν). Κάθε αρουραίος στεγάστηκε ξεχωριστά σε απολυμαντικόκλουβιά από ανοξείδωτο χάλυβα υπό ελεγχόμενη θερμοκρασία (23± 1 ◦Γ) και υγρασία (40–60 τοις εκατό ) με 12 ώρεςκύκλος φωτός/12 ωρών σκότους. Τροφή και νερό παρείχαν κατά βούληση. Κάθε αρουραίος εξημερώθηκε στην πρώτηεβδομάδα και δόθηκε εργαστηριακή δίαιτα τρωκτικών 5001 ως κύρια δίαιτα. Όλες οι διαδικασίες ακολουθούσαν το πρότυποτης Θεσμικής Επιτροπής Περίθαλψης και Χρήσης Ζώων (Αρ. Έγκρισης IACUC 101026) του ΕθνικούΠανεπιστήμιο Ωκεανού της Ταϊβάν, Ταϊβάν. Μετά την εξημέρωση, οι αρουραίοι χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: τον έλεγχοομάδα (Con) που τράφηκε με εργαστηριακή δίαιτα 5001 και η ομάδα διαβητικών που τράφηκε με δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά(HFD, 40 τοις εκατό ) για ολόκληρο το πείραμα. Μετά από σίτιση με το HFD για 4 εβδομάδες, η διαβητική ομάδαστους αρουραίους έγινε ένεση στρεπτοζοτοσίνης (65 mg/kg) (STZ) για να προκληθεί σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ). Στα πλαίσια15 λεπτά ένεσης STZ, ενέθηκε νικοτιναμίδη (230 mg/Kg σωματικού βάρους). Μια εβδομάδα μετά την ένεση,διεξήχθη από του στόματος δοκιμασία ανοχής γλυκόζης (OGTT) για να προσδιοριστεί η επιτυχής πρόκληση διαβητικούΣακχαρώδης (DM). Μετά από αυτό, τα ζώα χωρίστηκαν σε έξι ομάδες: τον έλεγχο (ταΐστηκαν με εργαστηριακή δίαιτα5001); Ομάδα DM (DM συν 45 τοις εκατό HFD); Ομάδα DMR (DM συν ροσιγλιταζόνη: 0,571 mg/kg ΣΒ) συν 45 τοις εκατό HFD;Ομάδα DME1 (DM συν CTE: 80 mg/kg ΣΒ) συν 45 τοις εκατό HFD. Ομάδα DME2 (DM συν CTE: 160 mg/kg Σ.Β.)συν 45 τοις εκατό HFD. και ομάδα DME4 (DM συν CTE: 320 mg/kg ΣΒ) συν 45 τοις εκατό HFD. Η ροσιγλιταζόνη (RSG) ήτανλαμβάνεται ως θετικός έλεγχος. Τρεις δόσεις CTE (80, 160 και 320 mg/kg) χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα μετη σύσταση της Υπηρεσίας Τροφίμων και Φαρμάκων της Ταϊβάν (TFDA) για υγιεινά τρόφιμα λειτουργικάκατευθυντήριες γραμμές αξιολόγησης. Δόθηκαν θεραπείες μέχρι το τέλος του πειράματος. Όλοι οι πειραματικοί αρουραίοιθυσιάστηκαν μετά από 6 εβδομάδες. Το αίμα που συλλέχθηκε από τους αρουραίους φυγοκεντρήθηκε στις 3000 rpm για15 λεπτά στις 4◦Γ. Το υπερκείμενο εξετάστηκε για την ακόλουθη ανάλυση:Ολική γλυκόζη, τριγλυκερίδια και χοληστερόλη

Προσδιορισμός:

Ο προσδιορισμός της γλυκόζης ήτανπραγματοποιείται με ενζυμικά κιτ γλυκόζης. Μετά, 20µL δειγμάτων πλάσματος αίματος προστέθηκαν στοαντιδραστήρια και διατηρήθηκαν στους 37◦C για 5 λεπτά. Η συγκέντρωση των ολικών τριγλυκεριδίων και της ολικής χοληστερόλης ήτανπροσδιορίζεται με χρήση ενζυματικών κιτ τριγλυκεριδίων και χοληστερόλης. Μετά, 10µL πλάσματος αίματος ήτανπροστέθηκε στα αντιδραστήρια και το πείραμα διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 510 nm.Ολική γλυκόζη/τριγλυκερίδιο/χοληστερόλη πλάσματος (mg/dL)=(Aδείγμα− AΚενό)/(Aπρότυπο− AΚενό) × 200. Ένα δείγμα: Απορρόφηση δειγμάτων αίματος, ΑΚενό: Τιμή απορρόφησης κιτ χωρίς δείγμα, Standard: Τιμή απορρόφησης του τυπικού αντιδραστηρίου, 200: τυπικά αντιδραστήρια σε συγκέντρωση200 mg/dL.Αξιολόγηση ινσουλίνης, λεπτίνης και ομοιοστατικού μοντέλου – Προσδιορισμός αντίστασης στην ινσουλίνη (HOMA-IR):Το επίπεδο ινσουλίνης προσδιορίστηκε με κιτ ELISA ινσουλίνης. Εδώ, 25µL πλάσματος αίματος προστέθηκαν στοαντιδραστηρίων και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm. Η συνολική περιεκτικότητα σε λεπτίνη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώνταςκιτ ανοσομετρικής ανάλυσης ενζύμου λεπτίνης. Μετά, 100µL του πλάσματος αναλύθηκαν και η απορρόφησημετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης ELISA. Το όλο πείραμα διεξήχθη σύμφωνα μεοδηγίες του κατασκευαστή. Η τιμή HOMA-IR προσδιορίστηκε από το μοντέλο ομοιόστασηςεξίσωση αξιολόγησης=Συγκέντρωση ινσουλίνης πλάσματος νηστείας (mU/mL)× γλυκόζη πλάσματος νηστείαςσυγκεντρώσεις (mmol/L)/22,5.Υπεροξείδωση λιπιδίων πλάσματος: Εδώ, 0.5 mL πλάσματος αίματος αναμίχθηκαν με 1 mL αντιδραστηρίου (15 τοις εκατό ,w/v τριχλωροξικό οξύ σε {{0}},25 N υδροχλωρικό οξύ (HCl) και 0,375 τοις εκατό,w/v θειοβαρβιτουρικό οξύ σε0.25 N HCl) και τοποθετήθηκε σε λουτρό νερού (Λουτρό νερού, BUCHI 461, Ζυρίχη, Ελβετία) στους 100◦Γ για15 λεπτά. Μετά από ψύξη, προστέθηκε 1 mL n-βουτανόλης, ανακινήθηκε έντονα και φυγοκεντρήθηκε στους 1500°C.× g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 532 nm [12]. Συγκέντρωση μηλονοδιαλδεΰδης (MDA) (nM/mL)=[(Ένα δείγμαστα 532 nm− Aκενό στα 532 nm)/ (Πρότυποστα 532 nm− Aκενό στα 532 nm)] × 5. Προσδιορισμός των επιπέδων τεστοστερόνης πλάσματος και ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH): Η τεστοστερόνηΤο κιτ ELISA χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του επιπέδου τεστοστερόνης στο πλάσμα του αίματος. Το κιτ RIA χρησιμοποιήθηκεπροσδιορίστε τη συγκέντρωση της LH. Μετά, 50µΠροστέθηκαν L πλάσματος και βασίστηκαν οι υπολογισμοίστη συγκέντρωση της ορμόνης LH-RP-3 (στάνταρ). Τα περαιτέρω βήματα έγιναν σύμφωνα μεσύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.Προσδιορισμός Παράγοντα Νέκρωσης Όγκων (TNF)- και συγκέντρωση ιντερλευκίνης-6 (IL-6):Το δεσμευμένο αντίσωμα αραιώθηκε 250 φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης, προστέθηκε σε 96-πλάκα φρεατίου (100µL/πηγάδι),και διατηρήθηκε στις 4◦C για διανυκτέρευση. Το υπερκείμενο αναρροφήθηκε και πλύθηκε δεκαπέντε φορές με πλύσηbuffer (1 φορά PBS, 0.05 τοις εκατό Tween 20). Μετά από επώαση (1 ώρα) με 200µg αραιωτικού προσδιορισμού, τα κύτταρα ήτανπλύθηκε 5 φορές με ρυθμιστικό πλύσης και 100µL του TNF- πρότυπο διάλυμα ή δείγματα δοκιμήςπροστίθεται σε κάθε φρεάτιο και επωάζεται για 2 ώρες. Μετά το πλύσιμο, 100µΠροστέθηκαν L ανιχνευθέντων αντισωμάτων IL-6και επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπερκείμενο αναρροφήθηκε και πλύθηκε 5 φορές. Επειτα,480 µΠροστέθηκαν L ενζύμου υπεροξειδάση αβιδίνης-χρένο (HRP) και επωάστηκαν για 30 λεπτά στο δωμάτιοθερμοκρασία. Το υπερκείμενο αναρροφήθηκε και πλύθηκε πέντε φορές με ρυθμιστικό πλύσης. Μετά, 100µL διαλύματος υποστρώματος προστέθηκαν και επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αργότερα, 50µL της στάσηςδιάλυμα (1Μ φωσφορικό οξύ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm.Ανάλυση Παραμέτρων Σπέρματος και ΌρχεωνΣυλλογή δειγμάτων σπέρματος: Η συλλογή δειγμάτων σπέρματος πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τηνμέθοδος που αναφέρθηκε προηγουμένως στο [13]. Το σπέρμα συλλέχτηκε από το υπερκείμενο και χρησιμοποιήθηκε γιαΠεραιτέρω ανάλυση.Ο αριθμός των σπερματοζωαρίων, η κινητικότητα του σπέρματος και το μη φυσιολογικό σπέρμα: Ο αριθμός των σπερματοζωαρίων ήτανυπολογίζεται χρησιμοποιώντας το αιμοκυτταρόμετρο και το διάλυμα μπλε τρυπανίου. Μετά, 100µL σπερματοζωαρίου ήταναναμιγνύεται με διάλυμα μπλε τρυπανίου και ο αριθμός των σπερματοζωαρίων, η κινητικότητα και το ανώμαλο σπέρμα ήτανυπολογίζεται με αιμοκυτταρόμετρο και μικροσκόπιο [14]. Nitro blue Tetrazolium NBT Reduction and Lipid Peroxidation of Sper and Orists: The Lipidη υπεροξείδωση και η αναγωγή του ΝΒΤ αναλύθηκαν σύμφωνα με την ίδια διαδικασία ανάλυσης πλάσματος.

Προσδιορισμός της Δισμουτάσης Υπεροξειδίου (SOD) και της Δραστικότητας Καταλάσης: Υπεροξειδική ΔισμουτάσηΗ δραστηριότητα (SOD) αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RANSEL. Εδώ, 0.05 mL ομογενοποιημένων όρχεωνπροστέθηκαν σε 1,7 mL διαλύματος αντίδρασης (0.05 mM ξανθίνη, 0,025 mM 2-(4-ιωδοφαινυλ)-{{0}}(4-νιτροφαινόλη)-5-χλωριούχο φαινυλτετραζόλιο (INT)). Μετά την ανάμειξη, 0,25 mL οξειδάσης ξανθίνης (80 U/L)προστέθηκε και αντέδρασε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 δευτερόλεπτα σε θερμοκρασία δωματίου. Η απορρόφηση ήτανμετρήθηκε στα 505 nm. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του ομογενοποιήματος των όρχεων προσδιορίστηκε από τοΥπολογίστηκε το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης Bio-Rad DC και η ειδική δράση του (U/mg πρωτεΐνης). Η καταλάσηΗ δραστηριότητα (CAT) προσδιορίστηκε σύμφωνα με μια μέθοδο που αναφέρθηκε προηγουμένως [15]. Χρώση H&E (αιματοξυλίνη και ηωσίνη).Ο όρχις εμποτίστηκε σε 10 τοις εκατό φορμαλίνης για 24 ώρες και αποθηκεύτηκε στους 4◦Γ. Κόψτε τα χαρτομάντιλα σε φέτεςμικρο μέγεθος και προσαρτάται στη διαφάνεια. Μετά τη στερέωση (95 τοις εκατό μεθανόλη συν 5 τοις εκατό οξικό οξύ), οι πλάκες ήτανβυθίζονται σε αιματοξυλίνη για 3 λεπτά, πλένονται με τρεχούμενο νερό για 5 λεπτά και στη συνέχεια εμποτίζονται με50 τοις εκατό , 70 τοις εκατό και 90 τοις εκατό αλκοόλ για ένα λεπτό. Μετά από αυτό, οι αντικειμενοφόρες πλάκες χρωματίστηκαν με ηωσίνη για 10 δευτερόλεπτα καιεμποτισμένο σε 100 τοις εκατό αλκοόλ για ένα λεπτό μέχρι να ξεθωριάσει. Τέλος, η αντικειμενοφόρος πλάκα εμποτίστηκε σε ξυλόλιο για έναλεπτό. Αργότερα, η τσουλήθρα στέγνωσε στον αέρα και σφραγίστηκε. Ο χρωματισμένος σωλήνας τοποθετήθηκε σε ανεστραμμένη αντίθεση φάσηςμικροσκόπιο (Μικροσκόπιο ανεστραμμένης διαφοράς φάσης, Olympus CK-2, Τόκιο, Ιαπωνία) για παρατήρησηη μορφολογία.Ανάλυση του ΥποθαλάμουΟ KISS1 του ποντικιού, υποδοχέας συζευγμένος με πρωτεΐνη G (GPR) 54, καταστολέας της σηματοδότησης κυτοκίνης 3 (SOCS-3)και sirtuin 1 (SIRT1)Οι αλληλουχίες γονιδίων ταυτοποιήθηκαν από το NCBI (Εθνικό Κέντρο ΒιοτεχνολογίαςΠληροφορίες) βάση δεδομένων γονιδίων και ένας συγκεκριμένος εκκινητής σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας το Primer 5.0 PREMIER Biosoft,Palo Alto, CA, Η.Π.Α.). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα παρατίθενται στον Πίνακα1.

Εκχύλιση ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA) από τον υποθάλαμο. Η εξαγωγή του RNA από τοΟ υποθάλαμος του εγκεφάλου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Mini Kit Lipid Tissue RNeasy. Τα αποκτηθένταΤα mRNA μετρήθηκαν ποσοτικά με αντίστροφη μεταγραφή (RT) και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης(PCR). Το συμπληρωματικό DNA που ελήφθη από την ανάλυση RT αποθηκεύτηκε στο−20 ◦C για μεταγενέστερη χρήση.Το εκχυλισμένο DNA υποβλήθηκε σε ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας πολυμεράση Taq.Μετά, 5~10µΛήφθηκαν L του προϊόντος PCR και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε άγαρ 1,5 τοις εκατόκολλοειδές. Η εικόνα λήφθηκε σε σύστημα απεικόνισης UVP BioDoc-It. Αντίστροφη μεταγραφή συμπληρωματικήΕλήφθη δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (cDNA) και πραγματοποιήθηκε PCR χρησιμοποιώντας το IQ SYBR Green SupermixΕργαλειοθήκη. Αργότερα, αναλύθηκε με το λογισμικό οπτικού συστήματος iQTM 5. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ααντιδραστήριο εκχύλισης πρωτεΐνης (T-PER). Στη συνέχεια, 20 mg ομογενοποιήματος όρχεων προστέθηκαν στα 400µL του T-PER και φυγοκεντρήθηκε (High-Speed ​​Centrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Germany) στο 4◦C (125,000× g) για 20 λεπτά. Η ακόλουθη μέθοδος ήταν παρόμοια με «ταυτοποίηση και ποσοτικοποίησηανάλυση πρωτεΐνης» σε in vitro ανάλυση.2.3. Στατιστική ανάλυσηΤα πειραματικά αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο μέσος όρος± τυπική απόκλιση (Μέση± SD) και τοΤα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk,Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με μονόδρομη ανάλυση τουδιακύμανση (ANOVA). Πολλαπλές συγκρίσεις διαφορετικών ομάδων αναλύθηκαν με τη δοκιμή Duncan στοαξία τουp < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Αποτελέσματα

3.1. Ανάλυση In Vitro

3.1.1. Σύγκριση Αντιοξειδωτικών Δραστηριοτήτων ECH, CTE και RES

Το μακροχρόνιο υψηλό οξειδωτικό στρες και η χρόνια φλεγμονή είναι οι κύριες αιτίες του διαβητικούεπιπλοκές [16]. Τα CTE περιέχουν διάφορους φαινυλαιθανοειδείς γλυκοσίτες όπως η εχινακοσίδη(ECH) και ακτεοσίδη, με δυνατότητα αντιοξειδωτικής δράσης [17]. Καθαρισμός ριζών DPPHδιεξήχθη ανάλυση για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης του ECH. Trolox και ρεσβερατρόλη(3,5,4'-τριυδροξυστιλβένιο, RES) ελήφθησαν ως πρότυπο και θετικός έλεγχος αντίστοιχα. Οπως φαίνεταιστο Σχήμα1, το ECH έδειξε καλύτερη δραστικότητα καθαρισμού ριζών και η δραστηριότητα ήταν σημαντικά υψηλότερηαπό αυτό του θετικού μάρτυρα (ΑΠΕ).

3.1.2. Βιωσιμότητα κυττάρων ECH σε κύτταρα LC-540 και TM3 LeydigΠραγματοποιήθηκε ανάλυση ΜΤΤ για την αξιολόγηση της κυτταρικής βιωσιμότητας διαφορετικής συγκέντρωσης ECH.Τα κύτταρα LC-540 Leydig και τα κύτταρα TM3 Leydig έδειξαν περισσότερο από το 80 τοις εκατό της βιωσιμότητας μετά από θεραπεία μεECH (Εικόνα2). Σε σύγκριση με τις άλλες συγκεντρώσεις, ένα 100-µΣυγκέντρωση Μ (αραιώσεις 100µM σε 2 τοις εκατό FBS) της ECH έδειξε καλύτερη κυτταρική βιωσιμότητα σε κύτταρα TM3 Leydig. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι τοΗ αυξημένη συγκέντρωση της ECH δεν συνεισφέρει καμία σημαντική τοξικότητα στα κύτταρα.

3.1.3. Επίδραση της ECH στην παραγωγή υπεροξειδίου που προκαλείται από AGE με τη δοκιμασία NBT σε LC-540 και TM3Leydig Cell

Τα AGEs προκαλούν οξειδωτική βλάβη στον οργανισμό λόγω της οξείδωσης της γλυκόζης και του σχηματισμού τηςελεύθερες ρίζες όπως το Ο2-, ρίζες υδροξυλίου και ομάδες καρβονυλίου [18]. Αφού διεγερθεί με50 µg/mL AGEs, το LC-540 (Εικόνα3α) και TM3 (Εικόνα3β) τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ECH και RES(5 µΜ και 10µΜ το καθένα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η παραγωγή ανιόντος υπεροξειδίου ήταν αυξημένηστην ομάδα ελέγχου (διεγερμένα AGEs), αλλά η παραγωγή ανιόντος υπεροξειδίου μειώθηκε μετάθεραπεία με ECH και ΑΠΕ. Από το σχήμα3, έγινε κατανοητό ότι το ECH και οι ΑΠΕ μειώνουν το επίπεδοπαραγωγής υπεροξειδίου και προστατεύουν τα κύτταρα από οξειδωτική βλάβη. Στην περίπτωση κυψελών LC-540,10 µΤο M ECH έδειξε σχεδόν παρόμοια δραστηριότητα με την κανονική ομάδα. Η παραγωγή υπεροξειδίου και στα δύοΤα κύτταρα μειώθηκαν με μια αύξηση στη συγκέντρωση τόσο του ECH όσο και του RES.3.1.4. Επίδραση του ECH στο H2O2 Παραγωγή σε AGE-Stimulated LC-540 Leydig CellsΟ προσδιορισμός DCFH-DA εκτελέστηκε για την ανίχνευση της παρουσίας οξειδωτικών ειδών. Μετά την είσοδο σεστα κύτταρα, η φθορίζουσα χρωστική ουσία FL DCFH-DA οξειδώνεται από το ενδοκυτταρικό Η2O2 και σχηματίζει διχλωροφλουορεσκεΐνη(DCF). Όπως φαίνεται στο Σχήμα4, υπήρξε σημαντική αύξηση του ενδοκυτταρικού H2O2 παραγωγή στοΟμάδα διεγερμένη από AGE (έλεγχος) ενώ η προσθήκη 10µΜ ECH και ΑΠΕ μειώθηκαν σημαντικάτο H2O2 παραγωγή στα κύτταρα. Διοίκηση του 10µΤο M ECH είχε ως αποτέλεσμα μόνο περίπου το 47,1 τοις εκατό του H2O2 παραγωγή, σημαντικά χαμηλότερη από ό,τι στην ομάδα ελέγχου.

3.1.5. Επίδραση της ECH στο RAGE και το NF-κΕπίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης Β σε διεγερμένη από AGE LC-540Leydig Cells

Πραγματοποιήθηκε ανάλυση στυπώματος Western για να επιβεβαιωθεί η παρουσία RAGE στο LC-540 Leydigκύτταρα. Η επίδραση του ECH στο RAGE (Εικόνα5α) και NF-κΒ (Εικόνα5β) επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνηςσε διεγερμένα από AGEs κύτταρα Leydig φαίνονται στο Σχήμα5. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 50µg/mLΗ συγκέντρωση των AGEs προκάλεσε υψηλότερη RAGE και NF-κΈκφραση Β σε κύτταρα LC-540 Leydig και10 µΗ συγκέντρωση M του ECH και του RES μείωσε σημαντικά την έκφραση του RAGE και του NF-κB. Η έκφραση του NF-κΤο B ήταν σημαντικά χαμηλότερο σε RES και ECH από τους ανταγωνιστές RAGE. Τα αποτελέσματα λοιπόνεπιβεβαίωσε ότι το ECH μείωσε το επίπεδο της φλεγμονής μειώνοντας το επίπεδο RAGE και NF-κB.

.1.6. Επίδραση της ECH στην οδό σύνθεσης τεστοστερόνης σε κύτταρα Leydig LC{3}} που διεγείρονται με AGE.

Η διαδικασία της σπερματογένεσης και της ανδρικής υπογονιμότητας εξαρτάται από την παρουσία τεστοστερόνης.Όπως φαίνεται στο Σχήμα6, οι εκφράσεις του StAR (Εικόνα6α), CYP11A1 (Εικόνα6β), CYP17A1 (Εικόνα6c), και HSD17 3 (Εικόνα6δ) οι πρωτεΐνες μειώθηκαν σημαντικά στο διεγερμένο από AGE LC-540 Leydigκύτταρα (ομάδα ελέγχου). Οι εκφράσεις των Star, CYP11A1, CYP17A1 και HSD17 3 πρωτεΐνες ήταναυξήθηκε σημαντικά όταν προστέθηκαν ο ανταγωνιστής RAGE, RES και ECH. Η αυξημένηέκφραση των πρωτεϊνών Star και CYP11A1 παρατηρήθηκε και στις δύο ομάδες που έλαβαν θεραπεία με ECH και RES.Το επίπεδο έκφρασης του CYP17A1 ήταν σχεδόν παρόμοιο στις ομάδες RES και ECH. Οι εκφράσεις τωνHSD17 Η πρωτεΐνη 3 σε κύτταρα Leydig που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ECH ήταν πολύ υψηλότερη από αυτές των RES και RAGEκύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με ανταγωνιστή. Αυξημένη έκφραση των Star, CYP11A1, CYP17A1 και HSD17 3 πρωτεΐνεςέδειξε τη φυσιολογική παραγωγή τεστοστερόνης.

5κύτταρα/mL και θεραπεία με RES και ECH(10µΜ) χορηγήθηκε για 24 ώρες. -η ακτίνη λήφθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η κανονική ομάδα (Nor)υποβλήθηκε σε αγωγή με μέσο και η ομάδα ελέγχου (Con) υποβλήθηκε σε θεραπεία με AGEs (50µg/mL).

Αποτελέσματαεμφανίστηκαν ως μέτριοι±SD (n = 3). Σημαντικές διαφορές (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">αναλύθηκε με τη δοκιμή πολλαπλών εύρους του Duncan.