Η εχινακοσίδη αντιστρέφει την αναδόμηση του μυοκαρδίου και βελτιώνει τη λειτουργία της καρδιάς

Επικοινωνία:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

Αφηρημένη

Η αναδιαμόρφωση του μυοκαρδίου είναι μια σημαντική παθολογική βάση της καρδιακής ανεπάρκειας, το μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες είναι ένας προαγωγέας της υπερτροφίας του μυοκαρδίου, της ίνωσης και της απόπτωσης. Το ECH είναι το κύριο ενεργό συστατικό μιας παραδοσιακής κινεζικής ιατρικής Cistanches Herba, πολλές μελέτες δείχνουν ότι διαθέτει ισχυρή αντιοξειδωτική ικανότητα σε νευρικά κύτταρα και όγκους, αναστέλλει το οξειδωτικό στρες των μιτοχονδρίων, προστατεύει τη μιτοχονδριακή λειτουργία, αλλά ο συγκεκριμένος μηχανισμός είναι ασαφής. Το SIRT1/FOXO3a/MnSOD είναι ένας σημαντικός αντιοξειδωτικός άξονας, η μελέτη διαπιστώνει ότι το ECH συνδέεται ομοιοπολικά με το SIRT1 ως συνδέτη και ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του SIRT1 στα εγκεφαλικά κύτταρα. Υποθέτουμε ότι η ECH μπορεί να αναστρέψει την αναδιαμόρφωση του μυοκαρδίου και να βελτιώσει την καρδιακή λειτουργία της καρδιακής ανεπάρκειας μέσω της ρύθμισης του άξονα σηματοδότησης SIRT1/FOXO3a/MnSOD και της αναστολής του οξειδωτικού στρες του μιτοχονδρίου στα καρδιομυοκύτταρα. Εδώ, πρώτα επάγουμε ένα κυτταρικό μοντέλο οξειδωτικού στρες με ISO με κύτταρα AC-16 και προεπεξεργαζόμαστε με ECH, το επίπεδο μιτοχονδριακού ROS, οξειδωτική βλάβη mtDNA, MMP, καρβονυλιωμένη πρωτεΐνη, υπεροξείδωση λιπιδίων, ενδοκυτταρικό ROS και ανιχνεύονται απόπτωση, επιβεβαιώνουν την επίδραση της ECH στο μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες και τη λειτουργία in vitro. Στη συνέχεια, καθιερώνουμε ένα μοντέλο αρουραίου HF που προκαλείται από ISO και προκατεργάζεται με ECH. Μετρούνται δείκτες καρδιακής λειτουργίας, αναδιαμόρφωση του μυοκαρδίου, οξειδωτικό στρες και λειτουργία του μιτοχονδρίου, έκφραση του άξονα σηματοδότησης SIRT1/FOXO3a/MnSOD, τα δεδομένα δείχνουν ότι η ECH βελτιώνει την καρδιακή λειτουργία, αναστέλλει την υπερτροφία του μυοκαρδίου, την ίνωση και την απόπτωση αυξάνει την έκφραση του SIRT1/FOXO3a1/FO Ο άξονας σηματοδότησης MnSOD, μειώνει τις οξειδωτικές βλάβες των μιτοχονδρίων, προστατεύει τη λειτουργία των μιτοχονδρίων. Συμπεραίνουμε ότι η ECH αναστρέφει την αναδιαμόρφωση του μυοκαρδίου και βελτιώνει την καρδιακή λειτουργία μέσω της προς τα πάνω ρύθμισης του άξονα SIRT1/FOXO3a/MnSOD και της αναστολής του μιτοχονδριακού οξειδωτικού στρες σε αρουραίους με καρδιακή ανεπάρκεια.

ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ Σεκινακοσίδη, καρδιακή ανεπάρκεια, μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες, αναδιαμόρφωση του μυοκαρδίου

φρέσκα βότανα κιστανάκιπρος τηνμιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες

1|ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η καρδιακή ανεπάρκεια (HF) είναι η τελική έκβαση των περισσότερων καρδιαγγειακών παθήσεων με υψηλό επιπολασμό και κακή πρόγνωση, και με την επιδεινωτική τάση της γήρανσης του πληθυσμού, η νοσηλεία και η θνησιμότητα λόγω χρόνιας καρδιακής ανεπάρκειας (CHF) αυξήθηκαν απότομα σε όλο τον κόσμο. Τα τελευταία 20 χρόνια, οι φαρμακευτικές θεραπείες για την καρδιακή ανεπάρκεια έχουν σημειώσει μεγάλη πρόοδο, αλλά το αποτέλεσμα είναι πολύ περιορισμένο, επομένως χρειάζονται επειγόντως νέα φάρμακα. Η αναδιαμόρφωση του μυοκαρδίου είναι μια σημαντική παθολογική βάση της καρδιακής ανεπάρκειας και χαρακτηρίζεται από υπερτροφία του μυοκαρδίου, απόπτωση, διάμεση ίνωση, τα κύτταρα του μυοκαρδίου είναι αποδιοργανωμένα και οδηγούν σε μείωση του κλάσματος εξώθησης (LVEF), αύξηση των τελοδιαστολικών και συστολικών διαστάσεων της αριστερής κοιλίας. (LVIDd και LVIDs) και μείωση της κλασματικής βράχυνσης της αριστερής κοιλίας (LVFS). Τα τελευταία χρόνια, πολυάριθμες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι το οξειδωτικό στρες είναι ένας σημαντικός προαγωγέας της αναδιαμόρφωσης του μυοκαρδίου.3-7

Το οξειδωτικό στρες είναι μια κατάσταση κατά την οποία παράγονται υπερβολικά αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) ή ελεύθερες ρίζες και οδηγούν σε οξειδωτική βλάβη των κυτταρικών συστατικών, η οποία, με τη σειρά της, προκαλεί κυτταρική δυσλειτουργία.8 Τα μιτοχόνδρια είναι η κύρια πηγή ενδοκυτταρικών ROS, ως αποτέλεσμα διαρροή από την αναπνευστική αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και τα μιτοχόνδρια είναι η πιο ευαίσθητη θέση στις επιδράσεις του ROS.9 Μελέτες σε HF εντόπισαν αυξημένη παραγωγή ROS από το σύμπλεγμα I της αναπνευστικής αλυσίδας.8 Η αυξημένη παραγωγή ROS προσβάλλει τα μιτοχονδριακά συστατικά πρώτα και έχει ως αποτέλεσμα υπερβολικό οξειδωτικό στρες , εκδηλώνεται ως καρβονυλίωση πρωτεϊνών, υπεροξείδωση λιπιδίων και βλάβη του DNA,10 και δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων, που κατά συνέπεια οδηγεί σε υπερβολικό σχηματισμό ROS,8 σχηματίζει έναν φαύλο κύκλο. Το παρατεταμένο οξειδωτικό στρες αποδεικνύεται ότι μπορεί να προκαλέσει υπερτροφία του μυοκαρδίου και ίνωση του μυοκαρδίου,11-13 και να προκαλέσει απόπτωση των κυττάρων του μυοκαρδίου μέσω της ενεργοποίησης της απόπτωσης που εξαρτάται από τα μιτοχόνδρια ως αποτέλεσμα της καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών της μιτοχονδριακής μεμβράνης και της απώλειας του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. , θεωρείται ότι η αναστολή του μιτοχονδριακού οξειδωτικού στρες μπορεί να είναι μια νέα στρατηγική για την πρόληψη της αναδιαμόρφωσης του μυοκαρδίου και ακόμη και της καρδιακής ανεπάρκειας.15-17

Το Echinacoside (ECH), ένα φυσικό φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο, είναι το κύριο δραστικό συστατικό του Cistanches Herba, που είναι η παραδοσιακή κινεζική ιατρική. Τα τελευταία χρόνια, η ECH έχει μελετηθεί εκτενώς στο νευρικό σύστημα και στους όγκους και έχει αναφερθεί ότι έχει μια ποικιλία φαρμακολογικών επιδράσεων, όπως αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, αντι-απόπτωσης και αντικαρκινικές ιδιότητες.18,19Σε Τα νευρικά κύτταρα, το ECH ενισχύει σημαντικά την αντιοξειδωτική ικανότητα, μειώνει την παραγωγή ROS, βελτιώνει το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης (MMP) και αυξάνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων,20 επιδεικνύει προστατευτικά αποτελέσματα στη μιτοχονδριακή λειτουργία και αναστέλλει το μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες, προστατεύει από τον οξειδωτικό τραυματισμό και βελτιώνει τη μνήμη, τελικά αποτρέπει νευροεκφυλισμός.21,22 Η ECH αυξάνει επίσης τη δραστηριότητα του SOD και παίζει προστατευτικό ρόλο στον εγκεφαλικό ιστό και στον ιστό του αμφιβληστροειδούς,19,23 αλλά ο ειδικός μηχανισμός για την αντιοξειδωτική του δράση είναι ασαφής.

Το SIRT1 σχετίζεται στενά με το οξειδωτικό στρες και ο άξονας σηματοδότησης SIRT1/FOXO3a/MnSOD είναι ο πιο σημαντικός αντιοξειδωτικός άξονας και είναι υπεύθυνος για την καταστολή του μιτοχονδριακού οξειδωτικού στρες, το MnSOD διανέμεται ευρέως στα μιτοχόνδρια και είναι κυρίως υπεύθυνο για την εκκαθάριση του ROS, του mitocho. αναστέλλοντας το οξειδωτικό στρες, οι ενώσεις που ενεργοποιούν αυτόν τον αντιοξειδωτικό άξονα μπορούν να αναστείλουν το οξειδωτικό στρες.24,25 Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ECH ασκεί τις φαρμακολογικές της επιδράσεις μέσω της ρύθμισης πολλαπλών οδών σηματοδότησης, όπως p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads και η οδός σηματοδότησης SIRT1.{10}} μια νέα μελέτη διαπιστώνει ότι η ECH συνδέεται ομοιοπολικά με το SIRT1 ως συνδέτη και ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του SIRT1 στα εγκεφαλικά κύτταρα.26 Υποδηλώνει ότι η ECH μπορεί να αναστείλει το οξειδωτικό στρες του μιτοχονδρίου στα καρδιομυοκύτταρα και το αντίστροφο του μυοκαρδίου αναδιαμόρφωση. Ωστόσο, η έρευνα για τις επιδράσεις της ECH έχει επικεντρωθεί στο νευρικό σύστημα ή τον όγκο, οι επιδράσεις και οι μηχανισμοί της ECH στο οξειδωτικό στρες των μιτοχονδρίων στα καρδιομυοκύτταρα και στην αναδιαμόρφωση του μυοκαρδίου παραμένουν άγνωστες. Εδώ, πρώτα επάγουμε ένα κυτταρικό μοντέλο οξειδωτικού στρες με ISO και επιβεβαιώνουμε την επίδραση του ECH στο οξειδωτικό στρες και τη λειτουργία του μιτοχονδρίου in vitro. Στη συνέχεια, καθιερώνουμε ένα μοντέλο αρουραίου HF που προκαλείται από το ISO και αποδεικνύουμε ότι η ECH αντιστρέφει την αναδιαμόρφωση του μυοκαρδίου και βελτιώνει την καρδιακή λειτουργία μέσω της προς τα πάνω ρύθμισης του άξονα σηματοδότησης SIRT1/FOXO3a/MnSOD και της αναστολής του οξειδωτικού στρες του μιτοχονδρίου σε αρουραίους με HF. Τα αποτελέσματα προορίζονται να παρέχουν πειραματικά στοιχεία για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων για την πρόληψη της καρδιακής ανεπάρκειας.

2|ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1|Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπεία

Τα κύτταρα AC16 αγοράζονται από την Bena Culture Collection. Τα κύτταρα διατηρούνται σε συμπλήρωμα υψηλής γλυκόζης Dulbecco's τροποποιημένου μέσου Eagle (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, USA) με 10 τοις εκατό εμβρυϊκό βόειο ορό είναι (10 τοις εκατό FBS; Gibco) σε φιάλες Τ-75 (Corning Glassworks, Corning, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ). Οι συνθήκες διατηρούνται στους 37 βαθμούς σε υγρή ατμόσφαιρα που περιέχει 5 τοις εκατό CO2. Μόλις τα κύτταρα φτάσουν το 70 τοις εκατό -80 τοις εκατό συρροή, τα κύτταρα της ομάδας ISO (Sigma, ΗΠΑ) επωάζονται με ένα μέσο που περιέχει 10 μΜ ISO (Sigma, ΗΠΑ) για 24 ώρες, τα κύτταρα της ομάδας ECH υποβάλλονται σε προεπεξεργασία με 50 μΜ ECH (MCE , ΗΠΑ) για 30 λεπτά πριν από την έκθεση ISO. Τα κύτταρα ελέγχου (Ctrl) δεν αντιμετωπίζονται τίποτα.

cistanche προς πώλησηεκχύλισμα

2.2|Ανίχνευση μιτοχονδριακού επιπέδου ROS με χρήση χημειοφωταύγειας λουμινόλης

Τα μιτοχόνδρια απομονώνονται και καθαρίζονται από κύτταρα AC-16 χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης μιτοχονδρίων (Sigma, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίζονται από το κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA (Biotech). Το επίπεδο του μιτοχονδριακού ROS ανιχνεύεται από τον αυλό (3-αμινοφθαλικό υδραζίδιο 5-αμινο-2,3-διυδρο-1,4-φθαλαζινοδιόνη) χρησιμοποιώντας ένα κιτ Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, ΗΠΑ), αντιδρά με το ROS και προκαλεί την εκπομπή φωτονίων, το οποίο είναι ένα φάσμα ζώνης με κορυφή περίπου στα 460 nm, και η μονάδα σχετικού φωτός (RLU) ανιχνεύεται από όργανο μέτρησης χημειοφωταύγειας και μετατρέπεται σε RLU/ug. μιτοχονδριακή πρωτεΐνη.

2.3|8-Το OHdG χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της οξειδωτικής βλάβης του μιτοχονδριακού DNA

Η οξειδωτική βλάβη του μιτοχονδριακού DNA αξιολογείται ανιχνεύοντας το περιεχόμενο της 8-Υδροξυ-2-δεοξυγουανοσίνης (8-OHG). Τα καθαρισμένα μιτοχόνδρια στα κύτταρα απομονώνονται χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης μιτοχονδρίων όπως παραπάνω (Sigma). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίζονται από το κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης BCA (Biotech). Στη συνέχεια, διαχωρίζονται για να προσδιοριστεί το επίπεδο του 8-OHdG χρησιμοποιώντας ένα κιτ Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση της αλλαγής χρώματος μετράται σε φασματοφωτόμετρο σε μήκος κύματος 450 nm. Η συγκέντρωση του 8-OHdG στα δείγματα προσδιορίζεται στη συνέχεια συγκρίνοντας την OD των δειγμάτων με την τυπική καμπύλη και μετατρέπεται σε ng/ml.

2.4|Μέτρηση MMP από JC-1

Τα μιτοχόνδρια απομονώνονται και καθαρίζονται από AC-16 και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίζεται όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Στη συνέχεια, τα μιτοχόνδρια επαναιωρούνται σε συγκέντρωση 1 mg/ml, η MMP μετράται χρησιμοποιώντας κιτ ανάλυσης JC-1 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ένταση φθορισμού μετράται σε μήκος κύματος διέγερσης: 490 nm, σχισμή 5 nm, μήκος κύματος εκπομπής: 590 nm, σχισμή 5 nm με όργανο φασματοφωτόμετρου,30 τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύονται ως FLU/ugP.

2,5|Ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής σε AC-16 κύτταρα

Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιείται για την εκτίμηση της κυτταρικής απόπτωσης. Ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V-FITC/PI (CWBIO, Κίνα) χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Η απόπτωση πρώιμου σταδίου, η απόπτωση ή νέκρωση όψιμου σταδίου, τα κυτταρικά υπολείμματα και τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίζονται ως αννεξίνη V ( συν )/ΡΙ (-), αννεξίνη V ( συν )/ΡΙ ( συν ), αννεξίνη V (-)/ΡΙ ( συν ) και αννεξίνη V (−)/PI (−), αντίστοιχα. Οι εντάσεις φθορισμού αναλύονται χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Κάθε πείραμα επαναλαμβάνεται 3 φορές.

2.6|Αξιολόγησε το ενδοκυτταρικό ROS με κυτταρόμετρο ροής

Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα υποβάλλονται σε θρυψίνη, πλένονται δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επαναιωρούνται σε PBS, χρωματίζονται με DCFH-DA (Beyotime, Κίνα) στην τελική συγκέντρωση 1 μΜ και επωάζονται για 1 ώρα στους 37 βαθμούς σε επωαστήρα με CO2 και στη συνέχεια δοκιμάζονται σε κυτταρόμετρο ροής σε διέγερση 488 nm . Η ένταση φθορισμού αντιπροσωπεύει το επίπεδο του ενδοκυτταρικού ROS.

2.7|Ελέγξτε την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη καρβονυλίου στα μιτοχόνδρια των κυττάρων AC-16

Μετά την επεξεργασία, τα καθαρισμένα μιτοχόνδρια απομονώνονται και υποβάλλονται σε υπερήχους σε πάγο και υποβάλλονται σε επεξεργασία με 1 τοις εκατό θειική στρεπτομυκίνη για να καθιζάνουν μιτοχονδριακά νουκλεϊκά οξέα, προσδιορίζεται η συγκέντρωση πρωτεΐνης. Η περιεκτικότητα σε καρβονυλική πρωτεΐνη ελέγχεται χρησιμοποιώντας κιτ Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) που βασίζεται στην παραγωγοποίηση της καρβονυλικής ομάδας με δινιτροφαινυλυδραζίνη (DNPH), σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ, η OD μετράται από συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών και μετατρέπεται σε nmol/ mg πρωτεΐνης σε σύγκριση με την τυπική καμπύλη.

2.8|Προσδιορισμός του επιπέδου υπεροξείδωσης λιπιδίων στα μιτοχόνδρια των AC-16 κυττάρων

Μετά τη θεραπεία, τα κύτταρα συλλέγονται και λύονται, τα μιτοχόνδρια απομονώνονται και καθαρίζονται και σπάζονται με υπερήχους, η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίζεται από το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Biotech), η υπεροξείδωση των λιπιδίων προσδιορίζεται από το επίπεδο μηλονοδιαλδεΰδης (MDA) μέσω της ανάλυσης TBARS , χρησιμοποιώντας κιτ (Nan jing Jian cheng, Κίνα) και το επίπεδο MDA μετράται σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η OD ανιχνεύεται στα 586 nm από έναν αναγνώστη μικροπλακών και μετατρέπεται σε μmol/g πρωτεΐνης σε σύγκριση με την τυπική καμπύλη.

2,9|Ζώα και θεραπεία

Νεαροί αρσενικοί αρουραίοι Sprague-Dawley βάρους 120-140g αποκτήθηκαν από το Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων του Πανεπιστημίου Xi'an Jiao tong (Shaanxi, Κίνα). Η έρευνα συμμορφώνεται με τον Οδηγό για τη φροντίδα και τη χρήση των εργαστηριακών ζώων, που δημοσιεύτηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας των ΗΠΑ (δημοσίευση NIH αρ.85-23, αναθεωρημένη το 1996) και τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από τις τοπικές αρχές ( Επιτροπή Βιοϊατρικής Δεοντολογίας του Ιατρικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Xi 'a Jiao Tong). Το μοντέλο της καρδιακής ανεπάρκειας επίμυος καθιερώθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς.31 Εν συντομία, η ισοπροτερενόλη (10 mg/kg) χορηγείται μία φορά την ημέρα με ενδοπεριτοναϊκή ένεση για 2 εβδομάδες (που ορίζεται ως ομάδα HF), η ECH χορηγείται με 20 ug/g μία φορά την ημέρα με ενδοπεριτοναϊκή ένεση σε 30 λεπτά πριν από τη θεραπεία ISO (ορίζεται ως ομάδα ECH) και η χορήγηση διαρκεί για 2 εβδομάδες. Στα ζώα ελέγχου χορηγείται 0,9 τοις εκατό NaCl (ορίζεται ως ομάδα Ctrl). Πραγματοποιούνται μετρήσεις υπερηχοκαρδιογραφίας για την αξιολόγηση της καρδιακής λειτουργίας.

2.10|Ηχοκαρδιογραφικές μετρήσεις

Τα ζώα αναισθητοποιούνται με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 300 mg/kg ένυδρης χλωράλης. Το σύστημα υπερήχων SONOS-2500 με μορφοτροπέα υπερήχων 7,5 MHz (HP, ΗΠΑ) χρησιμοποιείται για την πραγματοποίηση ηχοκαρδιογραφικών εξετάσεων. Το κλάσμα εξώθησης της αριστερής κοιλίας (LVEF), η κλασματική βράχυνση της αριστερής κοιλίας (LVFS), οι τελοδιαστολικές διαστάσεις της αριστερής κοιλίας (LVIDd), οι διαστάσεις της τελικής συστολικής αριστερής κοιλίας (LVIDs), ο καρδιακός ρυθμός (HR), το πάχος του μεσοκοιλιακού διαφράγματος στη διαστολή (IVSTd ), το πάχος του οπίσθιου τοιχώματος της αριστερής κοιλίας στη διαστολή (LVPWTd) μετράται όπως περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς.32

ΣΧΗΜΑ Το 1 50μmol ECH αναστέλλει αποτελεσματικά το μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες των κυττάρων AC-16 που προκαλείται από 10 μmol/L ISO και προστατεύει τη λειτουργία των μιτοχονδρίων και μειώνει την απόπτωση.

2.11|Μετράται η αναλογία βάρους καρδιάς προς σωματικό βάρος (HW/BW).

Ο αρουραίος ζυγίζεται πριν από την αναισθησία, η φρέσκια καρδιά απομονώνεται και ξεπλένεται το αίμα με 0.1mol/L PBS, κόβονται τα αγγεία και άλλος περιττός ιστός και η καρδιά ζυγίζεται και στη συνέχεια γίνεται HW/BW(mg/100g) υπολογίζεται.

2.12|Ιστολογική χρώση

Οι καρδιές των αρουραίων ανατέμνονται και στερεώνονται σε 4 τοις εκατό παραφορμαλδεΰδης, ενσωματώνονται σε παραφίνη και κόβονται σε φέτες πάχους 5 μm. Η χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης (ΗΕ) χρησιμοποιείται για την παρατήρηση των παθολογικών αλλαγών και το τρίχρωμο Masson για την αξιολόγηση των ινών κολλαγόνου του μυοκαρδιακού ιστού αρουραίων. Το κλάσμα όγκου καρδιακού κολλαγόνου (CVF) και η περιοχή διατομής των καρδιομυοκυττάρων μετράται με το Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, ΗΠΑ).

2.13|Χρώση TUNEL

Ο μυοκαρδιακός ιστός από την αριστερή κοιλία συλλέγεται και η ανάλυση TUNEL πραγματοποιείται όπως περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς32

2.14|Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης

Ο φρέσκος καρδιακός ιστός στερεώνεται σε 2,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη στους 4 βαθμούς, ο ιστός στη συνέχεια κόβεται σε όγκο 1 mm3 και σταθεροποιείται ξανά σε 2,5 τοις εκατό γλουταραλδεΰδη στους 4 βαθμούς για 2 ώρες, στη συνέχεια πλένεται με 0.1mol/L PBS, σταθεροποιείται σε 1 τοις εκατό οσμικό οξύ, αφυδατωμένο με ακετόνη, ενσωματωμένο με εποξειδική ρητίνη, γίνονται εξαιρετικά λεπτές φέτες λεπτές περίπου 800nm, χρωματίζονται με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο και στη συνέχεια παρατηρούνται σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (H{ {13}}, Hitachi Limited, Ιαπωνία). Για να ποσοτικοποιηθεί η προστατευτική επίδραση της ECH στη μιτοχονδριακή μορφολογία, η μέση μιτοχονδριακή περιφέρεια, η μέση μιτοχονδριακή περιοχή διατομής, το ποσοστό εκφυλισμού και το ποσοστό κενοτοπίωσης στα μιτοχόνδρια αναλύονται στατιστικά με το Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, ΗΠΑ).

2,15|Ποσοτική PCR

Ολικό RNA παρασκευάζεται από ιστό αριστερής κοιλίας με αντιδραστήριο Trizol (Invitrogen, Carlsbad, ΗΠΑ). Το cDNA συντίθεται χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA 1st Strand TUREscript (Takara, Ιαπωνία). Συγκεκριμένες αλληλουχίες εκκινητών κολλαγόνου που χρησιμοποίησα για PCR σε πραγματικό χρόνο είναι οι εξής: προς τα εμπρός: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, αντίστροφα: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. Προώθηση GAPDH 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', αντίστροφη 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. Πραγματοποιείται ποσοτική PCR (qPCR) σε πραγματικό χρόνο με SYBRPremix Ex Taq (Τέλειο σε πραγματικό χρόνο) (Takara, Ιαπωνία). Το σχετικό επίπεδο του mRNA υπολογίζεται με κανονικοποίηση σε GAPDH, σύμφωνα με τη μέθοδο 2-ΔΔCT.

2.16|Ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης πρωτεΐνης SIRT1, FOXO3a, MnSOD

Η ολική πρωτεΐνη του ιστού της αριστερής κοιλίας εκχυλίζεται σε πάγο χρησιμοποιώντας ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (BioRad, ΗΠΑ) με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma-Aldrich). Η συγκέντρωση προσδιορίζεται με τη μέθοδο BCA. Οι διαδικασίες του στυπώματος Western περιγράφονται προηγουμένως.33 Εν συντομία, το δείγμα πρωτεΐνης κλασματοποιείται σε γέλες δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου 15 τοις εκατό, μεταφέρεται σε μεμβράνες PVDF (BioRad, ΗΠΑ), αποκλείεται από 5 τοις εκατό αποβουτυρωμένο γάλα και επωάζεται με αντίσωμα MYH από ποντίκι (αραιωμένο 1:200, Santa Cruz, ΗΠΑ). Στη συνέχεια, επωάστηκε με ένα συζευγμένο με υπεροξειδάση χρένου αντίσωμα ποντικού κατσίκας (αραιωμένο 1:2,000, Santa Cruz, ΗΠΑ). Το σχετικό επίπεδο πρωτεΐνης υπολογίζεται με κανονικοποίηση της μέσης τιμής ακτίνας σε -ακτίνη. Οι ζώνες πρωτεϊνών ανιχνεύονται από ένα σύστημα χημειοφωταύγειας (ChemiDoc XRS, BioRad).

2.17|Μέτρηση του μιτοχονδριακού οξειδωτικού στρες στο μυοκάρδιο αρουραίου

Τα καθαρισμένα μιτοχόνδρια του μυοκαρδίου αρουραίου απομονώνονται χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης μιτοχονδρίων (Sigma, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, τα μιτοχονδριακά ROS, MMP, οξειδωτική βλάβη του mtDNA, περιεκτικότητα σε καρβονυλιωμένη πρωτεΐνη και επίπεδο υπεροξείδωσης λιπιδίων στα μιτοχόνδρια ανιχνεύονται με τις ίδιες μεθόδους. πειράματα κυττάρων που περιγράφονται παραπάνω. Αξίζει να σημειωθεί ότι το ROS στον ιστό του μυοκαρδίου ανιχνεύεται με φθορίζοντες ανιχνευτές DCFH-DA, η ένταση φθορισμού ανιχνεύεται με το όργανο μέτρησης σήμανσης ενζύμων, τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύονται ως μιτοχονδριακή πρωτεΐνη RLU/ug.

2.18|Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SEM. Η μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιείται για τη σύγκριση διαφορών μεταξύ πολλαπλών ομάδων, ακολουθούμενη από τη δοκιμασία Tukey post hoc για τη σημασία. Όλα τα στατιστικά στοιχεία προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS15.{2}} (SPSS Inc, IL, ΗΠΑ). Μια τιμή πιθανότητας P < 0,05="" θεωρείται="">

3|ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

3.1|Το 50 μM ECH αναστέλλει αποτελεσματικά τη μιτοχονδριακή οξειδωτική βλάβη και την απόπτωση σε κύτταρα AC-16

Τα μη επεξεργασμένα κελιά ορίζονται ως ομάδα Ctrl. Πρώτον, όπως δείχνει το Σχήμα 1Α, το ECH αναστέλλει το μιτοχονδριακό ROS που προκαλείται από το ISO. Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ISO εμφανίζουν σημαντική αύξηση στο μιτοχονδριακό ROS σε σύγκριση με το Ctrl και αυτή η αύξηση μειώνεται σημαντικά με την προεπεξεργασία με 50 μM ECH. Δεύτερον, το ECH μπορεί να αναστείλει την οξειδωτική βλάβη του mtDNA που προκαλείται από το ISO. 8-Το OHdG πιστεύεται ότι είναι μια από τις πιο άφθονες αλλοιώσεις του DNA που προκύπτουν από οξειδωτικό στρες και είναι βιοδείκτης οξειδωτικής βλάβης και επιδιόρθωσης του DNA. Όπως δείχνει το Σχήμα 1Β, ανιχνεύεται η περιεκτικότητα σε 8-OHdG σε καθαρισμένα μιτοχόνδρια από AC-16 κύτταρα, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το επίπεδο του 8-OHdG στα μιτοχόνδρια από κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με ISO αυξήθηκε δραματικά, αλλά η αλλαγή αντιστράφηκε κατά 50 μM ECH. Τρίτον, το ECH είναι αποτελεσματικό για την προστασία του MMP, το οποίο είναι μειωμένο από το ISO. Η ένταση φθορισμού μειώνεται σημαντικά στα κύτταρα που έχουν υποστεί επεξεργασία με ISO σε σύγκριση με τα κύτταρα Ctrl, ενώ η προεπεξεργασία με 50 μM ECH μειώνει σημαντικά τη μείωση της MMP, όπως δείχνει το σχήμα 1C. Τέταρτον, η ECH προστατεύει από την οξειδωτική βλάβη της μιτοχονδριακής πρωτεΐνης στα κύτταρα AC{12}}. Όπως δείχνει το Σχήμα 1D, η περιεκτικότητα σε καρβονυλική πρωτεΐνη στα μιτοχόνδρια των κυττάρων επεξεργασίας ISO αυξάνεται σημαντικά και η ECH εξασθενεί το αποτέλεσμα. Πέμπτον, η ECH αναστέλλει επίσης την υπεροξείδωση των μιτοχονδριακών λιπιδίων σε κύτταρα AC-16 που προκαλείται από το ISO. Όπως δείχνει το σχήμα 1Ε, το επίπεδο των υπεροξειδίων των λιπιδίων στα μιτοχόνδρια των κυττάρων ISO είναι προφανώς υψηλότερο από αυτό των κυττάρων Ctrl, ενώ αυτή η αύξηση μειώνεται σημαντικά κατά 50μM ECH προ-επεξεργασία. Τελικά, το ECH αναστέλλει τη συσσώρευση των ενδοκυτταρικών ROS. Όπως δείχνει το Σχήμα 1 ΣΤ, το επίπεδο του ενδοκυτταρικού ROS σε κύτταρα ISO είναι σημαντικά αυξημένο και μειώνεται σημαντικά σε κύτταρα που έχουν υποστεί προεπεξεργασία ECH. Το Σχήμα 1G δείχνει ότι ο ρυθμός απόπτωσης των AC-16 κυττάρων είναι σημαντικά αυξημένος μετά από επωάσεις 24 ωρών με 10μM ISO, σε σύγκριση με τα κύτταρα Ctrl, ενώ τα κύτταρα πριν από την επεξεργασία με 50 μM ECH μειώνουν σημαντικά την απόπτωση που προκαλείται από ISO.

ΣΧΗΜΑ 2 Η καρδιακή υπερτροφία αρουραίων με καρδιακή ανεπάρκεια που προκαλείται από ISO ανακουφίζεται και η καρδιακή λειτουργία βελτιώνεται σημαντικά με τη θεραπεία ECH.

3.2|Η ECH αναστρέφει την αναδιαμόρφωση του μυοκαρδίου και βελτιώνει την καρδιακή λειτουργία αρουραίων με καρδιακή ανεπάρκεια που προκαλούνται από ISO

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, οι καρδιές σε αρουραίους με καρδιακή ανεπάρκεια είναι εμφανής υπερτροφία και αναστρέφονται με θεραπεία με ECH. Όπως δείχνουν τα σχήματα 2B-D και L, το ECH μειώνει το HW/BW. Τα αποτελέσματα του ηχοκαρδιογραφήματος δείχνουν ότι το LVEF και το LVFS είναι σημαντικά μειωμένα στην ομάδα HF, τα LVIDd, LVIDs και IVSTd είναι σημαντικά αυξημένα στην ομάδα HF. Ωστόσο, το ECH μειώνει σημαντικά τα LVIDd, LVIDs, IVSTd και βελτιώνει τα LVEF και LVFS, δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στο HR μεταξύ των τριών ομάδων, το LVPWTd αυξάνεται σε HF, αλλά καμία διαφορά μεταξύ ECH και Ctrl ή μεταξύ ECH και HF, όλα ως Το Σχήμα 2Ε-Κ δείχνει. Τα αποτελέσματα της χρώσης HE υποδεικνύουν ότι η υπερτροφία του μυοκαρδίου, η διευθετημένη διαταραχή ή η εκφυλιστική νέκρωση, η διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων και η διάμεση υπεραιμία και το οίδημα σε αρουραίους HF, και η ECH ανακουφίζει σημαντικά αυτές τις βλάβες, η υπερτροφία του μυοκαρδίου και η διευθετημένη διαταραχή ανακουφίζονται. Η εκφυλιστική νέκρωση και η φλεγμονώδης διήθηση μειώνονται, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α. Η περιοχή διατομής του καρδιομυοκυττάρου μετράται, αυξάνεται σημαντικά μετά το ISO και μειώνεται στην ομάδα που έχει υποστεί αγωγή με ECH, όπως δείχνει το Σχήμα 3Ε. Οι αξιολογήσεις της εναπόθεσης κολλαγόνου με χρώση Masson αποκαλύπτουν ότι η περιεκτικότητα σε κολλαγόνο της αριστερής κοιλίας σε αρουραίους με HF αυξάνεται προφανώς και προφανώς μειώνεται μετά τη θεραπεία με ECH, η οποία προφανώς μειώνει την CVF. Η ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο αποκαλύπτει ότι τα μεταγραφήματα τύπου προκολλαγόνου Ⅰ ρυθμίζονται προς τα πάνω σε αρουραίους ISO και ρυθμίζονται προς τα κάτω σε αρουραίους ECH, αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή μεταξύ τους, όπως δείχνουν τα σχήματα 3Β και FG, τα δεδομένα δείχνουν ότι η ECH μειώνει αποτελεσματικά την εναπόθεση κολλαγόνου . Ο αριθμός των θετικών στο TUNEL κυττάρων στα καρδιομυοκύτταρα είναι σημαντικά αυξημένος σε αρουραίους με HF σε σύγκριση με το Ctrl, το ECH μειώνει σημαντικά την απόπτωση των κυττάρων του μυοκαρδίου και το Σχήμα 3C-D δείχνει την αντιπροσωπευτική εικόνα των θετικών στο TUNEL κυττάρων σε πεδία χαμηλής και υψηλής ισχύος αντίστοιχα, και Εικόνα Το 3Η δείχνει το ρυθμό απόπτωσης των κυττάρων του μυοκαρδίου. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ECH αναστρέφει αποτελεσματικά την υπερτροφία του μυοκαρδίου, τη διάμεση ίνωση του μυοκαρδίου και την απόπτωση και βελτιώνει τη λειτουργία της καρδιάς σε αρουραίους με καρδιακή ανεπάρκεια που προκαλείται από ISO.

ΣΧΗΜΑ 3 Τα αποτελέσματα της ιστολογικής χρώσης καταδεικνύουν ότι η ECH αναστρέφει την αναδιαμόρφωση της αριστερής κοιλίας αρουραίων HF που προκαλείται από ISO.

3.3|Η ECH προστατεύει την υπερδομή του μυοκαρδίου σε αρουραίους με καρδιακή ανεπάρκεια

Τα αποτελέσματα των μικρογραφιών μετάδοσης ηλεκτρονίων δείχνουν ότι η βλάβη στην υπερδομή του μυοκαρδίου θα μπορούσε να μετριαστεί από το ECH, όπως δείχνει το Σχήμα 4Α-Β. Τα μυοϊνίδια έχουν κατακόρυφη διάταξη, η δομή του σαρκομερίου είναι εμφανής, τα μυοινίδια είναι τακτοποιημένα και η γραμμή Ζ είναι καθαρή. Τα μιτοχόνδρια είναι τακτοποιημένα και η δομή είναι ξεκάθαρη στους αρουραίους Ctrl. Ωστόσο, τα μυοϊνίδια είναι αποδιοργανωμένα, διαρρηγμένα και διαλυμένα, η δομή του σαρκομερίου είναι ασαφής, η απουσία της γραμμής Ζ, η ζώνη συστολής του μυοκαρδίου είναι ορατή, ο αριθμός και ο όγκος των μιτοχονδρίων είναι αυξημένοι, τα μιτοχόνδρια έχουν διαφορετικά σχήματα και μεγέθη, διατεταγμένα σε αταξία, η δομή είναι ασαφής, διόγκωση και κατακερματισμός κρυστάλλου, κατάρρευση ή συσσώρευση και διαλυμένη σε κενοτόπιο σε αρουραίους με HF. Η ECH προφανώς εξασθενεί αυτές τις αλλαγές, η πλειονότητα των καρδιακών μυϊκών ινών είναι τακτοποιημένα και τα μυοκαρδιακά νημάτια είναι καθαρά, η γραμμή Z υπάρχει, αν και κάποια διάλυση των νημάτων είναι εμφανής, η δομή του σαρκομερίου είναι καθαρή, η πυκνότητα των μιτοχονδρίων μειώνεται, τα σχήματα και τα μεγέθη ανακουφίζονται, τακτοποιούνται πιο τακτοποιημένα, η διόγκωση των μιτοχονδρίων και ο κατακερματισμός των κριστών, η κατάρρευση ή η συσσώρευση και η κενοτοπίωση μειώνονται προφανώς από την ECH σε σύγκριση με την HF. Η διόγκωση των μιτοχονδρίων και ο κατακερματισμός των κριστών, η κατάρρευση ή η συσσώρευση και η μερική κενοτοπίωση αναγνωρίζονται ως μιτοχονδριακός εκφυλισμός. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η ECH προστατεύει αποτελεσματικά την υπερδομή του μυοκαρδίου και ιδιαίτερα προστατεύει τη μορφολογία των μιτοχονδρίων σε αρουραίους με HF, όπως δείχνει το Σχήμα 4C-F.

ΣΧΗΜΑ 4 Η ECH προστατεύει την υπερδομή των καρδιομυοκυττάρων και τη μιτοχονδριακή μορφολογία αρουραίων HF που προκαλείται από το ISO.

3.4|Το ECH ρυθμίζει προς τα πάνω την πρωτεϊνική έκφραση των SIRT1, FOXO3a και MnSOD

Η ανάλυση Western Blot δείχνει ότι το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης των SIRT1, FOXO3a και MnSOD ρυθμίζεται σημαντικά προς τα κάτω σε αρουραίους HF, ωστόσο, η ECH προφανώς ρυθμίζει προς τα πάνω τη μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης. Οι αντιπροσωπευτικές πρωτεϊνικές ζώνες της ανοσοστύπωσης και των αποτελεσμάτων στατιστικής ανάλυσης φαίνονται στο Σχήμα 5. Το μέρος των δεδομένων δείχνει ότι η ECH αυξάνει την έκφραση πρωτεΐνης των SIRT1, FOXO3a και MnSOD.

3,5|Η ECH αναστέλλει το μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες στον ιστό του μυοκαρδίου της αριστερής κοιλίας

Σε αυτό το μέρος, τα μιτοχονδριακά ROS, τα MMP, η οξειδωτική βλάβη του μιτοχονδριακού DNA, η περιεκτικότητα σε καρβονυλική πρωτεΐνη και το επίπεδο υπεροξείδωσης λιπιδίων στα μιτοχόνδρια στον μυοκαρδιακό ιστό της αριστερής κοιλίας των αρουραίων μετρώνται όλα και τα αποτελέσματα συμφωνούν με πειράματα κυττάρων, δηλαδή Το ECH μειώνει το μιτοχονδριακό ROS, προστατεύει το MMP, ανακουφίζει από τον βαθμό βλάβης του mtDNA, μειώνει την περιεκτικότητα σε καρβονυλικές πρωτεΐνες και την υπεροξείδωση των λιπιδίων στα μιτοχόνδρια, όπως δείχνει το Σχήμα 6.

ΣΧΗΜΑ 5 Η ECH ρυθμίζει προς τα πάνω το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης των SIRT1, FOXO3a και MnSOD που ρυθμίζεται προς τα κάτω σε αρουραίους HF.

4|ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι η ECH ασκεί αποτελεσματικούς ρόλους στην πρόληψη της αναδιαμόρφωσης του μυοκαρδίου και στη βελτίωση της καρδιακής λειτουργίας μέσω της προς τα πάνω ρύθμισης του άξονα σηματοδότησης SIRT1/FOXO3a/MnSOD και της αναστολής του οξειδωτικού στρες του μιτοχονδρίου.

Τα μιτοχόνδρια είναι η κύρια θέση παραγωγής ROS ως υποπροϊόν της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, λόγω της γειτνίασής τους με ROS, οι μιτοχονδριακές πρωτεΐνες, τα λιπίδια και το mtDNA πιστεύεται ότι είναι πρωταρχικοί στόχοι οξειδωτικής βλάβης μετά από υπερβολική εκπομπή μιτοχονδριακών ROS,34,35 αυτή η βλάβη διεγείρει την περαιτέρω παραγωγή ROS, ο φαύλος κύκλος συνεχίζεται, το ROS και το οξειδωτικό στρες θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε υπερτροφία του μυοκαρδίου, απόπτωση, διάμεση ίνωση και καρδιακή ανεπάρκεια μέσω της ενεργοποίησης πολλαπλών οδών σηματοδότησης. Το στρες είναι αποτελεσματικό για την πρόληψη της αναδιαμόρφωσης του μυοκαρδίου. Το ECH είναι ένα φυσικό φαινυλαιθανοειδές γλυκοσίδιο, συστατικό του παραδοσιακού κινέζικου βοτάνου Cistanche tubulosa. Έχει μελετηθεί ευρέως και έχει αποδειχθεί ότι διαθέτει είδη φαρμακολογικών δράσεων τα τελευταία χρόνια, όπως αντικαρκινική, αντι-απόπτωση, αντιγηραντική, νευροπροστατευτική δράση κ.λπ. Μελέτες έχουν αποδείξει ότι οι φαρμακολογικές δράσεις της ECH εξαρτώνται κυρίως από την αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση της,18,21 και η ECH μειώνει το μιτοχονδριακό ROS και προστατεύει τη λειτουργία των μιτοχονδρίων από την οξειδωτική βλάβη στα νευρικά κύτταρα.20,22 Εδώ, καταρχάς δείξαμε ότι Η ECH μειώνει τα μιτοχονδριακά ROS των καρδιομυοκυττάρων, επομένως, βελτιώνει το MMP, μειώνοντας την οξειδωτική βλάβη του mtDNA, πρωτεΐνης και λιπιδίων, αναστέλλοντας αποτελεσματικά την οξειδωτική βλάβη των μιτοχονδρίων και μειώνοντας την απόπτωση in vitro και in vivo, επομένως, αναστρέφει την αναδιαμόρφωση του μυοκαρδίου και βελτιώνει τη λειτουργία της καρδιάς. Σημαίνει ότι το ECH είναι ένα πιθανό νέο φάρμακο για την πρόληψη της αναδιαμόρφωσης του μυοκαρδίου και της καρδιακής ανεπάρκειας.

Σε κανονικές συνθήκες, το μιτοχονδριακό ROS καθαρίζεται κυρίως από το MnSOD το οποίο κατανέμεται στα μιτοχόνδρια και προστατεύει από την οξειδωτική βλάβη των μιτοχονδρίων. Το Ang II μειώνει σημαντικά την έκφραση MnSOD των καρδιομυοκυττάρων και προκαλεί υπερτροφία του μυοκαρδίου, ωστόσο, η ρεσβερατρόλη θα μπορούσε να αυξήσει την έκφραση του MnSOD και να αναστείλει την υπερτροφία του μυοκαρδίου που προκαλείται από το Ang II.36 Στο HF, η δραστηριότητα του MnSOD μειώνεται σημαντικά και η δημιουργία μιτοχονδριακών ROS .37,38 Σε ποντίκια νοκ-άουτ γονιδίου MnSOD ειδικά για την καρδιά, τα μιτοχονδριακά ROS δεν μπορούσαν να καθαριστούν και το ROS αυξήθηκε στα καρδιομυοκύτταρα, αυτό οδήγησε σε μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και προοδευτική καρδιακή διεύρυνση, οδηγώντας τελικά σε καρδιακή ανεπάρκεια.39 Στην παρούσα μελέτη, επιβεβαιώνουμε ότι η έκφραση του MnSOD μειώνεται σημαντικά, η οποία μειώνεται με την επεξεργασία ECH, και έτσι, το μιτοχονδριακό ROS μειώνεται και το μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες αναστέλλεται. Σημαίνει ότι η ECH προστατεύει τα καρδιομυοκύτταρα από οξειδωτική βλάβη μέσω της προς τα πάνω ρύθμισης της έκφρασης του MnSOD, διερευνούμε περαιτέρω τους μοριακούς μηχανισμούς που κρύβονται πίσω από αυτές τις επιδράσεις.

Η έκφραση του MnSOD ρυθμίζεται από το FOXO3a, το οποίο είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας και συνδέεται στην περιοχή προαγωγέα γονιδίου του MnSOD και οδηγεί στην προώθηση της μεταγραφής γονιδίων.40 Το SIRT1 είναι ένα ανάντη μόριο του FOXO3a και μπορεί να ενεργοποιήσει το FOXO3a με αποακετυλίωση. Ο άξονας σηματοδότησης SIRT1/FOXO3a/MnSOD παίζει καθοριστικό ρόλο στην προστασία από το οξειδωτικό στρες σε είδη κυτταρικών τύπων, η ενεργοποίηση του άξονα σηματοδότησης από την οιστραδιόλη αναστέλλει το οξειδωτικό στρες και ασκεί την καρδιακή προστασία24. Η ενεργοποίηση του άξονα σηματοδότησης από τη ρεσβερατρόλη αναστέλλει τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες40. Διαφορετικά, η αγγειοτενσίνη II αναστέλλει το μονοπάτι SIRT1/FoxO3a/MnSOD και προκαλεί μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες, βλάβες στο mtDNA στους οστεοβλάστες, η αδενυλυλοκυκλάση τύπου 5 αυξάνει το οξειδωτικό στρες αναστέλλοντας την έκφραση του MnSOD μέσω της παρούσας μελέτης Sirt1/Fox4. Η έκφραση των SIRT1, FoxO3a και MnSOD είναι όλα σημαντικά μειωμένα σε αρουραίους HF και το μιτοχονδριακό ROS είναι αυξημένο και το οξειδωτικό στρες ενισχύεται, ωστόσο, οι αλλαγές αντιστρέφονται από την ECH. Νέα έρευνα δείχνει ότι η ECH δεσμεύει άμεσα το SIRT1 ως συνδέτη και σχηματίζει ένα σύμπλεγμα με 9 ομοιοπολικούς δεσμούς και ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του SIRT1 στα νευρικά κύτταρα.26 Σε συμφωνία με αυτή τη μελέτη, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η ECH ρυθμίζει επίσης προς τα πάνω την έκφραση Το SIRT1 στα καρδιομυοκύτταρα, στη συνέχεια ρυθμίζει προς τα πάνω την γονιδιακή έκφραση του MnSOD μέσω του FoxO3a και αναστέλλει τα μιτοχονδριακά ROS και το οξειδωτικό στρες.

Η μακροχρόνια χρόνια ισχαιμία μπορεί να προκαλέσει χειμερία νάρκη του μυοκαρδίου, αυτά τα κύτταρα του μυοκαρδίου που βρίσκονται σε χειμερία νάρκη παρουσιάζουν συνήθως απώλεια συσταλτικών νημάτων, υπάρχει περίσσεια κόκκων γλυκογόνου στο κυτταρόπλασμα, σαρκοπλασματικό δίκτυο και χάνονται εγκάρσιοι σωληνίσκοι,43 επίσης, υπάρχουν ανωμαλίες στο μέγεθος και το σχήμα των μιτοχονδρίων , αντιδραστική υπερτροφία του μυοκαρδίου και διάμεση ίνωση, η οποία οφείλεται στην απώλεια μυοκυττάρων.44 Παρατηρήσαμε επίσης τις παραπάνω αλλαγές σε αρουραίους με καρδιακή ανεπάρκεια στη μελέτη μας, ενώ η ECH ανακουφίζει σημαντικά αυτές τις αλλαγές, καθώς η τελευταία μελέτη ανέφερε ανάκτηση της καρδιακής λειτουργίας μετά από ισχαιμικό στρες χαρακτηριστικό της αδρανοποίησης του μυοκαρδίου,45 μετράται επίσης το επίπεδο γλυκογόνου του μυοκαρδίου, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων, όπως φαίνεται στο Σχήμα 7J.

Η προηγούμενη μελέτη ανίχνευσε επίσης χειμερία νάρκη του μυοκαρδίου σε μοντέλο χοίρου μη ισχαιμικής καρδιακής ανεπάρκειας βηματοδοτώντας το ελεύθερο τοίχωμα LV με υψηλή συχνότητα,46 επειδή η μικροαγγειακή απόφραξη παίζει σημαντικό ρόλο στη χειμερία νάρκη του μυοκαρδίου και στην προκύπτουσα συσταλτική δυσλειτουργία, και αυτό βελτιώνεται σημαντικά όταν Η μικροαγγειακή απόφραξη αναστρέφεται από ένα φάρμακο.47 Προς το παρόν, ορισμένες μελέτες καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι η θεραπεία επαναγγείωσης είναι αποτελεσματική στη χειμερία νάρκη του μυοκαρδίου,43 χρησιμοποιώντας χρώση HE και Masson, παρατηρούμε ότι η πυκνότητα των τριχοειδών και των αρτηριών του μυοκαρδίου μειώνεται προφανώς σε αρουραίους με καρδιακή ανεπάρκεια και ανακουφίζεται σημαντικά από ECH, όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Α-Η. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι άλλες φυσικές ενώσεις, όπως η βήτα-γλυκάνη κριθαριού ασκούν καρδιοπροστατευτικά αποτελέσματα αυξάνοντας την έκφραση του MnSOD,48,49 και η αύξηση του MnSOD σχετίζεται με την αυξημένη πυκνότητα των τριχοειδών του μυοκαρδίου και την έκφραση του VEGF. Πραγματοποιήσαμε RT-PCR για να ανιχνεύσουμε την έκφραση του VEGF, τα δεδομένα είναι σύμφωνα με το εύρημα της ιστολογικής χρώσης, που σημαίνει ότι η ECH μπορεί να προάγει την αγγειογένεση και να αυξήσει την πυκνότητα των τριχοειδών του μυοκαρδίου μέσω της ρύθμισης της έκφρασης VEGF, όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Ι. Η παρούσα μελέτη διαπιστώνει ότι η ECH μπορεί να προστατεύσει και να αυξήσει το τριχοειδές και αρτηριακό του μυοκαρδίου μέσω της προς τα πάνω ρύθμισης της οδού SIRTI/FOXO3a/MnSOD και της έκφρασης του VEGF, καταστέλλοντας έτσι το μυοκάρδιο σε χειμερία νάρκη και συμβάλλοντας στη βελτίωση της καρδιακής λειτουργίας.

Ο Cistanche συμβάλλειπρος τηνβελτίωση της λειτουργίας της καρδιάς.

Για περισσότερες πληροφορίες, παρακαλώ κάντε κλικ εδώ.

Αξίζει να σημειωθεί ότι η απόπτωση των καρδιομυοκυττάρων είναι ευρέως γνωστό ότι είναι μια σημαντική παθολογική αλλαγή στην καρδιακή ανεπάρκεια και η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει πράγματι ότι μια μεγάλη ποσότητα αποπτωτικών κυττάρων σε αρουραίους με καρδιακή ανεπάρκεια και ECH μειώνει σημαντικά την απόπτωση μέσω της ρύθμισης της οδού SIRTI/FOXO3a/MnSOD και της αναστολής μιτοχονδριακό οξειδωτικό στρες, όπως αναφέρθηκε παραπάνω.

Πάνω απ 'όλα, η ECH αντιστρέφει την αναδιαμόρφωση του μυοκαρδίου και βελτιώνει τη λειτουργία της καρδιάς μέσω της προς τα πάνω ρύθμισης του άξονα σηματοδότησης SIRT1/FoxO3a/MnSOD, αναστέλλοντας έτσι το οξειδωτικό στρες του μιτοχονδρίου και μειώνοντας το μυοκάρδιο σε χειμερία νάρκη. Έτσι, προτείνεται ότι η ECH είναι ένα πιθανό φάρμακο για την πρόληψη ή τη θεραπεία της αναδιαμόρφωσης του μυοκαρδίου και της καρδιακής ανεπάρκειας.