Ανακάλυψη νέων αναστολέων STING με βάση τη δομή του ποντικιού Αγωνιστής STING DMXAA
Nov 27, 2023
Αφηρημένη:
Η πρωτεΐνη του διεγέρτη του γονιδίου ιντερφερόνης (STING) εμπλέκεται στην έμφυτη ανοσία. Το φάρμακο DMXAA (5,6-διμεθυλξανθενόνη-4-οξικό οξύ) αποδείχθηκε ότι είναι ένας ισχυρός αγωνιστής ποντικού STING (mSTING), αλλά είχε μικρή επίδραση στο ανθρώπινο STING (hSTING). Σε αυτό το άρθρο, βασιζόμαστε στη σύγκριση διαφορετικών κρυσταλλικών δομών και ανάλυσης σχέσεων αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-συνδέτη για να υποστηρίξουμε την υπόθεση ότι ο σχεδιασμός του φαρμάκου των παραλλαγών DMXAA έχει τη δυνατότητα να μετατρέψει τους αγωνιστές STING σε αναστολείς. Με βάση την προηγούμενη ανακάλυψη δύο αναλόγων DMXAA, 3 και 4 (και τα δύο θα μπορούσαν να συνδεθούν με το STING), τα βελτιστοποιήσαμε δομικά και συνθέσαμε νέα παράγωγα, αντίστοιχα. Σε προσδιορισμούς δέσμευσης, βρήκαμε τις ενώσεις 11 και 27 να αντιπροσωπεύουν συνδετικά STING που ήταν ανώτερα από τις αρχικές δομές και συζητήσαμε τις σχέσεις δομής-δραστικότητας. Όλες οι ενώσεις στόχοι ήταν ανενεργές σε κυτταρικούς προσδιορισμούς για τη διαλογή της αγωνιστικής δράσης STING. Με ευχαρίστηση, αναγνωρίσαμε τους 11 και 27 ως αναστολείς STING με μικρομοριακή δραστηριότητα και στις δύο οδούς hSTING και mSTING. Επιπλέον, τα 11 και 27 ανέστειλαν την επαγωγή ιντερφερόνης και φλεγμονωδών κυτοκινών που ενεργοποιήθηκαν από 20 3 0 -cGAMP χωρίς εμφανή κυτταροτοξικότητα. Αυτά τα ευρήματα σπάζουν την άκαμπτη σκέψη ότι το DMXAA παρέχει τη δομική βάση ειδικά για τους αγωνιστές STING και ανοίγει περισσότερες δυνατότητες για την ανάπτυξη νέων αγωνιστών ή αναστολέων STING.
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
Λέξεις-κλειδιά:
ΤΣΙΜΠΗΜΑ; DMXAA; επιλεκτικότητα ειδών· Αγωνιστής STING; αναστολέας STING
1. Εισαγωγή
Το γονίδιο του διεγέρτη της ιντερφερόνης (STING) είναι ένα ουσιαστικό μόριο σηματοδότησης για την εγγενή ανοσία, που μεσολαβεί πρωτίστως στις φυσικές ανοσοαποκρίσεις που προκαλούνται από το κυτταροπλασματικό DNA [1]. Όταν ο υποδοχέας DNA κυκλική συνθάση γουανοσίνης-αδενοσίνης φωσφορικής συνθάσης (cGAS) ανιχνεύει ενδοκυτταρικό δίκλωνο DNA, το cGAS καταλύει τη σύνθεση του 2 0,30 -cGAMP (Εικόνα 1), ενός κυκλικού δινουκλεοτιδίου (CDN) ικανό άμεσης σύνδεσης και ενεργοποίησης του STING στο ενδοπλασματικό δίκτυο [2-4]. Κατά την ενεργοποίηση, το STING σχηματίζει συσσωματώματα που στρατολογούνται κατάντη προς την κινάση 1 (TBK1) που δεσμεύει το TANK και δεσμεύει τον ρυθμιστικό παράγοντα 3 ιντερφερόνης (IRF3), ο οποίος φωσφορυλιώνει το IRF3, ενεργοποιεί τα διμερή IRF3 στον πυρήνα, διεγείρει την έκφραση ιντερφερόνης τύπου Ι και προκαλεί έκφραση (IFN) μια ανοσολογική απόκριση ιντερφερόνης [1]. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι το STING εμπλέκεται στην παθογένεση πολλαπλών ασθενειών και ότι η διέγερση του STING προκαλεί αποτελεσματικές ανοσοαποκρίσεις σε παθογόνες λοιμώξεις και καρκίνους. Ωστόσο, η αποτυχία ρύθμισης της χρόνιας φλεγμονώδους σηματοδότησης οδηγεί σε αυτοάνοσα και φλεγμονώδη νοσήματα [5-8]. Λόγω του θεμελιώδους ρόλου του STING στη ρύθμιση της έμφυτης ανοσίας, ένας μεγάλος αριθμός ομάδων έχει αρχίσει να αναπτύσσει αγωνιστές ή αναστολείς STING.
Εικόνα 1. Αντιπροσωπευτικοί διαμορφωτές STING
Η έρευνα για τους αγωνιστές STING πρώτης γενιάς επικεντρώθηκε στη δομική τροποποίηση των αναλόγων CDN για την παράκαμψη ορισμένων περιορισμών των ενδογενών CDN, όπως η κακή διαπερατότητα της μεμβράνης και η ευαισθησία στην υδρόλυση από τις φωσφατάσες [9,10]. Το μικρό μόριο STING αγωνιστής 5,6-διμεθυλξανθενόνη-4-οξικό οξύ (DMXAA), το οποίο έχει δείξει θεραπευτική υπόσχεση έναντι συμπαγών όγκων σε μοντέλα ποντικών, θα μπορούσε να εξουδετερώσει τα μειονεκτήματα των παραγώγων CDN [11]. Ωστόσο, το φάρμακο απέτυχε σε κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους [12]. Επιβεβαιώνεται περαιτέρω ότι το DMXAA δεσμεύεται επιλεκτικά στο STING ποντικού (mSTING) παρά στο ανθρώπινο STING (hSTING) [13,14], το οποίο εμποδίζει τη θεραπευτική δυνατότητα του DMXAA στους ανθρώπους. Η 10-Καρβοξυμεθυλ-9-ακριδινόνη (CMA) είναι ένας άλλος αντιπροσωπευτικός ειδικός για ποντικό αγωνιστή STING που χρησιμοποιήθηκε ως ισχυρός επαγωγέας IFN τύπου Ι για αντιική θεραπεία στις αρχές της δεκαετίας του 1970 [15]. Επομένως, η επιλεκτικότητα των ειδών είναι ζωτικός παράγοντας για την ανάπτυξη αγωνιστών STING μικρού μορίου. Οι άοκνες προσπάθειες ερευνητών, συμπεριλαμβανομένων των diABZI, SR717, MSA02 και άλλων [16-19] έχουν τεθεί υπόψη σε σημαντικούς νέους αγωνιστές hSTING.
Οφέλη από το cistanche για τους άνδρες-ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα
Όλο και περισσότερα στοιχεία δείχνουν ότι η υπερενεργοποίηση του STING σχετίζεται με αυτοφλεγμονώδη και αυτοάνοσα νοσήματα. Είναι απαραίτητο να περιοριστεί η υπερβολική ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης STING, η οποία υπογραμμίζει την πιθανή τιμή των αναστολέων STING. Ωστόσο, σε αντίθεση με τους αγωνιστές STING, η ανάπτυξη των αναστολέων STING είναι ακόμη σε αρχικό στάδιο και κανένας υποψήφιος φάρμακο δεν έχει εισέλθει ακόμη σε κλινικές μελέτες. Οι γνωστοί αναστολείς STING περιλαμβάνουν δύο τύπους ενώσεων: ανταγωνιστικούς ανταγωνιστές (SN-011 και Merck-18) και ομοιοπολικούς αναστολείς (H151) [20-22]. Οι προηγουμένως αναγνωρισμένοι ομοιοπολικοί αναστολείς STING αλληλεπιδρούν με το Cys88/91 ή το Cys91 που βρίσκεται στη Ν-τερματική διαμεμβρανική περιοχή του STING έξω από τον θύλακα δέσμευσης CDN [22]. Πρόσφατα, δύο ομάδες ανέφεραν διαδοχικά δύο δομικούς τύπους ανταγωνιστών STING που καταλαμβάνουν τον θύλακα σύνδεσης 20 3 0 -cGAMP για να αναστέλλουν την ενεργοποίηση του 20 3 0 -cGAMP, υποδηλώνοντας ένα φαινόμενο διπλής όψης στον θύλακα σύνδεσης CDN [20 ,21].
Εδώ, δίνουμε μια νέα προοπτική. Προτείνουμε ότι η κάτω τσέπη όπου βρίσκονται τα DMXAA και CMA διευκολύνει την ανάπτυξη αναστολέων STING με βάση την εξόρυξη δεδομένων σε βάθος και τη σύγκριση των πληροφοριών της συνκρυσταλλικής δομής των αναγνωρισμένων πρωτεϊνών STING. Η προηγούμενη μελέτη μας ανέφερε μια σειρά αναλόγων CMA και DMXAA και εντόπισε ενώσεις 3 και 4 που συνδέονται με το hSTING αλλά με ασθενή κυτταρική ισχύ [23] (Εικόνα 2).
Εικόνα 2. Χημικές δομές των ενώσεων 3 και 4 με δεδομένα για τις βιολογικές τους δραστηριότητες. Οι τιμές EC50 των ενώσεων 1-4 μετρήθηκαν από κύτταρα αναφοράς STING και τα IC50 δέσμευσης μετρήθηκαν με κιτ ανταγωνισμού STING.
Σε αυτό το άρθρο, σχετικά με το σχεδιασμό των αναστολέων STING για την ανακάλυψη πιο ισχυρών συνδετικών παραγόντων με περισσότερες επαφές στην κάτω τσέπη, πραγματοποιήσαμε δομικές βελτιστοποιήσεις για το 3 και το 4, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη SAR βασισμένη σε αναλύσεις δέσμευσης ανταγωνισμού. Στην αξιολόγηση βιοδραστικότητας, οι ενώσεις 11 και 27 έδρασαν ως συνδετικά ευρέως φάσματος και εμφάνισαν μικρομοριακά επίπεδα ανασταλτικής δραστηριότητας STING σε πολλαπλά αναφερόμενα κύτταρα. Όσον αφορά τη δομή σύνδεσης, δύο μόρια ένωσης 11 διατηρούν το hSTING σε μια ανενεργή "ανοικτή" διαμόρφωση, αναστέλλοντας έτσι ανταγωνιστικά την ενδογενή σύνδεση 20 3 0 -cGAMP, η οποία είναι παρόμοια με την κρυσταλλική δομή του Merck-18 και τη δομή σύνδεσης του SN-011 [20,21].
2. Αποτελέσματα
2.1. Στρατηγική σχεδίασης παραγώγων DMXAA ως αναστολείς STING
2.1.1. Προσδιορισμός θέσεων σχεδιασμού για αναστολείς STING με σύγκριση διαφορετικών κρυσταλλικών δομών
Η απο-πρωτεΐνη του τομέα δέσμευσης συνδέτη STING (LBD) κρυσταλλώθηκε ως συμμετρικό διμερές στον μη συνδέτη, το οποίο αποδείχθηκε ότι δεν προκαλείται από τη διήθηση γέλης και την αναλυτική ανάλυση υπερφυγοκέντρησης [24-26]. Το διμερές STING υιοθετεί μια διαμόρφωση που μοιάζει με πεταλούδα με τη θέση δέσμευσης συνδέτη τοποθετημένη στη διεπιφάνεια μεταξύ των δύο μονομερών. Πρώτον, αυτό το άρθρο εξετάζει την υποδομή και τους μηχανισμούς ενεργοποίησης των πρωτεϊνών hSTING και mSTING, συγκρίνοντας τις διαφορές μεταξύ τους, καθώς και αποκαλύπτοντας μερικές ενδιαφέρουσες ιδέες. Για τη δομή apo, η φυσική διαμόρφωση και των δύο πρωτεϊνών δείχνει ότι το mSTING είναι πιο συγκεντρωμένο από το hSTING (Εικόνα 3). Shih et αϊ. χρησιμοποίησε προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής (MD) για να μελετήσει τις διαφορές μεταξύ hSTING και mSTING, δείχνοντας ότι το hSTING προτιμά μια ανοιχτή-ανενεργή διαμόρφωση και το mSTING προτιμά μια κλειστή-ενεργή διαμόρφωση ακόμη και χωρίς δεσμευμένο συνδέτη [27].
Όταν δεσμεύεται στο 20,30 -cGAMP, η διαμορφωτική μετάβαση του hSTING είναι από ανοιχτή (απο-πρωτεΐνη, πλευρική απόσταση ~57 Α) σε κλειστή (πρωτεΐνη δεσμευμένη σε cGAMP, πλευρική απόσταση ~40 Α), ενώ το αντίθετο ισχύει για mSTING (29 Å έως 40 Å). Η δομή του apo-hSTING διαφέρει δραματικά από εκείνη του apo-mSTING, αλλά οι δομές του STING που συμπλέκονται με 20,30 -cGAMP επικαλύπτονται. Τα DMXAA, CMA και cGAMP είναι αγωνιστές STING με διαφορετικά δομικά ικριώματα, αλλά οι διαμορφώσεις ενεργοποίησής τους κατά τη σύνδεση με τις πρωτεΐνες mSTING είναι επίσης ουσιαστικά οι ίδιες (Εικόνα 3). Τα σενάρια που περιγράφονται παραπάνω μαρτυρούν ότι οι μηχανισμοί διέγερσης του hSTING και του mSTING είναι εντυπωσιακά αποκλίνοντες. οι διαμορφώσεις που ενεργοποιούνται από το STING είναι, ωστόσο, σχετικά σταθερές, ανεξάρτητες από την επιλεκτικότητα των ειδών και τον τύπο της ραχοκοκαλιάς του αγωνιστή (ενώ περιορίζονται σε αγωνιστές STING που επιφέρουν διαμορφωτικές αλλαγές). Οι όγκοι θύλακα σύνδεσης των διαφορετικών κρυσταλλικών συμπλεγμάτων είναι γενικά συγκλίνοντες (~300 Α3, Πίνακας S1), κάτι που αποτελεί περαιτέρω απόδειξη της σταθερότητας της διαμόρφωσης ενεργοποίησης πρωτεΐνης STING.
Σχήμα 3. Σύγκριση κρυσταλλικών δομών STING που συνδέονται με apo και ένωση. Η πρωτεΐνη mSTING είναι το σιτάρι (δοκιμασμένο σε απόσταση με κόκκινη γραμμή), κωδικός PDB: 4KC0 (apo), 4LOJ (δεσμευμένο-cGAMP), 4LOL (δεσμευμένο-DMXAA) και 4JC5 (δεσμευμένο-CMA)
Δεύτερον, με βάση τα παραπάνω ευρήματα της διαμορφωτικής σταθερότητας ενεργοποίησης, υπερθέσαμε συν-κρυσταλλικές δομές των cGAMP, DMXAA, CMA, SR717 και MSA02, που είναι αγωνιστές STING κλειστής διαμόρφωσης, για να διερευνήσουμε τη θέση των διαφορετικών δομικών αγωνιστών στο Τοποθεσίες δέσμευσης πρωτεΐνης STING. Ο θύλακος πρωτεΐνης μπορεί να χωριστεί σε δύο περιοχές: την κάτω τσέπη και την επάνω τσέπη, ακολουθώντας την κατανομή των αγωνιστών STING στον θύλακα πρωτεΐνης (Εικόνα 4α). Εκτός από τους αγωνιστές mSTING DMXAA και CMA που βρίσκονται εξ ολοκλήρου στον κάτω θύλακα, οι άλλοι αγωνιστές θα μπορούσαν να ενεργοποιήσουν την οδό hSTING και να βρίσκονται στην άνω περιοχή. Στη συνέχεια χαρτογραφήσαμε τις αλληλεπιδράσεις των πέντε αγωνιστών STING με υπολείμματα αμινοξέων συνδεδεμένα με την πρωτεΐνη STING (εντός 5 Α του συνδέτη· Εικόνα S1), δείχνοντας ότι τα πρωτογενή αμινοξέα περιελάμβαναν R238, Y167, R232, S162, T263 και T267 (ο αριθμός ακολουθίας των αντίστοιχων υπολειμμάτων mSTING μείον ένα). Η αντιστοίχιση των υπολειμμάτων διαδοχικά με τις τσέπες έδειξε ότι τα T267, T263 και S162 βρίσκονται στην κάτω τσέπη. η επάνω τσέπη περιέχει R238, R232 και Y167 (Εικόνα 4β). Όπως αναφέρθηκε, τα R238, Y167 και R232 είναι απαραίτητα για τη δέσμευση αγωνιστών με το STING, ειδικά το R238 (η πρωτεΐνη mSTING αντιστοιχεί στο R237), η μετάλλαξη του οποίου θα οδηγούσε σε πλήρη απώλεια σταθεροποίησης (σύνδεση συνδέτη) [28-30]. Οι Che et al. αποκάλυψε επίσης ότι το υπόλειμμα κλειδιού R238 κυριαρχεί στη σύνδεση του DMXAA και οι σημειακές μεταλλάξεις (S162A/E260I) μπορούν να ενισχύσουν την αλληλεπίδραση του R238 με το DMXAA με προσομοιώσεις MD [31].
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
Κάντε κλικ εδώ για να δείτε τα προϊόντα Cistanche Enhance Immunity
【Ζητήστε περισσότερα】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Για να καταλάβει τον θύλακα πρωτεΐνης mSTING, το DMXAA ή το CMA υιοθέτησαν έναν μοναδικό τρόπο δέσμευσης στον οποίο δύο αγωνιστές μικρού μορίου συνδέονται σε ένα μόνο ομοδιμερές mSTING. Τα DMXAA στερεώνονται σταθερά στην κάτω τσέπη με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ της κετο ομάδας και της πλευρικής αλυσίδας T266 (το hSTING αντιστοιχεί στο 267), ενώ η καρβοξυλική ομάδα αλληλεπιδρά με τις πλευρικές αλυσίδες R237 και T262 (Εικόνα 5α). Η αλληλεπίδραση του DMXAA με το R237 (το μόνο βασικό αμινοξύ στην επάνω τσέπη) είναι κρίσιμη για τη δραστηριότητα του mSTING. Μια λεπτομέρεια που συχνά παραβλέπεται είναι ότι το DMXAA μπορεί να δράσει μόνο στο R237 συμμετρικών μονομερών πρωτεϊνών, για παράδειγμα, DMXAA (μόριο Α) που επηρεάζει το R237B (Εικόνα 5α). Επειδή το DMXAA βρίσκεται στο κάτω μέρος, η απόσταση μεταξύ του μορίου Α και του R237B είναι 3,06 Α, ενώ η απόσταση από το R237A είναι μεγαλύτερη από 5 Α (Εικόνα 5β). Επωφελούμενο από τον πιο συμπαγή θύλακα της πρωτεΐνης mSTING, το DMXAA αλληλεπιδρά αβίαστα με το R237 του συμμετρικού μονομερούς mSTING, αλλά δεν υπάρχει τρόπος για το DMXAA να συσχετιστεί με οποιοδήποτε από τα R238 στην διαμορφωτικά ανοιχτή πρωτεΐνη apo-hSTING (Εικόνα 3). Ως εκ τούτου, η θέση τσέπης του DMXAA μειώνει τη διέγερση της οδού hSTING. Πρόσφατα, η Merck, εμπνευσμένη από την αναλογία δέσμευσης 2:1 του DMXAA, ανακάλυψε ανταγωνιστές STING ικανούς να καταλαμβάνουν τον θύλακα σύνδεσης [21]. Το κρυσταλλικό σύμπλεγμα Merck 18 και πρωτεΐνης hSTING δείχνει ότι η ένωση βρίσκεται κυρίως κάτω από τον θύλακα πρωτεΐνης και αλληλεπιδρά με τα S162, T263 και T267, τα οποία ταιριάζουν όλα με τις ιδιότητες του DMXAA (Εικόνα 5γ). Από αυτό, δημιουργήθηκαν υποθέσεις: η επάνω τσέπη είναι μια εξαιρετική κοιλότητα για τον σχεδιασμό αγωνιστών STING. η κάτω τσέπη είναι μια πιο κατάλληλη φωλιά για αναστολείς και η δομή του DMXAA ή του CMA έχει βελτιστοποιηθεί ώστε να έχει τη δυνατότητα να γίνει ανταγωνιστής του STING.
Εικόνα 4. Υποδιαίρεση των θέσεων δέσμευσης STING και κατανομή με βασικά αμινοξέα. (α) Θέση δύο περιοχών στο μονομερές STING. Η κάτω τσέπη έχει χρώμα ματζέντα και η επάνω τσέπη είναι πράσινη. Οι κωδικοί PDB για τα επικαλυπτόμενα κρυσταλλικά σύμπλοκα είναι οι εξής: 4LOH (cGAMP, πράσινο), 6UKV (MSA-02, κίτρινο), 6XNP (SR717, πορτοκαλί), 4LOL (DMXAA, ματζέντα) και 4JC5 (CMA, μωβ). (β) Κατανομές βασικών αμινοξέων στην άνω και κάτω περιοχή. Τα υπολείμματα στην κάτω τσέπη εμφανίζονται με ματζέντα και τα πράσινα στην επάνω περιοχή.
Σχήμα 5. Κρυσταλλικά σύμπλοκα DMXAA και Merck 18. (α) Διαμοριακές επαφές στο σύμπλοκο DMXAA και mSTING. Το δεσμευμένο DMXAA εμφανίζεται σε γκρι χρώμα, με μεμονωμένες υπομονάδες STING στο συμμετρικό διμερές να εμφανίζονται με πράσινο και μωβ. Οι εκθέτες Α και Β υποδεικνύουν μονομερή πρωτεΐνης ή ταυτότητα μεμονωμένου συνδέτη. (β) Αποστάσεις μεταξύ των βασικών υπολειμμάτων R237A και R237B, αντίστοιχα, και DMXAA (μόριο Α). Το R237A στο καρβοξύλιο του DMXAA είναι 6,02 Α, το R237B στο καρβοξυλικό του DMXAA είναι 3,06 Α. (γ) Κρυσταλλική δομή του Merck 18 που συνδέεται με την πρωτεΐνη hSTING (PDB 6MXE) και λεπτομέρειες των διαμοριακών επαφών της. Ο δεσμευμένος συνδετήρας εμφανίζεται με γκρι χρώμα, με μεμονωμένες υπομονάδες STING στο συμμετρικό διμερές να εμφανίζονται με πράσινο και μωβ. Οι εκθέτες Α και Β υποδεικνύουν μονομερή πρωτεΐνης ή ταυτότητα μεμονωμένου συνδέτη
Εικόνα 6. Βάση έρευνας και τα βελτιστοποιημένα hotspot μας για παράγωγα DMXAA και CMA. (α) Υπέρθεση της δομής του DMXAA δεσμευμένο στο mSTING (PDB: 4LOL, που εμφανίζεται ως σκούρο μπλε) με τη δομή του DMXAA συνδεδεμένο στο hSTING S162A/G230I/Q266I (PDB: 4QXR, εμφανίζεται ως πορτοκαλί). (β) Λεπτομέρειες του DMXAA συνδεδεμένου με μεταλλαγμένο hSTING (PDB: 4QXR). Τα πλαίσια με διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύουν τις πιθανές τοποθεσίες τροποποίησης. Τα υπολείμματα αμινοξέων που φαίνονται με πράσινο χρώμα είναι μεταλλαγμένα υπολείμματα (S162A/Q266I).
Βρήκαμε ότι η αδυναμία του DMXAA να ενεργοποιήσει το μονοπάτι φιλοξενίας σχετιζόταν με τη θέση του DMXAA στην κάτω τσέπη (σύμφωνα με την ενότητα 2.1.1), η οποία μας παρείχε επίσης την ιδέα σχεδιασμού των αναστολέων STING: αύξηση των επαφών των παραγώγων DMXAA με την κάτω περιοχή μέσω δομικών τροποποιήσεων για να διατηρηθεί το STING σε μη ενεργοποιημένη διαμόρφωση. Τα S162 και Q266 βρίσκονται κατάλληλα στον πυθμένα της θέσης δέσμευσης, έτσι τα DMXAAs μπορούν να τοποθετηθούν καλά σε άμεση επαφή και με τα δύο, διευκολύνοντας την εξερεύνηση της επίδρασης των αμινοξέων του κάτω θύλακα στους συνδέτες. Η ανάλυση των σχέσεων δομής-δραστηριότητας (SARs) αποκάλυψε ότι το τμήμα 5,6-διμεθυλίου και η μεθοξυ θέση C7- ήταν κρίσιμα για τη βιολογική δραστηριότητα των 3 και 4. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6β, το 5 ,6-ομάδα διμεθυλίου δημιούργησε υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με πολλαπλά αμινοξέα στην κάτω τσέπη. Λόγω της εγγύτητας της θέσης C7 του DMXAA με το αμινοξύ Q266, η αντίστοιχη τροποποίηση μεθόξυ επέτρεψε στα 3 και 4 να συνδεθούν με τη φιλοξενία. Επομένως, οι δομικές μας επεξεργασίες προϋποθέτουν το κλείδωμα του 5,6-διμεθυλίου και του C7 μεθοξυ και ο σχεδιασμός νέων παραγώγων επικεντρώθηκε στην τροποποίηση της πολικής ομάδας στη θέση C1/C2 (που επηρεάζει το S162) και στην αλλαγή της ομάδας καρβοξυλικού οξέος ( επέκταση της δομικής ποικιλομορφίας). Σχεδιάσαμε και συνθέσαμε μια σειρά παραγώγων χρησιμοποιώντας τις ενώσεις 3 και 4 ως ικριώματα, επικυρώνοντας έτσι την προτεινόμενη εικασία αναστολέα.
2.2. Χημεία
Η παρασκευή όλων των ενδιάμεσων και στοχευόμενων ενώσεων περιγράφεται στο Σχήμα 1. 1-μεθοξυ-2,3-διμεθυλ-4-νιτροβενζόλιο (5) και 2-βρωμοβενζοϊκό οξύ ( 7) ήταν εμπορικά διαθέσιμα. Αρχικά, το 1-μεθοξυ-2,{3-διμεθυλ-4-νιτροβενζόλιο μετατράπηκε σε 4-μεθοξυ- 2,3-διμεθυλανιλίνη (6) μέσω αναγωγής με σκόνη σιδήρου. Στη συνέχεια, τα 6 και 7 υποβλήθηκαν σε αντίδραση Ullmann με ανθρακικό κάλιο με κατάλυση με χαλκό και οξείδιο χαλκού (Ι) σε Ν, Ν-διμεθυλοφορμαμίδιο για να δώσουν το αντίστοιχο ενδιάμεσο 8. Η αντίδραση ενδομοριακής συμπύκνωσης του 8 πραγματοποιήθηκε με το αντιδραστήριο Eaton για να δώσει το ενδιάμεσο 2-μεθοξυ-3,4-διμεθυλακριδίνη-9(10Η)-όνη (9). Η επακόλουθη αντικατάσταση του 9 πραγματοποιήθηκε με βρωμοοξικό αιθυλεστέρα και η απώλεια 1 ισοδύναμου HBr έδωσε αιθυλ 2-(2-μεθοξυ-3,4-διμεθυλ-9- οξοακριδίνη-10(9Η)-υλ)οξική (10). Τελικά, ο οξικός αιθυλεστέρας στο 10 υδρολύθηκε σε καρβοξυλικό οξύ με υδροξείδιο του νατρίου δίνοντας 2-(2-μεθοξυ-3,4- διμεθυλ-9-οξοακριδίνη-10 (9Η)-υλ)οξικό οξύ (11).
Σχήμα 1. α. EtOH, Fe, NH4Cl; σι. DMF, Cu, Cu2O, K2CO3; ντο. Αντιδραστήριο Eaton; ρε. BrCH2COOC2H5, NaH; μι. NaOH; φά. CCl3CH(OH)2, NH2OH; σολ. H2SO4; η. EtOH, H2O2, NaOH.
Για την επακόλουθη σύνθεση περισσότερων ενώσεων-στόχων, πρέπει πρώτα να συνθέσουμε την ένωση 2-αμινο-5-μεθοξυ-3,4-διμεθυλβενζοϊκό οξύ (14). 6 αντέδρασε με ένυδρη χλωράλη και υδροξυλαμίνη, σχηματίζοντας ακεταμίδιο και υδροξυαμινο, με το ενδιάμεσο (Ε)-2-(υδροξυλαμίνη)-Ν-(4-μεθοξυ-2,3-διμεθυλφαινυλ )ακεταμίδιο (12). Η επακόλουθη αντίδραση αναδιάταξης Beckmann του υδροξυαμινο του 12 διεξήχθη με θειικό οξύ για να δώσει το παράγωγο λακτάμης 13. Τέλος, το ενδιάμεσο 13 υδρολύθηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου και υδροξείδιο του νατρίου σε διάλυμα αιθανόλης δίνοντας το 14. Χρησιμοποιώντας το 14 ως το υλικό έναρξης της αντίδρασης συνέθεσε περαιτέρω μια σειρά από 8-μεθοξυ-9,{10-διμεθυλ-6Hpyrrolo[3,2,1-de]acridine-1,6( Παράγωγα 2Η)-διόνης με υποκαταστάτες στα R1 και R2. Αρχικά, τα 14 και 15-19 υποβλήθηκαν σε αντίδραση Ullmann με ανθρακικό κάλιο με κατάλυση από χαλκό και οξείδιο χαλκού(Ι) σε Ν, Ν-διμεθυλοφορμαμίδιο για να δώσουν τα αντίστοιχα ενδιάμεσα 20-24. Οι αντιδράσεις ενδομοριακής συμπύκνωσης 20-24 πραγματοποιήθηκαν με το αντιδραστήριο Eaton για να δώσουν 8-μεθοξυ-9,10-διμεθυλ-6Η-πυρρόλο[3,2,{{46} }δε]ακριδίνη-1,6(2Η)-παράγωγα διόνης (25-29). Ομοίως, χρησιμοποιώντας το 14 ως υλικό έναρξης για την αντίδραση, συνθέσαμε περαιτέρω μια σειρά από 7-μεθοξυ{-5,6-διμεθυλ-9-οξο-9,{{ Παράγωγα 59}}διυδροακριδίνης-4- καρβοξυλικού οξέος με υποκαταστάτες στο R. Αρχικά, τα 14 και 7 ή 30 υποβλήθηκαν σε αντίδραση Ullmann με ανθρακικό κάλιο με κατάλυση από χαλκό και οξείδιο χαλκού(Ι) σε Ν, Ν-διμεθυλοφορμαμίδιο τα αντίστοιχα ενδιάμεσα 31 και 32. Οι αντιδράσεις ενδομοριακής συμπύκνωσης των 31 και 32 πραγματοποιήθηκαν με το αντιδραστήριο Eaton για να δώσουν 7-μεθοξυ-5,{6-διμεθυλ-9-οξο-9 παράγωγα10-διυδροακριδίνης-4-καρβοξυλικού οξέος (33,34). Έτσι, σχεδιάσαμε, συνθέσαμε και εξετάσαμε 16 ανάλογα ακριδόνης, των οποίων οι δομές συνοψίζονται στον Πίνακα 1.
Πίνακας 1. Δομές των νέων αναλόγων της παρούσας μελέτης.
2.3. Δυνατότητες δέσμευσης νέων ενώσεων στο STING και τα SAR τους
Δυνατότητες δέσμευσης νέων ενώσεων στο STING και τα SAR τους Για να επιβεβαιώσουμε άμεσα την αποτελεσματικότητα της δομικής τροποποίησης, εξετάσαμε πρώτα όλες τις συντιθέμενες ενώσεις με προσδιορισμούς εκτόπισης cGAMP. Εκτός από την επιλεκτικότητα των ειδών, υπάρχουν πέντε παραλλαγές του STING που είναι πολυμορφικές στον άνθρωπο, R232 (WT, 58% του πληθυσμού), HAQ (20%), H232 (13%), AQ (7%) και Q ( 2%) [32]. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε τα κιτ δοκιμασίας εμπορικού ανταγωνισμού με τεχνολογία ομοιογενούς φθορισμού με ανάλυση χρόνου (HTRF) για να δοκιμάσουμε τη βιοχημική ισχύ νέων ενώσεων στο mSTING και σε διάφορες ισομορφές hSTING (WT, H232 και AQ) και τις συγκρίνουμε με τον έλεγχο. Όπως αναμενόταν, οι ενώσεις ελέγχου 1-4 δεσμεύτηκαν όλες στο mSTING. από την οθόνη hSTING, οι ενώσεις 3 και 4 είχαν τιμές IC50 σε μικρομοριακό επίπεδο.
Πίνακας 2. Τα αποτελέσματα των ενώσεων με διάφορες ισόμορφες hSTING και δοκιμασίες ανταγωνισμού mSTING.
Πρώτον, με βάση την ένωση 3, ένα άτομο αλογόνου ή μεθοξυ ομάδα εισήχθη στη θέση C1/C2 (Πίνακας 1). Η ένωση 27, ως το βέλτιστο παράγωγο της ένωσης 3 (θέση C1 υποκατεστημένη με F), έχει καλύτερη συνολική δραστικότητα από την ένωση 3 (μονοψήφια μικρομοριακή δραστικότητα σε όλες τις βιοχημικές δοκιμασίες, Πίνακας 2). Η τροποποιημένη ένωση 25 με R{10}}έχει δεσμευτική επίδραση ευρέος φάσματος αλλά δεν είναι τόσο ενεργή όσο η F-υποκατεστημένη ή μη υποκατεστημένη έκδοση. Σε σύγκριση με την ένωση 3, οι ενώσεις (26, 28 και 29) με την ομάδα εισαγόμενης θέσης C2-εμφάνισαν όλες διαφορετικούς βαθμούς μείωσης στη συγγένεια δέσμευσης, ειδικά την ένωση 29. Δεύτερον, διατήρηση της ραχοκοκαλιάς της ένωσης 4 και αντικατάσταση το άτομο αλογόνου έναντι της θέσης C1/C2, λάβαμε τις ενώσεις 35–38 (Πίνακας 1). Αυτές οι ενώσεις ήταν ανενεργές και στις τέσσερις δοκιμές μετατόπισης σε συγκεντρώσεις έως 100 μΜ, αποδεικνύοντας ότι η υποκατάσταση με ένα άτομο αλογόνου στη θέση C1/C2 δεν είναι ανεκτή. Στη συνέχεια, μετατρέψαμε την οξική ομάδα της ένωσης 4 σε καρβοξυλομάδα (33) και εισαγάγαμε μεθοξυ στη θέση C2 (34). Δυστυχώς, αυτή η αλλαγή ήταν αποτυχία αφού και οι δύο ενώσεις παρέμειναν ανενεργές. Μαθαίνοντας από την αποτυχία μας, διερευνήσαμε περαιτέρω τα SAR των παραγώγων της ένωσης 4 μετατοπίζοντας την οξεική ομάδα στη θέση Ν και αφήνοντας τις θέσεις C1/C2 μη τροποποιημένες. Η ένωση 11 δείχνει δέσμευση σε ένα ευρύ φάσμα παραλλαγών STING, όλες με IC50 κάτω από 20 μΜ. η δραστικότητα είναι ανώτερη από την ένωση 4 και συγκρίσιμη με την ένωση 27. Επιπλέον, η ένωση 9 (χωρίς καρβοξυλομάδα στη θέση Ν) και η ένωση 10 (Ν-οξικός αιθυλεστέρας) είναι συνθετικοί πρόδρομοι της ένωσης 11 που δεν μπορούν να συνδεθούν με το STING, έμμεσα αποδεικνύοντας τη σημασία της ομάδας καρβοξυλικού οξέος.
2.4. Κυτταρική Βιολογική Αξιολόγηση
2.4.1. In Vitro Έλεγχος Νέων Αναλόγων με Δραστηριότητες Αγωνιστών STING
Ελέγξαμε συστηματικά όλες τις ενώσεις για δράση αγωνιστή STING χρησιμοποιώντας τις κυτταρικές σειρές αναφοράς 293T hSTING-WT, 293T-mSTING και THP1-KO-STING (που παρέχονται από την Invivo Gen). Χρησιμοποιώντας κύτταρα 293T-hSTING-R232 και κύτταρα 293T-mSTING, δείξαμε την ενεργοποίηση της οδού IRF ως έμμεση μέτρηση της επαγωγής IFN τύπου Ι, παρακολουθώντας τη δραστηριότητα της εκκριτικής εμβρυονικής αλκαλικής φωσφατάσης (SEAP), συμβάλλοντας στη μελέτη μας για την επιλεκτικότητα των ειδών. ενώσεις. Τα κύτταρα THP1-KO-STING δημιουργήθηκαν από THP1-Διπλά κύτταρα με σταθερό νοκ-άουτ του γονιδίου STING και χρησιμοποιήσαμε κύτταρα THP1-KO-STING για να επιβεβαιώσουμε εάν η ένωση εμφανίζει τη λειτουργία εξαρτώμενης από STING επαγωγής κυτοκίνης. Συγκρίναμε τις δραστηριότητες του αγωνιστή STING όλων των στοχευμένων παραγώγων με εκείνες των αγωνιστών αναφοράς για STING ποντικού (DMXAA) και ανθρώπου (20,30 -cGAMP). Παραδόξως, καμία από τις συντιθέμενες ενώσεις δεν μπορούσε να ενεργοποιήσει ούτε τις οδούς hSTING ούτε mSTING (μέγιστη συγκέντρωση στα 200 μΜ), κάτι που είναι σοβαρά ασυνεπές με τα αποτελέσματα των δοκιμασιών δέσμευσης. Επομένως, οι δεσμευτικοί μας παράγοντες STING μπορεί να έχουν πιθανά πρότυπα δέσμευσης ως νέους ανταγωνιστές STING.
2.4.2. Έλεγχος in vitro των συνδετικών ουσιών STING με Δραστηριότητες αναστολέων STING
Αρχικά, κάναμε προ-πειράματα: με τον 1 μΜ ομοιοπολικό αναστολέα H151 ως θετική αναφορά, διερευνήσαμε τα ανασταλτικά του επίπεδα σε κυτταρικές σειρές αναφοράς mSTING και hSTING που συγκαλλιεργήθηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις 20 3 0 -cGAMP για να προσδιορίσουμε τις βέλτιστες συνθήκες για τον έλεγχο του αναστολέα (βλ. Ενότητα 4.2.3 για λεπτομέρειες πρωτοκόλλου). Δεύτερον, αρχικά εξετάσαμε την ανασταλτική ισχύ των νέων ενώσεων με επεξεργασία με τις προ-πειραματικές μεθόδους σε συγκέντρωση 100 μΜ. Βρήκαμε ότι οι ενώσεις ευρέως φάσματος δέσμευσης STING 11 και 27 εμφάνισαν εξαιρετική αναστολή τόσο σε κύτταρα αναφοράς STING ποντικού όσο και σε ανθρώπινα, με τις ενώσεις 3 και 4 και τις άλλες ενώσεις να μην είναι τόσο αποτελεσματικές. Τρίτον, ορίσαμε διαβαθμίσεις συγκέντρωσης για τις ενώσεις 11 και 27 για να δοκιμάσουμε και τις δύο τιμές IC50 και να τις συγκρίνουμε με το H151. Οι ενώσεις 11 και 27 ήταν δραστικές σε μικρογραμμομοριακές συγκεντρώσεις αναστέλλοντας την έκφραση της IFN-επαγόμενης από 20 3 0 -cGAMP και στις δύο οδούς hSTING και mSTING.
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
Με τιμές IC50, η ένωση 11 (hSTING 19,93 μΜ και mSTING 15,47 μΜ) ξεπέρασε την ένωση 27 (hSTING 38,75 μΜ και mSTING 30,81 μΜ) (Εικόνα 7α). Συγκριτικά, οι τιμές IC50 του Η-151 στα κύτταρα 293T-hSTING και 293T-mSTING ήταν 1,04 και 0,82 μΜ (Εικόνα 7α), υποδεικνύοντας ότι ο ομοιοπολικός αναστολέας Η-151 παρουσιάζει καλύτερη ανασταλτική επίδραση στο STING -εξαρτώμενη σηματοδότηση σε κυτταρικές αναλύσεις. Για να επιβεβαιώσουμε περαιτέρω την ανασταλτική ιδιότητα των ενώσεων 11 και 27, χρησιμοποιήσαμε μια άλλη THP-1 κυτταρική σειρά αναφοράς ανθρώπινων μονοκυττάρων THP1-Dual-hSTING-R232, η οποία χρησιμοποιεί ένα σύστημα διπλής αναφοράς για να αναφέρει την ενεργοποίηση IRF ως έμμεσο μέτρο επαγωγής IFN τύπου Ι και ενεργοποίηση NF-κΒ ως έμμεσο μέτρο επαγωγής προφλεγμονώδους κυτοκίνης. Μετά τη διέγερση της κυτταρικής γραμμής αναφοράς THP-1 με 20,30 -cGAMP, προσθέσαμε αναστολείς STING με κατάλληλες συγκεντρώσεις για την αναστολή των επαγωγών της I IFN και της προφλεγμονώδους κυτοκίνης. Όπως αναμενόταν, οι ενώσεις 11, 27 και Η151 ανέστειλαν σημαντικά τις ενεργοποιημένες από το STING ενεργοποιήσεις της οδού IRF και NF-κB (Εικόνα 7β). Επιπλέον, για να αποκλειστεί η επίδραση της κυτταροτοξικότητας των ενώσεων στην ανασταλτική δράση, χρησιμοποιήσαμε το κιτ CellTiter-Glo για να προσδιορίσουμε την κυτταρική δραστηριότητα. Με ευχαρίστηση, οι ενώσεις 11 και 27 δεν έδειξαν στοιχεία κυτταροτοξικότητας σε κύτταρα 293T και THP-1 με δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας όταν προστέθηκαν σε συγκεντρώσεις (5 έως 100 μΜ) που αναστέλλουν το STING, σε αντίθεση με το Η151, το οποίο ήδη έδειξε σημαντική κυτταροτοξικότητα σε 10 μΜ (Εικόνα 7γ). Αυτές οι μελέτες αναγνώρισαν τις ενώσεις 11 και 27 ως μέτριους αναστολείς STING, διασπώντας την ευαισθησία των ειδών και αναστέλλοντας τις διπλές οδούς IRF και NF-κB χωρίς εμφανή κυτταροτοξικότητα.
2.5. Η δομική βάση της δραστηριότητας της ένωσης 11 διερευνήθηκε από το Docking
Ο μηχανισμός των ανταγωνιστικών ανταγωνιστών STING είναι να καταλαμβάνουν τη θέση δέσμευσης και να διαταράσσουν τη διαμόρφωση ενεργοποίησης της πρωτεΐνης STING [20,21]. Ειδικά για το hSTING, οι ανταγωνιστές αφήνουν το διμερές hSTING σε "ανοικτή" διαμόρφωση. Χρησιμοποιήσαμε τη σύνδεση Glide για να προσδιορίσουμε την αλληλεπίδραση μεταξύ του ανθρώπινου STING CTD (PDB ID κωδικός 6MXE) και της καλύτερης δραστικής ένωσης 11. Στη δομή σύνδεσης, οι δύο ενώσεις 11 είναι εν μέρει παράλληλες μεταξύ τους και βρίσκονται στο κάτω μέρος της σχισμής του το διμερές hSTING (Εικόνα 8α), κλειδώνοντας το hSTING σε μια ανενεργή ανοικτή διαμόρφωση (Εικόνα S2). Η ένωση 11 παράγει κυρίως υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, με την τρικυκλική δομή του συνδετήρα να επιτρέπει μεγαλύτερη επαφή με τη διεπαφή στον κάτω θύλακα. Όπως και με το DMXAA ή το CMA, η καρβοξυλική ομάδα σχηματίζει δεσμό υδρογόνου με την πλευρική αλυσίδα του Τ263, ενώ η κετο ομάδα σχηματίζει δεσμό υδρογόνου με την πλευρική αλυσίδα του Τ267. Το μεθοξυ στη θέση C2 αλληλεπιδρά στενά με το S162, με αποτέλεσμα τη γειτνίαση συνδέτη-προσδέματος μεταξύ τους. Οι υποκαταστάτες δις-μεθυλίου όχι μόνο δημιουργούν αλληλεπιδράσεις συνδέτη-προσδέματος, αλλά βρίσκονται επίσης βολικά στην είσοδο του άνω θύλακα, γεγονός που εμποδίζει τη σύνδεση των φυσικών αγωνιστών STING σε υπολείμματα κλειδιά (Εικόνα 8β).
Σχήμα 7. Τα συνδετικά STING ευρέως φάσματος 11 και 27 είναι ανταγωνιστές STING. (α) Χημικές δομές των ενώσεων 11 και 27 και η ανασταλτική δράση των αναστολέων STING έναντι των μονοπατιών m- και h- STING. 293Τ κύτταρα (mSTING ή hSTING), προεπεξεργασμένα με διαφορετικές συγκεντρώσεις ενώσεων διεγέρθηκαν με 20,30 -cGAMP. Η αναστολή της δραστηριότητας της οδού IRF μετρήθηκε έμμεσα με τιμές οπτικής πυκνότητας (OD). Η δοσοεξαρτώμενη ανασταλτική καμπύλη προσαρμόστηκε για τον υπολογισμό των IC50 των ενώσεων. (β) Οι ενώσεις 11 και 27 μπορούν να αναστείλουν την ενεργοποίηση διπλών οδών hSTING. Οι κυτταρικές σειρές αναφοράς THP1-hSTING-R232 διεγέρθηκαν με 20,{30 -cGAMP και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις ενώσεις, αναστέλλοντας την επαγωγή IFN (αξιολόγηση της δραστηριότητας από τις σχετικές μονάδες φωτός (RLU) της Lucia luciferase ) και επαγωγή προφλεγμονώδους κυτοκίνης (παρακολούθηση της δραστηριότητας του SEAP που μετράται με τιμές OD). (γ) Τα νέα ανάλογα παρουσιάζουν χαμηλή κυτταροτοξικότητα σε σύγκριση με τον ομοιοπολικό αναστολέα. 293Τ (ή THP-1 κύτταρα) επωάστηκαν με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση αναστολέων για τις υποδεικνυόμενες χρονικές περιόδους. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με κιτ CellTiter-Glo. Τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι ο μέσος όρος από τρία ανεξάρτητα πειράματα. NS (χωρίς σημαντική) p > 0,05, *** p < 0,001. Οι τιμές p υπολογίστηκαν με ένα τεστ t δύο ουρών.
Σχήμα 8. Δομή σύνδεσης της ένωσης 11 που συνδέεται με πρωτεΐνη STING. (α) Τρόπος δέσμευσης της ένωσης 11. Ο δεσμευμένος συνδετήρας παρουσιάζεται σε γκρι χρώμα, με μεμονωμένες υπομονάδες STING στο συμμετρικό διμερές να εμφανίζονται με πράσινο και μοβ. Στις τσέπες δεσίματος του μονομερούς STING, το κάτω μέρος είναι χρωματισμένο ματζέντα και το πάνω μέρος είναι πράσινο. (β) Οι διαμοριακές επαφές της ένωσης 11 συνδέονται με STING. Η ένωση 11 και τα αμινοξέα STING που ήρθαν σε επαφή παρουσιάζονται ως μοντέλο ραβδιού. Οι διαμοριακές επαφές και οι δεσμοί υδρογόνου φαίνονται με κίτρινη διακεκομμένη γραμμή. Οι εκθέτες Α και Β υποδεικνύουν μονομερή πρωτεΐνης ή ταυτότητα μεμονωμένου συνδέτη.
3. Συζήτηση
Υπό το φως των εκτενών αναφορών για τον μηχανισμό και τη κρυσταλλική δομή του STING, έχουμε την ευκαιρία να εξηγήσουμε το επιστημονικό πρόβλημα του γιατί το DMXAA δεν διαθέτει ανθρώπινη αγωνιστική δράση STING. Σε αυτή τη μελέτη, συγκρίνοντας διάφορες κρυσταλλικές δομές STING, λάβαμε μερικά ενδιαφέροντα ευρήματα: 1. Η διαμόρφωση ενεργοποίησης STING είναι σταθερή. 2. Υπάρχουν διαφορετικοί μηχανισμοί ενεργοποίησης για hSTING και mSTING. 3. Τα DMXAA και CMA βρίσκονται στο κάτω μέρος της θέσης δέσμευσης που τα διακρίνει από άλλους αγωνιστές. Δεδομένων των διαφορετικών μηχανισμών ενεργοποίησης του mSTING και του hSTING, οι αγωνιστές mSTING DMXAA ή CMA που βρίσκονται στον κάτω θύλακα δεν μπορούν να ασκήσουν ενεργοποίηση στο hSTING επειδή το apo-hSTING έχει μεγαλύτερη κοιλότητα δέσμευσης που εμποδίζει το πρόσδεμα να συσχετιστεί με το R238.
Οι Gao et al. ανέφερε ότι οι απλές μεταλλάξεις (G230I, S162A και Q266I) προσδίδουν στο hSTING την ίδια ευαισθησία DMXAA με το mSTING [33]. Οι προσομοιώσεις MD αποκάλυψαν ότι η πλευρική αλυσίδα της μετάλλαξης της περιοχής βλεφάρου G230I είναι επαρκής για να σχηματίσει ένα στερικό φράγμα για να αποτρέψει την απέκκριση του DMXAA, ενώ το DMXAA εξέρχεται εύκολα στο hSTING WT [27]. Με βάση τη δομική τροποποίηση που αντιστοιχεί σε μεταλλάξεις σημείου hSTING (S162A/Q266I) στη θέση δέσμευσης, σημαντικά ανάλογα DMXAA και CMA ήταν διαθέσιμα αλλά δεν υπάρχουν ισχυροί αγωνιστές hSTING. Ο λόγος πίσω από αυτό μπορεί να είναι ότι η λεπτή δομική ασυμφωνία μεταξύ "φυσικών" και "μεταλλαγμένων" hSTING μπορεί να διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο στη διαδικασία αναγνώρισης. Μέσω προσομοιώσεων MD, οι Che et al. διαπιστώθηκε ότι τα αφύσικα μεταλλαγμένα hSTING διαταράσσουν τις συντονισμένες κινήσεις των μορίων του νερού και αλλάζουν την ποσότητα του νερού που αποβάλλεται κατά τη δέσμευση του συνδέτη, κάτι που είναι πιο ευνοϊκό για την αποκατάσταση της ενεργοποίησης DMXAA του hSTING [31].
Ενθαρρυμένοι από την ανακάλυψη της μελέτης των αναστολέων STING στην κάτω θέση δέσμευσης [21], τολμούμε να οραματιστούμε ότι το DMXAA, που βρίσκεται στην ίδια περιοχή, έχει τη δυνατότητα να μετατραπεί σε νέους αναστολείς STING. Σε μια προηγούμενη μελέτη, συντήξαμε τις δομές των DMXAA και CMA με λεπτές δομικές τροποποιήσεις και ανακαλύψαμε επιτυχώς το 3 και το 4 που θα μπορούσαν να συνδεθούν με το hSTING, αλλά η ασθενής αγωνιστική δράση STING δεν ταιριάζει με τη δεσμευτική τους ισχύ. Σε αυτό το έγγραφο, η ιδέα του σχεδιασμού είναι να βελτιωθούν περαιτέρω οι επαφές των αναλόγων DMXAA με την κάτω τσέπη για να αντισταθούν ανταγωνιστικά στη δέσμευση του 20,30 -cGAMP, έτσι σχεδιάσαμε και συνθέσαμε βελτιστοποιημένες δομές των ενώσεων 3 και 4.
cistanche tubulosa-βελτίωση του ανοσοποιητικού συστήματος
Το πρώτο βήμα διαλογής ήταν να δοκιμαστεί η βιοχημική δραστηριότητα χρησιμοποιώντας τα κιτ δέσμευσης πολλαπλών παραλλαγών STING για να χαρακτηριστεί η δεσμευτική ισχύς των νέων παραγώγων. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων δέσμευσης απέδειξαν την ορθότητα των κατευθύνσεων σχεδιασμού μας. αναγνωρίσαμε τα 11 και 27 ως συνδετικά STING ευρέως φάσματος (ανώτερα από τα 3 και 4) και συζητήσαμε για τους SAR. Για τα ανάλογα της ένωσης 3, οι τροποποιήσεις στη θέση C1 βελτίωσαν σημαντικά τη σύνδεση σε διάφορες παραλλαγές STING, ενώ οι τροποποιημένες με C2-ενώσεις δεν είχαν κανένα αποτέλεσμα. Ωστόσο, η ένωση 4 δεν ήταν καλά ανεκτή για δομικές τροποποιήσεις στο C1/C2. Μετά την επανατοποθέτηση της θέσης καρβοξυλικού οξέος (C4 σε Ν), βρήκαμε το καλύτερο συνδετικό STING 11 και προσδιορίσαμε ότι η ομάδα καρβοξυλικού οξέος ήταν απαραίτητη για τη δραστηριότητα. Στη συνέχεια, εξετάσαμε όλες τις ενώσεις για δραστηριότητα σε κυτταρικό επίπεδο χρησιμοποιώντας τρεις κυτταρικές σειρές αναφοράς και καμία από τις ενώσεις-στόχους δεν ήταν ενεργή. Στη συνέχεια, δημιουργήσαμε μια μέθοδο διαλογής για τους αναστολείς STING και εξετάσαμε εκ νέου όλα τα νέα ανάλογα. Οι παράγοντες δέσμευσης STING 11 και 27 εμφάνισαν μικρομοριακές ανασταλτικές δραστηριότητες, με δεδομένα συγκρίσιμα με τον προσδιορισμό ανταγωνιστικής δέσμευσης. Ο ομοιοπολικός αναστολέας H151 έδειξε ελαφρώς καλύτερη ανασταλτική δράση STING από το 11 και το 27 in vitro. Επιπλέον, επικυρώσαμε περαιτέρω ότι τα 11 και 27 μπορούν να αναστείλουν αποτελεσματικά την επαγόμενη από 2030 -cGAMP ενεργοποίηση των διπλών οδών STING. Το πιο εντυπωσιακό είναι ότι οι 11 και 27 διατηρούν υψηλό επίπεδο βιωσιμότητας κυττάρων σε υψηλές συγκεντρώσεις, κάτι που δεν είναι δυνατό με το H151. Η κυτταροτοξικότητα είναι ένα κοινό πρόβλημα με τους ομοιοπολικούς αναστολείς και περιορίζει την εφαρμογή του H151.
Με την ανάλυση σύνδεσης, αποκτήσαμε μια εικόνα για τη δομική βάση της δραστηριότητας της καλύτερης δραστικής ένωσης 11. Η ένωση 11 καταλαμβάνει τέλεια την κάτω τσέπη, κρατώντας το hSTING σε μια ανενεργή ανοιχτή διαμόρφωση και επομένως αναστέλλοντας ανταγωνιστικά τη σύνδεση 20,30 -cGAMP. Η δομή του τρικυκλικού δακτυλίου της ακριδίνης είναι το κλειδί για τη δημιουργία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, με την ομάδα καρβοξυλικού οξέος και το τμήμα κετόνης να αγκυρώνουν την ένωση στο κάτω μέρος του θύλακα. Υποθέτουμε ότι το μεθοξυ παράγει στενούς συσχετισμούς με το S162, τραβώντας την πρωτεϊνική διαμόρφωση κλειστή οριακά αλλά όχι αρκετά για να τη μετατρέψει σε αγωνιστική διαμόρφωση. Η δομή δις-μεθυλίου δημιουργεί έναν χωρικό αποκλεισμό θέσης που ενισχύει τις αλληλεπιδράσεις συνδέτη-προσδέματος και μειώνει την είσοδο του αγωνιστή στην επάνω τσέπη. Επί του παρόντος, δεν έχουν αναφερθεί συν-κρυσταλλικές δομές ανταγωνιστών mSTING και STING, επομένως δεν μπορούμε να εξηγήσουμε τον μηχανισμό δράσης της ένωσης 11 με το mSTING χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση σύνδεσης. Ωστόσο, εικάζουμε ότι υπάρχουν δύο πιθανότητες: η μία είναι ότι η αρχή της δράσης είναι πανομοιότυπη με αυτή του hSTING. Το άλλο είναι ότι η ένωση 11 διατηρεί το mSTING σε μια πιο συγκεντρωτική διαμόρφωση apo και το 20,30 -cGAMP δεν μπορεί να εισέλθει στον θύλακα για να ασκήσει το αγωνιστικό αποτέλεσμα. Συνοψίζοντας, οι ανεπαίσθητες δομικές βελτιστοποιήσεις των ασθενέστερων αγωνιστών STING έχουν αντιστρέψει με επιτυχία τη βιολογική λειτουργία για την ανακάλυψη αναστολέων STING. Αυτά τα ευρήματα απεικονίζουν την πολυπλοκότητα των θυλάκων σύνδεσης STING και παρέχουν νέες ερευνητικές γνώσεις για την ανάπτυξη φαρμάκων αγωνιστών ή αναστολέων STING.
4. Υλικά και Μέθοδοι
4.1. Χημεία
Οι διαλύτες και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στη σύνθεση ελήφθησαν από την Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Πεκίνο, Κίνα). Οι δομές των προϊόντων ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπία 1Η και 13C-NMR (JNM-ECA-400, Ιαπωνία). Τα μοριακά βάρη των προϊόντων μετρήθηκαν με φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (HRMS) με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού (ESI) ως τρόπο ιονισμού (Agilent 1260-G6230A, Γερμανία). Το NMR και τα φάσματα μάζας των ενώσεων παρέχονται στα Συμπληρωματικά Υλικά. Οι ενώσεις 35-38 συντέθηκαν και αναγνωρίστηκαν από εμάς. ανατρέξτε στο άρθρο που αναφέρθηκε προηγουμένως για λεπτομέρειες [23].
{{0}}(2-μεθοξυ-3,4-διμεθυλ-9-οξοακριδίνη-10 (9Η)-υλ)οξικός εστέρας (1{ {25}}): Σε διάλυμα 4-μεθοξυ{{1{0}},3-διμεθυλανιλίνης (6) (0.97 g, 6,4 mmol) και 2-βρωμο-βενζοϊκό οξύ (7) (1,29 g, 6,4 mmol) σε DMF (6 mL) σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια προσθέσαμε κονιοποιημένο Cu (0.05 g), Cu2O ({{60}}.05 g) και K2CO3 ({{186}}.71 g, 5,1 mmol). Το μίγμα της αντίδρασης θερμάνθηκε στους 110 ◦C για 12 ώρες. Κατά την απομάκρυνση των διαλυτών υπό κενό, το υπόλειμμα διαλύθηκε σε διάλυμα ΝβΟΗ 1 Ν (25 mL). Το ακατέργαστο προϊόν ελήφθη με καθίζηση κατά την οξίνιση του διηθήματος με συμπ. HCl. Μετά την ξήρανση, το ακατέργαστο προϊόν προστέθηκε στο αντιδραστήριο Eaton (5 mL) σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια το μίγμα θερμάνθηκε στους 90°C για 1 ώρα. Το ψυχθέν μίγμα της αντίδρασης έπεσε σε κορεσμένο υδατικό διάλυμα NaHC03. Το ίζημα διηθήθηκε για τη συλλογή του ακατέργαστου προϊόντος. Ο καθαρισμός του υπολείμματος με χρωματογραφία στήλης πυριτικής πηκτής έδωσε 9, ένα ωχροκίτρινο στερεό (0,61 g, 37,7% απόδοση). Ένα διάλυμα NaH (1,43 mmol) και 9 (0,33 g, 1,3 mmol) σε DMF (5 mL) σε θερμοκρασία δωματίου αναδεύτηκε για 1 ώρα και στη συνέχεια ψύχθηκε στους 5-7 ◦C. Ο βρωμοοξικός αιθυλεστέρας (0,43 g, 2,6 mmol) προστέθηκε στο προκύπτον μίγμα και αναδεύτηκε συνεχώς σε θερμοκρασία δωματίου για 20 ώρες. Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης (TLC), το μίγμα της αντίδρασης χύθηκε σε παγωμένο νερό (15 mL). Τα προκύπτοντα ιζήματα διηθήθηκαν, ξηράνθηκαν και μετά εκχυλίστηκαν με χλωροφόρμιο. Η εξάτμιση του διαλύτη έδωσε έναν ακατέργαστο εστέρα ο οποίος καθαρίστηκε με ανακρυστάλλωση για να δώσει το 10, ένα κίτρινο στερεό (0,33 g, 76% απόδοση). 1Η NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8.30 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8.08 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.75-7.67 (m , 1Η), 7,57-7,50 (m, 1Η), 7,48 (s, 1Η), 5,02 (s, 2Η), 4,22 (q, J=7,1 Hz, 2Η), 3,96 (s, 3Η) , 2,77 (s, 3Η), 2,34 (s, 3Η), 1,21 (t, J=7,1 Hz, 3Η). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ (ppm): 169,25, 157,87, 155,96, 147,46, 146,72, 135,46, 132,15, 130,17, 81,81,125. 119,46, 95,26, 72,06, 61,28, 56,06, 14,59 , 14.34, 13.77. HRMS (ESI) m/z [Μ+Η]+ υπολογισμένο για C20H21NO4: 339,3910 βρέθηκε: 340,1546. 2-(2-μεθοξυ-3,4-διμεθυλ-9-οξοακριδίνη-10(9Η)-υλ)οξικό οξύ (11): Ένα διάλυμα 10 (0,37 g, 1,1 mmol) και NaOH (0,05 g, 1,3 mmol) σε αιθανόλη (20 mL) και νερό (2 mL) θερμάνθηκε στους 60°C για 1 ώρα. Κατά την απομάκρυνση των διαλυτών, το προκύπτον υπόλειμμα διαλύθηκε σε νερό και διηθήθηκε. Μετά την εξουδετέρωση του διηθήματος με συμπ. HCl, το μίγμα διηθήθηκε για να ληφθεί το ακατέργαστο στερεό, στη συνέχεια ανακρυσταλλώθηκε με μεθανόλη για να δώσει το 11, μια ωχροκίτρινη σκόνη (0,29 g, 85,7% απόδοση). 1Η NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 10.51 (s, 1Η), 8.33 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.04 (d, J=8.5 Hz, 1Η ), 7.69 (s, 1Η), 7.67-7.62 (m, 1Η), 7.45 (t, J=6.8 Hz, 1H), 4.52 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 2.75 (s, 3Η), 2,31 (s, 3Η). 13C NMR (101 MHz, DMSO-D6) δ (ppm): 159,04, 155,63, 147,47, 146,64, 134,86, 131,52, 129,56, 128,98, 85,61,125. 101,77, 96,02, 74,81, 55,69, 14,42, 13,33 . HRMS (ESI) m/z [Μ+Η]+ υπολογισμένο για C18H17NO4: 311,3370 βρέθηκε: 312,1229.
{{0}}χλωρο-8-μεθοξυ-9,10-διμεθυλ-6Η-πυρρολο [3,2,1-δε]ακριδίνη{ {9}},6(2Η)-διόνη (25): Σε διάλυμα 6-καρβοξυ-4-μεθοξυ-2,3-διμεθυλβενζολαμινίου (14) (1,3 g, 6,4 mmol) και 2-(2-βρωμο-4-χλωροφαινυλ)οξικό οξύ (15) (1,6 g, 6,4 mmol) σε DMF (6 mL) σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια προσθέσαμε κονιοποιημένο Cu (0.05 g), Cu2O (0.05 g) και K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). Το μίγμα της αντίδρασης θερμάνθηκε στους 110°C για 12 ώρες. Κατά την απομάκρυνση των διαλυτών υπό κενό, το υπόλειμμα διαλύθηκε σε διάλυμα ΝβΟΗ 1 Ν (25 mL). Το ακατέργαστο προϊόν ελήφθη με καθίζηση κατά την οξίνιση του διηθήματος με συμπ. HCl. Μετά την ξήρανση, το ακατέργαστο προϊόν προστέθηκε στο αντιδραστήριο Eaton (5 mL) σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια το μίγμα θερμάνθηκε στους 90°C για 1 ώρα. Το ψυχθέν μίγμα της αντίδρασης έπεσε σε κορεσμένο υδατικό διάλυμα NaHC03. Το ίζημα διηθήθηκε για τη συλλογή του ακατέργαστου προϊόντος. Καθαρισμός του υπολείμματος με χρωματογραφία στήλης πυριτικής πηκτής έδωσε 25, ένα κίτρινο στερεό (0,80 g, 38,6% απόδοση). 1Η NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8.17 (d, J =8.1, 1.5 Hz, 1Η), 7.86 (d, J {= 6.9 Hz, 1Η), 7,51 (s, 1Η), 3,84 (s, 3Η), 3,78 (s, 2Η), 2,49 (s, 3Η), 2,27 (s, 3Η); HRMS (ESI) m/z [Μ+Η]+ υπολογισμένο για C18H14ClNO3: 327,7640 ευρεθέν: 328,0734. 4-χλωρο-8-μεθοξυ-9,10-διμεθυλ-6Η-πυρρολο[3,2,1-δε]ακριδίνη-1 ,6(2Η)-διόνη (26): Η σύνθεση αυτής της ένωσης ήταν παρόμοια με 25. Το 15 αντικαταστάθηκε με 2-(2-βρωμο-5-χλωροφαινυλ)οξικό οξύ (16). Λάβαμε 0,82 g 26 ως ωχροκίτρινο στερεό με απόδοση 38,7%. 1Η NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 7,73 (s, 1Η), 7,52 (s, 1Η), 7,38 (s, 1Η), 3,71 (s, 3Η), 3,64 (s, 2Η), 2,36 (s, 1Η), 3Η), 2.13 (s, 3Η); HRMS (ESI) m/z [Μ+Η]+ υπολογισμένο για C18H14ClNO3: 327,7640 βρέθηκε: 328,0734.
{{0}}φθορο-8-μεθοξυ-9,10-διμεθυλ-6Η-πυρρολο[3,2,1-δε]ακριδίνη{ {9}},6(2Η)-διόνη (27): Η σύνθεση αυτής της ένωσης ήταν παρόμοια με 25. Το 15 αντικαταστάθηκε με 2-(2-βρωμο-4-φθοροφαινυλ)οξικό οξύ (17). Λάβαμε ένα βαθύ κίτρινο στερεό 27 με 0,84 g (απόδοση 42,1%). 1Η NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 8.21 (d, J=8.0 Hz, 1Η), 7.68 (s, 1Η), 7.23 (d, J {{39} }.5 Ηζ, 1Η), 3.88 (s, 3Η), 3.81 (s, 2Η), 2.53 (s, 3Η), 2.30 (s, 3Η); HRMS (ESI) m/z [Μ+Η]+ υπολογισμένο για C18H14FNO3: 311,3124 βρέθηκε: 312,1030. 4-φθορο-8-μεθοξυ-9,10-διμεθυλ-6Η-πυρρολο[3,2,1-δε]ακριδίνη-1 ,6(2Η)-διόνη (28): Η σύνθεση αυτής της ένωσης ήταν παρόμοια με 25. Το 15 αντικαταστάθηκε με 2-(2-βρωμο-5-φθοροφαινυλ)οξικό οξύ (18). Ελήφθησαν 0,81 g βαθύ κίτρινο στερεό (40,5% απόδοση). 1Η NMR (400 ΜΗζ, DMSOD6) δ 7.86 (s, 1Η), 7.64 (s, 1Η), 7.51 (s, 1Η), 3.83 (s, 3Η), 3.77 (s, 2Η), 2.49 (s, 3Η), 2.26 (s, 3Η); HRMS (ESI) m/z [Μ+Η]+ υπολογισμένο για C18H14FNO3: 311,3124 βρέθηκε: 312,1030.
4,8-διμεθοξυ-9,10-διμεθυλ-6Η-πυρρολο[3,2,1-δε]ακριδίνη-1,6(2Η )-διόνη (29): Η σύνθεση αυτής της ένωσης ήταν παρόμοια με 25. Το 15 αντικαταστάθηκε με 2-(2-βρωμο-5-μεθοξυφαινυλ)οξικό οξύ (19). {{20}}.73 g κίτρινου στερεού δόθηκε με απόδοση 35,2%. 1Η NMR (400 ΜΗζ, DMSO D6) δ 7,93 (s, 1Η), 7,61 (s, 1Η), 7,47 (s, 1Η), 3,84 (s, 3Η), 3,81 ( s, 3Η), 3,67 (s, 2Η), 2,44 (s, 3Η), 2,28 (s, 3Η); HRMS (ESI) m/z [Μ+Η]+ υπολογισμένο για C19H17NO4: 323.3480 βρέθηκε: 324.1230. 7-μεθοξυ-5,6-διμεθυλ-9-οξο-9,{10-διυδροακριδίνη-4-καρβοξυλικό οξύ (33): Σε διάλυμα από 6-καρβοξυ-4-μεθοξυ-2,3-διμεθυλβενζολομίνιο (14) (1,30 g, 6,4 mmol) και 2-βρωμο-βενζοϊκό οξύ (7) (1,29 g, 6,4 mmol) σε DMF (6 mL) σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια προσθέσαμε κονιοποιημένο Cu (0,05 g), Cu2O (0,05 g) και K2CO3 (0,71 g, 5,1 mmol). Το μίγμα της αντίδρασης θερμάνθηκε στους 110°C για 12 ώρες. Κατά την απομάκρυνση των διαλυτών υπό κενό, το υπόλειμμα διαλύθηκε σε διάλυμα ΝβΟΗ 1 Ν (25 mL). Το ακατέργαστο προϊόν ελήφθη με καθίζηση κατά την οξίνιση του διηθήματος με συμπ. HCl. Μετά την ξήρανση, το ακατέργαστο προϊόν προστέθηκε στο αντιδραστήριο Eaton (5 mL) σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια το μίγμα θερμάνθηκε στους 90°C για 1 ώρα. Το ψυχθέν μίγμα της αντίδρασης έπεσε σε κορεσμένο υδατικό διάλυμα NaHC03. Το ίζημα διηθήθηκε για τη συλλογή του ακατέργαστου προϊόντος. Ο καθαρισμός του υπολείμματος με χρωματογραφία στήλης πυριτικής πηκτής έδωσε 33, ένα ωχροκίτρινο στερεό (1.{106}} g, 52,7% απόδοση). 1Η NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 13.00 (s, 1Η), 10.28 (s, 1H), 8.01 (d, J=9.7 Hz, 1H), 7.69 (d , J=8.5 Hz, 1H), 7.48 (t, J=9.0 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 3.67 (s, 3H), 2.32 (s, 3H ), 2.10 (s, 3Η); HRMS (ESI) m/z [Μ+Η]+ υπολογισμένο για C17H15NO4: 297,3100 βρέθηκε: 298,1073. 2,7-διμεθοξυ-5,{6-διμεθυλ-9-οξο{-9,{10-διυδροακριδίνη-4-καρβοξυλικό οξύ (34): Το η σύνθεση αυτής της ένωσης ήταν παρόμοια με το 33. Το 7 αντικαταστάθηκε με 2-βρωμο-5- μεθοξυβενζοϊκό οξύ (30). Το κίτρινο στερεό έδωσε 1,05 g με 50,2% απόδοση. 1Η NMR (400 MHz, DMSO-D6) δ 12,96 (s, 1Η), 10,45 (s, 1Η), 7,84 (s, 1Η), 7,54 (s, 1Η), 7,50 (s, 1Η), 3,84 (s, 1Η), 3Η), 3,81 (s, 3Η), 2,48 (s, 3Η), 2,27 (s, 3Η); HRMS (ESI) m/z [Μ+Η]+ υπολογισμένο για C18H17NO5: 327,3360 βρέθηκε: 328,1179.
4.2. Βιολογική Δοκιμασία
Κιτ δέσμευσης ποντικού STING, ανθρώπινα κιτ δέσμευσης STING WT, κιτ δέσμευσης ανθρώπινου AQ STING και κιτ δέσμευσης ανθρώπινου H232 STING αγοράστηκαν από τη Cisbio. 293Τ κύτταρα mSTING (ISG/KI-IFNb), 293Τ κύτταρα hSTING-R232 (ISG/KI-IFNb), κύτταρα THP1-KI-hSTING-R232, κύτταρα THP1-KO-STING αγοράστηκαν από Invivogen. 293Τ κύτταρα mSTING και 293Τ κύτταρα hSTING-R232 καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας DMEM (Gibco, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ), 2 mM L-γλουταμίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 4,5 g/L γλυκόζης (Sigma- Aldrich), 10% FBS (Gibco), Pen-Strep (100 U/mL-100 μΜ) (Gibco), 100 μM νορμοκίνη (Invivogen, San Diego, CA, USA) και συμπληρωμένο με εκλεκτικά αντιβιοτικά (Invivogen ) βλαστικιδίνη (10 μΜ), υγρομυκίνη (100 μΜ) και ζεοκίνη (100 μΜ). Κύτταρα THP1-KO-STING και THP1-KI-hSTING-R232 κύτταρα καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας RPMI-1640 (Gibco), 2 mM L-γλουταμίνη (Sigma-Aldrich), 25 mM HEPES (Sigma-Aldrich), 10% αδρανοποιημένο με θερμότητα FBS (Gibco), PenStrep (100 U/mL-100 μM) (Gibco), 100 μM νορμοκίνη (Invivogen) και συμπληρωμένο με εκλεκτικά αντιβιοτικά (Invivogen) βλαστικιδίνη ( 10 μΜ) και ζεοκίνη (100 μΜ). Το διάλυμα QUANTI-Blue, QUANTI-Luc, 20,30 -cGAMP αγοράστηκαν από την Invivogen. Το H151 ελήφθη από την Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Πεκίνο, Κίνα). Το κιτ δοκιμασίας βιωσιμότητας φωταυγών κυττάρων CellTiter-Glo ελήφθη από την Promega.
4.2.1. HTRF STING Binding Competitive Assay
Σύμφωνα με τις οδηγίες των κιτ δέσμευσης STING, τα ακόλουθα διαλύματα προστέθηκαν διαδοχικά σε κάθε φρεάτιο στην 384-πλάκα πηγαδιού: 5 μL των ενώσεων ανίχνευσης ή 2 0,30 -cGAMP (θετικός έλεγχος ) με διαφορετικές συγκεντρώσεις ή αραιωτικό (αρνητικός έλεγχος). 5 μL ανθρώπινης πρωτεΐνης με επισήμανση STING 6His (φρεάτιο αρνητικού ελέγχου προστέθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα ανίχνευσης). 10 μL προσδέματος STING d2 και προαναμεμειγμένου διαλύματος εργασίας Anti 6His-Tb3+. Μετά από σφράγιση της πλάκας και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 3 ώρες, διαβάστηκαν οι τιμές φθορισμού στα 665 nm και 620 nm. Ο λόγος των δύο εντάσεων φθορισμού (665 nm/620 nm) χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της δεσμευτικής ισχύος των ενώσεων. Οι τιμές IC50 (50% ανασταλτική συγκέντρωση) υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism.
4.2.2. Κυτταρική Δοκιμασία για Διαλογή Ενώσεων για την Αγωνιστική Δραστηριότητα
Ποσότητες 180 μL κυττάρων 293T mSTING, 293Τ κυττάρων hSTING-R232 και εναιωρήματος κυττάρων THP1-KOSTING κατανεμήθηκαν σε {{6}πλάκες με επίπεδο πυθμένα πηγαδιών με πυκνότητα ~50,000 κύτταρα /πηγάδι (293T) ή ~100,000 κύτταρα/πηγάδι (THP1). Προστέθηκε ποσότητα 20 μL είτε αλατούχου διαλύματος είτε αλατούχου διαλύματος μιας δοκιμαστικής ένωσης, ή 20,30 -cGAMP ως θετικής αναφοράς και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ◦C με 5% CO2 για 48 ώρες. Στη συνέχεια, μια ποσότητα 20 μL υπερκειμένου προστέθηκε σε μια πλάκα 96-πηγαδιού με επίπεδο πυθμένα, ακολουθούμενη από 180 μL διαλύματος QUANTI-Blue σε κάθε φρεάτιο. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 ◦C για 3 ώρες και τα επίπεδα SEAP (η δραστηριότητα της οδού IRF) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο στα 620-655 nm.
4.2.3. Κυτταρική Δοκιμασία για Διαλογή Ενώσεων για Ανασταλτική Δραστηριότητα
Προ-πείραμα: 180 μL κυττάρων 293Τ mSTING, 293Τ κύτταρα hSTING-R232 (~50,000 κύτταρα/φρεάτιο) διεγέρθηκαν για 48 ώρες στους 37 ◦C σε Επωαστήρας 5% CO2 με 10 µL 2{0,30 -cGAMP (3,125 µM, 6,25 µM) και 10 µL H151 (1.{0 µΜ) ). Στη συνέχεια, μια ποσότητα 20 μL υπερκειμένου προστέθηκε σε μια πλάκα 96-πηγαδιού με επίπεδο πυθμένα, ακολουθούμενη από 180 μL διαλύματος QUANTI-Blue σε κάθε φρεάτιο. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 ◦C για 3 ώρες και τα επίπεδα SEAP (η δραστηριότητα της οδού IRF) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο στα 620-655 nm. 180 μL εναιωρήματος κυττάρων 293Τ mSTING, 293Τ hSTING-R232 κυττάρων κατανεμήθηκαν σε 96-πλάκες με επίπεδο πυθμένα πηγαδιών με πυκνότητα ~50,000 κύτταρα/φρεάτιο. Ποσότητα 10 μL 2 0,30 -cGAMP (3,125 μΜ) και ένωση 11 ή ένωση 27 (0,78 μΜ, 1,56 μΜ, 3,13 μΜ, 6,25 μΜ, 12,5 μΜ, 25 μΜ, 50 μΜ, . μΜ) ή Η151 (0,08 μΜ, 0,16 μΜ, 0,31 μΜ, 0,63 μΜ, 1,25 μΜ, 2,5 μΜ, 5 μΜ) προστέθηκαν και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37°C με 5% CO2 για 48 ώρες. Ακολούθως, μια ποσότητα 20 μL υπερκειμένου προστέθηκε σε μια 96-πλάκα με επίπεδο πυθμένα φρεατίου, ακολουθούμενη από 180 μL διαλύματος QUANTI-Blue σε κάθε φρεάτιο. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 ◦C για 3 ώρες και τα επίπεδα SEAP (η δραστηριότητα της οδού IRF) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο στα 620-655 nm. Οι τιμές IC50 υπολογίστηκαν με λογισμικό GraphPad.
4.2.4. Κυτταρική ανάλυση για την αναστολή των διπλών οδών STING
180 µL αιωρήματος κυττάρων THP1-KI-hSTING-R232 κατανεμήθηκαν σε 96-πλάκες με επίπεδο πυθμένα με πυκνότητα ~100,000 κύτταρα/φρεάτιο. Προστέθηκε ποσότητα 10 μL 20,30 -cGAMP και 10 μL ένωσης 11 (20 μΜ) ή ένωσης 27 (33 μΜ) ή Η151 (2 μΜ) και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ◦C με 5% CO2 για 24 ώρες. Στη συνέχεια, μια ποσότητα υπερκειμένου προστέθηκε σε μια 96-πηγαδιακή λευκή (αδιαφανή) πλάκα, ακολουθούμενη από διάλυμα QUANTI-Luc ή QUANTI-Blue σε κάθε φρεάτιο και τα επίπεδα φωταύγειας ή τα επίπεδα SEAP διαβάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αυτό επιτρέπει την ταυτόχρονη μελέτη της οδού του ρυθμιστικού παράγοντα IFN (IRF), αξιολογώντας τη δραστηριότητα της Lucia luciferase και της οδού NF-κB, παρακολουθώντας τη δραστηριότητα του SEAP.
4.2.5. Δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων CellTiter-Glo Luminescent
Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με κιτ δοκιμασίας βιωσιμότητας φωταυγών κυττάρων CellTiter-Glo σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις (5 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ) της ένωσης 11 ένωσης 27, ή Η-151 για 48 ώρες. 100 μL αντιδραστηρίου CellTiter-Glo προστέθηκαν σε μια πλάκα ανάλυσης φρεατίου για 10 λεπτά, και στη συνέχεια καταγράφηκε η φωταύγεια.
4.3. Μοριακή σύνδεση της ένωσης 11
Η κρυσταλλική δομή του συμπλέγματος STING (PDB ID: 6MXE) λήφθηκε από μια καταχώρηση της Τράπεζας Δεδομένων Πρωτεϊνών και χρησιμοποιήθηκε ως το σημείο εκκίνησης. Η πρωτεΐνη παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το πρωτεϊνικό παρασκεύασμα του Maestro και χωρίστηκε σε αλυσίδα Α και αλυσίδα Β. Δημιουργήσαμε μια θέση δέσμευσης στο LBD του μονομερούς STING με βάση τον αρχικό συνδέτη (Merck-18) χρησιμοποιώντας τη δημιουργία πλέγματος υποδοχέα. Χρησιμοποιήσαμε την ακρίβεια SP του Glide-docking για το μοριακό τμήμα σύνδεσης, επιτρέποντας στην ένωση 11 να δημιουργήσει το πολύ 20 στάσεις. Τελικά δημιουργήσαμε 16 δεμένες διαμορφώσεις (όλες στην κάτω τσέπη) και δοκιμάσαμε την ελεύθερη ενέργεια σύνδεσης των συμπλεγμάτων χρησιμοποιώντας τη μονάδα Prime MM-GBSA στο λογισμικό του Schrödinger. Επιπλέον, με βάση τη βαθμολογία σύνδεσης, τη βαθμολογία του μοντέλου ολίσθησης και τη βαθμολογία MMGBSA dG Bind, επιλέξαμε τη βέλτιστη διαμόρφωση που βαθμολογήθηκε πρώτη στις δύο και κατατάχθηκε τρίτη σε μία (που φαίνεται στον Πίνακα S2). Τέλος, συγχωνεύσαμε τις καλύτερες διαμορφώσεις των αλυσίδων Α και Β για να αποκτήσουμε την πλήρη δομή σύνδεσης.
βιβλιογραφικές αναφορές
1. Abe, Τ.; Harashima, Α.; Xia, Τ.; Konno, Η.; Konno, Κ.; Morales, Α.; Ahn, J.; Gutman, D.; Barber, GN STING Η αναγνώριση του κυτταροπλασμικού DNA υποκινεί την κυτταρική άμυνα. ΜοΙ. Cell 2013, 50, 5–15. [CrossRef]
2. Wu, J.; Sun, L.; Chen, Χ.; Du, F.; Shi, Η.; Chen, C.; Ο Chen, ZJ Cyclic GMP-AMP είναι ένας ενδογενής δεύτερος αγγελιοφόρος στην έμφυτη ανοσολογική σηματοδότηση από το κυτταροσολικό DNA. Science 2013, 339, 826–830. [CrossRef]
3. Abe, Τ.; Barber, GN κυτοσολικό-DNA-μεσολαβούμενη, εξαρτώμενη από STING Επαγωγή προφλεγμονώδους γονιδίου Απαιτεί την κανονική ενεργοποίηση του NF-κB μέσω του TBK1. J. Virol. 2014, 88, 5328–5341. [CrossRef]
4. Cai, Χ.; Chiu, Υ.-Η.; Chen, ZJ The cGAS-cGAMP-STING Pathway of Cytosolic DNA Sensing and Signaling. ΜοΙ. Cell 2014, 54, 289-296. [CrossRef] [PubMed]
5. Gao, D.; Li, Τ.; Li, X.-D.; Chen, Χ.; Li, Q.-Z.; Wight-Carter, Μ.; Chen, ZJ Η ενεργοποίηση της κυκλικής συνθάσης GMP-AMP από αυτο-DNA προκαλεί αυτοάνοσες ασθένειες. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 2015, 112, E5699–E5705. [CrossRef] [PubMed]
6. Li, TJ; Cheng, Η.; Yuan, Η.; Xu, QM; Shu, C.; Zhang, YF; Xu, Ρ.; Tan, J.; Rui, Υ.; Li, PJSR Αντικαρκινική δραστηριότητα του cGAMP μέσω διέγερσης της έμφυτης ανοσολογικής απόκρισης με τη μεσολάβηση cGAS-cGAMP-STING-IRF3. Sci. Rep. 2016, 6, 19049. [CrossRef] [PubMed]
7. Motwani, Μ.; Πεσιρίδης, Σ.; Fitzgerald, KA ανίχνευση DNA από το μονοπάτι cGAS-STING στην υγεία και την ασθένεια. Nat. Αιδ. Genet. 2019, 20, 657–674. [CrossRef]
8. Zhang, Η.; Εσείς, QD; Xu, XL Targeting Stimulator of Interferon Genes (STING): Μια προοπτική ιατρικής χημείας. J. Med. Chem. 2020, 63, 3785–3816. [CrossRef]
9. Gao, J.; Tao, J.; Liang, W.; Zhao, Μ.; Du, Χ.; Cui, S.; Duan, Η.; Kan, Β.; Su, Χ.; Jiang, Z. Προσδιορισμός και χαρακτηρισμός φωσφοδιεστεράσης που αποικοδομούν ειδικά το 30 3 0 -κυκλικό GMP-AMP. Cell Res. 2015, 25, 539–550. [CrossRef] [PubMed]
10. Corrales, L.; McWhirter, SM; Dubensky, TW; Gajewski, TF Η οδός STING του ξενιστή στη διεπαφή του καρκίνου και της ανοσίας. J. Clin. Ερευνήστε. 2016, 126, 2404–2411. [CrossRef] [PubMed]
11. Baguley, π.Χ. Ching, LM DMXAA: Ένας αντιαγγειακός παράγοντας με πολλαπλές αποκρίσεις ξενιστή. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2002, 54, 1503–1511. [CrossRef]
12. Lara, PN; Douillard, J.-Y.; Nakagawa, Κ.; von Pawel, J.; McKeage, MJ; Albert, Ι.; Losonczy, G.; Reck, Μ.; Heo, D.-S.; Fan, X.; et al. Τυχαιοποιημένη Δοκιμή Ελεγχόμενης με εικονικό φάρμακο Φάσης ΙΙΙ της καρβοπλατίνης και της πακλιταξέλης με ή χωρίς τον παράγοντα αγγειακής διαταραχής Vadimezan (ASA404) στον προχωρημένο μη-μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965–2971. [CrossRef]
13. Conlon, J.; Burdette, DL; Sharma, S.; Bhat, Ν.; Thompson, Μ.; Jiang, Ζ.; Rathinam, VAK; Monks, Β.; Jin, Τ.; Xiao, TS; et al. Ποντίκι, αλλά όχι ανθρώπινο STING, Δεσμοί και σήματα σε απόκριση στον παράγοντα αγγειακής διαταραχής 5, 6-Διμεθυλξανθενόνη-4-Οξικό οξύ. J. Immunol. 2013, 190, 5216–5225. [CrossRef] [PubMed]
14. Kim, S.; Li, L.; Maliga, Ζ.; Γιν, Q.; Wu, Η.; Mitchison, TJ Τα αντικαρκινικά φλαβονοειδή είναι εκλεκτικοί αγωνιστές του τσιμπήματος του ποντικιού. ACS Chem. Biol. 2013, 8, 1396–1401. [CrossRef] [PubMed]
15. Cavlar, Τ.; Deimling, Τ.; Ablasser, Α.; Hopfner, Κ.-Ρ.; Hornung, V. Ειδική για το είδος ανίχνευση της αντιιικής ένωσης μικρού μορίου CMA από το STING. EMBO J. 2013, 32, 1440–1450. [CrossRef]
16. Ramanjulu, JM; Πεσιρίδης, Γ.Σ. Yang, J.; Concha, Ν.; Singhaus, R.; Zhang, S.-Y.; Tran, J.-L.; Moore, Ρ.; Lehmann, S.; Eberl, HC; et al. Σχεδιασμός αγωνιστών υποδοχέα STING αμιδοβενζιμιδαζόλης με συστηματική δράση. Nature 2018, 564, 439–443. [CrossRef] [PubMed]
17. Chin, EN; Yu, C.; Vartabedian, VF; Jia, Υ.; Kumar, Μ.; Gamo, AM; Vernier, W.; Ali, SH; Kissai, Μ.; Lazar, DC; et al. Αντικαρκινική δράση ενός συστημικού μη νουκλεοτιδικού cGAMP μιμητικού που ενεργοποιεί το STING. Science 2020, 369, 993–999.
18. Pan, BS; Perera, SA; Piesvaux, JA; Presland, JP; Schroeder, GK; Cumming, JN; Trotter, BW; Altman, MD; Buevich, AV; Μετρητά, Β.; et al. Ένας από του στόματος διαθέσιμος μη νουκλεοτιδικός αγωνιστής STING με αντικαρκινική δράση. Science 2020, 369, eaba6098. [CrossRef] [PubMed]
19. Sali, ΤΜ; Pryke, KM; Jinu, Α.; Andrew, L.; Iris, Α.; Rebecca, Β.; Staverosky, JA; Smith, JL; Ahmed, AS; Lisi, AJPP Χαρακτηρισμός ενός νέου Ανθρωποειδούς Αγωνιστή STING που προκαλεί αντιική δράση κατά των αναδυόμενων αλφαϊών. PloS Pathog. 2015, 11, e1005324. [CrossRef] [PubMed]
20. Hong, Ζ.; Mei, J.; Li, C.; Bai, G.; Μαϊμαΐτη, Μ.; Hu, Η.; Yu, W.; Sun, L.; Zhang, L.; Cheng, D.; et al. Οι αναστολείς STING στοχεύουν τον θύλακα δέσμευσης κυκλικού δινουκλεοτιδίου. Proc. Natl. Ακαδ. Sci. ΗΠΑ 2021, 118, e2105465118. [CrossRef] [PubMed]
21. Siu, Τ.; Altman, MD; Baltus, GA; Childers, Μ.; Ellis, JM; Gunaydin, Η.; Hatch, Η.; Ζεστό.; Jewell, J.; Lacey, BM; et al. Ανακάλυψη ενός νέου cGAMP ανταγωνιστικού συνδετήρα της ανενεργής μορφής του STING. ACS Med. Chem. Κάτοικος της Λατβίας. 2019, 10, 92–97. [CrossRef] [PubMed]
22. Haag, SM; Gulen, MF; Reymond, L.; Gibelin, Α.; Abrami, L.; Decout, Α.; Heymann, Μ.; van der Goot, FG; Turcatti, G.; Behrendt, R.; et al. Στόχευση STING με ομοιοπολικούς αναστολείς μικρών μορίων. Nature 2018, 559, 269–273. [CrossRef]
23. Hou, S.; Lan, X.-J.; Li, W.; Yan, X.-L.; Chang, J.-J.; Yang, Χ.-Η.; Sun, W.; Xiao, J.-H.; Li, S. Σχεδιασμός, σύνθεση και βιολογική αξιολόγηση αναλόγων ακριδόνης ως νέους αγωνιστές υποδοχέα STING. Bioorg. Chem. 2020, 95, 103556. [CrossRef] [PubMed]
24. Ouyang, S.; Τραγούδι, Χ.; Wang, Υ.; Ru, Η.; Shaw, Ν.; Jiang, Υ.; Niu, F.; Zhu, Υ.; Qiu, W.; Parvatiyar, Κ.; et al. Η δομική ανάλυση της πρωτεΐνης προσαρμογέα STING αποκαλύπτει μια υδρόφοβη διεπαφή διμερούς και τρόπο κυκλικής σύνδεσης δι-GMP. Immunity 2012, 36, 1073-1086. [CrossRef] [PubMed]
25. Shu, C.; Yi, G.; Watts, Τ.; Kao, CC; Li, P. Η δομή του STING που συνδέεται με την κυκλική δι-ΟΜΡ αποκαλύπτει τον μηχανισμό της αναγνώρισης κυκλικών δινουκλεοτιδίων από το ανοσοποιητικό σύστημα. Nat. Struct. ΜοΙ. Biol. 2012, 19, 722–724. [CrossRef]
26. Huang, Υ.-Η.; Liu, Χ.-Υ.; Du, Χ.-Χ.; Jiang, Z.-F.; Su, X.-D. Η δομική βάση για την ανίχνευση και τη δέσμευση του κυκλικού δι-GMP από το STING. Nat. Struct. ΜοΙ. Biol. 2012, 19, 728–730. [CrossRef]
27. Shih, AY; Damm-Ganamet, KL; Mirzadegan, T. Dynamic Structural Differences between Human and Mouse STING Lead to Differing Sensitivity to DMXAA. Biophys. J. 2018, 114, 32–39. [CrossRef]
28. Gao, Ρ.; Ascano, Μ.; Zillinger, Τ.; Wang, W.; Dai, Ρ.; Serganov, AA; Gaffney, BL; Shuman, S.; Jones, RA; Deng, L.; et al. Ανάλυση δομής-λειτουργίας της ενεργοποίησης STING από c[G(20,50)pA(30,50)p] και στόχευσης από αντιικό DMXAA. Cell 2013, 154, 748-762. [CrossRef] [PubMed]
29. Zhang, C.; Shang, G.; Gui, Χ.; Zhang, Χ.; Bai, Χ.; Chen, ZJN Δομική βάση σύνδεσης STING και φωσφορυλίωσης από TBK1. Nature 2019, 567, 394–398. [CrossRef]
30. Vavˇrina, Z.; Gutten, Ο.; Smola, Μ.; Zavˇrel, M.; Aliakbar Tehrani, Z.; Charvát, V.; Kožíšek, Μ.; Boura, Ε.; Birkuš, G.; Rulíšek, L. Αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-προσδέματος στη θέση δέσμευσης STING που ανιχνεύτηκε από ορθολογικά σχεδιασμένες μονοσημειιακές μεταλλάξεις: Πείραμα και Θεωρία. Biochemistry 2021, 60, 607-620. [CrossRef] [PubMed]
31. Che, Χ.; Du, Χ.-Χ.; Cai, Χ.; Zhang, J.; Xie, WJ; Long, ZR; Ye, Z.-Y.; Zhang, Η.; Yang, L.; Su, X.-D.; et al. Μεμονωμένες μεταλλάξεις Αναδιαμορφώνουν το Δίκτυο Δομικής Συσχέτισης του συμπλέγματος DMXAA-Human STING. J. Phys. Chem. Β 2017, 121, 2073–2082. [CrossRef] [PubMed]
32. Diner, EJ; Burdette, DL; Wilson, SC; Monroe, KM; Kellenberger, CA; Hyodo, Μ.; Hayakawa, Υ.; Hammond, MC; Vance, RE Ο έμφυτος ανοσιακός αισθητήρας DNA cGAS Παράγει ένα μη κανονικό κυκλικό δινουκλεοτίδιο που ενεργοποιεί το ανθρώπινο STING. Cell Rep. 2013, 3, 1355–1361. [CrossRef] [PubMed]
33. Gao, Ρ.; Zillinger, Τ.; Wang, W.; Ascano, Μ.; Dai, Ρ.; Hartmann, G.; Tuschl, Τ.; Deng, L.; Barchet, W.; Οι αντικαταστάσεις Patel, DJ Binding-Pocket και Lid-Region καθιστούν το ανθρώπινο STING ευαίσθητο στο ειδικό για το είδος φάρμακο DMXAA. Cell Rep. 2014, 8, 1668–1676. [CrossRef] [PubMed]
34. Hwang, J.; Kang, Τ.; Lee, J.; Choi, B.-S.; Han, S. Σχεδιασμός, σύνθεση και βιολογική αξιολόγηση C7-λειτουργοποιημένων παραγώγων DMXAA ως πιθανών αγωνιστών ανθρώπινου STING. Οργ. Biomol. Chem. 2019, 17, 1869–1874. [CrossRef] [PubMed]